CN102851236B - 一株不动杆菌及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株不动杆菌及其构建方法和应用。其中的不动杆菌从黄化的水华鱼腥藻液中分离筛选并获得，该不动杆菌的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，命名为Acinetobacter SSAL-8。该不动杆菌可用于降解水华鱼腥藻，其降解效果随菌株浓度的增大而增加，当菌株的浓度为35％时，对水华鱼腥藻叶绿素a的抑制率达91％。

Description

一株不动杆菌及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术，具体涉及一株不动杆菌及其构建方法和应用。

背景技术

水体富营养化已成为困扰世界各国的普遍性环境问题。浮游藻类的大量繁殖导致水华的频繁爆发，严重影响了人类的生活、生产和身体健康，造成了世界范围内的生态灾害，探索控制水华发生的有效途径已迫在眉睫。目前治理水体富营养化主要是采用物理和化学方法，但这两种方法不仅会消耗大量的财力和物力，而且会在一定程度上破坏生态环境。溶藻菌作为水华和赤潮的防治生物，日益受到国内外环境工作者的广泛关注。国外对溶藻菌的研究已有数十年的历史，自Geitler报道一种寄生在刚毛藻上的粘细菌以来，陆续有溶藻菌的相关报道，研究重点也逐渐从单一溶藻菌的筛选及溶藻特性研究过渡到菌---藻种群生态学及分子调控机理等方面。目前，国内对溶藻细菌的研究还处于初始阶段，因此，寻找高效溶藻菌对溶藻菌的深入研究及应用具有重要意义。

水华鱼腥藻是导致水体富营养化的主要藻种之一，分布广，能够产生藻毒素，直接和间接危害人类，然截止目前，利用微生物方式控制水华鱼腥藻的研究甚是罕见。为此，本发明通过分离纯化高效溶藻菌株，探讨该溶藻菌株对水华鱼腥藻的生长效应和光合色素的影响，对于安全、经济、高效的控制水体富营养化、治理水华具有重要的科学实践价值。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种不动杆菌；本发明的目的之二是提供一种利用微生物去除水华鱼腥藻(引起水华的常见藻类)的方法，以消除当前水华中水华鱼腥藻的大量繁殖带来的环境污染问题。

本发明中的不动杆菌从农业部都市农业(南方)重点实验室黄化的水华鱼腥藻液中分离筛选并获得，已于2012年6月6日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。保藏编号为CGMCC No.6196。其分类命名为：不动杆菌，拉丁名：Acinetobacter sp.。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：一株不动杆菌，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，命名为Acinetobacter SSAL-8。

上述不动杆菌的构建方法，包括以下步骤：

A、以黄化的水华鱼腥藻液作为溶藻细菌的分离源，采用涂布平板法及分区划线法多次纯化分离得到25株溶藻细菌；

B、将分离获得的25株溶藻细菌分别置于100mL LB液体培养基中，在180r·min^-1、37℃下培养24h；

C、将经过培养的25株溶藻细菌分别取800μL滴加到水华鱼腥藻固体平板上，通过溶藻斑的大小考察、比较各菌的溶藻效果，最终筛选出具有较高溶藻效应的菌株SSAL-8，经鉴定为芽孢杆菌，命名为Acinetobacter SSAL-8；

D、将菌株Acinetobacter SSAL-8接入斜面培养基，于4℃扩大培养制成菌悬液；

E、将菌悬液加入到灭菌的甘油中，甘油的最终浓度为25％，放入-80℃的冰箱保藏。

上述的不动杆菌的构建方法，其中，所述的LB液体培养基的组分及含量为：酵母提取物，5g；胰蛋白胨，10g；NaCl，10g；蒸馏水1000mL；pH7.0-7.2。

上述的不动杆菌的构建方法，其中，所述的斜面培养基的组分及含量为：磷酸氢二钾(K₂HPO₄)，0.075g；硫酸镁(MgSO₄·H₂O)，0.125g；碳酸钙(CaCO₃)，0.100g；柠檬酸铁(1％水溶液)，0.5mL；柠檬酸(1％水溶液)，0.5mL；钼酸(1％水溶液)，5滴；氢氧化钠(1％水溶液)，1.5mL；琼脂粉，15g；蒸馏水，1000mL。

