CN104328075A

CN104328075A - 一株具有溶藻能力的枯草芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN104328075A
Application number: CN201410624723.9A
Authority: CN
Inventors: 单宝龙; 陈雷; 谷巍; 陈玉春; 翟延庆; 李光; 王兴华; 赵倩; 高绪娜; 王红
Original assignee: Shandong Boly Lely Bioengineering Co ltd
Current assignee: Shandong Boly Lely Bioengineering Co ltd
Priority date: 2014-11-06
Filing date: 2014-11-06
Publication date: 2015-02-04
Anticipated expiration: 2034-11-06
Also published as: CN104328075B; CN104328075A8

Abstract

本发明公开了一株具有溶藻能力的枯草芽孢杆菌及其应用，菌种命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLS1，已于2012年12月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO：M 2012534。该菌种能够有效的杀灭有害藻类，即使是对淡水水体中危害最为严重的铜绿微囊藻效果也明显，及时的缓解并避免了水华和赤潮现象。本发明的菌种应用方法简单，按照常规的方法制成粉剂或者片剂，根据需要随时投放于水体中即可，在赤潮或水华没有发生的情况下，向水体中投放该菌种，可维持水体菌群的平衡，菌种对水体养殖动物是安全的，发酵条件温和，易于扩大培养。

Description

一株具有溶藻能力的枯草芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物领域，尤其涉及一株具有溶藻能力的枯草芽孢杆菌及其应用。

背景技术

在海洋和淡水水体中，由于富营养化程度的加剧，藻类过量繁殖形成水华或赤潮，从而影响和改变水体的理化性质，并且能直接或间接引起食藻动物的大量死亡。传统的治理方法如机械除藻，高频电磁脉冲以及利用除草剂等方法，常受到成本和环境安全性问题等诸多因素的限制。相比之下，生物控藻技术成本低、安全性好，其中溶藻细菌因其较高的除藻效力，成为防治水华和赤潮的一个新方向。

溶藻细菌(algae-lysing bacteria)是一类以直接或间接方式抑制藻类生长，或杀死藻类、溶解藻细胞的细菌的统称，作为水生生态系统中生物种群结构和功能的一个重要组成部分，对水华和赤潮的控制、维持藻类生物量的平衡有非常重要的作用，它们对浮游植物的溶解作用也可能是调节水生生态系统中初级生产力的一个重要因素。水华和赤潮的突然消亡可能与溶藻细菌的感染有关。溶藻细菌作为水华和赤潮防治的生物，引起了国内外不少学者的关注，近年来国外不断分离出新的溶藻细菌。相对而言，国内报道较少，近十多年来几乎处于停滞状态。

溶藻细菌可以用于对蓝藻等有害藻类引起的水华的防治已有报道，如郭吉等从太湖分离到对铜绿微囊藻有溶藻作用的芽孢杆菌；刘晶等也在广州富营养化的池塘中分离到对铜绿微囊藻和水华鱼腥藻具有溶藻功能的蜡状芽孢杆菌和短小芽孢杆菌等。

溶藻细菌的作用方式一般分为两种：一是直接溶藻，即直接进攻宿主，它需要细菌与溶藻细胞直接接触，甚至侵入藻细胞内。Shilo M最早报道了粘细菌(Myxobacter)对蓝藻的直接溶解作用，史顺玉等发现的菌株也是直接溶藻。二是间接溶藻，即间接进攻宿主，主要包括细菌同藻竞争有限营养或细菌分泌胞外物质溶藻。其中分泌胞外物质溶藻文献报道较多，是溶藻细菌的主要作用方式。溶藻细菌可以通过释放特异性或非特异性的胞外物质，如蛋白质、羟胺、抗生素、多肽、氨基酸等杀死藻细胞。报道间接溶藻作用的主要有彭超、Lee Sun-og和Imamura等。

目前，国内外溶藻细菌一般分离自因富营养化而发生水华或赤潮的湖泊及海洋，大多为革兰氏阴性菌。由于溶藻细菌在自然水体中存在的比率比较低，故采用传统的方法需要浓缩大量水样，耗时长且很难获得理想溶藻细菌，与将来工程实际应用相距甚远。因此，寻找溶藻细菌分离源，实现短时间内分离筛选获得所需菌株，对溶藻细菌的深入研究及应用具有重要意义。

