CN113215047B - 魔芋多糖降解产物KGM-1k与KGM-5k在制备益生菌保护剂中的应用 - Google Patents

魔芋多糖降解产物KGM-1k与KGM-5k在制备益生菌保护剂中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113215047B
CN113215047B CN202110552218.8A CN202110552218A CN113215047B CN 113215047 B CN113215047 B CN 113215047B CN 202110552218 A CN202110552218 A CN 202110552218A CN 113215047 B CN113215047 B CN 113215047B
Authority
CN
China
Prior art keywords
kgm
konjac polysaccharide
degradation product
polysaccharide degradation
konjac
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110552218.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113215047A (zh
Inventor
王仲孚
龚桂萍
黄琳娟
方洁
王雪
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Northwest University
Original Assignee
Northwest University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Northwest University filed Critical Northwest University
Priority to CN202110552218.8A priority Critical patent/CN113215047B/zh
Publication of CN113215047A publication Critical patent/CN113215047A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113215047B publication Critical patent/CN113215047B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及魔芋多糖降解产物KGM‑1k与KGM‑5k在制备益生菌保护剂中的应用。本发明先采用过氧化氢破坏魔芋多糖分子间的氢键作用，再利用纤维素酶对其进行降解，经60％的乙醇醇沉分离纯化，制备得到具有均一性分子量的魔芋多糖降解产物KGM‑1k和KGM‑5k组分。首次考察了魔芋多糖降解产物KGM‑1k和KGM‑5k在模拟胃液、小肠液、真空冷冻干燥及不同贮存温度(4℃和25℃)贮藏条件下对益生菌存活情况的影响。结果显示，魔芋多糖降解产物KGM‑1k和KGM‑5k均可以使益生菌抗逆性增强，提高益生菌在真空冷冻干燥及不同贮存温度贮藏条件下的活菌数和在消化道的存活率，进而能耐受胃肠液进入肠道预定部位实现定植，对提高益生菌的生物功效具有重要意义。

Description

魔芋多糖降解产物KGM-1k与KGM-5k在制备益生菌保护剂中的 应用
