CN103074279A

CN103074279A - 一株类芽胞杆菌及其在降解微囊藻毒素中的应用

Info

Publication number: CN103074279A
Application number: CN2013100115000A
Authority: CN
Inventors: 虞龙; 钱梦宇; 李玉燕; 于洋
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2013-01-14
Filing date: 2013-01-14
Publication date: 2013-05-01
Anticipated expiration: 2033-01-14
Also published as: CN103074279B

Abstract

本发明公开了一株类芽胞杆菌（Paenibacillus sp.）PN-S435，保藏编号为CCTCC M2012422，能够将微囊藻毒素作为唯一碳源、氮源，可以高效降解微囊藻毒素。将原始出发菌株PV-3经低能氮离子注入-氯化锂复合诱变结合紫外线-氯化锂复合诱变后，初筛、复筛获得。本发明提供的菌株降解水体中MCs的能力可达到30.2mg/L.Day，相对于出发菌株提高了64.1%，该菌株可较大幅度提高降解水体中MCs的能力，经遗传稳定性试验证明其可应用于实际应用，治理水华爆发特别严重的水体，解除甚至避免藻毒素对饮用水安全构成的威胁。

Description

一株类芽胞杆菌及其在降解微囊藻毒素中的应用

技术领域

本发明涉及一株类芽胞杆菌及其在降解微囊藻毒素中的应用，属于环境微生物领域。

技术背景

由于环境污染，近年来水体富营养化程度日益加剧，蓝藻水华频繁爆发，所带来的最主要危害之一是某些蓝藻细胞产生并向水体中释放多种不同类型的藻毒素，其中微囊藻毒素(microcystins，MCs)是一类出现频率最高、产生量最大和造成危害最严重的藻毒素种类。它是以动物肝脏为作用靶器官的一类肝毒素，能够特异性地抑制蛋白磷酸酶活性进而诱发癌症等一系列病变，是世界各地广泛存在并且危害极大的一种蓝藻毒素。微囊藻是淡水水体中最常见的一类水华蓝藻,它所释放的微囊藻毒素(MCs)分布最广、危害最严重,对动物和人类健康构成潜在威胁。由于MCs具有环状化学结构,具有稳定性高、难降解的特点,因此在常规的水处理工艺中难以有效地去除。

MCs的基本结构是由7个氨基酸组成的环状多肽，由于多肽组成中氨基酸种类的变化，导致了MCs类型的多样性。

Figure 2013100115000100002DEST_PATH_IMAGE001

在迄今发现的70多种MCs的异构体中，微囊藻毒素-LR(MC-LR)、微囊藻毒素—RR（MC—RR）是存在广泛、毒性较强、含量较高的两种。从南京市水华爆发的水体中提取的MCs，MC-LR占67.6%，MC-RR占11.7%。因此，我们用MCs降解菌降解水样中藻毒素时，以测量这两种异构体的总减少量作为依据。其结构稳定，在300℃高温下还能维持很长时间不分解。传统的水处理工艺很难将MCs从水中去除，一般的多肽分解酶也不能将MCs分解，给饮用水安全造成了严重的威胁。为此，一些物理化学处理工艺已被尝试用以去除MCs，如活性碳吸附、TiO₂光催化氧化、臭氧氧化等等，但从技术、经济以及实际应用等方面的要求来看，目前尚无真正有效的手段去除水中的MCs。

微生物降解是一条可行的途径，国外已有很多对微囊藻毒素的微生物降解进行的研究，Jones等于1994年最先从澳大利亚马兰比季河中筛选出一株能够降解MCs的鞘氨醇单胞菌。天然水体和沉积物中均存在着能够降解MCs的微生物,目前已报道了一些能够降解MCs的特殊微生物菌种,如纯菌株青枯菌(Ralstonia solanacearum)、食酸戴尔福特菌(Delftia acidovorans)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aerugiosa)和鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)，虽然其中某些菌种的藻毒素降解量可高达50mg/L.Day，但是这些菌种对MCs的降解并不彻底，会产生其他中间降解产物，且经过室内实验，这些菌种不能以MCs作为唯一C源、N源，增加了应用到实际环境的难度。

