CN102796685A

CN102796685A - 一株芽孢杆菌Bacillus SSAL-6及其在降解水华鱼腥藻中的应用

Info

Publication number: CN102796685A
Application number: CN201210285075XA
Authority: CN
Inventors: 沈健英; 孙秀敏
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2012-08-10
Filing date: 2012-08-10
Publication date: 2012-11-28
Anticipated expiration: 2032-08-10
Also published as: CN102796685B

Abstract

本发明公开了一种芽孢杆菌及其在降解水华鱼腥藻中的应用，所述芽孢杆菌从农业部都市农业（南方）重点实验室黄化的水华鱼腥藻液中分离筛选获得，命名为芽孢杆菌Bacillus SSAL-6，已于2012年6月6日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.6195；在自然条件下，芽孢杆菌Bacillus SSAL-6对水华鱼腥藻的降解效果随菌株浓度的增大而增加，当芽孢杆菌的浓度为35%时，对水华鱼腥藻叶绿素a的抑制率可高达96%。本发明所述的芽孢杆菌Bacillus SSAL-6具有良好的溶藻效应，能够有效地降解水华鱼腥藻，对水体富营养化的控制提供了有效手段，为利用微生物治理水华提供了重要的方法。

Description

一株芽孢杆菌Bacillus SSAL-6及其在降解水华鱼腥藻中的应用

技术领域

本发明涉及一种微生物，具体涉及一株芽孢杆菌Bacillus SSAL-6及其在降解水华鱼腥藻中的应用，属于微生物技术领域。

背景技术

水体富营养化已成为困扰世界各国的普遍性环境问题。浮游藻类的大量繁殖导致水华的频繁爆发，严重影响了人类的生活、生产和身体健康，造成了世界范围内的生态灾害，探索控制水华发生的有效途径已迫在眉睫。目前治理水体富营养化主要是采用物理和化学方法，但这两种方法不仅会消耗大量的财力和物力，而且会在一定程度上破坏生态环境。溶藻菌作为水华和赤潮的防治生物，日益受到国内外环境工作者的广泛关注。国外对溶藻菌的研究已有数十年的历史，自Geitler报道一种寄生在刚毛藻上的粘细菌以来，陆续有溶藻菌的相关报道，研究重点也逐渐从单一溶藻菌的筛选及溶藻特性研究过渡到菌---藻种群生态学及分子调控机理等方面。目前，国内对溶藻细菌的研究还处于初始阶段，因此，寻找高效溶藻菌对溶藻菌的深入研究及应用具有重要意义。

水华鱼腥藻（引起水华的常见藻类）是导致水体富营养化的主要藻种之一，其分布广，能够产生藻毒素，直接和间接危害人类，然而截止目前，利用微生物方式控制水华鱼腥藻的研究甚是罕见。为此，探讨溶藻菌株对水华鱼腥藻的生长效应和光合色素的影响，对于安全、经济、高效地控制水体富营养化、治理水华具有重要的科学实践价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一株能够有效降解水华鱼腥藻的芽孢杆菌。

本发明所述的芽孢杆菌从农业部都市农业（南方）重点实验室黄化的水华鱼腥藻液中分离筛选获得，命名为芽孢杆菌Bacillus SSAL-6，已保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏日期：2012年6月6日，保藏编号：CGMCC No.6195。

本发明的另一目的是提供一种利用微生物去除水华鱼腥藻的方法，即所述芽孢杆菌Bacillus SSAL-6应用在降解水华鱼腥藻上，以消除当前水华中水华鱼腥藻的大量繁殖带来的环境污染问题。

所述的芽孢杆菌Bacillus SSAL-6的浓度为35%。

实验结果表明，在自然条件下，芽孢杆菌Bacillus SSAL-6对水华鱼腥藻的降解效果随菌株浓度的增大而增加，当芽孢杆菌Bacillus SSAL-6的浓度为35%时，对水华鱼腥藻叶绿素a的抑制率可高达96%。本发明所述的芽孢杆菌Bacillus SSAL-6具有良好的溶藻效应，能够有效地降解水华鱼腥藻，对水体富营养化的控制提供了有效手段，为微生物治理水华的研究提供了重要基础。