淡水水体中危害最为严重的是铜绿微囊藻，在水产养殖过程中，若藻类生长过量，水体过浓，易引起水产养殖动物浮头，甚至窒息、死亡等。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供一株具有溶藻能力的枯草芽孢杆菌及其应用，通过筛选得到一株具有溶藻性能细菌并进行应用的前期设计实验，为开发生物治理蓝藻微生态制剂提供平台。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一株具有溶藻能力的枯草芽孢杆菌，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLS1，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；保藏地址：中国武汉，武汉大学；邮编：430072；保藏日期：2012年12月18日；保藏编号：CCTCC NO：M 2012534。

所述枯草芽孢杆菌的菌种生物学特性如下：菌株CCTCC M2012534直杆状，单个，芽孢中生或近中生，革兰氏染色呈阳性，菌落形态为圆形，不透明，好氧菌厌氧不生长，过氧化氢酶、柠檬酸盐、D-葡萄糖、甘露醇、酪朊、淀粉水解、硝酸盐还原、D-木糖、阿拉伯糖、V-P反应、蔗糖反应为阳性，吲哚、酪氨酸、苯丙氨酸脱氨酶反应为阴性，质量分数为2％NaCl、质量分数为5％NaCl、30℃和50℃均可生长，5℃不生长，最适温度28℃，最佳初始pH为7.2。

一种菌剂，活性成分为枯草芽孢杆菌CCTCC M 2012534，一种粉剂或片剂，由所述菌剂制备而成。

所述菌株和/或所述菌剂和/或所述粉剂和/或所述片剂，在杀灭有害藻类中的应用，所述有害藻类为铜绿微囊藻或小球藻中的一种或两种；在防治水华和赤潮中的应用；在水产养殖中治理水体环境中的应用。

所述的枯草芽孢杆菌CCTCC M2012534的培养方法，包括以下步骤：

(1)菌种：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLS1，CCTCC M2012534；

(2)斜面培养：将步骤(1)中的菌种接种于固体斜面培养基上，在32℃～40℃条件下培养20h～28h；

(3)一级种子培养：取培养好的斜面，在无菌条件下接种，用接种环取两环于50mL～100mL种子液体培养基中，在32℃～40℃条件下，摇床培养14～18h，转速为200rpm，制得一级种子液；

(4)扩大培养：以5％的接种量，将一级种子液接于500mL～1000mL种子液体培养基中，在32℃～40℃条件下，摇床培养14～18h，转速为200rpm，制得二级种子液；

(5)发酵罐培养：以3％的接种量，将二级种子液接于液体发酵培养基中，于20℃～37℃条件下，转速为200rpm，培养28h～35h后，待芽孢率达到90％以上时，收集发酵液，即得菌剂；

(6)向发酵液中加入4～8％(质量百分数)玉米淀粉，立即喷雾干燥，制得菌粉。

上述步骤(3)、(4)中所述种子液体培养基配方为：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L，使用时，调节pH至6.5～7.5，120℃条件下灭菌25min；步骤(2)所述固体斜面培养基为上述种子液体培养基中添加质量分数为1.5～2.0％的琼脂粉；步骤(5)中所述液体发酵培养基配方为：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L，氯化钠5g/L，使用时，调节pH至6.5～7.5，120℃条件下灭菌25min。

将菌粉压成片剂；所述菌株和/或所述菌剂和/或所述粉剂和/或所述片剂的应用方法，直接投放于水中即可。

本发明的有益效果：

1、本发明以淡水水体中危害最为严重的铜绿微囊藻作为模式藻种，筛选出一株能够有效防治藻类危害的溶藻细菌，筛选的枯草芽孢杆菌CCTCC M2012534能够有效的杀灭有害藻类，对淡水水体中危害最为严重的铜绿微囊藻效果明显，及时的缓解并避免了水华和赤潮现象。

2、本发明的菌种应用方法简单，按照常规的方法制成粉剂或者片剂，根据需要随时投放于水体中即可。

3、在赤潮或水华没有发生的情况下，向水体中投放该菌种，可维持水体菌群的平衡。

4、通过对水体动物安全性的评价得知，本发明的菌种对水体养殖动物是安全的，不管是人工感染还是人工注射试验，水体动物均未出现不良现象，所以本发明菌种是一种适用于淡水养殖的可靠菌种。

