CN108611286A - 一种磺胺类抗生素/重金属复合污染降解/吸附菌及其应用 - Google Patents

一种磺胺类抗生素/重金属复合污染降解/吸附菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种磺胺类抗生素/重金属复合污染降解/吸附菌及其应用。该降解菌为酵母菌（Sakaguchia cladiensis）A5，该菌株已于2018年1月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC NO：60319。该菌株对磺胺甲嘧啶和磺胺甲噁唑等磺胺类抗生素具有很好的降解效果，同时对重金属也有吸附作用，可用于磺胺类抗生素和重金属复合污染的治理，应用对象可包括含有磺胺类抗生素/重金属复合污染物的废水废渣、水环境或土壤等，能减少抗生素和重金属对生态环境安全产生的危害，且具有节能、环保等优点，具有广阔的应用前景。

Description

一种磺胺类抗生素/重金属复合污染降解/吸附菌及其应用
技术领域
本发明属于环境污染物处理技术领域。更具体地，涉及一种磺胺类抗生素/重金属复合污染降解/吸附菌及其应用。
背景技术
长期以来，抗生素被广泛的应用于人类医疗及动物疾病治疗中，根据不同的抗生素种类以及用途添加不同剂量的抗生素，预防疾病和促进动物生长。而抗生素的大量消耗、排泄及丢弃，使抗生素已在不同的环境介质中普遍被检测到。研究发现，生物体摄入大量抗生素类药物后除部分被机体代谢外，有40%~90%以原药或初级代谢产物的形式随粪便和尿液排出体外，最终又通过施肥等方式进入土壤环境或者通过渗漏和污水排放进入水体环境，直接影响动植物及微生物的生命活动，最终通过食物链可能影响到人类健康。据报道，2014 年全球有 70 万人因抗生素耐药性的产生而死亡，因此解决抗生素问题迫在眉睫。为了解决抗生素污染问题，除了减少抗生素的滥用，如何去除环境体系中残留的抗生素已经成为近年来研究的热点。
近年来，我国土壤重金属污染事件频发，不仅对耕地与农产品质量构成严重威胁，还直接损害了民众身体健康，影响社会稳定。我国土壤及水环境中重金属污染形势严峻，尤其在畜禽养殖场的规模化养殖业中，大量使用各种能促进畜禽生长和抑制有害菌的微量元素添加剂及抗菌剂药物，如铜、锌、砷、铬、磺胺类抗生素和四环素类抗生素等。这些被大量应用在饲料添加剂中的重金属和抗生素类药物，大部分并不能被机体所吸收，而是随着排泄物排出体外，导致畜禽粪便中抗生素和重金属大量残留，使得养殖场及周边环境形成了抗生素和重金属复合污染的典型环境。由于这两类污染物又具有相对稳定、难降解、毒性强、有积累效应等特点，因此复合污染的形成对生态环境破坏更大，对人类健康造成更大的威胁。因此开展环境中抗生素/重金属复合污染治理的相关研究迫在眉睫。
微生物的代谢转化直接影响环境中各类污染物的环境行为，而微生物技术被认为是最有潜力的环境污染修复手段之一。目前已有学者开展关于四环素类、磺胺类、β-内酰胺类、氟喹诺酮类和大环内酯等抗生素特异性降解菌的筛选鉴定，降解条件和降解效果的研究。也发现了一些对抗生素具有降解功能的菌株，主要包括：降解四环素的缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta TD2)、人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi TD3)；降解土霉素的蜡样芽抱杆菌(Bacillus cereus)；降解磺胺甲基异噁唑的嗜冷菌(Pseudomonas HA-4)；降解磺胺间甲氧嘧啶的豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae HA-J1)；降解磺胺甲噁唑的黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)。