CN107475152A - 太湖芦苇荡底泥微囊藻毒素降解菌及降解mc‑lr方法 - Google Patents

太湖芦苇荡底泥微囊藻毒素降解菌及降解mc‑lr方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了太湖芦苇荡底泥微囊藻毒素降解菌及降解MC‑LR方法，属于环保水生物处理技术领域。微囊藻毒素降解菌JZ‑4，保藏编号为CGMCC No.14051，建议的分类命名为Aeromonas salmonicida subsp.salmonicida。本发明从太湖百渎港采集的芦苇荡根部底泥，从中筛选出1株具有微囊藻毒素降解能力的土著菌JZ‑4，其MC‑LR降解率可达到88.86％，对去除饮用水源水中MCs具有广阔前景。此外，亦为微生物降解MCs提供一种筛菌来源。

Description

太湖芦苇荡底泥微囊藻毒素降解菌及降解MC-LR方法
技术领域
本发明属于环保水生物处理技术领域，涉及一种从太湖芦苇荡底泥中筛选MC-LR降解菌并利用其降解微囊藻毒素的方法。
背景技术
我国部分自然水体(如太湖、巢湖等)连年夏秋季节蓝藻暴发，引起微囊藻毒素(MCs)污染。MCs是藻类分泌的一种毒素，对水生物和人类有一定毒性。研究表明，它以动物肝脏为主要靶器官，抑制肝的蛋白磷酸脂酶活性，引起细胞角蛋白高度磷酸化，并能诱导肿瘤坏死因子和白细胞介素，导致肝损伤。目前MCs已有MC-LR、MC-RR、MC-YR等90余种异构体，其中MC-LR急性毒性最强，世界卫生组织(WHO)和我国《生活饮用水卫生规范》均将饮用水中MC-LR的安全限值定为1μg/L。但在我国太湖、巢湖、滇池及长江和黄河中下游许多湖泊的饮用水源水中均检测到MCs的存在。太湖梅梁湾是无锡市主要的水源地，经检测，2009年春夏季其部分水样中MCs的质量浓度分别为1.15、1.64μg·L-1，超出阈值。
由于MCs稳定的环状结构和间隔双键，采用活性炭吸附、光降解、膜过滤等常规工艺难以有效去除水体中的MCs，而利用一些特殊的微生物对MCs进行降解，既经济、安全，又符合生态修复理念。《Natural Toxins》1994年第2卷第4期228-235页最早报道了Jones等从澳大利亚天然河流中分离出一株具有MC-LR降解能力的鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas，ACM-3962)，《Water Research》2006年第40卷第6期1294-1302页、《Applied and EnvironmentalMicrobiology》2007年第75卷第21期6924-6928页和《环境科学学报》2007年第27卷第7期1145-1150页报道了目前分离出的MCs降解纯菌种主要分布在厚壁菌门、放线菌门和变形菌门中。相对于自然界中广泛存在的MCs降解菌，迄今为止已分离出的MCs降解纯菌种仍相当有限。
蓝藻暴发时期，太湖百渎港的芦苇荡中漂浮大量蓝藻。天气转凉后，藻细胞衰亡后沉积于岸边，大量的胞内结合态MCs进入土壤，但经检测芦苇荡底泥中MCs含量却不高。芦苇根系存在通气组织，具有改良土壤、抑制藻类、维持生物多样性等生态效益，由此推测，其根系底泥中可能存在降解MCs的微生物。本发明对芦苇荡底泥进行富集、筛选，分离出1株MC-LR降解效果较好的土著菌，以期为解决饮用水源水MCs污染问题提供理论指导。
发明内容
本发明的目的是：从蓝藻爆发时期(7月31日)于太湖百渎港采集的芦苇荡根部底泥筛选分离出一株微囊藻毒素降解菌JZ-4，提供一种MCs降解菌的筛选来源及菌种，以期促进水源水中MCs的自然归趋。
本发明所采用技术方案如下：
发明人从太湖百渎港采集的芦苇荡根部底泥中筛选出1株微囊藻毒素降解菌JZ-4，经16S rDNA鉴定为杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(Aeromonas salmonicidasubsp.salmonicida)，现保藏于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通生物中心(CGMCC)，保藏时间为：2017年4月20日，保藏编号为CGMCC No.14051，建议的分类命名为Aeromonas salmonicidasubsp.salmonicida。
微囊藻毒素降解菌并利用其降解MC-LR的方法，按照下述步骤进行：
菌株JZ-4经营养肉汤培养基活化培养12h后，按体积分数为3％-11％的接菌量接种至pH值为5-9的添加MC-LR的无机盐培养基中，调节MC-LR初始浓度为14.12μg·L-1，30℃、140r·min-1振荡培养6d，可以达到降解MC-LR的目的。
本发明所用的细菌营养肉汤培养基组成：鱼粉蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠10g，加蒸馏水至1L，调制pH为7-7.2，添加1.5％-2％的琼脂，加热溶解，灭菌冷却后制得固体培养基。
本发明所用的添加MC-LR的无机盐培养基为：K2HPO4 1.6g，KH2PO4 0.4g，MgSO4·7H2O 0.2g，NaCl 0.5g，CaCl2 20mg，FeCl3·6H2O 2.3mg，加蒸馏水至1L。添加本课题组提取的MC-LR粗提液作为碳、氮源，调节pH至7-7.2，添加1.5％-2％的琼脂，加热溶解，灭菌冷却后制得固体培养基。
