CN107177538A - 一株海洋蜡样芽胞杆菌及其在水华鱼腥藻防治方面的应用 - Google Patents

一株海洋蜡样芽胞杆菌及其在水华鱼腥藻防治方面的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107177538A
CN107177538A CN201710591053.9A CN201710591053A CN107177538A CN 107177538 A CN107177538 A CN 107177538A CN 201710591053 A CN201710591053 A CN 201710591053A CN 107177538 A CN107177538 A CN 107177538A
Authority
CN
China
Prior art keywords
aquae
bacterial strain
anabaena flos
algae
bacillus cereus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201710591053.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107177538B (zh
Inventor
周晓见
许明景
田良玉
缪莉
靳翠丽
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yangzhou University
Original Assignee
Yangzhou University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yangzhou University filed Critical Yangzhou University
Priority to CN201710591053.9A priority Critical patent/CN107177538B/zh
Publication of CN107177538A publication Critical patent/CN107177538A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107177538B publication Critical patent/CN107177538B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C12R2001/085—Bacillus cereus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/10—Animals; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F3/00—Biological treatment of water, waste water, or sewage
    • C02F3/34—Biological treatment of water, waste water, or sewage characterised by the microorganisms used

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Water Supply & Treatment (AREA)
  • Environmental & Geological Engineering (AREA)
  • Hydrology & Water Resources (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明属于环境微生物领域，具体涉及一种具有溶藻特性的海洋蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)HY339及其在抑制水华鱼腥藻生长方面的应用，它的保藏编号是CGMCC No.14207。菌株HY339发酵液及发酵液粗提物对水华鱼腥藻(Anabaena flos‑aquae)的生长具有较强的抑制效果，且对菌株HY339的淡化培养并未影响其溶藻效果，有望开发新型水产抑藻菌剂并应用于淡水蓝藻水华的生物防治领域。