5、本发明的菌种发酵条件温和，易于扩大培养。

附图说明

一株具有溶藻能力的枯草芽孢杆菌，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLS1，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国武汉，武汉大学，邮编：430072，保藏日期：2012年12月18日，保藏编号：CCTCC NO：M 2012534；

图1为本发明的菌株溶藻效果的初步判定结果，0号为对照瓶，1～3号为自泰安市岱庙采集的富营养化淡水水样，4～6号为自泰安市南湖采集的富营养化淡水水样，7～10号为自泰安市东湖采集的富营养化淡水水样；

图2为本发明的单株菌溶藻效果的判定结果，a、b、c、d号瓶为依次盛放的36株单株菌；

图3为菌株1-17的溶藻效果；

图4为菌株1-17的溶藻培养效果，其中四个锥形瓶自左向右依次是对照瓶、菌悬液浓度为M1-10⁸cfu/mL瓶、菌悬液浓度为M2-10⁷cfu/mL瓶、菌悬液浓度为M3-10⁶cfu/mL瓶；

图5为菌株BLS1的溶藻效果；

图6为菌株BLS1的溶藻培养效果，其中四个锥形瓶自左向右依次是对照瓶、菌悬液浓度为M1-10⁸cfu/mL瓶、菌悬液浓度为M2-10⁷cfu/mL瓶、菌悬液浓度为M3-10⁶cfu/mL瓶；

图7为菌株2-3的溶藻效果；

图8为菌株2-3的溶藻培养效果，其中四个锥形瓶自左向右依次是对照瓶、菌悬液浓度为M1-10⁸cfu/mL瓶、菌悬液浓度为M2-10⁷cfu/mL瓶、菌悬液浓度为M3-10⁶cfu/mL瓶；

图9为菌株1-17与菌株BLS1复配的溶藻效果；

图10为菌株1-17与菌株BLS1复配的溶藻培养效果，其中四个锥形瓶自左向右依次是对照瓶、菌悬液浓度为M1-10⁸cfu/mL瓶、菌悬液浓度为M2-10⁷cfu/mL瓶、菌悬液浓度为M3-10⁶cfu/mL瓶；

图11为菌株2-3与菌株BLS1复配的溶藻效果；

图12为菌株2-3与菌株BLS1复配的溶藻培养效果，其中四个锥形瓶自左向右依次是对照瓶、菌悬液浓度为M1-10⁸cfu/mL瓶、菌悬液浓度为M2-10⁷cfu/mL瓶、菌悬液浓度为M3-10⁶cfu/mL瓶；

图13为菌株1-17对小球藻的安全性评价；

图14为菌株BLS1对小球藻的安全性评价；

图15为菌株2-3对小球藻的安全性评价；

图16为菌株BLS1生长曲线活菌计数；

图17为菌株BLS1生长曲线OD值；

图18为菌株1-17生长曲线活菌计数；

图19为菌株1-17生长曲线OD值；

图20为菌株BLS1的应用效果。

具体实施方式

下面结合附图与实施例对本发明作进一步说明。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1藻种：铜绿微囊藻、小球藻(两者均购自中国科学院水生生物研究所淡水藻种库)。

1.1.2菌种：自泰安市内(东湖、南湖、岱庙)富营养化的淡水水体分离。

1.1.3试验动物：鲫鱼购自泰安市五马市场；试验用鲤鱼购自泰安温泉鱼苗厂。

1.1.4培养基：铜绿微囊藻培养基：即朱氏10号培养基，pH＝7.1；小球藻培养基：即F/2培养基，pH＝7.0；细菌培养基：即营养琼脂培养基；芽孢杆菌培养基；各培养基组成见表1。

表1 培养基组成成分

1.2试验设备：光照培养箱、普通培养箱、低速离心机、分光光度计、光学显微镜、水族箱、摇床、超净工作台、高压锅等。

1.3试验方法

1.3.1藻种的培养

1.3.1.1铜绿微囊藻的活化：试验前，先将购买的铜绿微囊藻纯藻种于2000Lx、25℃条件下的光照培养箱中静置培养，每隔3h人工摇动一次(均在无菌条件下进行)，持续预培养一周，并镜检有无杂藻和藻类生长情况，如达到同步良好生长，就可作为试验的藻种液。