本发明的有益效果：
考虑到芦苇根系的通气组织具有净化作用，本发明从太湖百渎港采集的芦苇荡根部底泥，从中筛选出1株具有微囊藻毒素降解能力的土著菌JZ-4，1d内其对MC-LR的降解率为11.03％，6d后菌株JZ-4的MC-LR降解率可达到88.86％，对去除饮用水源水中MCs具有广阔前景。此外，亦为微生物降解MCs提供一种筛菌来源。
本发明菌株JZ-4降解MC-LR的优选方法：按体积分数为3％的接菌量，将活化培养12h后的菌液接种至pH值为7的添加MC-LR的无机盐培养基中，在30℃条件下140r·min-1振荡培养6d，菌株JZ-4的MC-LR降解效果最好。
具体实施方式
菌株的筛选及鉴定
1样品采集
蓝藻爆发时期(7月31日)于太湖百渎港芦苇荡中挖出整颗芦苇，收集芦苇根系及其周围底泥，于-4℃下保存备用。
2菌株筛选与分离
(1)按1:9的比例称取芦苇根部底泥加入无菌水中，置于摇床，140r·min-1振荡4-6h，使底泥与无菌水混匀，得到底泥匀浆液。
(2)将上述匀浆液静置2h，按1:4的比例移取上清液加至添加MC-LR的无机盐培养基中连续驯化培养3次，并逐次增加培养基中MC-LR的浓度。
(3)将驯化后的菌液梯度稀释涂布于无机盐&MC-LR培养基平板上，于30℃恒温培养箱中倒置培养7天，根据不同性状挑选优势单菌落划线纯化4-5次，纯化所得5株纯菌株分别命名为JZ-1、JZ-2、JZ-3、JZ-、JZ-5，并将其接种至斜面培养基上于2-8℃保存。
(4)从斜面培养基上挑取5株菌分别接入添加MC-LR的无机盐培养基中(MC-LR初始浓度为42.19μg/L)，设不加菌空白样，振荡培养6d后，取样8000r·min-1离心10min，取上清液测定MC-LR含量，以空白样作对照计算降解率，获得MC-LR降解效果较好的菌株进行深入研究。
3菌株鉴定
(1)菌株JZ-4在牛肉膏蛋白胨培养基上30℃培养2d，单菌落直径约为1-4mm，圆形、乳白、隆起、湿润、表面较光滑、边缘完整。继续培养，菌落逐渐变大，表面干燥形成褶皱，边缘略不规则，呈米黄色。菌株JZ-4的革兰氏染色和生理生化试验结果表明：该菌株的菌体呈杆状，革兰氏染色呈阳性，接触酶、运动性、葡萄糖发酵氧化、产吲哚、明胶水解、硝酸盐还原及5％NaCl生长均为阳性，淀粉水解、V.P试验、甲基红试验、产硫化氢、脂酶、7％NaCl生长均为阴性。
(2)菌株JZ-4经16S rDNA鉴定为杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(Aeromonas salmonicidasubsp.salmonicida)，现保藏于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通生物中心(CGMCC)，保藏时间为：2017年4月20日，保藏编号为CGMCC No.14051，建议的分类命名为Aeromonas salmonicidasubsp.salmonicida。
以下提供本发明利用上述菌株JZ-4降解MC-LR的3个实例案：
实施例1
从菌株JZ-4斜面培养基中挑取一环菌接种至50mL营养肉汤培养基中，在温度为30℃的条件下，140r·min-1振荡培养12h，按照体积分数为3％的接菌量接种至pH值为7的30mL无机盐&MC-LR培养基中，在温度为30℃条件下，140r·min-1振荡培养6d，每天取样测定MC-LR含量，1-6d内菌株JZ-4对MC-LR的降解率分别为11.03％、42.05％、68.25％、79.34％、84.85％、88.86％。
实施例2
本实施例与实施例1不同之处在于接菌量的差异.
从菌株JZ-4斜面培养基中挑取一环菌接种至50mL营养肉汤培养基中，在温度为30℃的条件下，140r·min-1振荡培养12h，分别按照体积分数为3％、5％、7％、9％、11％的接菌量将菌液接种至pH值为7的30mL无机盐&MC-LR培养基中，在温度为30℃条件下，140r·min-1振荡培养6d，取样测定MC-LR含量。当接菌量为3％时，MC-LR降解率87.96％；当接菌量为5％时，MC-LR降解率84.06％；当接菌量为7％时，MC-LR降解率68.71％；当接菌量为9％时，MC-LR降解率60.43％；当接菌量为11％时，MC-LR降解率50.44％。因此当体积分数为3％的接菌量时，MC-LR降解效果最好。
实施例3
本实施例与实施例1和实施例2不同之处在于反应体系初始pH值的差异。
从菌株JZ-4斜面培养基中挑取一环菌接入装有50mL营养肉汤培养基中，在温度为30℃的条件下，140r·min-1振荡培养12h，按照体积分数为5％的接菌量将菌液分别接种至30mL pH值为5、6、7、8、9的无机盐&MC-LR培养基中，在温度为30℃条件下，140r·min-1振荡培养6d，取样测定MC-LR含量。当反应体系初始pH值为5时，MC-LR降解率为14.38％；当反应体系初始pH值为6时，MC-LR降解率为74.07％；当反应体系初始pH值为7时，MC-LR降解率为84.06％；当反应体系初始pH值为8时，MC-LR降解率为63.11％；当反应体系初始pH值为9时，MC-LR降解率为32.65％。因此当反应体系初始pH值为7时，MC-LR降解效果最好。