Description

一株海洋蜡样芽胞杆菌及其在水华鱼腥藻防治方面的应用
技术领域
本发明涉及环境微生物领域，一株具有分泌溶藻活性物质的海洋蜡状芽孢杆菌HY339(Bacillus cereus HY339)及其在淡水蓝藻水华鱼腥藻生物防治领域中的应用。
背景技术
当前阶段蓝藻水华的控制方法可分为物理、化学和生物方法。物理方法如超声波除藻、气浮除藻、过滤和机械清除等方法成本较高、费时费力、操作困难且往往治标不治本；化学方法包括化学药剂法、光化学降解法和电化学法等，是目前较为成熟的除藻技术，但化学方法容易污染环境、破坏生态系统，生物毒性大，容易造成药物残留和二次污染，且长期使用会使藻类产生抗药性。
所以，生物防控法越来越受到专家学者们的青睐。蓝藻水华的生物防控过程中，微生物的利用至关重要，尤其以具有溶藻特性的微生物对蓝藻水华的抑制发挥了重要作用。
水华鱼腥藻是引起水华蓝藻爆发的主要藻种之一，适应性强，就发生频率和范围来讲，是仅次于微囊藻的有毒水华蓝藻。对水华鱼腥藻生长的抑制研究非常具有学术和应用价值，本领域的学者们致力于筛选出对水华鱼腥藻的生长具有显著抑制效果的溶藻细菌，同时研究其具有溶藻活性的次生代谢产物，开发微生物溶藻制剂，应用于蓝藻水华问题的安全高效解决，对安全、经济、高效地控制和治理水华具有重要价值。
发明内容
为实现上述背景介绍中的问题，本发明提供了一株具有溶藻特性的海洋蜡样芽胞杆菌HY339(Bacillus cereus HY339)及其代谢产物在水华鱼腥藻生物防治中的应用。
本发明公开了一株具有溶藻特性的海洋蜡样芽胞杆菌HY339(Bacillus cereusHY339)，保藏编号为CGMCC No.14207。
进一步地，本发明提供了上述菌株HY339在水华鱼腥藻生态防治中的应用。
进一步地，本发明提供了上述菌株HY339的发酵产物在水华鱼腥藻生态防治中的应用。
进一步地，本发明提供了一种溶藻菌剂，所述溶藻剂中包含所述的菌株HY339。
进一步地，本发明提供了一种溶藻制剂，所述溶藻制剂中包含所述的菌株HY339的发酵产物，所述发酵产物为发酵液、发酵液浓缩物、发酵液粗提物或发酵液提取物。
优选地，菌液发酵条件为，菌株HY339接种于pH7.0的灭菌LB培养基中，25℃、150rpm条件下发酵5天得到菌株HY339发酵液，其中，LB培养基使用人工海水配制。
优选地，发酵产物萃取剂为乙酸乙酯混合5％体积比的丙酮，萃取体系中乙酸乙酯-丙酮混合液与发酵液的体积比为1:1，混合后进行震荡5min，分离出的上层乙酸乙酯-丙酮混合液即为菌株HY339发酵液萃取液；萃取液以旋转蒸发仪蒸干后即为发酵液粗提物。
本发明所述的菌株HY339是海水里分离出来的细菌，一般而言，海水细菌难以直接用于淡水水华防治。但本发明通过淡化培养发现，该菌可以适合低盐度生长，且可在淡水条件下进行溶藻活动。
具体的菌株HY339的淡化培养方法如下：
①发酵培养所述的菌株HY339；
②取发酵液接种于不同盐度培养基进行第二次发酵；
③以不同盐度发酵液进行溶藻实验。
其中，菌株HY339初始培养基为以人工海水配制的LB培养基，灭菌，发酵条件为：pH7.0，25℃、150rpm条件下发酵48h。
其中，淡化培养基盐度梯度分别为0％、0.25％、0.5％、1％、2％和3.5％。结果表明菌株HY339虽然为海洋菌株，但在低盐度条件下也可正常生长，可在淡水条件下进行溶藻活动。
本发明菌株HY339发酵液及发酵液粗提物对水华鱼腥藻(Anabaena flos-aquae)的生长具有较强的抑制效果，且对菌株HY339的淡化培养并未影响其溶藻效果，有望开发新型水产抑藻菌剂并应用于淡水蓝藻水华的生物防治领域。
附图说明
图1是本发明实施例1中筛选到的6株活性菌株对水华鱼腥藻生长的抑制作用。
图2是本发明实施例2中细菌发酵液以3％体积比添加时水华鱼腥藻生物量4天变化图。
图3是本发明实施例3中细菌发酵液粗提物对水华鱼腥藻藻生物量的影响。
图4是本发明实施例4中不同盐度培养条件下菌株HY339生长情况(490nm吸光度值)。
图5是本发明实施例5中不同盐度培养的菌株HY339发酵液以3％体积比添加时水华鱼腥藻生物量4天变化图。
图6是菌株HY339经16S rDNA基因序列分析后所得系统发育树。
本发明菌株HY339于2017年5月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，分类命名为蜡样芽胞杆菌Bacillus cereus，保藏编号为CGMCC No.14207。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的海洋蜡样芽胞杆菌HY339菌株及其乙酸乙酯粗提物在蓝藻水华控制中的效果作进一步说明，以充分了解本发明的目的、特征和效果。
实施例1活性菌株筛选
从连云港海域海水、沉积物中共分离出细菌110株，将其活化培养，取培养48h的菌液1.5mL分别加入新接种的100mL水华鱼腥藻藻液中，将藻液放入全自动光照培养箱培养，培养条件：温度25℃，光照强度2000Lux，光暗比14:10。每天定时取样测定水华鱼腥藻生物量(以单位体积内藻丝总长计)，发现其中104株抑藻活性不显著，但有6株细菌，包括HY339、HY423、HY555、HY684、HY689、HY728，对水华鱼腥藻的生长均具有显著的抑制作用，结果见图1。6株海洋细菌(HY339、HY423、HY555、HY684、HY689、HY728)在添加量体积比为1.5％时，对水华鱼腥藻6天抑制率分别为93.0％、78.6％、80.4％、75.7％、84.0％和88.2％；其中菌株HY339，抑制率最高(93.0％)，活性最优。
实施例2溶藻性细菌HY339发酵液及其乙酸乙酯-丙酮萃取液制备方法
将菌株HY339按照1％的接种量接种于人工海水配制的LB培养基中，25℃、150rpm条件下摇床培养5d后得到发酵液。
将丙酮以5％体积比混入乙酸乙酯中得到乙酸乙酯-丙酮混合液。
将乙酸乙酯-丙酮混合液按照1:1的比例加入发酵液中，混合后进行震荡5min，分离出的上层乙酸乙酯-丙酮混合液即为菌株HY339发酵液萃取液；将萃取液以旋转蒸发仪蒸干后即为发酵液粗提物。
实施例3菌株HY339发酵液对水华鱼腥藻的溶藻效果
以人工海盐配置LB培养基并对菌株HY339进行接种发酵5天，发酵条件：25℃，150rpm摇床培养。
将发酵好的菌液以3％接种率加入处于对数生长期的水华鱼腥藻藻液中，同样使用无菌的LB培养基以相同接种率加入藻液中作为对照，在光照培养箱中培养4天，每天取样测定对照组和实验组水华鱼腥藻生物量，计算溶藻效率，对照组和实验组各设三个平行样，结果以平均值±标准差形式表示。水华鱼腥藻抑制率公式：
如图2所示，所述菌株HY339发酵液对蓝藻代表水华鱼腥藻FACHB-1255(Anabaenaflos-aquae)的4天抑制率可达到91.1±6.1％。
实施例4菌株HY339发酵液乙酸乙酯-丙酮混合液粗提物的溶藻效果
将丙酮以5％体积比混入乙酸乙酯中得到乙酸乙酯-丙酮混合液。
取菌株HY339发酵5天的菌液，将乙酸乙酯-丙酮混合液按照1:1的比例加入菌株HY339发酵液中，混合后进行震荡5min，分离出的上层萃取液，将萃取液以旋转蒸发仪蒸干后得到发酵液粗提物，将粗提物用无菌水溶解至原菌液相同体积。对照为经相同处理后的未接种LB培养基。
将按照上述方法制得的发酵液初提物稀释液和培养基初提物稀释液分别以3％体积比添加量添加到处于对数生长期的水华鱼腥藻藻液中，发酵液萃取液处理组为实验组，培养基萃取液处理组为对照组。在光照培养箱中培养4天，每天取样测定对照组和实验组水华鱼腥藻生物量，计算溶藻效率，对照组和实验组各设三个平行样，结果以平均值±标准差形式表示。
如图3所示，菌液乙酸乙酯-丙酮溶液粗提物对水华鱼腥藻(Anabaena flos-aquae)的4天抑制率可达到51.5±11.5％。
实施例5菌株HY339在不同盐度条件下的生长情况
以不同盐度人工海水配置LB培养基并接种菌株HY339发酵培养3天，培养前后在490nm测定培养液吸光度值。
LB培养基不同盐度梯度设定为：0％、0.25％、0.5％、1％、2％和3.5％，实验第0天和第3天取菌液测定其在490nm波长下的吸光度三次，结果以平均值±标准差形式表示，如图4所示，吸光度分别为0.83、1.79、1.78、1.66、1.55、1.74，盐度为0.25％的培养基培养3天后菌液吸光度最高，说明菌株HY339虽然为海洋菌株，但在低盐度条件下也可正常生长，可在淡水条件下进行溶藻活动。
实施例6不同盐度条件下菌株HY339的发酵液对水华鱼腥藻生长的抑制效果
以不同盐度人工海水配置LB培养基并接种菌株HY339进行发酵培养5天，发酵条件：25℃，150rpm摇床培养。
将不同盐度培养条件下发酵好的菌液以3％接种率加入处于对数生长期的水华鱼腥藻藻液中，使用无菌的LB培养基以相同接种率加入藻液中作为对照，在光照培养箱中培养4天，每天取样测定对照组和实验组水华鱼腥藻生物量，计算溶藻效率，对照组和实验组各设三个平行样，结果以平均值±标准差形式表示。
如图5所示，菌株在不同盐度条件下(0％、0.25％、0.5％、1％、2％和3.5％)所培养的发酵液对水华鱼腥藻的4天抑制率分别为53.6％、86.0％、75.8％、81.0％、75.3％和85.8％。考虑到各盐度下菌株生长达到的密度差异，可分析出培养基盐度对发酵液抑制水华鱼腥藻生长的效果无显著性影响，且在所设定盐度范围内盐度为0.25％时发酵液抑制水华鱼腥藻生长效果最佳，说明菌株HY339适应淡水和低盐度培养后保持溶藻活性。
实施例7菌株HY339的16S rDNA序列分析和种属鉴定
预先对菌株HY339进行纯化培养并发酵2天后，由上海生工公司进行16S rDNA基因序列分析，根据基因序列分析结果构建该菌株系统发育树，见图6。如图6所示，鉴定菌株HY339为蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)。