尽管如此，经文献与专利检索，极少关注抗生素/重金属复合污染降解/吸附功能微生物的研究，尤其尚未发现有关于磺胺类抗生素和重金属铜降解/吸附菌筛选、鉴定及性能研究的相关报道。因此，有必要开展相关的研究，从环境筛选驯化来获得能同时降解磺胺抗生素和吸附转化重金属铜的特异功能菌，将有利于促进微生物技术在畜禽养殖场当前磺胺类抗生素/重金属铜复合污染治理中的应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有磺胺类抗生素污染和重金属污染，尤其是两者复合污染处理技术的缺陷和不足，提供一种能够高效降解磺胺类抗生素且吸附重金属的微生物菌。旨在促进微生物技术在环境抗生素和重金属污染治理中的应用，尤其解决畜禽养殖场及周边环境中磺胺类抗生素和重金属铜复合污染问题。
本发明的目的是提供一种磺胺类抗生素/重金属复合污染降解/吸附菌。
本发明另一目的是提供所述复合污染降解/吸附菌在磺胺类抗生素/重金属复合污染的处理方面的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明研究发现，酵母菌(Sakaguchia cladiensis) 在磺胺类药物（尤其是磺胺甲嘧啶）/重金属铜复合污染中，不仅能有效降解抗生素，同时对重金属铜也有吸附效果；可用于处理含有磺胺类抗生素/重金属铜复合污染物的废水废渣，尤其是典型的含磺胺类药物/铜复合污染的畜禽养殖废水。能减少抗生素和重金属对生态环境安全产生的危害，具有广阔的应用前景。
而且本发明还从珠三角地区某畜禽养殖场受污染土壤中筛选、驯化、分离纯化得到一株酵母菌A5菌株，已于2018年1月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC NO：60319。
因此，酵母菌(Sakaguchia cladiensis)在降解处理磺胺类抗生素污染和/或吸附重金属方面的应用，以及酵母菌(Sakaguchia cladiensis)在治理受磺胺类抗生素/重金属铜复合污染的水环境和土壤方面的应用，均应在本发明的保护范围之内。
优选地，所述酵母菌为上述酵母菌A5菌株。
优选地，所述磺胺类抗生素为磺胺甲嘧啶、磺胺甲噁唑和/或磺胺嘧啶。
优选地，所述重金属为铜。
一种含有酵母菌(Sakaguchia cladiensis)的磺胺类抗生素/重金属铜复合污染降解/吸附菌生物菌剂，也应在本发明的保护范围之内。优选地，所述酵母菌为上述酵母菌A5菌株。
优选地，所述降解菌剂为酵母菌A5菌株的菌悬液。
优选地，是酵母菌A5菌株活化培养后制备而成。具体是将酵母菌A5菌株在LB培养基或酵母培养基中培养活化，离心收集沉淀物，经洗涤后稀释制备而成。
优选地，所述菌悬液的制备方法为：将斜面保存的酵母菌A5接种到液体LB培养基或酵母培养基中，恒温振荡培养制得活化种子液；然后将种子液接种到新鲜培养基，继续扩大培养后，离心弃上清液收集菌体，无菌水重悬得菌悬液。
更优选地，所述菌悬液的制备方法为：将斜面保存的酵母菌A5接种到液体LB培养基中，于25～30℃、150～160 r/min恒温振荡培养24～36 h，制得活化种子液；按接种量1%～10%将种子液接种到新鲜培养基，继续于25℃、150 r/min扩大培养24～36 h；然后25℃、6000 r/min离心5～10min，弃上清液收集菌体，无菌水洗涤2～3次，最后用无菌水配置成1g/L的菌悬液。
优选地，所述LB培养基的配方为：NaCl 5g/L，酵母提取物10g/L，胰蛋白栋10g/L，溶剂为水，pH为7.0～7.2。实验前高温高压灭菌。
本发明具有以下有益效果：