1.3.1.2小球藻的活化：小球藻的活化方法同铜绿微囊藻，藻种活化及扩大培养采用的培养基为F/2培养基。

1.3.2藻液制备

无菌倒取藻液，4000rpm离心10min，弃去上清液，藻体液用15mg/L NaHCO₃洗涤两遍后作为接种藻液。以每个三角瓶50mL计，接种后铜绿微囊藻的初始密度为OD值(450nm)0.005(1.26×10⁵cfu/mL)。

1.3.3实验动物饲养

试验用鲫鱼购自泰安市五马市场，平均体重(160±15)g，暂养于室内玻璃水族箱(长宽高分别为：0.9m、0.5m、0.5m)中，有效水体积为180L。以充分曝气除氯的自来水作为循环水源，水温控制在(23±1)℃，24h持续曝气充氧；日投喂量为鱼体重的1.5％，早、中、晚定时投喂。经过14d的适应训练后将试验鱼按体重随机分为三个试验组，每组15尾，试验周期为21d。

1.3.4溶藻细菌的分离与筛选

1.3.4.1野生溶藻细菌的分离

(1)用采水器从试验点水体中采集水样，水样用0.45μm纤维滤膜过滤，将10mL滤液加入40mL培养5d的铜绿微囊藻培养液中，混合均匀，按铜绿微囊藻活化的培养条件培养7d后，将黄化的藻液作为溶藻细菌的材料，取黄化藻液按10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6梯度稀释，平板涂布，划线分离，37℃培养48h，获得单个菌落。

(2)将单个菌落接种于营养琼脂培养基中，37℃振荡培养24h，取10mL菌液加入100mL铜绿微囊藻液中，按铜绿微囊藻活化的培养条件培养7d后，将藻液黄化明显、溶藻效果最好的样品稀释，平板涂布，划线分离，获得单个菌落，重复上述操作以验证菌株的溶菌效果。

(3)将溶藻效果稳定的菌株接种于营养琼脂培养基中，37℃振荡培养24h，4000rpm，离心10min收集菌泥，用质量分数为0.75％的生理盐水洗涤三次后配制成1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶cfu/mL的菌悬液，分别取5mL菌悬液加入到50mL铜绿微囊藻液当中，经过7d监测叶绿素含量的变化(采用热乙醇法测定)，叶绿素含量降低为溶藻效果较佳组。

叶绿素含量测定方法(热乙醇法)：取3mL藻液于10mL离心管中，4000rpm离心10min后弃上清加入5mL体积分数为90％的乙醇溶液，将试管置于75℃水浴锅中提取5min，取其提取液进行测定。采用分光光度计读取其665nm和750nm处的吸光度数值，向其中加入1mol/L盐酸，8min后再次读取其665nm和750nm处的吸光度数值。利用公式计算叶绿素含量：C(chla)＝27.3(Ea–Eb)Ve/V，式中C(chla)为水样中叶绿素a的含量μg/L，Ea为提取液酸化前波长665nm和750nm处的光密度之差，Eb为提取液酸化后波长665nm和750nm处的光密度之差，Ve为提取液的总体积(5mL)，V为抽滤的水样体积(3mL)。

(4)将筛选出溶藻效果最好的溶藻细菌与其他菌种进行两两复配以2.5mL：2.5mL的比例加入，最终均配制成浓度1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶cfu/mL，选出溶藻效果较好的复配菌种。

1.3.5溶藻细菌的鉴定

溶藻细菌的鉴定采用生理生化鉴定与16S rDNA鉴定相结合的方式进行。生理生化试验所用培养基的配制见《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠，2001年第一版)和《微生物学实验》(沈萍，2007年第四版)。

1.3.5.116S rDNA的扩增与序列分析

目的菌株接种于新鲜的芽孢杆菌培养基中培养20h，采用天根公司的试剂盒提取菌体DNA，并对其进行16S rDNA序列扩增。所用引物为通用引物：上游引物5’-agagtttgatcctggctcag-3’下游引物5’-aaggaggtgatccagccgca-3’，PCR反应体系(50μL)为:dNTP Mixture 4μL(含Taq DNA聚合酶及dNTP等，天根生化科技有限公司)，5×Primer STARBuffer 10μL，上下游引物各0.6μL，模板DNA 1μL，酶0.5μL，超纯水33.3μL。PCR扩增程序为95℃预变性5min，94℃变性1min，59℃退火15s，72℃延伸45s，30个循环，72℃延伸10min。PCR产物送北京博尚生物技术有限公司进行序列测定。