Claims (5)

1.一株海洋蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)HY339，它的保藏编号是CGMCCNo.14207。
2.权利要求1所述的海洋蜡状芽孢杆菌CGMCC No.14207在控制水华鱼腥藻中的应用。
3.权利要求1所述的海洋蜡状芽孢杆菌CGMCC No.14207的发酵产物在控制蓝藻水华中的应用。
4.一种溶藻菌剂，其特征在于，所述溶藻剂中包含权利要求1所述的海洋蜡状芽孢杆菌CGMCC No.14207。
5.一种溶藻制剂，其特征在于，所述溶藻制剂中包含权利要求1所述的海洋蜡状芽孢杆菌CGMCC No.14207的发酵产物，所述发酵产物为发酵液、发酵液浓缩物、发酵液粗提物或发酵液提取物。
CN201710591053.9A 2017-07-19 2017-07-19 一株海洋蜡样芽胞杆菌及其在水华鱼腥藻防治方面的应用 Active CN107177538B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710591053.9A CN107177538B (zh) 2017-07-19 2017-07-19 一株海洋蜡样芽胞杆菌及其在水华鱼腥藻防治方面的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710591053.9A CN107177538B (zh) 2017-07-19 2017-07-19 一株海洋蜡样芽胞杆菌及其在水华鱼腥藻防治方面的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107177538A true CN107177538A (zh) 2017-09-19
CN107177538B CN107177538B (zh) 2019-12-06