本发明筛选得到一种酵母菌，对磺胺甲嘧啶和磺胺甲噁唑等磺胺类抗生素具有很好的降解效果，可用于磺胺类抗生素污染的降解治理；同时对重金属也有较好的吸附作用；应用对象可包括含有磺胺类抗生素/重金属铜复合污染物的废水废渣、水环境或土壤等，尤其是典型的含磺胺甲嘧啶/铜复合污染的畜禽养殖废水的治理，能减少抗生素和重金属对生态环境安全产生的危害。
而且，利用本发明的酵母菌处理磺胺类抗生素和重金属污染，与物理吸附和化学降解等方法相比，具有节能、环保等优点，具有十分广阔的应用前景。
附图说明
图1为酵母菌A5的平板生长的形态形貌。
图2为酵母菌A5的显微镜成像图。
图3为酵母菌A5的系统发育树。
图4为酵母菌A5的生长曲线图。
图5为酵母菌A5对磺胺甲嘧啶/铜复合污染的降解/吸附曲线。
图6为酵母菌A5对磺胺类抗生素/铜复合污染的降解时间曲线及铜的去除效果。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
实施例1 磺胺类抗生素/重金属铜复合污染降解/吸附菌的分离与鉴定
1、实验材料
营养培养基：氯化钠5 g、牛肉膏3 g、蛋白栋10 g、蒸馏水1000 mL、pH为7.0～7.2。固体培养基则加琼脂粉（条）15 g/L。
无机盐培养基：(NH4)2SO4 1 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、KH2PO4 3 g、K2HPO4·3H2O 7 g、柠檬酸钠0.5 g、蒸馏水1000 mL、pH为7.0～7.2。
所述培养基实验前均置于高压蒸汽灭菌锅中，121℃灭菌30 min。
2、菌株的分离与鉴定
（1）耐受菌的筛选、驯化：
微生物驯化分4个阶段进行。采集珠三角某一畜禽养殖场受污染的土壤样，首先在无菌操作条件下，将土样加到100 mL含磺胺类抗生素（10 mg/L）和重金属铜（10 mg/L）的营养培养基中，置于30℃，150 r/min的恒温摇床中避光培养7 d。之后，取10%体积的培养液转接到另一抗生素浓度为30 mg/L的营养培养液中，同样条件继续培养7 d，进行第二阶段驯化。接下来，每7 d为一周期，继续培养驯化，第三阶段驯化抗生素浓度提升到50 mg/L；第四阶段驯化抗生素浓度提升为100 mg/L；驯化过程除抗生素浓度变化，其它培养条件不变。
（2）菌的分离纯化和筛选：
驯化结束，将菌群培养液按10-1～10-6梯度稀释，分别取10-4、10-5、10-6 3个稀释梯度的培养液各200 μL涂布接种到固体营养培养基上，倒置于培养箱中30℃培养24～36 h。对长出的菌落进行编号，并分别挑出进一步划线分离培养，直到获得纯化到单一菌落。
之后，分别将每个单一菌落接种到含有磺胺类抗生素和重金属铜复合污染的无机盐培养基中进行降解/吸附实验，其中磺胺类抗生素为唯一碳源，分别考察每种菌对磺胺类抗生素的降解能力以及对铜的吸附效果。所述的磺胺类抗生素为磺胺甲嘧啶、磺胺甲噁唑和磺胺嘧啶，优选磺胺甲嘧啶。
所述的降解实验条件为：每20 mL无机盐培养基中，磺胺类抗生素浓度 1 mg/L，铜浓度10 mg/L，投菌量1 g/L，置于25℃，150 r/min的恒温摇床中避光培养。
最后筛选获得一株对磺胺类抗生素/铜复合污染的降解/吸附能力最好、生长性能稳定的作为目标菌株，编号为A5。
（3）目标菌株A5的鉴定
电子显微镜样品的制备和观察：在干净的载玻片中间滴1滴无菌水，用灼烧冷却的接种环挑取少量菌A5与载玻片上水滴充分混匀后，在载玻片上涂布成一均匀的薄层；自然晾干；在已经干燥固定的菌体上滴加草酸铵结晶紫染色液，静置1~2 min；之后将染液倾倒，斜置载玻片，用清水冲去残留多余染液，直到流出的水呈无色为止，自然晾干。按显微镜操作步骤，先在低倍镜下观察，找到合适视野之后用油镜在高倍镜下进一步观察菌体细胞形貌。
菌株形态及生理生化鉴定结果：酵母菌A5的平板生长的形态形貌如图1所示，显微镜成像图如图2所示。菌落呈红色、不透明、圆形、表面光滑湿润、边缘整齐；显微镜下菌细胞成单个椭球状，细胞较大，着色性好。
