CN103343100A - 一株降解农药氯嘧磺隆和多菌灵的细菌及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株降解农药氯嘧磺隆和多菌灵的细菌及其用途。该降解农药氯嘧磺隆和多菌灵的细菌是根瘤菌(Rhizobium sp.)LD1616，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.7775。本发明提供的根瘤菌(Rhizobium sp.)LD1616CGMCC No.7775在无机盐培养基中7d对氯嘧磺隆（45mg/L）的降解率达到71.56%；5d对多菌灵（100mg/L）的降解率达到24.92%，这表明该菌株能够高效降解氯嘧磺隆和多菌灵，在修复土壤残留农药氯嘧磺隆和多菌灵污染方面具有广阔的应用前景。

Description

一株降解农药氯嘧磺隆和多菌灵的细菌及其用途
技术领域
本发明涉及一株降解农药氯嘧磺隆和多菌灵的细菌及其用途。
背景技术
氯嘧磺隆，英文通用名称chlorimuron-ethyl，化学名称2-(4-氯-6-甲氧基嘧啶-2-基氨基甲酰氨基磺酰基)苯甲酸甲酯，结构式如式1所示：
Figure BDA00003444115000011
式1。
氯嘧磺隆是超高效的磺酰脲类除草剂，作用靶标为植物体内的ALS(乙酰乳酸合成酶)，抑制支链氨基酸缬氨酸、异亮氨酸的生物合成，导致底物α-丁酮积累，阻碍细胞分裂间期DNA合成，使有丝分裂停止，细胞不能正常生长。氯嘧磺隆可被植物的根、茎、叶吸收，在植物体内进行上下传导，是选择性芽前、芽后除草剂，主要用于大豆等农田，防除阔叶杂草和某些莎草科及禾本科杂草。
多菌灵（carbendazim）化学名称N-(2-苯骈咪唑基)-氨基甲酸甲酯，英文名称methyl benzimidazol-2-ylcarbamate。分子式为C9H9N3O2，结构式如式2所示：
Figure BDA00003444115000012
式2。
多菌灵能干扰核酸合成和细胞有丝分裂过程，对多种作物真菌病害有防治效果，是目前农业上防治植物病害的主要杀菌剂，使用范围非常广，用于水稻、花生、棉花、烟草、甜菜、以及多种蔬菜，可防治瓜类白粉病、西红柿早疫病、豆类炭疽病、疫病、油菜菌核病、大葱、韭菜灰霉病、茄子、黄瓜菌核病，瓜类、菜豆炭疽病、豌豆白粉病等，对控制花生旺长也有一定作用。
除草剂、杀菌剂的大量使用，防止了病虫草害，提高了农业生产效率，但也带来了一些农业生产和环境污染等生态问题。研究表明，除草剂、杀菌剂等农药可以在土壤中残留数年，甚至数十年，对土壤微生物有抑制作用，对鱼类有较强的毒性，对环境污染很大。多菌灵能引起人肝病，导致染色体畸变的作用，存在潜在的致癌、致畸、致突变作用，对哺乳动物毒害作用很大。
农药残留主要靠土壤中的微生物来降解，但自然降解过程十分缓慢。因此，有针对性地筛选高效降解菌株，研制微生物修复剂，通过人工接种加速土壤中除草剂、杀菌剂的降解，消除残留药害是一项十分必要的工作和切实可行的途径。
发明内容
本发明的目的是提供一株可以高效降解农药氯嘧磺隆和多菌灵的细菌。
本发明所提供的细菌是根瘤菌(Rhizobium sp.)LD1616，该菌株已于2013年6月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为CGMCC No.7775。
本发明的另一个目的是提供一种菌剂，该菌剂的活性成分为所述的根瘤菌(Rhizobium sp.)LD1616CGMCC No.7775。
所述菌剂为下述1）或2）所述菌剂：
1）用于降解农药氯嘧磺隆和/或多菌灵的菌剂；
2）用于修复土壤残留农药氯嘧磺隆和/或多菌灵污染的菌剂。
所述菌剂还可包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物为聚乙烯醇和/或聚二醇。所述液体载体为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂为癸烷和/或十二烷。所述菌剂中，所述活性成分可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述组合物的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。
根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂（如吐温20、吐温80等）、粘合剂、稳定剂（如抗氧化剂）、pH调节剂等。
所述的根瘤菌(Rhizobium sp.)LD1616CGMCC No.7775或以根瘤菌(Rhizobium sp.)LD1616CGMCC No.7775为活性成分的菌剂在降解农药氯嘧磺隆和/或多菌灵中的应用也属于本发明的保护范围。
