CN104498393A - 一株降解除草剂普施特的细菌及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株降解除草剂普施特的细菌及其用途。该降解普施特和乙草胺的细菌是中间根瘤菌(Mesorhizobium sp.)198-R-31，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.9865。本发明提供的中间根瘤菌(Mesorhizobium sp.)198-R-31 CGMCC No.9865在无机盐培养基中7天对100mg/L普施特的降解率达到84.62％。这表明该菌株能够降解普施特，在修复土壤普施特污染方面具有广阔的应用前景。

Description

一株降解除草剂普施特的细菌及其用途
技术领域
本发明涉及微生物领域中一株降解除草剂普施特的细菌及其用途。
背景技术
普施特，又名咪草烟，英文名称Pursuit(imazethapyr-ammonium)，化学名称(RS)-5-乙基-2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)烟酸。化学结构如式1所示：
普施特是咪唑啉酮类除草剂，是侧链氨基酸合成抑制剂，芽前或芽后均可施用，对大豆和其他豆科植物农田的禾本科杂草和某些阔叶杂草如苋菜、蓼、藜、龙葵、苍耳、稗草、狗尾草、马唐、黍等有优异的防治效果。
普施特为长残效除草剂，优点是除草效果好、杀草谱宽、用药量少、使用方便、用药成本低，但它们在土壤中残留时间长，一般可达2－3年，在连作或轮作农田中使用极易造成后茬作物药害、减产、甚至绝产，并严重影响了农业种植业结构的调整。长残效除草剂使后茬作物受药害减产、绝产事件时有发生。主要表现为：一是在黑龙江、吉林、内蒙古一些地方把大豆田改为水田，种植水稻受害严重，甚至绝产。二是除草剂施后3－4年仍有药害，导致甜菜种植业下滑。三是经济作物发展受影响，白瓜籽、向日葵、马铃薯、亚麻和蔬菜等受到伤害，严重者基地受毁。内蒙古东北部几年前就想调整种植业结构，因小麦、大豆田多年使用长残效除草剂使种植马铃薯、亚麻、白瓜子、芸豆等经济作物未能实现，严重制约了本地经济发展。四是玉米、高粱、谷子等作物受害，矮化减产或绝产。
自然界除草剂残留的降解主要依靠土壤中微生物来完成，但自然降解十分缓慢。因此，有针对性地筛选高效微生物菌株，研制微生物修复剂，通过人工接种加速土壤长残效除草剂的降解、消除农田除草剂残留药害是一项十分必要的工作和切实可行的途径。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何降解除草剂普施特。
为解决上述技术问题，本发明提供了一株可以降解除草剂普施特的细菌。
本发明提供的细菌是中间根瘤菌(Mesorhizobium sp.)198-R-31，该菌株已于2014年10月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.9865。
本发明的另一个目的是提供一种菌剂，该菌剂的活性成分为所述的中间根瘤菌(Mesorhizobium sp.)198-R-31 CGMCC No.9865。
上述菌剂可为下述1)或2)所述菌剂：
1)用于降解除草剂普施特的菌剂；
2)用于修复土壤除草剂普施特污染的菌剂。
所述菌剂还可以包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇和/或聚二醇。所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂可为癸烷和/或十二烷。所述菌剂中，所述活性成分可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述组合物的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。
根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。
所述的中间根瘤菌(Mesorhizobium sp.)198-R-31 CGMCC No.9865或以中间根瘤菌(Mesorhizobium sp.)198-R-31 CGMCC No.9865为活性成分的菌剂在降解除草剂普施特中的应用也属于本发明的保护范围。
所述的中间根瘤菌(Mesorhizobium sp.)198-R-31 CGMCC No.9865或以中间根瘤菌(Mesorhizobium sp.)198-R-31 CGMCC No.9865为活性成分的菌剂在修复土壤除草剂普施特污染中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明的再一个目的是提供一种培养中间根瘤菌(Mesorhizobium sp.)198-R-31CGMCC No.9865的方法。
本发明所提供的培养中间根瘤菌(Mesorhizobium sp.)198-R-31 CGMCC No.9865的方法包括将中间根瘤菌(Mesorhizobium sp.)198-R-31 CGMCC No.9865在用于培养中间根瘤菌的培养基中培养的步骤。
本发明的又一个目的是提供一种以中间根瘤菌(Mesorhizobium sp.)198-R-31CGMCC No.9865为活性成分的菌剂的制备方法。
本发明所提供上述菌剂的制备方法，包括如下步骤：将所述的中间根瘤菌(Mesorhizobium sp.)198-R-31 CGMCC No.9865作为活性成分，得到所述菌剂。
本发明是从长期受到除草剂普施特污染的农田采集土样，并从中分离筛选得到的除草剂普施特降解菌中间根瘤菌(Mesorhizobium sp.)198-R-31 CGMCC No.9865。实验证明，该菌株在无机盐培养基中7天对100mg/L普施特的降解率达到84.62％。这表明该菌株能降解除草剂普施特，在修复土壤除草剂普施特污染方面具有广阔的应用前景。
保藏说明
菌种名称：中间根瘤菌
拉丁名：(Mesorhizobium sp.)