上述不动杆菌用于降解水华鱼腥藻，其降解效果随菌株浓度的增大而增加，当菌株的浓度为35％时，对水华鱼腥藻叶绿素a的抑制率达91％。

附图说明

图1为不动杆菌Acinetobacter SSAL-8对水华鱼腥藻细胞数的影响；

图2为不动杆菌Acinetobacter SSAL-8对水华鱼腥藻干重的影响；

图3为不动杆菌Acinetobacter SSAL-8对水华鱼腥藻色素吸收光谱的影响；

图4为不动杆菌Acinetobacter SSAL-8对水华鱼腥藻叶绿素a的影响。

具体实施方式

实施例1、不动杆菌Acinetobacter SSAL-8的分离、纯化及其鉴定

不动杆菌Acinetobacter SSAL-8的分离及纯化

以农业部都市农业(南方)重点实验室黄化的水华鱼腥藻液作为溶藻细菌的分离源，采用涂布平板法及分区划线法多次纯化分离，将分离获得的25株细菌分别置于100mL LB液体培养基中，180r·min^-1，37℃下培养24h，然后分别取800μL滴加到水华鱼腥藻固体平板上，通过溶藻斑的大小考察、比较各菌的溶藻效果，最终筛选出具有较高溶藻效应的菌株SSAL-8。经鉴定为芽孢杆菌，命名为Acinetobacter SSAL-8。将其接入斜面培养基，于冰箱4℃保存；将扩大培养制成的菌悬液加入到灭菌的甘油中，甘油的最终浓度为25％，放入-80℃的冰箱保藏。

所述的LB液体培养基的组分及含量为：酵母提取物，5g；胰蛋白胨，10g；NaCl，10g；蒸馏水1000mL；pH7.0-7.2。

所述的斜面培养基的组分及含量为：磷酸氢二钾(K₂HPO₄)，0.075g；硫酸镁(MgSO₄·H₂O)，0.125g；碳酸钙(CaCO₃)，0.100g；柠檬酸铁(1％水溶液)，0.5mL；柠檬酸(1％水溶液)，0.5mL；钼酸(1％水溶液)，5滴；氢氧化钠(1％水溶液)，1.5mL；琼脂粉，15g；蒸馏水，1000mL。

不动杆菌Acinetobacter SSAL-8的生理生化鉴定

该菌株为革兰氏阴性不动杆菌，杆状，芽孢近圆形，大多中央生菌落呈近白色。

使用引物7f(5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′)和1540r(5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)。经序列比对表明，该菌株为不动杆菌，将其命名为Acinetobacter SSAL-8。该不动杆菌Acinetobacter SSAL-8已于2012年6月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存号为CGMCCNo.6196。

实施例2、不动杆菌Acinetobacter SSAL-8对水华鱼腥藻生长效应和光合色素的影响

不动杆菌Acinetobacter SSAL-8对水华鱼腥藻生长效应的影响

水华鱼腥藻培养参照藻类生长抑制实验的标准方法(国家环保部)，采用水生111号无氮培养液培养，pH为7.5。培养温度30±2℃，连续24h光照，光照强度3000±200lx，静置培养，每天定期摇动3次。

在水华鱼腥藻浓度为5×10⁴～1×10⁵个/mL时，分别向100mL藻液中加入不动杆菌Acinetobacter SSAL-8(菌体浓度约为10⁹个/mL)，处理浓度(v/v)梯度为：5％、10％、15％、20％、25％、30％和35％，每组样设3个重复。制备与实验组相同的一系列不同配比的培养液(LB培养液：水生111号无氮培养液)，分别用于培养不动杆菌Acinetobacter SSAL-8和水华鱼腥藻形成对照组。以细胞计数法测定藻体细胞数量、并测定水华鱼腥藻干重。细胞计数方法：从接种计时起，每隔24h取样，用计数框进行细胞计数。用移液器取经过超声波破碎仪打碎过的藻液0.1mL于计数框中，在低倍镜下观察，放大倍数40×10，随机取五个视野，数出所看到的细胞数，取其平均值。N＝10×a×S_计/S_视；a--每个视野内细胞平均值；S_计--计数框面积；S_视--视野面积；N--每mL中细胞个数。水华鱼腥藻干重测定方法：取定量的藻液，离心得藻，加入称量皿，在80℃烘至恒重。