因此，我们需要做大量工作在分离与筛选MCs降解菌方面，一方面筛选出能够适用于实际水体环境中的菌种，但是这些菌种即使通过驯化之后对藻毒素的降解量仍然较低，所以另一方面，我们将筛选出的MCs降解菌株进行诱变处理，以得到高效MCs降解突变菌株以应用于实际水体环境。大幅度提高MCs降解菌降解水体中MCs的能力，解除甚至避免藻毒素对饮用水安全构成的严重威胁，具有重大的应用价值和实际意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一株类芽胞杆菌，能够将微囊藻毒素作为唯一碳源、氮源，可以高效降解微囊藻毒素。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一株类芽胞杆菌（Paenibacillus sp.）PN-S435，已于2012年10 月 24 日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC M 2012422。

上述类芽胞杆菌（Paenibacillus sp.）PN-S435 的筛选方法是：将原始出发菌株PV-3经低能氮离子注入-氯化锂(N⁺- LiCl) 复合诱变结合紫外线-氯化锂 ( UV- LiCl)复合诱变后，通过藻毒素基础培养基初筛、微囊藻培养液降解复筛选获MCs降解能力较高的菌株作为下一轮诱变的出发菌株。重复上述筛选过程，最终筛选得到目标菌株类芽胞杆菌PN-S435，该菌株可大幅度提高微囊藻室内培养液中藻毒素的降解速率。

本发明筛选得到的类芽胞杆菌PN-S435的形态及生理生化特征如下：

细胞形态：杆状，粗而短。

菌落颜色：淡黄色（牛肉膏蛋白胨固体培养基）。

需氧方式：兼性厌氧。

菌落大小：1-2.5mm。

生长最适温度：25℃~28℃。

生长最适pH：7.2~7.5。

鞭毛：无。

菌体形态：圆形菌落，湿润，边缘整齐，表面光滑，质地均匀，容易挑起。

革兰氏颜色：阳性。

本技术发明所提供的类芽孢杆菌PN-S435的诱变方法，具体步骤如下：

1）孢子悬浮液制备：将出发菌株制成菌体悬液，调整孢子浓度约为10⁶个/毫升。

2）低能氮离子注入-氯化锂复合诱变：取0.1mL步骤1）的孢子悬液均匀涂布于无菌平皿上，无菌风吹干，镜检无细胞重叠后进行氮离子注入。在10~18KeV、注入剂量为40×10¹⁴ ~240×10¹⁴ions/cm²下对MCs降解菌进行离子注入。靶室内放置不接受氮离子注入的对照样。离子注入完毕后，取出平皿，在无菌环境下用1mL无菌水洗脱，涂布到氯化锂平板培养基上，在26~30℃下倒置培养6~7d。

3）紫外线-氯化锂复合诱变：取5mL步骤1）中孢子悬液移入含有磁力转子的无菌平板中，进行紫外线照射诱变，照射时间为30~90s，诱变结束后取菌悬液涂布于氯化锂平板培养基上，在25~28℃下避光倒置培养6~7d。

4）诱变菌株的筛选：

初筛：将步骤2)和步骤3)诱变得到的单菌落接种至斜面培养基上，培养5天后，取出50%制成菌体悬液接种于MCs培养基，培养3~5d后，取菌落出现较早、菌落较大的菌株，留取50%的高效降解菌株上室内微囊藻培养液复筛。

复筛：将初筛筛选到的单菌落接至斜面培养基在25~28℃条件下培养2~3d；将斜面培养物接入微囊藻室内培养液中，放入光照培养箱中，培养温度28-33℃，2-3d后测定藻液中MCs的降解量，筛出降解量最高的菌株作为下一轮诱变筛选的出发菌株。

重复步骤1)~4)，直至筛选出微囊藻毒素降解量高的目标菌株类芽胞杆菌PN-S435。

步骤2)中低能氮离子注入，优选诱变能量为16KeV，诱变剂量为160×10¹⁴ions/cm²。

步骤3)中紫外线诱变，优选照射时间为60s。

本发明所采用的培养基配方（%为质量百分比）及制备方法如下：

平板/斜面培养基配方：碳源0.5%~1%、氮源1%~1.5%、无机盐0.1%~0.5%、琼脂1%~2%、其余为蒸馏水，pH 7.2~7.5；其中所述碳源为葡萄糖、淀粉和糖蜜中的一种或几种的混合；所述氮源为蛋白胨、酵母膏和牛肉膏中的一种或两种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、铁盐中的一种或几种的混合。