附图说明

图1为本发明的芽孢杆菌Bacillus SSAL-6在1000×下的染色显微图。

图2为本发明的芽孢杆菌Bacillus SSAL-6对水华鱼腥藻细胞数的影响。

图3为本发明的芽孢杆菌Bacillus SSAL-6对水华鱼腥藻干重的影响。

图4为本发明的芽孢杆菌Bacillus SSAL-6对水华鱼腥藻色素吸收光谱的影响。

图5为本发明的芽孢杆菌Bacillus SSAL-6对水华鱼腥藻叶绿素a的影响。

具体实施方式

实施例1、芽孢杆菌Bacillus SSAL-6的分离、纯化及其鉴定

1、芽孢杆菌Bacillus SSAL-6的分离及纯化

以农业部都市农业（南方）重点实验室黄化的水华鱼腥藻液作为溶藻细菌的分离源，采用涂布平板法及分区划线法多次纯化分离，将分离获得的25株细菌分别置于100mL LB液体培养基中，摇床转速为180r·min^-1，37℃下培养24h，然后分别取800μL滴加到水华鱼腥藻固体平板上，通过溶藻斑的大小考察、比较各菌的溶藻效果，最终筛选出具有较高溶藻效应的菌株SSAL-6。经鉴定为芽孢杆菌，命名为Bacillus SSAL-6。将其接入斜面培养基，于冰箱4℃保存；将扩大培养制成的菌悬液加入到灭菌的甘油中，甘油的最终浓度为25%，放入-80℃的冰箱保藏。

所述的LB液体培养基组分及配比为：酵母提取物，5g；胰蛋白胨，10g；NaCl，10g；蒸馏水1000mL；pH7.0-7.2。

所述的LB固体培养基组分及配比为：酵母提取物，5g；胰蛋白胨，10g；NaCl，10g；琼脂粉，15g；蒸馏水1000mL；pH7.0-7.2。

所述的水华鱼腥藻固体培养基组分及配比为：磷酸氢二钾(K₂HPO₄)，0.075g；硫酸镁(MgSO₄·H₂O)，0.125g；碳酸钙(CaCO₃)，0.100g；柠檬酸铁(1%水溶液)，0.5mL；柠檬酸(1%水溶液)，0.5mL；钼酸(1%水溶液)，5滴；氢氧化钠(1%水溶液)，1.5mL；琼脂粉，15g；蒸馏水，1000mL。

2、芽孢杆菌Bacillus SSAL-6的生理生化鉴定

该菌株为革兰氏阳性芽孢杆菌，杆状，芽孢为椭圆形，大多中央生菌落呈近橘黄色。

使用引物7f(5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3')和1540r(5'AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3')。经序列比对表明，该菌株为芽孢杆菌，将其命名为Bacillus SSAL-6。该芽孢杆菌Bacillus SSAL-6已于2012年6月6保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保存号为CGMCCNo.6195。

实施例2、芽孢杆菌Bacillus SSAL-6对水华鱼腥藻生长效应和光合色素的影响

1、芽孢杆菌Bacillus SSAL-6对水华鱼腥藻生长效应的影响

水华鱼腥藻培养参照藻类生长抑制实验的标准方法（国家环保部），采用水生111号无氮培养液培养，pH为7.5。培养温度30±2℃，连续24h光照，光照强度3000±200lx，静置培养，每天定期摇动3次。

在水华鱼腥藻浓度为5×10⁴~1×10⁵个/mL时，分别向100mL藻液中加入芽孢杆菌BacillusSSAL-6（菌体浓度约为10⁹个/mL），处理浓度(v/v)梯度为：5%、10%、15%、20%、25%、30%和35%，每组样设3个重复。制备与实验组相同的一系列不同配比的培养液（LB培养液：水生111号无氮培养液），分别用于培养芽孢杆菌Bacillus SSAL-6和水华鱼腥藻形成对照组。以细胞计数法测定藻体细胞数量并测定水华鱼腥藻干重。细胞计数方法：从接种计时起，每隔24h取样，用计数框进行细胞计数。用移液器取经过超声波破碎仪打碎过的藻液0.1mL于计数框中，在低倍镜下观察，放大倍数40×10，随机取五个视野，数出所看到的细胞数，取其平均值。N=10×a×S_计/S_视，其中，a--每个视野内细胞平均值，S_计--计数框面积，S_视--视野面积，N--每mL中细胞个数。水华鱼腥藻干重测定方法：取定量的藻液，离心得藻，加入称量皿，在80℃烘至恒重。

不同浓度的芽孢杆菌Bacillus SSAL-6对水华鱼腥藻的细胞数的影响的测定结果如图2所示。结果表明，水华鱼腥藻细胞的去除效果与芽孢杆菌Bacillus SSAL-6浓度呈现出一定的浓度---相关性，即随着芽孢杆菌Bacillus SSAL-6浓度的增长，对水华鱼腥藻细胞的去除作用增强。当芽孢杆菌Bacillus SSAL-6菌体浓度为5%、10%、15%、20%、25%、30%和35%时，培养24h对水华鱼腥藻细胞的去除率分别为3%、7%、12%、16%、19%、22%和25%，培养168h后分别变为5%、17%、26%、29%、31%、34%和36%，与对照相比，呈现显著差异（P＜0.05）。