不同浓度的不动杆菌Acinetobacter SSAL-8对水华鱼腥藻的细胞数的影响的测定结果如图1所示，结果表明水华鱼腥藻细胞的去除效果与不动杆菌AcinetobacterSSAL-8浓度呈现出一定的相关性，即随着不动杆菌Acinetobacter SSAL-8浓度的增长，对水华鱼腥藻细胞的去除作用越强。当不动杆菌Acinetobacter SSAL-8菌体浓度为5％、10％、15％、20％、25％、30％和35％时，培养24h对水华鱼腥藻细胞的去除率分别为2％、5％、11％、15％、18％、21％和24％，培养168h后分别变为5％、16％、25％、28％、29％、32％和34％，与对照相比，呈现显著差异(P＜0.05)。

不同浓度的不动杆菌Acinetobacter SSAL-8对水华鱼腥藻的干重的影响的测定结果如图2所示，结果表明纯LB液体培养基的投入对水华鱼腥藻干重亦会产生影响，当LB液体培养基浓度依次为5％、10％、15％、20％、25％、30％和35％时，培养168h后的水华鱼腥藻干重相应增加，分别为15.90、16.40、16.77、17.74、18.11、19.38和22.04mg/mL。通过排除LB液体培养基本身对水华鱼腥藻生长的影响因素，可见，随着菌体浓度从5％依次升至35％，不动杆菌Acinetobacter SSAL-8对水华鱼腥藻干重的抑制率依次为4％、15％、25％、29％、35％、36％和38％。

不动杆菌Acinetobacter SSAL-8对水华鱼腥藻光合色素的影响

以Bhandari and Sharma法连续扫描400～750nm波长范围内色素吸收光谱，并对水华鱼腥藻叶绿素a含量进行测定。叶绿素a的提取测定：取水华鱼腥藻藻液10mL过0.45μm的混合纤维素膜，将带藻细胞的膜冷冻过夜，取出后迅速用8mL热乙醇于热水浴中萃取2min，将萃取液超声破碎5-20min后，于暗处静置2-6h，离心(5000r/min，4℃)5min后取上清液3.5mL置于比色皿中，于665nm和750nm处测吸光值，计算酸化前的光密度值(E_665b＝Abs_665b-Abs_750b)，然后滴加200μL的1mol/L盐酸酸化，5min后于波长665nm和750nm处再测吸光值，计算酸化后的光密度值(E_665a＝Abs_665a-Abs_750a)。采用热乙醇为萃取溶剂，A＝11.5，K＝2.43，比色皿光程为1cm

叶绿素 $a(\mathrm{\μg}/\mathrm{mL})=\frac{27.9\×(E_{665b}-E_{665a})\×v}{V}$

不同浓度的不动杆菌Acinetobacter SSAL-8对水华鱼腥藻色素吸收光谱的影响的测定结果如图3所示，结果表明不同浓度的不动杆菌Acinetobacter SSAL-8作用于水华鱼腥藻时，其色素光谱吸收曲线变化差异较大。高浓度(＞25％)处理下光谱吸收曲线已非常不明显，各处峰值模糊甚微，表明Acinetobacter SSAL-8已大大地抑制了藻体色素的种类和含量。中低浓度(5～25％)处理下，随着菌体浓度的增加，各色素光谱吸收峰值均有降低，这与不动杆菌Acinetobacter SSAL-8对藻体细胞数以及干重的影响相一致，谱图充分体现溶藻菌的浓度相关性。