氯化锂平板培养基配方：碳源0.5%~1%、氮源1%~1.5%、无机盐0.1%~0.5%、琼脂1.0%~2.0%、氯化锂1.0moL·L^-1、其余为蒸馏水，pH 7.2~7.5；其中所述碳源为葡萄糖、淀粉和糖蜜中的一种或几种的混合；所述氮源为蛋白胨、酵母膏和牛肉膏中的一种或两种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、铁盐中的一种或几种的混合。

MCs培养基：MCs 1%~2%、无机盐0.1%~0.5%，琼脂1.0%~2.0%，其余为水，pH 7.2~7.5；其中所述的MCs作为唯一的C源以及N源；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、磷酸盐中的一种或几种的混合。

微囊藻室内培养液是铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa PCC 7806）接种于BG-11培养基，接种量为5~15%(v/v)，放入光照培养箱（培养温度为28~33℃，光照强度为4000lx，光暗比为12h:12h）培养10d后的室内藻液培养液，以模拟水华爆发的水体自然环境。其中BG-11培养基配方参见文献（《4种不同培养基下铜绿微囊藻和四尾栅藻生长比较》，胡小贞等）配置。

本技术发明所提供的类芽孢杆菌PN-S435培养方法包括如下步骤：

（1）平板/斜面培养：将类芽胞杆菌PN-S435接种至平板或者斜面培养基上培养，培养温度为25~28℃，培养时间为3~4d；

（2）扩大培养：将步骤1）中培养的类芽胞杆菌PN-S435接种至发酵培养基中培养，培养温度为25~28℃，培养时间3~4d；

本发明所提供的类芽孢杆菌PN-S435在降解微囊藻毒素中的应用，具体步骤如下：

1)、平板/斜面培养：将类芽胞杆菌PN-S435接种至平板或者斜面培养基上培养，培养温度为25~28℃，培养时间为3~4d；

2)、扩大培养：将步骤1）培养的类芽胞杆菌PN-S435接种至液体发酵培养基进行扩大培养，培养温度为25~28℃，培养时间3~4d；

3)、降解应用：将步骤1)中培养的类芽胞杆菌PN-S435制成菌悬液或者将步骤2）发酵培养的类芽胞杆菌PN-S435进行离心，洗涤，收集湿菌体，投入到含微囊藻毒素的水体中进行降解。

所述菌悬液的浓度为：10¹⁸个/ml ~10²⁰个/ml。

其中：平板/斜面培养基：碳源0.5%~1%、氮源1%~1.5%、无机盐0.1%~0.5%、琼脂1%~2%、其余为蒸馏水，pH 7.2~7.5；其中所述碳源为葡萄糖、淀粉和糖蜜中的一种或几种的混合；所述氮源为蛋白胨、酵母膏和牛肉膏中的一种或两种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、铁盐中的一种或几种的混合。

发酵培养基：MCs 1%~2%、无机盐0.1%~0.5%，其余为水，pH 7.2~7.5；其中所述的MCs作为唯一的C源以及N源；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、磷酸盐中的一种或几种的混合。

有益效果：本发明采用物理化学复合诱变方法诱变出发菌株类芽胞杆菌（Paenibacillus sp.）PV-3，得到MCs降解率高的类芽胞杆菌PN-S435。该菌株是对环境比较友好的菌种，能够将微囊藻毒素作为唯一碳源、氮源，可以直接加入藻类培养基中或者自然水体中进行降解作用，与自然条件较为接近。该菌株可在自然水体中降解MCs，大幅度提高水体中MCs的降解速率，能够及时治理水华爆发特别严重的水体，能够解除甚至避免藻毒素对饮用水安全构成的严重威胁，且遗传稳定性好。本发明完全符合实际应用需要，为水源水的生物预处理技术提供高效降解MCs的工程菌，具有重大的社会意义和经济价值。

微囊藻室内培养液加入类芽胞杆菌PN-S435菌悬液之后，24h之后水体中藻毒素含量由原来的80.3mg/L下降为53.5mg/L，48h之后下降为20.9 mg/L，72h之后MCs含量几乎为零，且不产生其他中间产物。在野外，PN-S435湿菌体投入后，24h后藻毒素含量由原先得116.2下降为92.7mg/L，48h之后下降为58.6mg/L，72h后下降为24.5mg/L。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1

本实施例说明类芽孢杆菌PN-S435的诱变筛选方法。

诱变过程所用到的培养基如下：

平板/斜面培养基：葡萄糖0.5%，牛肉膏0.5%，胰蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%，MgSO₄ 0.05%，NaCl 0.2%，K₂HPO₄0.02%，琼脂1.2%，其余为蒸馏水，pH 7.4。