菌A5的分子鉴定：菌A5的分子鉴定委托广东省微生物研究所进行。经过DNA提取，PCR扩增，序列测序及序列对比，菌A5的26S rDNA测序序列与Sakaguchia cladiensis具有最高同源性。并构建了系统发育树，如图3所示。
综上形态鉴定和分子鉴定结果，本发明筛选得到的菌A5鉴定为酵母菌Sakaguchia cladiensis。并已于2018年1月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCCNO：60319；保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
实施例2 酵母菌A5的生长曲线的测定
1、将酵母菌A5分别接种到LB培养基和含有磺胺甲嘧啶/铜复合污染的液体营养培养基中，置于25 ℃，150 r/min摇床恒温培养，并分别于0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、24、36、48、60、72、96、120、144、168、192 、216 h取样，测定培养液的OD 600，用灭菌的LB液体培养基调零。
所述的LB培养基为：NaCl 5g/L，酵母提取物10g/L，胰蛋白栋10g/L，水 1000mL，pH为7.0～7.2。
所述的含有磺胺甲嘧啶/铜复合污染的液体LB培养基为：在上述的LB培养基中加入磺胺甲嘧啶和重金属铜，使其浓度均为100 mg/L。
2、结果如图4所示，所述酵母菌A5在含有磺胺甲嘧啶/铜复合污染培养体系中也能正常生长。
实施例3 酵母菌A5对磺胺甲嘧啶/铜复合污染的降解/吸附实验
1、实验方法
（1）菌悬液的制备：
从保种斜面，刮取1~2环菌A5，接入到已灭菌的LB培养基中，包扎后置于恒温摇床培养箱（25 ℃，150 r/min），扩大培养24~36 h。取已活化的菌A5培养液，离心（6000 r/min，25℃），收集菌体，用无菌水洗涤2次（6000 r/min，25℃）之后用无菌水重悬，制成一定浓度的菌悬液。
（2）菌A5对磺胺甲嘧啶/铜复合污染的降解/吸附：
在已经高压灭菌的无机盐培养基中加入一定量的磺胺甲嘧啶作为唯一碳源，使其浓度为1 mg/L，加入一定量的铜溶液，使其浓度为10 mg/L；之后接入1 mL菌悬液，使投菌量为1g/L（湿重）；同时设计空白组（不加菌）对照。所有样品包扎后置于25 ℃，150 r/min避光培养，定时取样，测定溶液中残留的磺胺甲嘧啶和铜的浓度。
（3）磺胺甲嘧啶的测定：
样品离心后取定量上清液与萃取剂（含0.1%甲酸水：乙腈：甲醇=10:3:1）按1:1充分混合，高速离心后取上清液过滤（0.22 um），利用高效液相色谱（HPLC）分析磺胺甲嘧啶残余浓度。分析条件为： C18反相柱，5μm,4.6×250mm，紫外检测器，检测波长 270nm，水（含0.1%甲酸）：乙腈=30:70（V/V）为流动相，流速 1 mL/min，进样量 20 μL。
（4）铜的测定：
样品离心后，取定量上清液过滤（0.22 um），利用火焰原子吸收光谱仪分析溶液中铜残余浓度。
2、结果如图5所示，在含磺胺甲嘧啶/重金属铜复合污染体系中，菌A5对磺胺甲嘧啶的降解率随时间延长而增大，第48 h其降解率为38.2 %；降解磺胺甲嘧啶同时，菌A5对铜也有吸附效果，在第4 h铜的去除率就达到48%左右；而且铜的存在还可以促进菌A5对磺胺甲嘧啶的降解。
实施例4 污染物浓度对酵母菌A5降解/吸附磺胺甲嘧啶/铜复合污染的影响
在高压灭菌的无机盐培养基中加入一定量的磺胺甲嘧啶作为唯一碳源，使其浓度分别为0.5、1 、3和5 mg/L；同时加入一定量的铜溶液，使其浓度为10 mg/L；之后接入1 mL菌悬液，使投菌量为1 g/L（湿重）；同时设计空白组（不加菌）对照。所有样品包扎后置于25 ℃，150 r/min避光培养，反应2 d后取样，测定溶液中残留磺胺甲嘧啶和铜的浓度。菌悬液制备、磺胺甲嘧啶及铜测定的方法如实施例3中所述。