叶绿素a是光能的捕获者，也是叶绿体膜内光传导者，因此叶绿素a含量的多少，充分反映出藻体光合成能力的强弱。不同浓度的不动杆菌Acinetobacter SSAL-8对水华鱼腥藻叶绿素a的影响的测定结果如图4所示(A、B、C、D、E、F、G、H分别代表不动杆菌Acinetobacter SSAL-8浓度为0％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％)，结果表明溶藻菌对叶绿素a的抑制作用随着菌体浓度的增加而增强。菌体浓度为5％、10％、15％、20％、25％、30％和35％，对不动杆菌AcinetobacterSSAL-8而言，24h对叶绿素a的抑制率分别为6％、12％、21％、29％、30％、41％和43％，168h后依次升至61％、68％、82％、90％、87％、90％和91％。

序列表

<110>上海交通大学

<120>一株不动杆菌及其构建方法和应用

<160>1

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>1531

<212>DNA

<213>Acinetobacter SSAL-8

<400>1

cagagtttga tcctggctca gattgaacgc tggcggcagg cttaacacat gcaagtcgag      60

cggagtgatg gtgcttgcac tatcacttag cggcggacgg gtgagtaatg cttaggaatc     120

tgcctattag tgggggacaa catctcgaaa gggatgctaa taccgcatac gtcctacggg     180

agaaagcagg ggatcacttg tgaccttgcg ctaatagatg agcctaagtc ggattagcta     240

gttggtgggg taaaggccta ccaaggcgac gatctgtagc gggtctgaga ggatgatccg     300

ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgg     360

acaatggggg gaaccctgat ccagccatgc cgcgtgtgtg gagaaggcct tatggttgta     420

aagcacttta agcgaggagg aggctctttt ggttaatacc caagatgagt ggacgttact     480

cgcagaataa gcaccggcta actctgtgcc agcagccgcg gtaatacaga gggtgcaagc     540

gttaatcgga tttactgggc gtaaagcgcg cgtaggcggc caattaagtc aaatgtgaaa     600

tccccgagct taacttggga attgcattcg atactggttg gctagagtgt gggagaggat     660

ggtagaattc caggtgtagc ggtgaaatgc gtagagatct ggaggaatac cgatggcgaa     720

ggcagccatc tggcctaaca ctgacgctga ggtgcgaaag catggggagc aaacaggatt     780

agataccctg gtagtccatg ccgtaaacga tgtctaccag ccgttggggc ctttgaggct     840

ttagtggcga agctaacgcg ataagtagac cgcctgggga gtacggtcgc aagactaaaa     900

ctcaaatgaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagga tgtggtttaa ttcgatgcaa     960

cgcgaagaac cttacctggc cttgacatag tagaaacttt ccagagatgg attggtgcct    1020

tcgggaatct acatacaggt gctgcatggc tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg    1080

ttaagtcccg caacgagcgc aaccctcttc cttacttgcc agcatttcgg atgggaactt    1140

taaggatact gccagtgaca aactggagga aggcggggac gacgtcaagt catcatggcc    1200

cttacggcca gggctacaca cgtgctacaa tggtcggtac aaagggttgc tacctagcga    1260

taggatgcta atctcaaaaa gccgatcgta gtccggattg gagtctgcaa ctcgactcca    1320

tgaagtcgga atcgctagta atcgcggatc agaatgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc    1380

ttgtacacac cgcccgtcac accatgggag tttgttgcac cagaagtagc tagcctaact    1440

gcaaagaggg cggttaccac ggtgtggccg atgactgggg tgaagtcgta acaaggtagc    1500

cgtaggggaa cctgcggctg gatcacctcc t                                   1531

Claims (2)

1.一株不动杆菌Acinetobacter SSAL-8，其特征在于，所述菌株保藏号为CGMCC No.6196，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.如权利要求1中所述的不动杆菌的应用，其特征在于：所述的不动杆菌用于降解水华鱼腥藻，其降解效果随菌株浓度的增大而增加，当菌株的浓度为35%时，对水华鱼腥藻叶绿素a的抑制率达91%。

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