CN102816718B - 一株芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物技术领域，特别涉及一株芽孢杆菌及其应用。本发明提供一株芽孢杆菌（Bacillus）SSAL-1，保藏号为CGMCCNo.6194。本发明的芽孢杆菌SSAL-1能够有效地降解水华鱼腥藻，在一定条件下，芽孢杆菌SSAL-1对水华鱼腥藻的降解效果随菌株浓度的增大而增加，当芽孢杆菌SSAL-1的浓度为35%时，对水华鱼腥藻叶绿素a的抑制率可高达96%。

Description

一株芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，特别涉及一株芽孢杆菌及其应用。

背景技术

水体富营养化已成为困扰世界各国的普遍性环境问题。浮游藻类的大量繁殖导致水华的频繁爆发，严重影响了人类的生活、生产和身体健康，造成了世界范围内的生态灾害，因此，探索控制水华发生的有效途径已迫在眉睫。目前，治理水体富营养化主要是采用物理和化学方法，但这两种方法不仅会消耗大量的财力和物力，而且会在一定程度上破坏生态环境。溶藻菌作为水华和赤潮的防治生物，日益受到国内外环境工作者的广泛关注。国外对溶藻菌的研究已有数十年的历史，自Geitler报道一种寄生在刚毛藻上的粘细菌以来，陆续有溶藻菌的相关报道，研究重点也逐渐从单一溶藻菌的筛选及溶藻特性研究过渡到菌---藻种群生态学及分子调控机理等方面。目前，国内对溶藻细菌的研究还处于初始阶段，因此，寻找高效溶藻菌对溶藻菌的深入研究及应用具有重要意义。

水华鱼腥藻是导致水体富营养化的主要藻种之一，其分布广，能够产生藻毒素，直接和间接危害人类，然截止目前，利用微生物方式控制水华鱼腥藻的研究甚是罕见。

发明内容

本发明目的在于提供一株芽孢杆菌，它可以影响水华鱼腥藻的生长效应和光合色素，从而起到溶藻作用。

本发明所提供的是芽孢杆菌（Bacillus）SSAL-1，保藏号为CGMCC No.6194。

本发明从农业部都市农业（南方）重点实验室黄化的水华鱼腥藻液中分离筛选并获得一株对水华鱼腥藻具有良好溶藻效应的细菌，经鉴定为芽孢杆菌，命名为SSAL-1，分类命名为芽孢杆菌（Bacillus）。

本发明芽孢杆菌SSAL-1具有以下微生物学特性：该菌株为革兰氏阳性芽孢杆菌，杆状，芽孢为椭圆形，大多中央生菌落呈近白色。

本发明的芽孢杆菌SSAL-1能够有效地降解水华鱼腥藻，对水体富营养化的控制提供了科学依据，为微生物治理水华的研究提供了重要基础。在一定条件下，芽孢杆菌SSAL-1对水华鱼腥藻的降解效果随菌株浓度的增大而增加，当芽孢杆菌SSAL-1的浓度为35%时，对水华鱼腥藻叶绿素a的抑制率可高达96%。

保藏信息

本发明的芽孢杆菌（Bacillus）SSAL-1保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2012年6月6日，保藏编号：CGMCC No.6194。

附图说明

图1为芽孢杆菌SSAL-1在1000×下的染色显微图；

图2为芽孢杆菌SSAL-1对水华鱼腥藻细胞数的影响示意图；

图3为芽孢杆菌SSAL-1对水华鱼腥藻干重的影响示意图；

图4为芽孢杆菌SSAL-1对水华鱼腥藻色素吸收光谱的影响示意图；

图5为芽孢杆菌SSAL-1对水华鱼腥藻叶绿素a的影响示意图。

具体实施方式

以下举例说明本发明，但是并不用于限定本发明的保护范围。

实施例1芽孢杆菌SSAL-1的分离、纯化及其鉴定

1）、芽孢杆菌SSAL-1的分离及纯化

以农业部都市农业（南方）重点实验室黄化的水华鱼腥藻液作为溶藻细菌的分离源，采用涂布平板法及分区划线法多次纯化分离，将分离获得的25株细菌分别置于100mL LB液体培养基中，于180r·min^-1，37℃下培养24h，然后分别取800μL滴加到水华鱼腥藻固体平板上，通过溶藻斑的大小考察、比较各菌的溶藻效果，最终筛选出具高溶藻效应的菌株SSAL-1，其在显微镜下的结构如图1所示。经鉴定为芽孢杆菌，命名为SSAL-1，分类命名为芽孢杆菌（Bacillus）。将其接入斜面培养基，于冰箱4℃保存；将扩大培养制成的菌悬液加入到灭菌的甘油中，甘油的最终浓度为25%，放入-80℃的冰箱保藏。