氯化锂平板培养基：葡萄糖0.5%，牛肉膏0.5%，胰蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%， MgSO₄ 0.05%，NaCl 0.2%，K₂HPO₄0.02%，琼脂1.2%，氯化锂1.0moL·L^-1，其余为蒸馏水，pH 7.4。

MCs培养基：MCs 1.8%，MgSO₄ 0.05%，NaCl 0.2%，K₂HPO₄ 0.02%，琼脂1.2%，其余为蒸馏水，pH 7.4。

微囊藻室内培养液：将铜绿微囊藻种接种于BG-11培养基上，接种量为5~15%(v/v)，光照培养箱培养十天，培养温度为28~33℃，光照强度为4000lx，光暗比为12h:12h，培养时间10d。

原始出发菌株PV-3从水华频发的太湖梅梁湾中筛选获得，取自太湖梅梁湾水华上清液，加入到以微囊藻毒素为底物的基础培养基中（MCs浓度为5mg/L，30℃恒温培养，逐步增大微囊藻毒素浓度，连续富集培养3次，富集培养基中微囊藻毒素浓度依次为10mg/L、20mg/L、40mg/L。富集后的菌液经稀释涂布后，根据菌落性状不同进行分离纯化。得到原始出发菌株类芽胞杆菌PV-3，其生理特征：细胞呈杆状，较短，兼性厌氧的革兰氏阳性菌，无鞭毛，圆形菌落，湿润，边缘整齐，表面光滑，质地均匀，容易挑起，生长最适温度：25℃~28℃，生长温度范围为15-50℃，生长最适pH：7.2~7.5，生长pH范围为5.6~10.0。

以类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.）PV-3为出发菌株，进行诱变，具体步骤如下：

(1) 孢子悬浮液制备：取28℃恒温培养7d的类芽孢杆菌PV-3新鲜斜面加无菌水10mL，刮洗下培养好的新鲜斜面菌体后倾于带有一定玻璃珠的250mL三角瓶内震荡摇匀20min(250rmp/min)，打散，三层脱脂纱布过滤，滤液用血球计数板计数，调整菌体浓度成10⁶个/ml，备用。

(2) 低能氮离子注入-氯化锂复合诱变：取0.1mL的步骤(1)中孢子悬液均匀涂布于无菌空平皿上，镜检无细胞重叠者进行低能氮离子注入。本实验低能氮离子注入机为多功能注入机。分别在10KeV、14KeV、16KeV、18KeV的能量下对出发菌株进行离子注入。注入剂量分别为40×10¹⁴ions/cm²、80×10¹⁴ions/cm²、120×10¹⁴ions/cm²、160×10¹⁴ions/cm²、200×10¹⁴ions/cm²、240×10¹⁴ions/cm²。靶室真空度为10^-3Pa，以20S脉冲式注入，间隔15s，靶室内放置不接受注入的对照样。确定诱变能量16KeV，诱变剂量160×10¹⁴ions/cm²为最佳低能氮离子注入诱变条件。离子注入完毕后，取出平皿，在无菌环境下用1ml无菌水洗脱，涂布到氯化锂平板培养基上，在25~28℃下倒置培养6~7d。

(3) 紫外线-氯化锂复合诱变：取5mL步骤(1)中孢子悬液移入含有磁力转子的无菌空平板中，至于磁力搅拌器上。先开启20W紫外灯预热20min，再调整培养皿高度于紫外灯下30cm处，打开平皿盖，分别照射30s、45s、60s、75s、90s，诱变结束后取菌悬液涂布于氯化锂平板培养基上，于26~30℃条件下倒置避光恒温培养6~7d。根据实验结果，确定60s为紫外诱变最佳时间，此时正突变率最高。

4）诱变菌株的筛选：

初筛：将步骤2)和步骤3)诱变得到的单菌落接种至斜面培养基上，培养5天后，取出50%制成菌体悬液接种于MCs培养基，培养4d后，取菌落出现较早、菌落较大的菌株，留取50%的高效降解菌株上室内微囊藻培养液复筛。

复筛：将初筛筛选到的单菌落接至斜面培养基在30~35℃条件下培养2~3d；将斜面培养物接入微囊藻室内培养液中，放入光照培养箱中，培养温度28-33℃，2-3d后测定藻液中MCs的降解量，筛出降解量最高的菌株作为下一轮诱变筛选的出发菌株。