1.3.5.2生理生化

测定指标：厌氧生长、过氧化氢酶、柠檬酸盐、D-葡萄糖、吲哚、甘露醇、酪朊、酪氨酸、淀粉水解、硝酸盐还原、D-木糖、阿拉伯糖、生长温度(5℃、30℃、50℃)、NaCl(质量分数2％、质量分数5％)、苯丙氨酸脱氨酶、V-P反应、蔗糖。测定方法见《微生物学实验》(沈萍，2007年第四版)。

1.3.6溶藻效果确定性评价

将鉴定出的溶藻细菌菌株接种于芽孢杆菌培养基中，37℃振荡培养24h，4000rpm，离心10min收集菌泥，用质量分数为0.75％的生理盐水洗涤三次后配置成1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶cfu/mL的菌悬液，分别取5mL菌悬液加入到50mL铜绿微囊藻液当中。观察溶藻效果试验周期为7d，每个试验菌株及复配菌株溶藻效果的确定性评价均重复三次，以得到确定性结果。观测指标：显微镜镜检藻细胞变化情况、肉眼观察藻液颜色变化、藻液叶绿素含量的测定(采用热乙醇法)。

1.3.7溶藻细菌的安全性评价

1.3.7.1养殖动物安全评价

(1)人工感染试验：

试验用鲫鱼经过14d暂养观察后取健康鲫鱼60尾，分为4组，每组15尾，其中三组为试验组，一组为对照组。在试验组水体中加入分离出的溶藻细菌，使水体的含菌量达10⁸cfu/mL，进行人工感染试验。观察感染过程中鲫鱼的活动状况、发病及死亡情况。

(2)人工注射试验：

离心收集培养24h的菌体，经质量分数为0.75％无菌生理盐水洗涤并配制成10⁸cfu/mL的溶藻细菌悬液，取健康鲫鱼60尾，分为4组，每组15尾，其中三组为试验组，一组为对照组。试验组鲫鱼每尾腹腔接种0.1mL经上述处理的溶藻细菌悬液，对照组注射0.1mL无菌生理盐水。观察注射后鲫鱼的活动状况、发病及死亡情况。于注射后第15d剖解鲫鱼，观察内脏器官有无病理变化。

1.3.7.2模式藻种安全评价

以小球藻为模式藻种，将单个菌落接种于营养琼脂培养基中，37℃振荡培养24h，取10mL菌液加入100mL小球藻藻液中，按上述培养条件培养7d后，观察藻细胞变化情况、藻液黄化程度、藻液叶绿素含量变化。

1.3.8溶藻细菌发酵条件的研究

1.3.8.1最佳培养温度的确定：将鉴定出的菌株接种到液体培养基中，分别在28℃、30℃、34℃、37℃的温度下，160rpm摇床培养48h，测定发酵液中的活菌数。

1.3.8.2最佳初始pH值的确定：将鉴定出的菌株接种到初始pH值分别为6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6的液体培养基，按试验1.3.8.1确定的最佳培养温度，160rpm摇床培养48h，测定发酵液中的活菌数。

1.3.8.3最佳通风量的确定：将鉴定出的菌株在不同装样量(500mL三角瓶装样50mL、100mL、150mL、200mL)和摇床转速(160rpm、180rpm、200rpm、220rpm)条件下测定菌体生成量的变化，分别在30℃培养36h后测定菌体含量。

1.3.8.4最佳接种量的确定：将鉴定出的菌株分别按照4％、6％、8％、10％、12％的接种量接种，35℃，220rpm，培养48h，检测生物量和芽孢形成水平。

1.3.9溶藻细菌生长曲线的测定

细菌生长曲线采用比浊法和活菌技术法两种方法进行测定：取60mL液体培养基于250mL三角瓶中，用无菌吸管准确吸取2.5mL培养18h的溶藻菌培养液于三角瓶中培养，将其置于摇床中振荡培养，培养温度30℃，转速160rpm。每2h时取样一次，用720型分光光度计在550nm处测量吸光度，同时进行活菌计数并镜检芽孢率。