菌株编号：198-R-31
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2014年10月28日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.9865
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的培养基如下：
无氮液体培养基：溶质及其浓度为蔗糖10g/L，NaCl 0.12g/L，K2HPO4·3H2O 0.5g/L，CaCO31g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L；溶剂为蒸馏水；pH7.2。
无氮固体培养基：向无氮液体培养基中加琼脂至其含量为15-20g/L得到的培养基。
牛肉膏蛋白胨液体培养基：溶质及其浓度为牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl5g/L；溶剂为蒸馏水；pH7.2。
牛肉膏蛋白胨固体培养基：溶质及其浓度为牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl5g/L、琼脂15-20g/L；溶剂为蒸馏水；pH7.2。
无机盐液体培养基：溶质及其浓度为NH4Cl 1.0g/L，KH2PO40.5g/L，K2HPO41.5g/L，MgSO40.2g/L，NaCl 0.5g/L；溶剂为蒸馏水；pH7.2。
无机盐固体培养基：向无机盐液体培养基中加琼脂至其含量为2％得到的培养基。
实施例1、中间根瘤菌(Mesorhizobium sp.)198-R-31 CGMCC No.9865的分离与鉴定
一、普施特降解菌198-R-31的分离
1、在100ml无菌水中加入10g土壤样品(采自中国黑龙江黑河受除草剂污染的农田)振荡培养30min制成混浊液。吸取1ml上述混浊液加入盛有9ml无菌水中的试管中充分混匀(此时稀释度记为10-1)，然后从此试管中吸取1ml加入到另一盛有9ml无菌水的试管中混合均匀，以此类推制成10-2、10-3、10-4、10-5不同稀释度的菌悬液。将各稀释度取0.1ml均匀涂布在无氮固体培养基平板上，28℃恒温静置培养2—3天。待菌落形成后，在无氮固体培养基平板上进行菌种纯化。
2、对除草剂普施特、乙草胺、氯嘧磺隆和杂草焚降解能力的初步筛选采用平板透明圈法。将普施特标准品(Fluka公司产品)加入无机盐固体培养基使其含量为1000mg/L，得到普施特平板；将乙草胺标准品(Fluka公司产品)加入无机盐固体培养基使其含量为1000mg/L，得到乙草胺平板；将氯嘧磺隆标准品(Fluka公司产品)加入无机盐固体培养基使其含量为1000mg/L，得到氯嘧磺隆平板；将杂草焚标准品(Fluka公司产品)加入无机盐固体培养基使其含量为1000mg/L，得到杂草焚平板。将普施特平板、乙草胺平板、氯嘧磺隆平板和杂草焚平板进行分区，吸取步骤1纯化得到的每株菌的菌悬液10μL(各种菌株菌悬液的菌体含量相同)分别点种到四种平板上(每株菌在一个平板上重复3次)，28℃培养、观察。筛选到一株在普施特平板上能形成较大透明圈的菌株，将其命名为普施特降解菌198-R-31。普施特降解菌198-R-31在乙草胺平板、氯嘧磺隆平板和杂草焚平板上均不能形成透明圈。说明普施特降解菌198-R-31能降解普施特，不能降解乙草胺、氯嘧磺隆和杂草焚。
表1.普施特降解菌198-R-31对四种除草剂降解能力初筛结果
菌株编号 普施特 乙草胺 氯嘧磺隆 杂草焚
普施特降解菌198-R-31 + － － －
注：“+”表示形成较大透明圈，“－”表示无透明圈形成。
二、普施特降解菌198-R-31的鉴定
从以下几个方面鉴定步骤一分离并纯化得到的普施特降解菌198-R-31：
1、形态学鉴定
将处于对数生长期且菌落大小稳定，上述步骤一分离并纯化得到的普施特降解菌198-R-31进行单菌落状态观察，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、湿润度、菌落表面状态(是否平坦、突起、褶皱、凹陷等)、菌落边缘状态(是否整齐、不规则、放射状等)。