技术领域
本发明属于涉及生物技术领域，具体涉及魔芋多糖降解产物KGM-1k与KGM-5k在制备益生菌保护剂中的应用。
背景技术
益生菌是指对人体健康尤其是消化系统健康有益的活性细菌或酵母，具有抑制有害菌生长、保护胃黏膜不受伤害、提高机体免疫能力、防治腹泻、维持肠道功能稳定、促进肠胃蠕动、助消化及通便等功能。当肠道菌群失调后，可以通过口服益生菌的方式调节修复菌群结构。但是这些益生菌到达大肠定植之前，首先需要通过胃和小肠的转运，而胃中的胃液和胃蛋白酶以及小肠中的胰蛋白酶和胆碱盐类物质可能会破坏菌体的生理活性，造成益生菌的死亡。
真空冷冻干燥是制备菌粉或储存菌种的一种常用的技术，因其过程在低温中进行可以抑制菌体细胞内的生化反应，从而保护菌种的活力。但是在冷冻期间细胞内外形成大的冰晶，从而对细胞膜进行机械性的破坏。另外，真空冷冻干燥还会导致菌体细胞中的酶类活性降低，最终导致菌体代谢能力下降，直至死亡。因此，可以通过添加保护剂的手段来降低菌种死亡概率。
魔芋多糖是一种水溶性的膳食纤维，由D-葡萄糖和D-甘露糖通过β-1，4糖苷键连接而成的杂多糖。魔芋多糖具有粘稠性、凝胶性和强吸水性等特点，可调节脂质代谢、改善血糖、减肥等功效。但由于魔芋多糖分子量较大(分子量为500-2000kDa)，粘稠度高，溶解性小，性质不稳定，使应用范围受到限制。相比于魔芋多糖，魔芋多糖降解产物不仅具有性质稳定和溶解性好的特点，还具有免疫调节、降低血脂、清理肠道、预防高血压、高胆固醇、冠心病和肥胖病等作用。但魔芋多糖降解产物对益生菌是否具有保护作用未见报道。
发明内容
为了有效避免益生菌菌种因外界环境破坏菌体的生理活性以及细胞膜而导致的死亡，本发明提供一种魔芋多糖降解产物KGM-1k与KGM-5k在制备益生菌保护剂中的应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
魔芋多糖降解产物KGM-1k在制备益生菌保护剂中的应用，其中，所述魔芋多糖降解产物KGM-1k分子量位于1kDa±0.6kDa范围内，由Man和Glc组成，Man与Glc相对摩尔比为1：5～1：3.5。
魔芋多糖降解产物KGM-5k在制备益生菌保护剂中的应用，其中，所述魔芋多糖降解产物KGM-5k分子量位于5kDa±2kDa范围内，由Man和Glc组成，Man与Glc相对摩尔比为1：2.5～1：1.6。
魔芋多糖降解产物KGM-1k与KGM-5k的混合物在制备益生菌保护剂中的应用，其中，所述魔芋多糖降解产物KGM-1k分子量位于1kDa±0.6kDa范围内，由Man和Glc组成，Man与Glc相对摩尔比为1：5～1：3.5；所述魔芋多糖降解产物KGM-5k分子量位于5kDa±2kDa范围内，由Man和Glc组成，Man与Glc相对摩尔比为1：2.5～1：1.6。
进一步地，所述魔芋多糖降解产物KGM-1k平均分子量为1kDa；所述魔芋多糖降解产物KGM-5k平均分子量为5kDa；所述魔芋多糖降解产物KGM-1k中Man与Glc相对摩尔比为1：4.5；所述魔芋多糖降解产物KGM-5k中Man与Glc相对摩尔比为1：2.1。
进一步地，所述益生菌为枯草芽孢杆菌、长双歧杆菌SQ011、乳双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌或丁酸梭菌中的一种或多种。
进一步地，所述魔芋多糖降解产物KGM-1k与KGM-5k的制备方法如下：
步骤1、利用过氧化氢处理魔芋多糖：