1.3.10溶藻细菌的应用试验

试验用鲤鱼购自泰安温泉鱼苗厂，平均体重(55±5)g，分为对照组和试验组，各90尾，分别暂养于水泥养殖池(4m×1.2m×1.5m)中，有效水体积为4立方，水温29±0.5℃。水体每日午后14:00充氧持续2h，日投喂量为鱼体重的5％，早、中、晚定时投喂，经过43d投喂饲养后水体出现蓝藻水华现象，镜检后发现优势藻为铜绿微囊藻，次优势藻为项圈藻。此时在水体中投入200mL活菌数为5×10⁸的BLS1菌液，分别于5d、7d测定水体叶绿素含量(采用热乙醇法)。

2结果与分析

2.1溶藻细菌的筛选

由图1可知，经过7d的培养，1、4、5、6号瓶发生黄化现象，其余均无明显黄化现象，可以判定1、4、5、6号瓶存在溶藻微生物，并对黄化藻液进行了菌株分离共得到33株野生菌。如图2所示，36株单株菌(33株野生菌，3株实验室现有菌种)中有10、11、12、18、19、20、22、23、24、28、31、32、33、35、36共计15株出现了明显的黄化现象，根据出现黄化现象的时间最终筛得3株野生溶藻细菌，分别为菌株1-17、菌株BLS1、菌株2-3，并对这三株菌进行了菌种鉴定。

2.2溶藻细菌的鉴定

2.2.1生理生化反应鉴定结果

由表2可知，菌株1-17可厌氧生长，过氧化氢酶、D-葡萄糖、甘露醇、淀粉水解、硝酸盐还原、D-木糖、阿拉伯糖、V-P反应、蔗糖反应为阳性，柠檬酸盐、吲哚、酪朊、酪氨酸、苯丙氨酸脱氨酶反应为阴性，在5％NaCl、5℃和50℃不生长，2％NaCl和30℃生长良好；菌株BLS1厌氧不生长，过氧化氢酶、柠檬酸盐、D-葡萄糖、甘露醇、酪朊、淀粉水解、硝酸盐还原、D-木糖、阿拉伯糖、V-P反应、蔗糖反应为阳性，吲哚、酪氨酸、苯丙氨酸脱氨酶反应为阴性，2％NaCl、5％NaCl、30℃和50℃均可生长，5℃不生长；菌株2-3厌氧可生长，过氧化氢酶、柠檬酸盐、D-葡萄糖、酪朊、酪氨酸、淀粉水解、硝酸盐还原、V-P反应、蔗糖反应为阳性，吲哚、甘露醇、D-木糖、阿拉伯糖、苯丙氨酸脱氨酶反应为阴性，2％NaCl、5％NaCl、30℃可生长，5℃、50℃不生长。

表2 三株菌生理生化反应结果

注：“–”反应阴性，“+”反应阳性。

2.2.2测序结果

2.2.2.1三株菌的16S rDNA测序结果见SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3。

2.2.3鉴定结果

表3 野生溶藻细菌鉴定结果

表3结果表明，结合16S rDNA和生理生化反应最终得出鉴定结果：菌株1-17为淀粉液化芽孢杆菌，菌株BLS1为枯草芽孢杆菌，菌株2-3为苏云金芽孢杆菌。

2.3溶藻效果确定性评价

2.3.1菌株1-17溶藻效果

表4 菌株1-17溶藻效果chla(μg/L)平均值

由表4、图3、图4可知，经过7d的溶藻试验，在1d、2d、3d叶绿素含量均呈下降趋势，从4d后叶绿素含量各组出现不规律的增长，7d时叶绿素含量均高出初始值，但低于对照组；黄化效果仅高浓度组稍明显，其余两组无肉眼可见黄化现象。分析原因可能是添加初期，随着菌株1-17的生长繁殖，抑藻效果比较明显，但是随着时间的延长，菌株1-17所产生的抑藻物质并不足够完全抑制藻类生长，因此出现了后期藻类的继续生长现象，分析出若延长培养时间可能会出现与对照组持平的结果，考虑实际应用的实效和成本问题，可以判定菌株1-17虽然具有溶藻效果但并不是溶藻效果最佳的菌株。