结果表明，上述步骤一分离并纯化得到的普施特降解菌198-R-31菌落凸起、乳白色、粘稠、边缘规则；菌落小，直径0.4-0.9mm。
2、生理生化特征分析
参考《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册.北京:科学出版社，2011.)和《微生物学实验》(沈萍,范秀容,李广武.微生物学实验(第三版).北京:高等教育出版社,1999.)测定上述普施特降解菌198-R-31的生理生化特征。
所述普施特降解菌198-R-31的生理生化特征测定结果如表2所示：
表2.普施特降解菌198-R-31的生理生化特征
注：“+”表示阳性，“－”表示阴性。
3、16S rDNA序列同源性分析
常规方法培养上述步骤一分离纯化得到的普施特降解菌198-R-31，提取菌株的总DNA作为基因扩增模板，以细菌16SrDNA通用引物，27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492r：5′-TACCTTGTTACGACTT-3′进行PCR反应。反应体系采用上海生物工程有限公司PCR扩增试剂盒。反应程序为：95℃变性30s、55℃退火1min、72℃延伸2min，共30个循环。DNA测序由北京三博远志生物技术公司完成，序列拼接及相似性分析使用DNAStar软件完成，基因比对通过美国国家生物技术信息中心NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)和EzTaxon在线完成。
PCR基因扩增得到普施特降解菌198-R-31的16S rDNA基因片段约1.3kb，测定序列后与NCBI和EzTaxon数据库中已公开的16S rDNA序列进行在线同源性比对，结果显示普施特降解菌198-R-31与中间根瘤菌属Mesorhizobium amorphae(GenBank登录号AF041442)同源性最高，达到99.85％。
普施特降解菌198-R-31的16S rDNA序列详见序列1。
鉴于上述形态、生理生化特征分析和16S rDNA序列同源性分析结果，将步骤一分离纯化得到的普施特降解菌198-R-31鉴定为中间根瘤菌(Mesorhizobium sp.)。该普施特降解菌198-R-31已于2014年10月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.9865。普施特降解菌198-R-31的全称为中间根瘤菌(Mesorhizobiumsp.)198-R-31 CGMCC No.9865，简称为中间根瘤菌(Mesorhizobium sp.)198-R-31。
实施例2、中间根瘤菌(Mesorhizobium sp.)198-R-31 CGMCC No.9865降解普施特能力定量测定
一、普施特测定标准曲线的绘制
准确称取普施特标准品(Fluka公司产品)10.0mg于10mL容量瓶中，用少量甲醇溶解，将容量瓶放在超声波浴槽中振荡10min，然后用甲醇定容至10mL，摇匀，配成1000mg/L普施特母液。然后继续用甲醇稀释获得浓度分别为20、40、60、80、100mg/L的标准溶液。采用高效液相色谱(HPLC)测定不同浓度普施特标准品的峰面积，3次重复。以普施特浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制普施特标准曲线，如图1所示。
检测条件如下：
检测系统：Agilent 1100 Series。色谱柱：C18DiamosilTM反相柱，250mm×4.6mm，粒径5μm。色谱条件：流动相：乙腈：水(冰乙酸调pH3.0)＝40:60(v/v)；检测波长，258nm；流速，1.0mL/min；进样体积，10μL；柱温30℃
所得普施特测定标准曲线：y＝24.482x-6.6979(R2＝0.9998)。其中，y为峰面积，x为普施特浓度。