利用浓度为5mmol/L～20mmol/L的过氧化氢处理魔芋多糖水溶液，魔芋多糖水溶液中魔芋多糖的质量浓度为10％～40％，在35℃～60℃条件下，处理60～120分钟；
步骤2、纤维素酶溶液的配制：
称取质量为魔芋多糖质量1％～10％的纤维素酶溶于CH3COOH-CH3COONa缓冲溶液中；
步骤3、利用纤维素酶降解魔芋多糖：
向步骤1处理后的魔芋多糖溶液中加入步骤2配制的纤维素酶溶液，在40℃条件下，反应50～100分钟，灭酶活；
步骤4、魔芋多糖降解产物的纯化：
将步骤3处理后的溶液进行离心，醇沉，再次离心，分别收集沉淀和上清液，沉淀为魔芋多糖降解产物KGM-5k，上清液为魔芋多糖降解产物KGM-1k，喷雾干燥。
进一步地，步骤1中过氧化氢浓度为10mmol/L，处理温度为50℃，处理时间为60分钟；步骤3中反应时间为60分钟；步骤4中醇沉过程采用60％～95％的乙醇，两次离心过程的离心力均为4000rpm，离心时间均为10分钟。
本发明还提供一种益生菌的保护剂，其特殊之处在于：包括魔芋多糖降解产物KGM-1k，所述魔芋多糖降解产物KGM-1k分子量位于1kDa±0.6kDa范围内，由Man和Glc组成，Man与Glc相对摩尔比为1：5～1：3.5；
或，包括魔芋多糖降解产物KGM-5k，所述魔芋多糖降解产物KGM-5k分子量位于5kDa±2kDa范围内，由Man和Glc组成，Man与Glc相对摩尔比为1：2.5～1：1.6；
或，由魔芋多糖降解产物KGM-1k和魔芋多糖降解产物KGM-5k组成，所述魔芋多糖降解产物KGM-1k分子量位于1kDa±0.6kDa范围内，由Man和Glc组成，Man与Glc相对摩尔比为1：5～1：3.5；所述魔芋多糖降解产物KGM-5k分子量位于5kDa±2kDa范围内，由Man和Glc组成，Man与Glc相对摩尔比为1：2.5～1：1.6。
进一步地，所述魔芋多糖降解产物KGM-1k平均分子量为1kDa；所述魔芋多糖降解产物KGM-5k平均分子量为5kDa；所述魔芋多糖降解产物KGM-1k中Man与Glc相对摩尔比为1：4.5；所述魔芋多糖降解产物KGM-5k中Man与Glc相对摩尔比为1：2.1。
本发明还提供上述益生菌的保护剂在益生菌保护工艺中的应用，将保护剂与益生菌菌泥充分混合形成混合物，其中保护剂与益生菌菌泥湿重质量比为1：5～4：1。
本发明的有益效果在于：
本发明公开了魔芋多糖降解产物(KGM-1k、KGM-5k)的制备及其对益生菌的保护作用，添加魔芋多糖降解产物后，益生菌的抗逆性增强，提高益生菌在真空冷冻干燥及不同贮存温度贮藏条件下的活菌数和在消化道的存活率，进而能耐受胃肠液进入肠道预定部位实现定植，对提高益生菌的生物功效具有重要意义。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为魔芋多糖KGM和魔芋多糖降解产物KGM-1k和KGM-5k的单糖组成分析图谱。单糖标准：1.鼠李糖(Rha)；2.岩藻糖(Fuc)；3.阿拉伯糖(Ara)；4.木糖(Xyl)；5.甘露糖(Man)；6.葡萄糖(Glc)；7.半乳糖(Gla)；8.葡萄糖醛酸(GlcA)；9.半乳糖醛酸(GlaA)。
图2为魔芋多糖降解产物KGM-1k和KGM-5k的分子量测定图谱。
图3为魔芋多糖降解产物KGM-1k对长双歧杆菌SQ011在模拟胃液中的存活情况；结果为mean±SD(n＝3)，不同字母代表差异显著(p<0.05)，相同字母代表无显著性差异。