2.3.2菌株BLS1溶藻效果

表5 菌株BLS1溶藻效果chla(μg/L)平均值

由表5、图5、图6可知，7d结束时，各浓度组叶绿素含量均呈下降趋势，且均低于对照组；各组均出现明显黄化现象。试验结果可以看出，菌株BLS1的抑藻效果明显，且整个试验周期内的叶绿素含量均是降低的，说明菌株BLS1的抑藻效果非常理想且相对稳定，考虑实际应用的时效性和使用成本等问题，其具有较高的应用价值，因此，可以判定菌株BLS1是具有应用价值的一株溶藻细菌。

2.3.3菌株2-3溶藻效果

表6 菌株2-3溶藻效果chla(μg/L)平均值

如表6、图7、图8所示，7d结束时，各浓度组叶绿素含量均低于对照组，但均高于初始值；其中仅高浓度组出现黄化现象，其余两组均无肉眼可见黄化现象。分析原因可能是添加初期随着菌株2-3的生长繁殖，抑藻效果比较明显，但是随着时间的延长，菌株2-3所产生的抑藻物质并不足够完全抑制藻类生长，因此出现了后期藻类的继续生长现象，但其高浓度组生长非常缓慢，如果继续加大使用量可能会出现较好的抑藻效果，但成本也相应增加，考虑实际应用的实效和成本问题，可以判定菌株2-3虽然具有溶藻效果但并不是溶藻效果最佳的菌株，但其溶藻效果及应用价值要好于菌株1-17。

2.3.4菌株1-17与菌株BLS1复配溶藻效果

表7 菌株1-17与菌株BLS1复配溶藻效果chla(μg/L)平均值

如表7、图9、图10所示，7d结束后，各浓度组叶绿素含量均低于对照组，但均高于初始值。从表中可以看出，菌株1-17与菌株BLS1复配后具有溶藻效果，但是不明显，叶绿素含量虽然低于对照组，但是一直处于上升状态，且肉眼观察除高浓度组外并无明显黄化现象，因此可以判定，菌株1-17与菌株BLS1复配溶藻效果并不理想。

2.3.5菌株BLS1与菌株2-3复配溶藻效果

表8 菌株BLS1与菌株2-3复配溶藻效果chla(μg/L)平均值

如表8、图11、图12所示，7d结束时，各浓度组叶绿素含量低于初始值，且肉眼可见的黄化现象明显。分析原因，可能是由于两株菌的抑藻效果起到了协同作用，因此溶藻效果明显，且相对比较稳定。

2.4溶藻效果安全性评价

2.4.1养殖动物的安全性评价

表9 溶藻细菌对养殖动物安全性评价结果

如表9所示，所分得的三株溶藻细菌对养殖动物均是安全的，在试验周期内无死亡现象，摄食正常，在人工注射试验中亦未出现明显不良现象。

2.4.2模式藻种的安全性评价

2.4.2.1菌株1-17对小球藻的安全性评价

表10 菌株1-17对小球藻的安全性评价

如表10、图13所示，菌株1-17对小球藻具有溶藻性，没有明确的选择性溶藻的特点。

2.4.2.2菌株BLS1对小球藻的安全性评价

表11 菌株BLS1对小球藻的安全性评价

如表11、图14所示，菌株BLS1对小球藻具有溶藻性，没有明确的选择性溶藻的特点。

2.4.2.3菌株2-3对小球藻的安全性评价

表12 菌株2-3对小球藻的安全性评价

如表12、图15所示，菌株2-3对小球藻具有溶藻性，没有明确的选择性溶藻的特点。

2.5溶藻细菌发酵条件的研究

考虑菌株的应用价值及溶藻效果仅对菌株BLS1，菌株1-17进行了发酵条件的研究。

2.5.1温度

表13 温度对活菌数的影响

试验结果表明，菌株BLS1在28℃的条件下活菌数最高，菌株1-17在34℃的条件下活菌数最高。

2.5.2pH值

表14 pH值对活菌数的影响

如表14所示，菌株BLS1在pH7.0条件下活菌数最高，菌株1-17在pH7.2条件下活菌数最高。

2.5.3通风量的确定

表15 转速对BLS1生物量和芽孢率的影响

试验结果表明，转速对BLS1的影响不大，低转速140rpm和高转速220rpm的活菌数都在7.0×10⁸cfu/g左右，而芽孢率以200rpm和220rpm最高，分别为95％和96％，但与低转速的芽孢形成率差异不明显。