重复步骤1)~4)，注意低能氮离子注入-氯化锂复合诱变和紫外线-氯化锂复合诱变交替使用，筛选出微囊藻毒素降解量高的目标菌株类芽胞杆菌PN-S435。将筛选得到的类芽胞杆菌PN-S435和原始出发菌株PV-3分别接种于微囊藻室内培养液中，检测培养液中MCs初始含量及培养3d后培养液中MCs含量，计算得到日均降解量，如表1所示：

表1

菌号	类芽胞杆菌出发菌株PV-3	类芽胞杆菌PN-S435
			MCs日均降解量	18.4mg/L	30.2mg/L

经过筛选获得的突变类芽胞杆菌（Paenibacillus sp.）PN-S435，在降解过程中，对MCs的降解量明显高于出发菌株。

实施例2

本实施例说明菌株的鉴定及遗传稳定性

本发明菌株类芽胞杆菌PN-S435主要形态及生物学特征如下：细胞呈杆状，较短较粗，兼性厌氧的革兰氏阳性菌，无鞭毛，在胞囊内有圆形芽孢，在牛肉膏蛋白胨培养基上菌落颜色为淡黄色，菌落大小1-2.5mm，圆形菌落，菌落较厚，湿润，边缘整齐，表面光滑，质地均匀，容易挑起，菌落大小1-2.5mm，生长最适温度：25℃~28℃，生长温度范围为15-50℃，生长最适pH：7.2~7.5，生长pH范围为5.6~10.0。

本实施例说明筛选获得的突变类芽胞杆菌（Paenibacillus sp.）PN-S435的遗传稳定性。传代降解试验结果如表2所示：

表2 类芽胞杆菌（Paenibacillus sp.）PN-S435的遗传稳定性

传代次数	MCs日均降解量（mg/L）
		1	29.8
2	30.1
		3	30.3
4	30.2
		5	29.9

从遗传稳定性实验结果可知，经过5次连续传代，突变类芽胞杆菌（Paenibacillus sp.）PN-S435对MCs的降解量较稳定，具有很好的传代稳定性，可作为进一步研究和开发以应用于水源水处理的工程菌。

实施例3

本实施例说明突变株类芽胞杆菌PN-S435 的培养方法。

本实施例所述的培养基配方（%为质量百分比）：

平板/斜面培养基：葡萄糖0.5%，牛肉膏0.5%，胰蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%， MgSO₄ 0.05%，NaCl 0.2%，K₂HPO₄ 0.02%，琼脂1.2%，其余为蒸馏水，pH 7.4。

发酵培养基：MCs 1.8%，MgSO₄ 0.05%，NaCl 0.2%，K₂HPO₄ 0.02%，琼脂1.2%，其余为蒸馏水，pH 7.4。

培养方法包括如下步骤：

1) 平板/斜面培养：将类芽胞杆菌PN-S435划线接种至平板或者斜面培养基上培养，培养温度为25~28℃，培养时间为3~4d；

2）扩大培养：将步骤1）平板培养的类芽胞杆菌PN-S435接种至发酵培养基进行扩大培养，培养温度为25~28℃，培养时间3~4d；

3）降解应用：将步骤1)中培养的类芽胞杆菌PN-S435制成菌悬液或者将步骤2）发酵培养的类芽胞杆菌PN-S435进行离心，洗涤，收集湿菌体，投入到含微囊藻毒素的水体中进行降解。

菌悬液制备：取上述平板或者斜面培养基培养的类芽孢杆菌PN-S435加入无菌水，刮洗下培养好的新鲜菌体，经三层脱脂纱布过滤，收集于三角瓶内。收集完毕后，加入微囊藻室内培养液中进行降解作用。

实施例4

本实施例说明类芽胞杆菌PN-S435在降解MCs中的应用

微囊藻室内培养液：将铜绿微囊藻种（Microcystis aeruginosa PCC 7806）接种于BG-11，接种量为5~15%(v/v)，光照培养箱的培养温度为25.0~27.0℃，光照强度为4000lx，光暗比为12h:12h，培养时间10d。微囊藻室内培养液，是用最接近太湖水华爆发且占绝对优势的藻种——微囊藻接种到富含无机N、P培养基中置于光照培养箱中培养，相对比较接近水华爆发的水体环境。