二、中间根瘤菌(Mesorhizobium sp.)198-R-31 CGMCC No.9865降解普施特能力定量测定
中间根瘤菌(Mesorhizobium sp.)198-R-31处理：将中间根瘤菌(Mesorhizobiumsp.)198-R-31 CGMCC No.9865接种在牛肉膏蛋白胨固体培养基上培养24h，挑取1环接种在5mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，180r/min培养12h，离心去掉培养基，用无机盐液体培养基调节到OD600值为1.0。吸取0.2mL菌悬液(1×109cfu/ml)接种到5mL含普施特100mg/L的无机盐液体培养基(向无机盐液体培养基中加入普施特(Fluka公司产品)使普施特的浓度为100mg/L得到的培养基)的试管中，28℃，180r/min培养7天，得到降解液。取4mL降解液至50mL离心管中，加入8mL二氯甲烷，振荡2min，静置10min，加入少许无水硫酸钠。准确吸取800μL有机相转移至1.5mL EP离心管中，在氮吹仪上吹干，加入400μL甲醇(色谱级)，在超声波清洗仪上溶解10min，用液谱过滤器过滤收集至样品瓶中，按照上述HPLC法测定普施特。
空白对照处理：同时，以未接种中间根瘤菌(Mesorhizobium sp.)198-R-31 CGMCCNo.9865的上述含普施特100mg/L的无机盐液体培养基作为空白对照，按照上述方法测定普施特的浓度。
普施特降解率：X＝(1-A/B)×100％，式中X为降解率(％)，A为中间根瘤菌(Mesorhizobium sp.)198-R-31处理液中残留的普施特浓度，B为未接菌空白对照处理液中残留的普施特浓度。实验设3次重复，每次重复每个处理接种10个试管。
表3.中间根瘤菌(Mesorhizobium sp.)198-R-31 CGMCC No.986降解普施特功效
结果显示，普施特初始浓度为100mg/L，7天后所述中间根瘤菌(Mesorhizobiumsp.)198-R-31 CGMCC No.9865对普施特的降解率达到84.62％(如表3所示)，这一结果表明，本发明所提供的中间根瘤菌(Mesorhizobium sp.)198-R-31 CGMCC No.9865可降解普施特。

Claims (7)

1.中间根瘤菌(Mesorhizobium sp.)198-R-31，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.9865。
2.一种菌剂，其特征在于：所述菌剂的活性成分为权利要求1所述的中间根瘤菌(Mesorhizobium sp.)198-R-31 CGMCC No.9865。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂为下述1)或2)所述菌剂：
1)用于降解普施特的菌剂；
2)用于修复土壤普施特污染的菌剂。
4.权利要求1所述的中间根瘤菌(Mesorhizobium sp.)198-R-31 CGMCC No.9865、或权利要求2或3所述的菌剂在降解普施特中的应用。
5.权利要求1所述的中间根瘤菌(Mesorhizobium sp.)198-R-31 CGMCC No.9865、或权利要求2或3所述的菌剂在修复土壤普施特污染中的应用。
6.培养权利要求1所述中间根瘤菌(Mesorhizobium sp.)198-R-31 CGMCC No.9865的方法，包括将所述中间根瘤菌(Mesorhizobium sp.)198-R-31 CGMCC No.9865在用于培养中间根瘤菌的培养基中培养的步骤。
7.权利要求2或3所述菌剂的制备方法，包括如下步骤：将权利要求1所述的中间根瘤菌(Mesorhizobium sp.)198-R-31 CGMCC No.9865作为活性成分，得到所述菌剂。
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