结果表明，磺胺甲嘧啶初始浓度对其降解影响明显，在投菌量为1 g/L时，菌A5对1mg/L的磺胺甲嘧啶降解效果最好，之后随浓度增大越不利磺胺甲嘧啶降解。但是磺胺甲嘧啶初始浓度的变化对于复合污染中铜的去除影响不显著，可以保持45%左右的去除率。
实施例5 溶液pH对菌A5降解/吸附磺胺甲嘧啶/铜复合污染的影响
在高压灭菌的无机盐培养基中加入一定量的磺胺甲嘧啶作为唯一碳源，使其浓度为1mg/L；加入一定量的铜溶液，使其浓度为10 mg/L；调节溶液pH，使体系pH分别为酸性（1~3）、弱酸性（5~6）、中性（7）、弱碱性（9~10）和碱性（12~14）。之后接入一定量的菌悬液，使投菌量为1 g/L（湿重）；同时设计空白组（不加菌）对照。所有样品包扎后置于25 ℃，150 r/min避光培养，反应2 d后取样，测定溶液中磺胺甲嘧啶和铜的残余浓度。菌悬液制备、磺胺甲嘧啶和铜测定的方法如实施例3中所述。
结果如图6所示，酸性条件下不利于磺胺甲嘧啶和铜的去除。对于重金属铜的去除，最佳的溶液pH值为中性（pH 7），之后，随着pH的升高去除率降低；而中性到碱性pH范围内，对磺胺甲嘧啶降解的影响不明显。
实施例6 酵母菌A5对含磺胺类抗生素/重金属铜复合污染废水的处理
在含有多种磺胺类抗生素（磺胺甲嘧啶、磺胺甲噁唑和磺胺嘧啶）和重金属铜的水体中加入菌A5菌悬液，投菌量为1 g/L（湿重），设计空白组（不加菌）对照。置于25 ℃，150 r/min避光反应2 d后取样，测定溶液中残留磺胺甲嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺嘧啶和铜的浓度。菌悬液制备、磺胺甲嘧啶及铜测定的方法如实施例3中所述。
实验结果表明，菌A5对3种磺胺类抗生素均具有良好降解效果，其中对磺胺甲嘧啶的降解去除效果最好。同时对铜也有不错的吸附效果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一株磺胺类抗生素/重金属复合污染降解/吸附菌，其特征在于，为酵母菌(Sakaguchia cladiensis) A5菌株，该菌株已于2018年1月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC NO：60319。
2.酵母菌(Sakaguchia cladiensis)在降解处理磺胺类抗生素污染和/或吸附重金属方面的应用。
3.酵母菌(Sakaguchia cladiensis)在治理受磺胺类抗生素/重金属铜复合污染的水环境和土壤方面的应用。
4.根据权利要求2或3所述应用，其特征在于，所述酵母菌为权利要求1所述酵母菌A5菌株。
5.根据权利要求2或3所述应用，其特征在于，所述磺胺类抗生素为磺胺甲嘧啶、磺胺甲噁唑和/或磺胺嘧啶，所述重金属为铜。
6.一种磺胺类抗生素/重金属铜复合污染降解/吸附菌生物菌剂，其特征在于，含有酵母菌(Sakaguchia cladiensis)。
7.根据权利要求6所述菌剂，其特征在于，所述酵母菌为权利要求1所述酵母菌A5菌株。
8.根据权利要求7所述菌剂，其特征在于，所述降解菌剂为酵母菌A5菌株的菌悬液。
9.根据权利要求7所述菌剂，其特征在于，是酵母菌A5菌株活化培养后制备而成。
10.根据权利要求8所述菌剂，其特征在于，所述菌悬液的制备方法为：将斜面保存的酵母菌A5接种到液体LB培养基或酵母培养基中，恒温振荡培养制得活化种子液；然后将种子液接种到新鲜培养基，继续扩大培养后，离心弃上清液收集菌体，无菌水重悬得菌悬液。
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