所述的根瘤菌(Rhizobium sp.)LD1616CGMCC No.7775或以根瘤菌(Rhizobium sp.)LD1616CGMCC No.7775为活性成分的菌剂在修复土壤残留农药氯嘧磺隆和/或多菌灵污染中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明的再一个目的是提供一种培养根瘤菌(Rhizobium sp.)LD1616CGMCCNo.7775的方法，该方法包括将根瘤菌(Rhizobium sp.)LD1616CGMCC No.7775在用于培养根瘤菌的培养基中培养的步骤。
本发明的又一个目的是提供一种以根瘤菌(Rhizobium sp.)LD1616CGMCC No.7775为活性成分的菌剂的制备方法，包括如下步骤：将所述的根瘤菌(Rhizobium sp.)LD1616CGMCC No.7775作为活性成分，得到所述菌剂。
本发明是从长期受到农药氯嘧磺隆和多菌灵污染的农田采集土样，并从中分离、筛选得到的降解农药氯嘧磺隆和多菌灵的菌株根瘤菌(Rhizobium sp.)LD1616CGMCCNo.7775。实验证明，该菌株在无机盐培养基中7天对氯嘧磺隆（45mg/L）的降解率达到71.56%；5天对多菌灵（100mg/L）的降解率达到24.92%。这表明，该菌株能高效降解农药氯嘧磺隆和多菌灵，在修复土壤残留农药氯嘧磺隆和多菌灵污染方面具有广阔的应用前景。
保藏说明
菌种名称：根瘤菌
拉丁名：(Rhizobium sp.)
菌株编号：LD1616
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2013年6月20日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.7775
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的培养基如下：
富集培养液：K2HPO47g/L，KH2PO42g/L，MgSO4·7H2O0.1g/L，MnSO40.05g/L，FeSO40.05g/L，CaC120.003g/L，葡萄糖5g/L，用蒸馏水定容至1L，pH7.0；（氯嘧磺隆和多菌灵用量按照下文实施例1添加）。
分离培养基：向富集培养液中加琼脂至其质量浓度为2％。
无机盐液体培养基：NH4Cl1.0g/L，KH2PO40.5g/L，K2HPO41.5g/L，MgSO40.2g/L，NaCl0.5g/L，用蒸馏水定容至1L，pH7.0。
无机盐固体培养基：向无机盐液体培养基中加琼脂至其质量浓度为2％。
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，琼脂20g/L，用蒸馏水定容至1L，pH7.2。
实施例1、根瘤菌(Rhizobium sp.)LD1616CGMCC No.7775的分离与鉴定
一、农药降解菌LD1616的分离
在100mL含氯嘧磺隆20mg/L的富集培养液中加入10g土壤样品（采自中国北京市受到除草剂乙草胺污染的农田），28℃、180r/min振荡培养7d富集氯嘧磺隆降解菌。第一轮富集结束后，吸取10mL富集液转移至含氯嘧磺隆40mg/L的100mL富集培养液中，继续培养7d进行第二轮富集。如此连续富集、培养5次，氯嘧磺隆浓度依次为20、40、60、80和100mg/L。
降解菌的筛选采用平板透明圈法。将氯嘧磺隆加入无机盐固体培养基制成平板，终浓度为1000mg/L。将平板均分为四个区，每区标记不同样品（富集液）编号，取富集液15μL点种到编号区域，28℃培养、观察。将有透明圈出现的样品（富集液）用无菌水倍比稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5梯度，取10-3、10-4、10-5梯度各100μL至上述含氯嘧磺隆1000mg/L的无机盐固体培养基，每个梯度3个重复，涂布均匀。28℃培养、观察，待平板上出现单菌落后，挑取有透明圈的单菌落转接至牛肉膏蛋白胨培养基上，25℃培养，纯化，备用。
经过大量的富集培养，分离到能够在含氯嘧磺隆1000mg/L的无机盐固体培养基上形成透明圈的菌株60余株。进一步筛选后，获得一个编号为LD1616的菌株，命名为农药降解菌LD1616，该菌株能够在纯培养条件下，将初始浓度45mg/L的氯嘧磺隆在7d内降解71.56%；而且还能降解杀菌剂多菌灵，5d对初始浓度100mg/L多菌灵的降解率达到24.92%。
二、农药降解菌LD1616的鉴定
从以下几个方面鉴定步骤一分离并纯化得到的农药降解菌LD1616：
1、形态学鉴定
将处于对数生长期，且菌落大小稳定，上述步骤一分离并纯化得到的农药降解菌LD1616进行单菌落状态观察，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、湿润度、菌落表面状态（是否平坦、突起、褶皱、凹陷等）、菌落边缘状态（是否整齐、不规则、放射状等）。