将实施例3制备的类芽孢杆菌PN-S435菌体悬液和原始出发菌株PV-3菌体悬液分别倒入到微囊藻室内培养液中（5% V/V），培养温度为30~35℃，检测微囊藻室内培养液中MCs初始含量及培养1d、2d、3d后培养液中MCs含量，计算得到每日降解量，见表3：

表3 PV-3和PN-S435菌株的MCs日降解量

实施例5

本实例说明微囊藻毒素浓度测定方法。

本实施例是利用HPLC分析测定方法测定水体以及胞内微囊藻毒素浓度。

1). 取一定体积水样（50ml—100ml），经GF/C膜过滤，滤液置于棕色玻璃瓶中，-20℃保存。滤膜放入冷冻干燥机中冻干，取出后置于-70℃保存。

2). 水样富集和浓缩（GB/T 20466-2006）：取C18固相萃取柱，移液枪加入10ml甲醇，当甲醇页面接近小柱上层筛片时，加入10ml超纯水活化（整个过程不能使C18固相萃取小柱变干），然后与SPE固相萃取装置连接。将步骤1)的滤液通过固相萃取柱（流速为8-10ml/min）进行富集，富集完毕，先后用10ml超纯水和20%的甲醇溶液淋洗固相萃取柱。

3). 洗脱：用10ml甲醇（含0.1%的三氟乙酸）作为洗脱液洗涤步骤2)的萃取小柱，洗脱微囊藻毒素，洗脱液收集在玻璃容器中。在40℃下用旋转蒸发仪将洗脱液浓缩至干。用1ml甲醇溶解干物质，涡旋混合器充分混合1min，用尖嘴吸管吸出，小股氮气流吹干，加50%的甲醇溶液（V/V）定容至200μL。

4). 将步骤1)的GF/C滤膜剪碎至烧杯中，加入20ml 5%醋酸溶液，超声波震荡30min，用显微镜检查细胞是否完全破碎，然后用高速离心机12000 r/min 离心100min，分离上清液于4℃下避光保存，残渣再按同样方法重复离心2次，合并上清液用GF/C滤膜过滤，滤液富集和浓缩方法同步骤2)、藻毒素的洗脱同步骤3)。

5.HPLC法测定：微囊藻毒素检测采用美国安捷伦公司Agilent HPLC1200高效液相色谱仪，该色谱仪配有DAD检测器。色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18（5μm，4.6×150mm），检测波长238nm，柱温25℃，进样量20μL，流速1ml/min。流动相A为含0.04%三氟乙酸；流动相B为乙腈，浓度梯度起始值为70%流动相A+30%流动相B，时间10min；60%流动相A+40%流动相B，时间15min。精密称取MC—RR、MC—LR标准品溶于甲醇中，配成梯度浓度，精密量取各20μL，分别注入HPLC，记录色谱图，以标准品溶液浓度与相应的峰面积计算回归方程（相关系数应不小于0.99）。精密量取样品20μL，记录色谱图，根据回归方程计算出样品浓度。

实施例6

本实施例说明类芽胞杆菌PN-S435在野外降解MCs中的应用。

在南京市浦口区，选择三处水华爆发的小池塘，编号N1、N2、N3，分别取水样，取一定量水样用HPLC测其微囊藻毒素初始含量。将类芽孢杆菌PN-S435制成菌体悬液后，以12000 r/min离心10min，弃上清液，得到菌体，菌体用磷酸缓冲液洗涤2次后投入到N1、N2、N3池塘中。每隔一段时间取样，测试其MCs含量，计算一段时间内MCs的降解量及去除率。每个池塘每次取样设三个平行，如表4所示：

表4 类芽胞杆菌PN-S435在野外降解MCS的应用

Figure 2013100115000100002DEST_PATH_IMAGE003

Claims

1.一株类芽胞杆菌（Paenibacillus sp.）PN-S435，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号 CCTCC M 2012422。

2.权利要求1所述的类芽胞杆菌PN-S435在降解微囊藻毒素中的应用。

3.根据权利要求2所述的类芽胞杆菌PN-S435在降解微囊藻毒素中的应用，其特征在于包括如下步骤：

2)、扩大培养：将步骤1）培养的类芽胞杆菌PN-S435接种至发酵培养基进行扩大培养，培养温度为25~28℃，培养时间3~4d；

3)、降解应用：将步骤1)中平板/斜面培养的类芽胞杆菌PN-S435制成菌悬液或者将步骤2）发酵培养的类芽胞杆菌PN-S435进行离心，洗涤，收集湿菌体，投入到含微囊藻毒素的水体中进行降解。