Claims (4)

1.微囊藻毒素降解菌JZ-4，保藏编号为CGMCC No.14051，建议的分类命名为Aeromonassalmonicida subsp.salmonicida。
2.微囊藻毒素降解菌降解MC-LR的方法，其特征在于按照下述步骤进行：
菌株JZ-4经营养肉汤培养基活化培养12h后，按体积比3-11％接菌量接至pH值为5-9的无机盐和MC-LR培养基中，MC-LR初始浓度为14.12μg·L-1，30℃、140r/min振荡培养6d，即可以达到降解MC-LR的目的。
3.根据权利要求1所述的微囊藻毒素降解菌降解MC-LR的方法，其特征在于按照下述步骤进行：
所用的细菌营养肉汤培养基组成：鱼粉蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠10g，加蒸馏水至1L，调制pH为7-7.2，添加1.5-2％的琼脂，加热溶解，灭菌冷却后制得固体培养基。
4.根据权利要求1所述的微囊藻毒素降解菌降解MC-LR的方法，其特征在于所用的无机盐和MC-LR培养基为：K2HPO4 1.6g，KH2PO4 0.4g，MgSO4·7H2O 0.2g，NaCl 0.5g，CaCl220mg，FeCl3·6H2O 2.3mg，加蒸馏水至1L；添加提取的MC-LR粗提液作为碳、氮源，调节pH至7-7.2，添加1.5-2％的琼脂，加热溶解，灭菌冷却后制得固体培养基。
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