表16 装液量对BLS1生物量和芽孢率的影响

试验结果表明，最终确定装液量为250mL三角瓶中装60mL培养基。

2.5.4接种量对BLS1生物量和芽孢率的影响

表17 接种量对BLS1生物量和芽孢率的影响

当接种量为12％时，芽孢率可达92％。原因可能是接种量越大，培养基中营养物质消耗的越快，达到生长平台期越快，越有利于芽孢的形成。

2.6溶藻细菌生长曲线的测定

表18 菌株BLS1与菌株1-17生长曲线

如表18、图16、图17、图18、图19所示，菌株BLS1活菌数最高值出现在40h，菌株1-17活菌数最高值44h。

2.7溶藻细菌的应用试验

表19 菌株BLS1应用效果

如表19、图20所示，水体中叶绿素含量明显下降，从现场观察结果可以看到水体表面的蓝藻得到了控制，通过镜检结果可以发现铜绿微囊藻和项圈藻数量明显减少，且养殖动物未出现死亡现象。该结果达到试验预期，因菌株BLS1经过实验室研究证明其具有一定的溶藻效果，因此该结果说明菌株BLS1具有处理养殖水体蓝藻问题的能力，且由于其是生物除藻，处理过程相对化学除藻剂柔和，对养殖动物造成的应激较小，在解决了水体蓝藻问题的同时保护了养殖动物。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims

1.一株具有溶藻能力的枯草芽孢杆菌，其特征在于，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)BLS1，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国武汉，武汉大学，保藏日期：2012年12月18日，保藏编号：CCTCC NO：M 2012534。

2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于，菌种生物学特性如下：直杆状，单个，芽孢中生或近中生，革兰氏染色呈阳性，菌落形态为圆形，不透明，好氧菌，厌氧不生长，过氧化氢酶、柠檬酸盐、D-葡萄糖、甘露醇、酪朊、淀粉水解、硝酸盐还原、D-木糖、阿拉伯糖、V-P反应、蔗糖反应为阳性，吲哚、酪氨酸、苯丙氨酸脱氨酶反应为阴性，质量分数为2％NaCl、质量分数为5％NaCl、30℃和50℃均可生长，5℃不生长，最适温度28℃，最佳初始pH为7.2。

3.如权利要求1所述的具有溶藻能力的枯草芽孢杆菌的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)菌种：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLS1，CCTCC M2012534；

(5)发酵罐培养：以3％的接种量，将二级种子液接于液体发酵培养基中，于20℃～37℃条件下，转速为200rpm，培养28h～35h后，待芽孢率达到90％以上时，收集发酵液；

上述步骤(3)、(4)中，所述种子液体培养基配方为：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L，使用时，调节pH至6.5～7.5，120℃条件下灭菌25min；步骤(2)所述固体斜面培养基为上述种子液体培养基中添加质量分数为1.5～2.0％的琼脂粉；步骤(5)中所述液体发酵培养基配方为：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L，氯化钠5g/L，使用时，调节pH至6.5～7.5，120℃条件下灭菌25min。

4.一种菌剂，其特征在于，活性成分为权利要求1所述的菌。

5.一种粉剂，其特征在于，由权利要求4所述的菌剂制备而成。

6.如权利要求5所述的粉剂的制备方法，其特征在于，向权利要求4所述的菌剂中加入质量百分数为4～8％的玉米淀粉，立即喷雾干燥，制得菌粉。

7.一种片剂，其特征在于，由权利要求4所述的菌剂或由权利要求5所述的粉剂制备而成。

8.如权利要求7所述的片剂的制备方法，其特征在于，将权利要求5所述的粉剂压成片剂。

9.权利要求1所述具有溶藻能力的枯草芽孢杆菌在杀灭有害藻类中的应用；所述有害藻类为铜绿微囊藻或小球藻中的一种或两种。

10.权利要求1所述的具有溶藻能力的枯草芽孢杆菌在防治水华和赤潮、在水产养殖治理水体环境中的应用。