图4为魔芋多糖降解产物KGM-1k对长双歧杆菌SQ011在模拟小肠液中的存活情况；结果为mean±SD(n＝3)，不同字母代表差异显著(p<0.05)，相同字母代表无显著性差异。
图5为魔芋多糖降解产物KGM-1k对长双歧杆菌SQ011冻干菌粉在不同贮存温度贮藏条件下活菌数的影响。(A)4℃贮存；(B)25℃贮存。结果为mean±SD(n＝3)，不同字母代表差异显著(p<0.05)，相同字母代表无显著性差异。
图6为魔芋多糖降解产物KGM-5k对长双歧杆菌SQ011在模拟胃液中的存活情况。结果为mean±SD(n＝3)，不同字母代表差异显著(p<0.05)，相同字母代表无显著性差异。
图7为魔芋多糖降解产物KGM-5k对长双歧杆菌SQ011在模拟小肠液中的存活情况。结果为mean±SD(n＝3)，不同字母代表差异显著(p<0.05)，相同字母代表无显著性差异。
图8为魔芋多糖降解产物KGM-5k对长双歧杆菌SQ011冻干菌粉在不同贮存温度贮藏条件下活菌数的影响。(A)4℃贮存；(B)25℃贮存。结果为mean±SD(n＝3)，不同字母代表差异显著(p<0.05)，相同字母代表无显著性差异。
具体实施方式
下面结合附图和实施例进一步详述本发明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明中，魔芋多糖降解产物制备方法如下：
步骤1、利用微量过氧化氢处理魔芋多糖，破坏魔芋多糖分子间的氢键作用：将2000g魔芋多糖加入到温度为50℃的10L蒸馏水中，加入过氧化氢，使过氧化氢终浓度为10mmol/L，搅拌反应60分钟；
如果魔芋多糖浓度过高，会导致黏稠度过高，无法搅拌，温度过高可能会导致过氧化氢挥发掉，长时间反应对该过程影响不大。因此，在其他实施例中保证魔芋多糖浓度处于10％～40％，在35℃～60℃条件下，处理60～90分钟均可。
步骤2、纤维素酶溶液的配制：称取40g纤维素酶溶于pH为5的CH3COOH-CH3COONa缓冲溶液中，缓冲液体积为2L；
在其他实施例中，纤维素酶的质量为魔芋多糖质量的1％～10％即可。
步骤3、利用纤维素酶降解魔芋多糖：将纤维素酶溶液缓慢加入至经过氧化氢处理后的魔芋多糖溶液中，在40℃条件下，搅拌反应60分钟左右(50～100分钟)，升温至100℃，反应10分钟灭酶活。
步骤4、魔芋多糖降解产物的纯化：将纤维素酶降解溶液进行离心，离心力为4000rpm，离心时间为10分钟，收集上清。采用60％～95％乙醇沉淀上清液12小时，离心(4000rpm，10分钟)，分别收集沉淀和上清液，喷雾干燥，沉淀为魔芋多糖降解产物KGM-5k，上清液为魔芋多糖降解产物KGM-1k。
魔芋多糖降解产物理化性质分析：采用糖醇乙酸酯衍生化法测定单糖组成，采用高效凝胶渗透色谱法测定分子量，结果如图1、2及表1。
由图1和表1可知，魔芋多糖KGM由甘露糖(Man)与葡萄糖(Glc)组成，其相对摩尔比为1：2.2；魔芋多糖降解产物KGM-1k由Man和Glc组成，其相对摩尔比为1：4.5；魔芋多糖降解产物KGM-5k由Man和Glc组成，其相对摩尔比为1：2.1。
因测试条件不同，魔芋多糖降解产物KGM-1k中Man和Glc的相对摩尔比可以在1：5～1：3.5之间浮动；魔芋多糖降解产物KGM-5k中Man和Glc的相对摩尔比可以在1：2.5～1：1.6之间浮动。
图2可知，魔芋多糖降解产物KGM-1k的分子量位于1±0.6kDa范围，平均分子量为1kDa，魔芋多糖降解产物KGM-5k的分子量为5±2kDa，平均分子量为5kDa。
表1魔芋多糖KMG和魔芋多糖降解产物(KGM-1k和KGM-5k)的单糖组成相对摩尔百分比
Figure BDA0003075553460000061
以下通过实施例说明魔芋多糖降解产物KGM-1k与KGM-5k对益生菌的保护作用。
实施例一
该实施例研究魔芋多糖降解产物KGM-1k对长双歧杆菌SQ011存活的影响。
配制含魔芋多糖降解产物KGM-1k的模拟胃液：首先配制不含碳源的MRS培养基，用盐酸将不含碳源的MRS培养基的pH调至2，分装后加入5％(KGM-1k/MRS培养基，m/m)的魔芋多糖降解产物KGM-1k，充分溶解后，在121℃高压灭菌。然后将胃蛋白酶溶解于适量PBS溶液(磷酸盐缓冲溶液)中并过滤除菌；最后将处理后的胃蛋白酶按3g/L的浓度添加到上述含有魔芋多糖降解产物KGM-1k的MRS培养基中。
配制含魔芋多糖降解产物KGM-1k的模拟小肠液：首先用氢氧化钠将不含碳源的MRS培养基的pH调至7，加入3％(牛胆盐/MRS培养基，m/m)的牛胆盐混匀，分装后加入5％(KGM-1k/培养基，m/m)的魔芋多糖降解产物KGM-1k，溶解后121℃高压灭菌。然后将胰蛋白酶溶解于适量PBS溶液中并过滤除菌。最后将处理后的胰蛋白酶按10g/L的浓度添加到上述含有魔芋多糖降解产物KGM-1k的MRS培养基中。
以下通过实验研究魔芋多糖降解产物KGM-1k对长双歧杆菌SQ011菌种在模拟胃液和小肠液环境中耐受性的影响：
测定在配制好的模拟胃液中按1.5％(菌泥湿重/培养基，m/m)的接种量接种活化好的长双歧杆菌SQ011，用移液枪轻轻吹打使菌体均匀的分散在模拟胃液中，转移至厌氧培养箱中培养，分别在1.5小时和3小时取出试管，离心除去菌悬液上清，利用PBS溶液轻轻漂洗3-4次，然后用等体积PBS将菌体重悬，梯度稀释后使用平板计数法计算菌悬液中的活菌数，结果如图3。操作同上，在模拟小肠液中也接种1.5％(菌泥湿重/培养基，m/m)的长双歧杆菌SQ011，吹打混匀，厌氧培养箱内培养，分别在3小时和6小时计算模拟小肠液中的活菌数。结果如图4。
由图3可知，长双歧杆菌SQ011自身对于模拟胃液的抵抗力很差，而添加魔芋多糖降解产物KGM-1k后可显著提高模拟胃液中长双歧杆菌SQ011的活菌数。处理1.5小时后，空白组和KGM-1k组的长双歧杆菌SQ011的活菌数分别为0.24×106/mL和2.66×106/mL，KGM-1k组显著高于空白组(p<0.05)；处理3小时后，空白组的活菌数为0.11×106/mL，KGM-1k组的活菌数为1.66×106/mL，其显著高于空白组(p<0.05)。因此，魔芋多糖降解产物KGM-1k可以显著提高长双歧杆菌SQ011在模拟胃液环境中的耐受性。
由图4可知，与空白组相比，添加了魔芋多糖降解产物KGM-1k的实验组可显著提高模拟小肠液中长双歧杆菌SQ011的活菌数，其中，处理3小时，空白组和KGM-1k的活菌数分别为2.00×106/mL和4.53×106/mL，KGM-1k组显著高于空白组(p<0.05)；处理6小时，空白组和KGM-1k的活菌数分别为1.83×106/mL和3.83×106/mL，其中KGM-1k组显著高于空白组(p<0.05)。综合上述结果，魔芋多糖降解产物KGM-1k可以显著提高长双歧杆菌SQ011在模拟小肠环境中的耐受性。
以下通过实验研究魔芋多糖降解产物KGM-1k对长双歧杆菌SQ011在真空冷冻干燥过程中活菌数的影响：
分别配制含20％的海藻糖溶液(阳性组)、脱脂乳溶液(阳性组)和魔芋多糖降解产物KGM-1k溶液的保护剂。将活化后的细菌37℃厌氧培养24h，在6000g、10min的离心条件下离心，去掉上清，得到菌泥沉淀，然后按1.6：1(保护剂/菌泥湿重，m/m)，-80℃预冻8h，真空冷冻干燥得到冻干菌粉。将冻干后的样品重悬于等体积的PBS中，活菌计数法计算添加了不同保护剂后菌种的存活数，结果如表2。
由表2可知，添加了魔芋多糖降解产物KGM-1k、脱脂乳(阳性对照组)和海藻糖(阳性对照组)均可显著提升冻干菌粉中长双歧杆菌SQ011的活菌数。空白组、脱脂乳组、海藻糖组和魔芋多糖降解产物KGM-1k的活菌数分别为2.55×106/mL、1.02×107/mL、9.43×106/mL和2.63×108/mL，魔芋多糖降解产物KGM-1k组显著高于空白对照组和阳性对照组(p<0.05)。因此，魔芋多糖降解产物KGM-1k可以显著提高长双歧杆菌SQ011的抗冻干能力，减少其在真空冷冻干燥过程中的损失。
表2魔芋多糖降解产物KGM-1k对长双歧杆菌SQ011在真空冷冻干燥过程中活菌数的影响
Figure BDA0003075553460000081
结果为mean±SD(n＝6)，不同字母代表差异显著(p<0.05)，相同字母代表无显著差异。
以下通过实验研究魔芋多糖降解产物KGM-1k对长双歧杆菌SQ011冻干菌粉在不同贮存温度贮藏条件下活菌数的影响：
分别配制含20％海藻糖溶液、脱脂乳溶液、魔芋多糖降解产物KGM-1k溶液的保护剂。将活化后的长双歧杆菌SQ011在37℃厌氧培养24h，在6000g、10min的离心条件下离心，去掉上清，得到菌泥沉淀，然后按1.6：1(保护剂/菌泥湿重，m/m)的比例加入保护剂，-80℃预冻8h，真空冷冻干燥得到冻干菌粉。然后将制备好的冻干菌粉在4℃和25℃条件下储存两个月，每两周测定一次活菌数，结果如图5。
由图5可知，长双歧杆菌SQ011的冻干菌粉中的活菌数随着时间的延长逐渐下降。经过8周的贮存后，贮存温度为4℃时，KGM-1k组、空白组、脱脂乳(阳性对照组)和海藻糖(阳性对照组)的活菌数分别降低15.79％、39.02％、20.81％和17.03％，KGM-1k组显著低于空白组和阳性组(p<0.05)；贮存温度为25℃时，KGM-1k组、空白组、脱脂乳(阳性对照组)和海藻糖(阳性对照组)的活菌数分别降低30.89％、40.61％、30.35％和26.74％，KGM-1k组显著低于空白组(p<0.05)。因此，魔芋多糖降解产物KGM-1k作为长双歧杆菌SQ011的冻干保护剂可显著降低活菌数的下降率，得到稳定贮存的冻干菌粉。魔芋多糖降解产物KGM-1k在4℃贮藏条件下的保护效果优于25℃。
实施例二
该实施例研究魔芋多糖降解产物KGM-5k对长双歧杆菌SQ011存活的影响。
配制含魔芋多糖降解产物KGM-5k的模拟胃液：首先配制不含碳源的MRS培养基，用盐酸将该培养基的pH调至2，分装后加入5％(KGM-5k/MRS培养基，m/m)的魔芋多糖降解产物KGM-5k，充分溶解后121℃高压灭菌。然后将胃蛋白酶溶解于适量PBS溶液中并过滤除菌。最后将处理后的胃蛋白酶按3g/L的浓度添加到上述含有魔芋多糖降解产物KGM-5k的MRS培养基中。
配制含魔芋多糖降解产物KGM-5k的模拟小肠液：首先用氢氧化钠将不含碳源的MRS培养基的pH调至7，加入3％(牛胆盐/MRS培养基，m/m)的牛胆盐混匀，分装后加入5％(KGM-5k/培养基，m/m)的魔芋多糖降解产物KGM-5k，溶解后121℃高压灭菌。然后将胰蛋白酶溶解于适量PBS溶液中并过滤除菌。最后将处理后的胰蛋白酶按10g/L的浓度添加到上述含有魔芋多糖降解产物KGM-5k的MRS培养基中。