其中，上述的LB液体培养基组分及配比为：酵母提取物，5g；胰蛋白胨，10g；NaCl，10g；蒸馏水1000mL；LB液体培养基的pH值为7.0-7.2。上述的水华鱼腥藻固体培养基组分及配比为：磷酸氢二钾(K₂HPO₄)，0.075g；硫酸镁(MgSO₄·H₂O)，0.125g；碳酸钙(CaCO₃)，0.100g；柠檬酸铁(1%水溶液)，0.5mL；柠檬酸(1%水溶液)，0.5mL；钼酸(1%水溶液)，5滴；氢氧化钠(1%水溶液)，1.5mL；琼脂粉，15g；蒸馏水，1000mL。

2）、芽孢杆菌SSAL-1的生理生化鉴定

经鉴定可知该菌株为革兰氏阳性芽孢杆菌，杆状，芽孢为椭圆形，大多中央生菌落呈近白色。

使用引物7f(5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3')和1540r(5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3')构筑得到SSAL-1菌株的DNA序列，该序列具有序列表中序列1的核苷酸序列。经序列比对表明，经鉴定为芽孢杆菌，命名为SSAL-1，分类命名为芽孢杆菌（Bacillus）。该芽孢杆菌SSAL-1已于2012年6月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保存号为CGMCCNo.6194。

实施例2芽孢杆菌SSAL-1对水华鱼腥藻生长效应和光合色素的影响

1）、芽孢杆菌SSAL-1对水华鱼腥藻生长效应的影响

水华鱼腥藻培养参照藻类生长抑制实验的标准方法（国家环保部），采用水生111号无氮培养液培养，pH为7.5。培养温度30±2℃，连续24h光照，光照强度3000±200lx，静置培养，每天定期摇动3次。

在水华鱼腥藻浓度为5×10⁴~1×10⁵个/mL时，分别向100mL藻液中加入芽孢杆菌SSAL-1（菌体浓度约为10⁹个/mL），处理浓度(v/v)梯度为：5%、10%、15%、20%、25%、30%和35%，每组样设3个重复。制备与实验组相同的一系列不同配比的培养液（LB培养液：水生111号无氮培养液），分别用于培养溶藻菌和水华鱼腥藻形成对照组。以细胞计数法测定藻体细胞数量、并测定水华鱼腥藻干重。细胞计数方法：从接种计时起，每隔24h取样，用计数框进行细胞计数。用移液器取经过超声波破碎仪打碎过的藻液0.1mL于计数框中，在低倍镜下观察，放大倍数40×10，随机取五个视野，数出所看到的细胞数，取其平均值。N=10×a×S_计/S_视；a--每个视野内细胞平均值；S_计--计数框面积；S_视--视野面积；N--每mL中细胞个数。水华鱼腥藻干重测定方法：取定量的藻液，离心得藻，加入称量皿，在80℃烘至恒重。

不同浓度的芽孢杆菌SSAL-1对水华鱼腥藻的细胞数的影响的测定结果如图2所示，结果表明：水华鱼腥藻细胞的去除效果与芽孢杆菌SSAL-1的浓度呈现出一定的浓度---相关性，即随着芽孢杆菌SSAL-1浓度的增长，对水华鱼腥藻细胞的去除作用越强。当芽孢杆菌SSAL-1菌体浓度为5%、10%、15%、20%、25%、30%和35%时，培养24h对水华鱼腥藻细胞的去除率分别为57%、65%、81%、86%、87%、89%和90%，培养168h后分别变为86%、86%、89%、91%、91%、92%和92%，与对照相比，呈现显著差异（P<0.05）。

不同浓度的芽孢杆菌SSAL-1对水华鱼腥藻的干重的影响的测定结果如图3所示，结果表明：纯LB液体培养基的投入对水华鱼腥藻干重亦会产生影响，当LB液体培养基浓度依次为5%、10%、15%、20%、25%、30%和35%时，培养24h后的水华鱼腥藻干重相应增加，分别为7.25、9.09、10.69、11.16、12.53、13.38和13.84mg/mL，而投加不同浓度（5%~35%）的芽孢杆菌SSAL-1后，分别为2.97、3.27、2.24、1.79、1.34和1.52mg/mL。通过排除LB液体培养基本身对水华鱼腥藻生长的影响因素，可见，随着菌体浓度从5%依次升至35%，芽孢杆菌SSAL-1对水华鱼腥藻干重的抑制率依次为59%、64%、79%、84%、86%、90%和89%。

2）、芽孢杆菌SSAL-1对水华鱼腥藻光合色素的影响

以Bhandari and Sharma法连续扫描400~750nm波长范围内色素吸收光谱，并对水华鱼腥藻叶绿素a含量进行测定。叶绿素a的提取测定：取水华鱼腥藻藻液10mL过0.45μm的混合纤维素膜，将带藻细胞的膜冷冻过夜，取出后迅速用8mL热乙醇于热水浴中萃取2min，将萃取液超声破碎5-20min后，于暗处静置2-6h，离心(5000r/min,4℃)5min后取上清液3.5mL置于比色皿中，于665nm和750nm处测吸光值，计算酸化前的光密度值（E_665b＝Abs_665b-Abs_750b），然后滴加200μL的1mol/L盐酸酸化，5min后于波长665nm和750nm处再测吸光值，计算酸化后的光密度值（E_665a＝Abs_665a-Abs_750a）。采用热乙醇为萃取溶剂，A=11.5，K=2.43，比色皿光程为1cm