对于处于对数生长期的所述农药降解菌LD1616，经涂片染色后采用光学显微镜观察菌体的形态。
结果表明，上述步骤一分离并纯化得到的农药降解菌LD1616菌落圆形凸起、淡黄色、表面光滑湿润、边缘整齐；菌体短杆状，革兰氏染色阴性。
2、生理生化特征分析
参考《常见细菌系统鉴定手册》（东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册.北京:科学出版社，2011.）和《微生物学实验》（沈萍,范秀容,李广武.微生物学实验(第三版).北京:高等教育出版社,1999.）测定上述农药降解菌LD1616的生理生化特征。
所述农药降解菌LD1616的生理生化特征测定结果如表1所示：
表1农药降解菌LD1616的生理生化特征
Figure BDA00003444115000051
注：“＋”表示阳性，“－”表示阴性。
3、16s rDNA序列同源性分析
常规方法培养上述步骤一分离纯化得到的农药降解菌LD1616，提取菌株的总DNA作为基因扩增模板，以细菌16s rDNA通用引物，27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492r：5′-TACCTTGTTACGACTT-3′进行PCR反应。反应体系采用上海生物工程有限公司PCR扩增试剂盒。反应程序为：95℃变性30s、55℃退火1min、72℃延伸2min，共30个循环。DNA测序由北京三博远志生物技术公司完成，序列拼接及相似性分析使用DNAStar软件完成，基因比对通过美国国家生物技术信息中心NCBI数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）和EzTaxon在线完成。
PCR基因扩增得到农药降解菌LD1616的16S rDNA基因片段约1.5kb，测定序列后与NCBI和EzTaxon数据库中已公开的16S rDNA序列进行在线同源性比对，结果显示LD1616与放射杆状根瘤菌Rhizobium radiobacter ATCC19358T（GenBank登录号AJ389904）的同源性最高，达到99.926%。
农药降解菌LD1616的16s rDNA序列详见序列表中序列1。
4、生长特性分析
进行了农药降解菌LD1616最适温度和最适pH生长实验。采用无机盐液体培养基，分别在4℃、28℃、37℃、60℃培养、观察、记录菌株的温度适应性，每个处理3次重复。调整pH分别为4、5、6、7、8、9、10，每个处理3次重复，培养、观察、记录菌株生长的最适pH。
结果表明，所述农药降解菌LD1616的最适生长温度为28℃，最适生长pH为pH7～8。
鉴于上述形态、生理生化特征分析和16s rDNA序列同源性分析结果，将步骤一分离纯化得到的农药降解菌LD1616鉴定为变型细菌α亚群根瘤菌科（Rhizobiaceae）根瘤菌属(Rhizobium sp.)。该农药降解菌LD1616已于2013年6月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为CGMCC No.7775。
实施例2、根瘤菌(Rhizobium sp.)LD1616CGMCC No.7775降解农药氯嘧磺隆和多菌灵能力定量测定
一、氯嘧磺隆测定标准曲线制作
用甲醇将氯嘧磺隆标准品（购自Fluka公司）配制成系列浓度10、20、40、60、80、100mg/L标准溶液，采用高效液相色谱（HPLC）测定不同浓度氯嘧磺隆标准品的峰面积，3次重复。以氯嘧磺隆的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制氯嘧磺隆标准曲线。
检测条件如下：
检测系统：Agilent1100Series。色谱柱：C18DiamosilTM反相柱，250mm×4.6mm，粒径5μm。色谱条件：流动相：乙腈：甲醇：水：冰乙酸=45:15:40:0.1（v/v）；检测波长，236nm；流速，1.0mL/min；进样体积，10μL；柱温30℃。
测定结果如表2所示：
表2不同浓度氯嘧磺隆HPLC测定峰面积
Figure BDA00003444115000061
根据表2数据，得到氯嘧磺隆测定标准曲线：y=33.717x-20.032(R2=0.9950)。其中，y为峰面积，x为氯嘧磺隆浓度。
二、多菌灵测定标准曲线制作
用多菌灵标准品（购自Sigma公司）配制系列标准悬液，根据多菌灵在281nm处有最大吸收峰这一特点，通过紫外分光光度法测定OD281，进而绘制多菌灵测定标准曲线，不同浓度多菌灵的OD281测定结果如表3所示：
表3不同浓度多菌灵的OD281值
Figure BDA00003444115000071
根据表3数据，多菌灵测定标准曲线方程为y=0.076x+0.006（R2=0.999）。其中，y为峰面积，x为多菌灵浓度。
三、根瘤菌(Rhizobium sp.)LD1616CGMCC No.7775降解氯嘧磺隆能力定量测定