不同浓度的芽孢杆菌Bacillus SSAL-6对水华鱼腥藻的干重的影响的测定结果如图3所示。结果表明，纯LB液体培养基的投入对水华鱼腥藻干重亦会产生影响，当LB液体培养基浓度依次为5%、10%、15%、20%、25%、30%和35%时，培养168h后的水华鱼腥藻干重相应增加，分别为15.90、16.40、16.77、17.74、18.11、19.38和22.04mg/mL。通过排除LB液体培养基本身对水华鱼腥藻生长的影响因素，可见，随着菌体浓度从5%依次升至35%，芽孢杆菌Bacillus SSAL-6对水华鱼腥藻干重的抑制率依次为5%、16%、27%、31%、36%、37%和40%。

所述的水华鱼腥藻液体培养基组分及配比为：磷酸氢二钾(K₂HPO₄)，0.075g；硫酸镁(MgSO₄·H₂O)，0.125g；碳酸钙(CaCO₃)，0.100g；柠檬酸铁(1%水溶液)，0.5mL；柠檬酸(1%水溶液)，0.5mL；钼酸(1%水溶液)，5滴；氢氧化钠(1%水溶液)，1.5mL；蒸馏水，1000mL。

2、芽孢杆菌Bacillus SSAL-6对水华鱼腥藻光合色素的影响

以Bhandari and Sharma法连续扫描400~750nm波长范围内色素吸收光谱，并对水华鱼腥藻叶绿素a含量进行测定。叶绿素a的提取测定：取水华鱼腥藻藻液10mL过0.45μm的混合纤维素膜，将带藻细胞的膜冷冻过夜，取出后迅速用8mL热乙醇于热水浴中萃取2min，将萃取液超声破碎5-20min后，于暗处静置2-6h，离心(5000r/min,4℃)5min后取上清液3.5mL置于比色皿中，于665nm和750nm处测吸光值，计算酸化前的光密度值（E_665b＝Abs_65b-Abs_750b），然后滴加200μL的1mol/L盐酸酸化，5min后于波长665nm和750nm处再测吸光值，计算酸化后的光密度值（E_665a＝Abs_665a-Abs_750a）。采用热乙醇为萃取溶剂，A=11.5，K=2.43，比色皿光程为1cm

不同浓度的芽孢杆菌Bacillus SSAL-6对水华鱼腥藻色素吸收光谱的影响的测定结果如图4所示。结果表明，不同浓度的芽孢杆菌Bacillus SSAL-6作用于水华鱼腥藻时，其色素光谱吸收曲线变化差异较大。高浓度（＞25%）处理下光谱吸收曲线已非常不明显，各处峰值模糊甚微，表明芽孢杆菌Bacillus SSAL-6已大大地抑制了藻体色素的种类和含量。中低浓度（5~25%）处理下，随着菌体浓度的增加，各色素光谱吸收峰值均有降低，这与溶藻菌对藻体细胞数以及干重的影响相一致，谱图充分体现溶藻菌的浓度相关性。

叶绿素a是光能的捕获者，也是叶绿体膜内光传导者，因此叶绿素a含量的多少，充分反映出藻体光合成能力的强弱。不同浓度的芽孢杆菌Bacillus SSAL-6对水华鱼腥藻叶绿素a的影响的测定结果如图5所示（A、B、C、D、E、F、G、H分别代表芽孢杆菌Bacillus SSAL-6浓度为0%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%）。结果表明，芽孢杆菌Bacillus SSAL-6对叶绿素a的抑制作用随着菌体浓度的增加而增强。菌体浓度为5%、10%、15%、20%、25%、30%和35%，对芽孢杆菌Bacillus SSAL-6而言，24h对叶绿素a的抑制率分别为8%、14%、21%、29%、35%、42%和46%，168h后依次升至74%、81%、90%、94%、95%、95%和96%。此外，芽孢杆菌Bacillus SSAL-6对叶绿素a的抑制率亦随着时间的延伸而增大，但增势趋缓，如浓度为35%的芽孢杆菌Bacillus SSAL-6在24~120h内对水华鱼腥藻叶绿素a的抑制率由46%逐渐升至95%，而120~168h由95%仅升至96%。

Claims

1.芽孢杆菌（Bacillus）SSAL-6，其特征在于：其保藏编号为CGMCCNo.6195。

2.如权利要求1所述的芽孢杆菌（Bacillus）SSAL-6在降解水华鱼腥藻中的应用。

3.如权利要求2所述的芽孢杆菌（Bacillus）SSAL-6在降解水华鱼腥藻中的应用的方法，其特征在于：所述的芽孢杆菌Bacillus SSAL-6的浓度为35%。