以下通过实验研究魔芋多糖降解产物KGM-5k对长双歧杆菌SQ011菌种在模拟胃液和小肠液环境中耐受性的影响：
在配制好的模拟胃液中按1.5％(菌泥湿重/培养基，m/m)的接种量接种活化好的长双歧杆菌SQ011，用移液枪轻轻吹打使菌体均匀的分散在模拟胃液中，转移至厌氧培养箱中培养，分别在1.5小时和3小时取出试管，离心除去菌悬液上清，利用PBS溶液轻轻漂洗3-4次，然后用等体积PBS将菌体重悬，梯度稀释后使用平板计数法计算菌悬液中的活菌数，结果如图6。操作同上，在模拟小肠液中也接种1.5％(菌泥湿重/培养基，m/m)的长双歧杆菌SQ011，吹打混匀，厌氧培养箱内培养，分别在3小时和6小时计算模拟小肠液中的活菌数。结果如图7。
由图6可知，长双歧杆菌SQ011自身对于模拟胃液的抵抗力很差，而添加魔芋多糖降解产物KGM-5k组可显著提高模拟胃液中长双歧杆菌SQ011的活菌数。处理1.5小时后，空白组的长双歧杆菌SQ011的活菌数为0.24×106/mL，KGM-5k组的活菌数为3.13×106/mL，魔芋多糖降解产物KGM-5k组显著高于空白组(p<0.05)；处理3小时后，空白组的活菌数为0.11×106/mL，KGM-5k组的活菌数为1.63×106/mL，其显著高于空白组(p<0.05)。因此，魔芋多糖降解产物KGM-5k可以显著提高长双歧杆菌SQ011在模拟胃液环境中的耐受性。
由图7可知，处理3小时，空白组和KGM-5k的活菌数分别为2.00×106/mL和2.33×106/mL，KGM-5k组显著高于空白组(p<0.05)；处理6小时，空白组和KGM-5k的活菌数分别为1.83×106/mL和2.00×106/mL。综合上述结果，魔芋多糖降解产物KGM-5k可以提高长双歧杆菌SQ011在模拟小肠环境中的耐受性。
以下通过实验研究魔芋多糖降解产物KGM-5k对长双歧杆菌SQ011在真空冷冻干燥过程中活菌数的影响：
分别配制含20％的海藻糖溶液(阳性组)、脱脂乳溶液(阳性组)和KGM-5k溶液的保护剂。将活化后的细菌37℃厌氧培养24h，在6000g、10min的离心条件下离心，去掉上清，得到菌泥沉淀，然后按1.6：1(保护剂/菌泥湿重，m/m)的比例加入保护剂，-80℃预冻8h，真空冷冻干燥得到冻干菌粉。将冻干后的样品重悬于等体积的PBS中，活菌计数法计算添加了不同保护剂后菌种的存活数，结果如表3。
由表3可知，添加了KGM-5k、脱脂乳(阳性对照组)和海藻糖(阳性对照组)均可显著提升冻干菌粉中长双歧杆菌SQ011的活菌数。空白组、脱脂乳组、海藻糖组和KGM-5k组的活菌数分别为2.55×106/mL、1.02×107/mL、9.43×106/mL和2.08×108/mL，KGM-5k组显著高于空白对照组和阳性对照组(p<0.05)。因此，魔芋多糖降解产物KGM-5k可以显著提高长双歧杆菌SQ011的抗冻干能力，减少其在真空冷冻干燥过程中的损失。
表3魔芋多糖降解产物KGM-5k对长双歧杆菌SQ011在真空冷冻干燥过程中活菌数的影响
Figure BDA0003075553460000101
结果为mean±SD(n＝6)，不同字母代表差异显著(p<0.05)，相同字母代表无显著差异。
以下通过实验研究魔芋多糖降解产物KGM-5k对长双歧杆菌SQ011冻干菌粉在不同贮存温度贮藏条件下活菌数的影响：