在试管中准确加入5mL含氯嘧磺隆约50mg/L的无机盐培养基（向无机盐液体培养基中加入氯嘧磺隆使氯嘧磺隆的浓度为约50mg/L得到的培养基），再加入0.2ml的OD600nm值为1.0的根瘤菌(Rhizobium sp.)LD1616CGMCC No.7775菌液（1×109cfu/ml），28℃、180r/min培养7天，取4mL降解液至50mL离心管中，加入4mL二氯甲烷，振荡2min，静置10min，加入少许无水硫酸钠。准确吸取500μL有机相转移至1.5mL EP离心管中，在氮吹仪上吹干，加入500μL甲醇（色谱级），在超声波清洗仪上溶解10min，用液谱过滤器过滤收集至样品瓶中，按照上述HPLC法测定氯嘧磺隆。同时，以没有接入根瘤菌(Rhizobium sp.)LD1616CGMCC No.7775的上述含氯嘧磺隆约50mg/L的无机盐培养基作为空白对照，按照上述方法测定氯嘧磺隆的浓度。氯嘧磺隆降解率：X=(1-A/B)×100%，式中X为降解率(%)，A为接菌处理液中残留的氯嘧磺隆浓度，B为未接菌空白对照处理液中残留的氯嘧磺隆浓度。实验设3次重复，每次重复每个处理接种1个试管。
结果显示，氯嘧磺隆初始浓度为45.05mg/L，7天后根瘤菌(Rhizobium sp.)LD1616CGMCC No.7775对氯嘧磺隆的降解率达到71.56%（如表4所示）。这一结果表明，本发明所提供的根瘤菌(Rhizobium sp.)LD1616CGMCC No.7775可高效降解氯嘧磺隆。
表4根瘤菌(Rhizobium sp.)LD1616CGMCC No.7775降解氯嘧磺隆功效
Figure BDA00003444115000072
四、根瘤菌(Rhizobium sp.)LD1616CGMCC No.7775降解多菌灵能力定量测定
在装有50ml无机盐液体培养基的三角瓶（容积为250ml）中加入多菌灵使多菌灵的终浓度为100mg/L，接种2ml OD600nm值为1.0的根瘤菌(Rhizobium sp.)LD1616CGMCCNo.7775菌液（1×109cfu/ml），同时以含多菌灵100mg/L，但未接种根瘤菌(Rhizobiumsp.)LD1616CGMCC No.7775的无机盐液体培养基作为空白对照。于25℃，200r／min摇床培养，5天后取样根据步骤二绘制的多菌灵测定标准曲线按照步骤二的方法来测定多菌灵残留量。多菌灵降解率：X=(1-A/B)×100%，式中X为降解率(%)，A为接菌处理液中残留的多菌灵浓度，B为未接菌空白对照处理液中残留的多菌灵浓度。实验设3次重复，每次重复每个处理接种1个三角瓶。
结果显示，多菌灵初始浓度为99.61mg/L，5天后所述根瘤菌(Rhizobium sp.)LD1616CGMCC No.7775对多菌灵降解率达24.92%（如表5所示）。这一结果表明，本发明所提供的根瘤菌(Rhizobium sp.)LD1616CGMCC No.7775可高效降解多菌灵。
表5根瘤菌(Rhizobium sp.)LD1616CGMCC No.7775降解多菌灵功效
Figure BDA00003444115000082
Figure IDA00003444115900011
Figure IDA00003444115900021

Claims (7)

1.根瘤菌(Rhizobium sp.)LD1616，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.7775。
2.一种菌剂，其特征在于：所述菌剂的活性成分为权利要求1所述的根瘤菌(Rhizobium sp.)LD1616CGMCC No.7775。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂为下述1）或2）所述菌剂：
1）用于降解氯嘧磺隆和/或多菌灵的菌剂；
2）用于修复土壤氯嘧磺隆和/或多菌灵污染的菌剂。
4.权利要求1所述的根瘤菌(Rhizobium sp.)LD1616CGMCC No.7775、或权利要求2或3所述的菌剂在降解氯嘧磺隆和/或多菌灵中的应用。
5.权利要求1所述的根瘤菌(Rhizobium sp.)LD1616CGMCC No.7775、或权利要求2或3所述的菌剂在修复土壤氯嘧磺隆和/或多菌灵污染中的应用。
6.培养权利要求1所述根瘤菌(Rhizobium sp.)LD1616CGMCC No.7775的方法，包括将所述根瘤菌(Rhizobium sp.)LD1616CGMCC No.7775在用于培养根瘤菌的培养基中培养的步骤。
7.权利要求2或3所述菌剂的制备方法，包括如下步骤：将权利要求1所述的根瘤菌(Rhizobium sp.)LD1616CGMCC No.7775作为活性成分，得到所述菌剂。
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