Family

ID=59837565

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710591053.9A Active CN107177538B (zh) 2017-07-19 2017-07-19 一株海洋蜡样芽胞杆菌及其在水华鱼腥藻防治方面的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107177538B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114891666A (zh) * 2022-04-14 2022-08-12 厦门大学 海洋菌株及其催化制备四氢姜黄素的用途

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102154162A (zh) * 2010-12-30 2011-08-17 北京大学 一种解淀粉芽孢杆菌及其应用
CN102796685A (zh) * 2012-08-10 2012-11-28 上海交通大学 一株芽孢杆菌Bacillus SSAL-6及其在降解水华鱼腥藻中的应用
CN103695342A (zh) * 2013-12-12 2014-04-02 上海交通大学 一株具有溶藻活性的芽孢杆菌及其应用
CN104328075A (zh) * 2014-11-06 2015-02-04 山东宝来利来生物工程股份有限公司 一株具有溶藻能力的枯草芽孢杆菌及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102154162A (zh) * 2010-12-30 2011-08-17 北京大学 一种解淀粉芽孢杆菌及其应用
CN102796685A (zh) * 2012-08-10 2012-11-28 上海交通大学 一株芽孢杆菌Bacillus SSAL-6及其在降解水华鱼腥藻中的应用
CN103695342A (zh) * 2013-12-12 2014-04-02 上海交通大学 一株具有溶藻活性的芽孢杆菌及其应用
CN104328075A (zh) * 2014-11-06 2015-02-04 山东宝来利来生物工程股份有限公司 一株具有溶藻能力的枯草芽孢杆菌及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
李超等: "解淀粉芽孢杆菌对鱼腥藻的抑藻效果分析与机理初探", 《环境科学学报》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114891666A (zh) * 2022-04-14 2022-08-12 厦门大学 海洋菌株及其催化制备四氢姜黄素的用途
CN114891666B (zh) * 2022-04-14 2024-05-24 厦门大学 海洋菌株及其催化制备四氢姜黄素的用途

Also Published As

Publication number Publication date
CN107177538B (zh) 2019-12-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Lu et al. Bio-conversion of photosynthetic bacteria from non-toxic wastewater to realize wastewater treatment and bioresource recovery: a review
Schrader et al. Development of phytoplankton communities and common off-flavors in a biofloc technology system used for the culture of channel catfish (Ictalurus punctatus)
CN102888353B (zh) 溶藻细菌及其去除铜绿微囊藻的方法
CN103396950A (zh) 一种基于微藻养殖的沼液生态净化方法
CN103992187A (zh) 一种用于防治水体青苔的生物菌肥及其制备方法
CN103484370B (zh) 一种利用畜禽排泄物废水培养螺旋藻的方法
CN106148232B (zh) 一株拮抗植物病原细菌的细菌菌株及其应用
CN101503264A (zh) 一种异位生态修复富营养化水体的方法
CN103937726A (zh) 一种溶藻铜绿假单胞菌及其用途
CN109486733A (zh) 一株具有溶藻能力的交替单胞菌及其对东海原甲藻的应用
CN109234167A (zh) 一种小球藻及其在沼液净化中的应用
CN106591169B (zh) 一种n-甲基吡咯烷酮降解芽孢杆菌nmp-2及其应用
CN104140938A (zh) 一种防治果树腐烂病的拮抗细菌菌株及其应用
CN108004271B (zh) 一种具有溶藻活性的链霉菌及其应用
CN105110489A (zh) 一种高温期虾蟹养殖用净水保草生物制剂及其制备方法和应用
CN106222107B (zh) 一株来自猪场废弃物的极端嗜热细菌
CN102898197A (zh) 以藻泥作为添加剂生产促生生物有机肥的工艺及产品
CN111621431B (zh) 具有溶藻能力的海口小单胞菌及其对米氏凯伦藻的应用
CN107177538A (zh) 一株海洋蜡样芽胞杆菌及其在水华鱼腥藻防治方面的应用
CN107473980A (zh) 一种酰胺类化合物在制备细菌群体感应活性抑制剂中的应用
CN103952359A (zh) 一株短波单胞菌及其应用
CN105400697A (zh) 微藻在二氧化碳下生长净化未稀释厌氧发酵尾液的方法
CN102206605B (zh) 具有溶藻活性的微小杆菌及其在蓝藻水华控制中的应用
CN103255073B (zh) 一种光合细菌快速繁殖的方法
CN103484403B (zh) 从泥鳅体内筛选的溶藻菌及利用其去除铜绿微囊藻的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant