CN102181384B - 可代谢呋喃唑酮的乙酸钙不动杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及利用微生物进行环境治理领域，具体地说可代谢呋喃唑酮的醋酸钙不动杆菌及其应用。乙酸钙不动杆菌Acinetobacter calcoaceticus T32，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)登记保藏；保藏日期为2010年11月06日；编号为CGMCC No.4311。所述乙酸钙不动杆菌可作为降解呋喃唑酮的菌剂。本发明利用T32自身的代谢过程清除环境中的呋喃唑酮具有降解速度快、操作简单、费用低等优点。

Description

可代谢呋喃唑酮的乙酸钙不动杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及利用微生物进行环境治理领域，具体地说是可代谢呋喃唑酮的醋酸钙不动杆菌及其应用。 

背景技术

呋喃唑酮又名痢特灵，分子式为C₈H₇N₃O₅，是一种人工合成的具有5-硝基呋喃基本结构的广谱抗菌药物。由于呋喃唑酮具有价格便宜、药效快等优点，常用来预防和控制霍乱、球虫病、猪肠炎和火鸡黑头病等因细菌和原生物引起的感染，在水产养殖中也有一定的应用。然而研究表明，呋喃唑酮可使实验动物发生基因突变并诱发癌变。呋喃唑酮在水产养殖环境中的残留导致鱼虾类的慢性中毒，严重危及鱼类的健康养殖。目前国际上已经将呋喃唑酮列为违禁药物，我国的农业部文件农牧发[2002]1号也规定动物源性食品中呋喃唑酮的检出限为不得检出，并颁布了禁止使用该类兽药的禁令。目前，相对于呋喃唑酮的检测和监控相比，如何去除环境和生物体中的呋喃唑酮的研究报道较少。相比物理化学的呋喃唑酮去除方式，生物处理具有降解彻底、费用低、无二次污染等优点，加上微生物本身具有较强的有适应环境能力强、代谢多样性高等优点，对环境中多种有机污染物具有代谢作用，能够通过其自身代谢降低污染物的毒性或是清除环境中的污染物。目前，有关微生物代谢呋喃唑酮的研究，仅有蒋丽娟等从受污染鱼塘底泥中筛选到一株可降解低浓度呋喃唑酮的铜绿假单胞菌，为利用细菌清除环境中呋喃唑酮污染提供了基础资料。 

发明内容

本发明目的在于提供一种可代谢呋喃唑酮的醋酸钙不动杆菌及其应用。 

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为： 

一种可代谢呋喃唑酮的醋酸钙不动杆菌，醋酸钙不动杆菌Acinetobacter calcoaceticus T32，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)登记保藏；保藏日期为2010年11月06日；编号为CGMCC No.4311。 

可代谢呋喃唑酮的醋酸钙不动杆菌的应用，所述醋酸钙不动杆菌可作为降解呋喃唑酮的菌剂。 

所述醋酸钙不动杆菌降解呋喃唑酮过程为：将醋酸钙不动杆菌驯化培养后培养于含有呋喃唑酮的无机盐蛋白胨液体培养基中培养， 利用高效液相色谱(HPLC)检测其降解率，以未接种T32的含有呋喃唑酮的无机盐蛋白胨液体培养基作为对照。 

所述含有呋喃唑酮的无机盐蛋白胨液体培养基中无机盐蛋白胨液体培养基为Na₂HPO₄·12H₂O 3g/L，KH₂PO₄1g/L，NaCl 3g/L，MgSO₄0.3g/L，Tryptone 2.5g/L；调节pH至6.0-8.0。 

所述利用高效液相色谱(HPLC)检测过程为采用液相色谱仪：skyray LC-310液相色谱系统；色谱柱：Waters C18反向柱4.6×250mm，粒度5μm；检测条件为流动相，流动相为乙腈与乙酸水溶液混合，乙腈∶乙酸水溶液＝V(乙腈)∶V(乙酸水溶液)＝55∶45，进样量为20μL；温度为25℃；紫外检测器检测参数为检测波长365nm；其中乙酸水溶液为乙酸与水混合，乙酸∶水混合＝V(乙酸)∶V(水)＝1∶1000。 

与现有技术相比，本发明的积极效果是：目前，以细菌代谢途径为中心环节的环境污染物清除技术在重金属富集、有机污染的降解和石油降解中均有应用。本发明得到的醋酸钙不动杆菌可降解环境中的呋喃唑酮，具有降解速度快、费用低、操作步骤简单等优点，为彻底清除环境中的呋喃唑酮残留提供了较好的思路。 

附图说明

图1为本发明实施例提供的醋酸钙不动杆菌T32的16S rDNA的序列。 

图2为本发明实施例提供的醋酸钙不动杆菌T32降解呋喃唑酮过程中，随时间增加溶液中呋喃唑酮的相对浓度变化过程。呋喃唑酮的起始浓度为5ppm；横坐标为天数，纵坐标为呋喃唑酮的相对浓度。(■，无细菌的溶液中呋喃唑酮的相对浓度；△，含有细菌T32的溶液中呋喃唑酮的相对浓度)。 

图3为本发明实施例的醋酸钙不动杆菌T32降解呋喃唑酮过冲中，随时间增加溶液中呋喃唑酮的相对浓度变化过程。呋喃唑酮的起始浓度为10ppm；横坐标为天数，纵坐标为呋喃唑酮的相对浓度。(■，无细菌的溶液中呋喃唑酮的相对浓度；△，含有细菌T32的溶液中呋喃唑酮的相对浓度)。 

图4为利用本发明实施例提供的醋酸钙不动杆菌CGMCC No.4311处理5ppm的呋喃唑酮30小时的HPLC谱图。 

具体实施方式

实施例1 

醋酸钙不动杆菌T3216SrDNA的获取： 

所述醋酸钙不动杆菌T32以在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)登记保藏；保藏日期为2010年11月06日；编号为CGMCC No.4311。收集处于稳定期的醋酸钙不动杆菌T32，提 取该菌的基因组DNA。具体步骤为： 

(1)30℃过夜培养的T32菌株按1％(V/V)的接种量接种到含有10ml LB培养基的试管中，待细菌的OD₆₀₀≈1.0左右时，取1ml菌液于1.5ml离心管中10,000g离心1min收集菌体。 

(2)加1ml 0.9％NaCl洗涤沉淀，10,000g离心3min。 

(3)弃上清，用450μl TE缓冲液重新悬浮沉淀，并加入50μ120％的SDS，轻轻的上下颠倒离心管使之混匀，75℃水浴中放置5min，至菌液裂解变澄清；所述TE缓冲液为12mM Tris-HCl，12mM EDTA，pH 8.0。 

(4)加500μl体积比3∶1的苯酚-氯仿抽提，轻轻颠倒使之混匀，室温静置5min后10,000g离心5min。 

(5)将上清转移至一新的1.5ml离心管并补足体积到500μl，加500μl体积比3∶1的苯酚-氯仿，混匀室温静置5min后10,000g离心5min。再将上清转移至一新的离心管中，如此反复，直至看不到中间的蛋白质层为止。 

(6)上清转移至一新的1.5ml离心管并补足体积到500μl，加500μl氯仿，轻轻混匀后10,000g离心5min。 

(7)上清转移至一新的1.5ml离心管，补加TE缓冲液至500μ1。然后加入50μl的3M NaAc混匀，最后加入550μl的异丙醇，上下颠倒几次，此时应看到有絮状沉淀产生，10,000g离心5min。 

(8)弃上清，加入1ml 70％的乙醇洗涤沉淀，10,000g离心5min，尽量吸干液体，室温干燥约10min。 

(9)加入50μl含有终浓度为10-20mg/ml RNaseA的TE缓冲液溶解DNA。利用8F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492R(GGTTACCTTGTTACG ACTT)为引物，提取的T32基因组DNA为模板，PCR扩增其16S rDNA并进行鉴定。PCR的条件为94℃变性4min，94℃变性30s，57℃退火1min，72℃延伸1min，从第二步开始，30个循环。PCR产物由北京诺赛基因进行测序。DNA测序片段(参见图1)。 

实施例2 

利用醋酸钙不动杆菌T32处理含有浓度为5ppm的呋喃唑酮溶液的方法： 

(1)微生物菌株：选用醋酸钙不动杆菌T32CGMCC No.4311。 

(2)种子培养：：从平板上选取一环菌落接入LB培养基，摇瓶装液量30％，培养温度为28～30℃，培养转速180～200rpm/min，培养时间为10-16h。LB培养基的配方为：胰蛋白胨，10g，酵母浸膏，5g，氯化钠，10g，蒸馏水，1L。 

(3)驯化培养：将步骤(2)中的T32按1％(V/V)的接种量接种 在无机盐蛋白胨培养基中，28℃过夜培养10-16h。无机盐蛋白胨培养基的配方为：Na₂HPO₄·12H₂O 3g/L，KH₂PO₄1g/L，NaCl 3g/L，MgSO₄0.3g/L，Tryptone 2.5g/L；调节pH6.0-8.0。 

(4)T32降解呋喃唑酮：将步骤(3)中的T32菌体按起始浓度为1×10⁸CFU mL^-1接种于含有5ppm呋喃唑酮的无机盐蛋白胨液体培养基中进行培养，以未接种T32的含有呋喃唑酮的无机盐蛋白胨液体培养基作为对照。在不同的时间点取出500μl的培养液，13,000rpm离心5min，收集上清液。 

(5)呋喃唑酮浓度的高效液相色谱(HPLC)检测：将步骤(4)中收集的上清液分别进行高效液相色谱检测，测定呋喃唑酮的相对浓度，同时测定处理5ppm的呋喃唑酮30小时色谱。高效液相色谱检测条件为：液相色谱仪：skyray LC-310液相色谱系统；色谱柱：Waters C18反向柱4.6×250mm，粒度5μm；检测条件为流动相，V(乙腈)∶V(乙酸水溶液)[V(乙酸)∶V(水)＝1∶1000]＝55∶45；进样量为20μL；温度为25℃；紫外检测器检测参数为检测波长365nm。 

以加入呋喃唑酮的初始浓度为100％，不同时间点溶液中呋喃唑酮的相对浓度＝(样品的峰面积/呋喃唑酮的初始浓度峰面积)*100％，据此得到随时间增加溶液中呋喃唑酮相对浓度的曲线(参见图2)。以加入呋喃唑酮的初始浓度为100％，在没有加入细菌的情况下，6天时呋喃唑酮的浓度从100％变为90％；而加入醋酸钙不动杆菌T32，培养1天时呋喃唑酮的浓度从100％降低为7.2％，6天时呋喃唑酮的浓度降低为0.9％。可见，在初始浓度为5ppm的呋喃唑酮溶液中，加入细菌T32，能够将溶液中90％左右的呋喃唑酮降解。 

同时醋酸钙不动杆菌CGMCC No.4311处理5ppm的呋喃唑酮30小时的HPLC谱图(参见图4)。可知没有加入细菌的呋喃唑酮峰面积远远大于加入细菌以后呋喃唑酮峰面积。 

实施例3 

利用醋酸钙不动杆菌T32处理含有浓度为10ppm的呋喃唑酮溶液的方法： 

(1)微生物菌株：选用醋酸钙不动杆菌T32CGMCC No.4311； 

(2)种子培养：从-80℃冰箱中将保存的T32接于10ml的LB培养基中，摇瓶装液量30％，培养温度为28～30℃，培养转速180～200rpm/min，培养时间为10-16h。LB培养基的配方为：胰蛋白胨，10g，酵母浸膏，5g，氯化钠，10g，蒸馏水，1L。 

(3)驯化培养：将步骤(2)中的T32按1％的接种量(V/V)接种在无机盐蛋白胨培养基中，28℃过夜培养10-16h。无机盐蛋白胨培养基的配方为：Na₂HPO₄·12H₂O 3g/L，KH₂PO₄1g/L，NaCl 3g/L， MgSO₄0.3g/L，Tryptone 2.5g/L；调节pH6.0-8.0。 

(4)T32降解呋喃唑酮：将步骤(3)中的T32菌体按起始浓度为1×10⁸CFU mL^-1接种于含有10ppm呋喃唑酮的无机盐蛋白胨液体培养基中进行培养，以未接种T32的含有呋喃唑酮的无机盐蛋白胨液体培养基作为对照。在不同的时间点取出500μl的培养液，13,000rpm离心5min，收集上清液。 

(5)呋喃唑酮浓度的高效液相色谱(HPLC)检测和降解率的计算： 

将步骤(4)中收集的上清液分别进行高效液相色谱检测，测定呋喃唑酮的相对浓度，高效液相色谱检测条件为：液相色谱仪：skyray LC-310液相色谱系统；色谱柱：Waters C18反向柱4.6×250mm，粒度5μm；检测条件为流动相，V(乙腈)∶V(乙酸水溶液)[V(乙酸)∶V(水)＝1∶1000]＝55∶45；进样量为20μL；温度为25℃；紫外检测器检测参数为检测波长365nm。以加入呋喃唑酮的初始浓度为100％，不同时间点溶液中呋喃唑酮的相对浓度＝(样品的峰面积/呋喃唑酮的初始浓度峰面积)*100％，据此得到随时间增加溶液中呋喃唑酮相对浓度的曲线(参见图3)。在没有加入细菌的情况下，6天时呋喃唑酮的浓度几乎没有任何变化；而加入醋酸钙不动杆菌T32，培养1天时呋喃唑酮的浓度从100％降低为27％，6天时呋喃唑酮的浓度降低为10％。可见，在初始浓度为10ppm的呋喃唑酮溶液中，加入细菌T32培养6天，能够将溶液中90％以上的呋喃唑酮降解。 

Claims (5)

1.一种可代谢呋喃唑酮的醋酸钙不动杆菌，其特征在于：醋酸钙不动杆菌Acinetobacter calcoaceticus T32，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)登记保藏；保藏日期为2010年11月06日；编号为CGMCC No.4311。

2.一种权利要求1所述的可代谢呋喃唑酮的醋酸钙不动杆菌的应用，其特征在于：所述醋酸钙不动杆菌可作为降解呋喃唑酮的菌剂。

3.按权利要求2所述的可代谢呋喃唑酮的醋酸钙不动杆菌的应用，其特征在于：所述醋酸钙不动杆菌降解呋喃唑酮过程为：将醋酸钙不动杆菌驯化培养后培养于含有呋喃唑酮的无机盐蛋白胨液体培养基中培养，利用高效液相色谱(HPLC)检测其降解率，以未接种T32的含有呋喃唑酮的无机盐蛋白胨液体培养基作为对照。

4.按权利要求2所述的可代谢呋喃唑酮的醋酸钙不动杆菌的应用，其特征在于：所述含有呋喃唑酮的无机盐蛋白胨液体培养基中无机盐蛋白胨液体培养基为Na₂HPO₄·12H₂O3g/L，KH₂PO₄1g/L，NaCl3g/L，MgSO₄0.3g/L，Tryptone2.5g/L；调节pH至6.0-8.0。

5.按权利要求2所述的可代谢呋喃唑酮的醋酸钙不动杆菌的应用，其特征在于：所述利用高效液相色谱(HPLC)检测过程为采用液相色谱仪：skyray LC-310液相色谱系统；色谱柱：Waters C18反向柱4.6×250mm，粒度5μm；检测条件为流动相，流动相为乙腈与乙酸水溶液混合，乙腈∶乙酸水溶液＝V(乙腈)∶V(乙酸水溶液)＝55∶45，进样量为20μL；温度为25℃；紫外检测器检测参数为检测波长365nm；其中乙酸水溶液为乙酸与水混合，乙酸∶水混合＝V(乙酸)∶V(水)＝1∶1000。

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