其中，v表示提取液体积(mL)，V表示样品的体积(L)。

不同浓度的芽孢杆菌SSAL-1对水华鱼腥藻色素吸收光谱的影响的测定结果如图4所示，结果表明：不同浓度的芽孢杆菌SSAL-1作用于水华鱼腥藻时，其色素光谱吸收曲线变化表现出一致性。在5%~35%浓度芽孢杆菌SSAL-1菌株处理下，各光谱吸收曲线已非常不明显，各处峰值模糊甚微，表明芽孢杆菌SSAL-1大大地抑制了藻体色素的种类和含量。

叶绿素a是光能的捕获者，也是叶绿体膜内光传导者，因此叶绿素a含量的多少，充分反映出藻体光合成能力的强弱。不同浓度的芽孢杆菌SSAL-1对水华鱼腥藻叶绿素a的影响的测定结果如图5所示（A、B、C、D、E、F、G、H分别代表溶藻菌浓度为0%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%），结果表明：芽孢杆菌SSAL-1对叶绿素a的抑制作用随着菌体浓度的增加而增强。菌体浓度为5%、10%、15%、20%、25%、30%和35%，对芽孢杆菌SSAL-1而言，24h对叶绿素a的抑制率分别为61%、68%、82%、88%、89%、90%和91%，168h后依次升至92%、94%、94%、94%、94%、95%和96%。

本发明的芽孢杆菌SSAL-1能够有效地降解水华鱼腥藻，对水体富营养化的控制提供了科学依据，为微生物治理水华的研究提供了重要基础。在一定条件下，芽孢杆菌SSAL-1对水华鱼腥藻的降解效果随菌株浓度的增大而增加，当芽孢杆菌SSAL-1的浓度为35%时，对水华鱼腥藻叶绿素a的抑制率可高达96%。

以上公开的仅为本申请的几个具体实施例，但本申请并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化，都应落在本申请的保护范围内。

序列表

<110>上海交通大学

<120>一株芽孢杆菌及其应用

<160>1

<170>PatentIn version3.5

<210>1

<211>1572

<212>DNA

<213>芽孢杆菌（Bacillus）SSAL-1

<400>1

cagagtttga tcctggctga tcctggctca gagtttgatc ctggctcagg atgaacgctg 60

gcggcgtgcc taatacatgc aagtcgagcg aatggattaa gagcttgctc ttatgaagtt 120

agcggcggac gggtgagtaa cacgtgggta acctgcccat aagactggga taactccggg 180

aaaccggggc taataccgga taacattttg aaccgcatgg ttcgaaattg aaaggcggct 240

tcggctgtca cttatggatg gacccgcgtc gcattagcta gttggtgagg taacggctca 300

ccaaggcaac gatgcgtagc cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac 360

ggcccagact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac 420

ggagcaacgc cgcgtgagtg atgaaggctt tcgggtcgta aaactctgtt gttagggaag 480

aacaagtgct agttgaataa gctggcacct tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta 540

actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc gttatccgga attattgggc 600

gtaaagcgcg cgcaggtggt ttcttaagtc tgatgtgaaa gcccacggct caaccgtgga 660

gggtcattgg aaactgggag acttgagtgc agaagaggaa agtggaattc catgtgtagc 720

ggtgaaatgc gtagagatat ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactttc tggtctgtaa 780

ctgacactga ggcgcgaaag cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg 840

ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttagagg gtttccgccc tttagtgctg aagttaacgc 900

attaagcact ccgcctgggg agtacggccg caaggctgaa actcaaagga attgacgggg 960

gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca acgcgaggaa ccttaccagg 1020

tcttgacatc ctctgacaac cctagagata gggcttctcc ttcgggagca gagtgacagg 1080

tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg 1140

caacccttga tcttagttgc catcattcag ttgggcactc taaggtgact gccggtgaca 1200

aaccggagga aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct gggctacaca 1260

cgtgctacaa tggacggtac aaagagctgc aagaccgcga ggtggagcta atctcataaa 1320

accgttctca gttcggattg taggctgcaa ctcgcctaca tgaagctgga atcgctagta 1380

atcgcggatc agcatgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac 1440

accacgagag tttgtaacac ccgaagtcgg tggggtaacc tttttggagc cagccgccta 1500

aggtgggaca gatgattggg gtgaagtcgt aacaaggtag ccgtatcgga aggtgcggct 1560

ggatcacctc ct 1572

Claims (2)

1.一株芽孢杆菌（Bacillus sp.）SSAL-1，保藏号为CGMCC No.6194。

2.权利要求1所述的芽孢杆菌SSAL-1在降解水华鱼腥藻中的应用。