分别配制含20％海藻糖溶液、脱脂乳溶液、KGM-1k溶液的保护剂。将活化后的长双歧杆菌SQ011在37℃厌氧培养24h，在6000g、10min的离心条件下离心，去掉上清，得到菌泥沉淀，然后按1.6：1(保护剂/菌泥湿重，m/m)的比例加入保护剂，-80℃预冻8h，真空冷冻干燥得到冻干菌粉。然后将制备好的冻干菌粉在4℃和25℃条件下储存两个月，每两周测定一次活菌数，结果如图8。
由图8可知，长双歧杆菌SQ011的冻干菌粉中的活菌数随着时间的延长逐渐下降。经过8周的贮存后，贮存温度为4℃时，KGM-5k组、空白组、脱脂乳(阳性对照组)和海藻糖(阳性对照组)的活菌数分别降低21.99％、39.02％、20.81％和17.03％，KGM-5k组显著低于空白组(p<0.05)；贮存温度为25℃时，KGM-5k组、空白组、脱脂乳(阳性对照组)和海藻糖(阳性对照组)的活菌数分别降低36.08％、40.61％、30.35％和26.74％，KGM-5k组显著低于空白组(p<0.05)。因此，魔芋多糖降解产物KGM-5k作为长双歧杆菌SQ011的冻干保护剂可显著降低活菌数的下降率，得到稳定贮存的冻干菌粉。魔芋多糖降解产物KGM-5k在4℃贮藏条件下的保护效果优于25℃。
从上述结果可以看出，魔芋多糖降解产物(KGM-1k和KGM-5k)，均可以延长益生菌穿过胃肠道的生存能力，提高真空冷冻干燥过程和不同温度贮存条件下的存活率，其中魔芋多糖降解产物KGM-1k的保护效果优于魔芋多糖降解产物KGM-5k。当然，二者也可以混合使用。
上述实施例中均提及的是长双歧杆菌SQ011，根据本领域技术人员的常规认知，魔芋多糖降解产物KGM-1k与KGM-5k可对长双歧杆菌SQ011进行保护，也可以推广至保护其他益生菌，如枯草芽孢杆菌、乳双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌或丁酸梭菌中的一种或多种。
当魔芋多糖降解产物(KGM-1k和KGM-5k)作为益生菌的保护剂时，可将其与益生菌菌泥充分混合形成混合物，其中保护剂与益生菌菌泥湿重质量比可选为1：5～4：1。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (4)

1.魔芋多糖降解产物KGM-1k与KGM-5k的混合物在制备益生菌保护剂中的应用，其特征在于：所述魔芋多糖降解产物KGM-1k分子量位于1kDa±0.6kDa范围内，由Man和Glc组成，Man与Glc相对摩尔比为1：5~1：3.5；所述魔芋多糖降解产物KGM-5k分子量位于5kDa±2kDa范围内，由Man和Glc组成，Man与Glc相对摩尔比为1：2.5~1：1.6；所述益生菌为长双歧杆菌；
所述魔芋多糖降解产物KGM-1k与KGM-5k的制备方法如下：
步骤1、利用过氧化氢处理魔芋多糖：
利用浓度为5mmol/L~20mmol/L的过氧化氢处理魔芋多糖水溶液，魔芋多糖水溶液中魔芋多糖的质量浓度为10%~40%，在35℃~60℃条件下，处理60~120分钟；
步骤2、纤维素酶溶液的配制：
称取质量为魔芋多糖质量1%~10%的纤维素酶溶于CH3COOH-CH3COONa缓冲溶液中；
步骤3、利用纤维素酶降解魔芋多糖：
向步骤1处理后的魔芋多糖溶液中加入步骤2配制的纤维素酶溶液，在40℃条件下，反应50~100分钟，灭酶活；
步骤4、魔芋多糖降解产物的纯化：
将步骤3处理后的溶液进行离心，收集上清液，采用60%~95%的乙醇沉淀上清液，再次离心，分别收集沉淀和上清液，沉淀为魔芋多糖降解产物KGM-5k，上清液为魔芋多糖降解产物KGM-1k，喷雾干燥。
2.根据权利要求1所述的魔芋多糖降解产物KGM-1k与KGM-5k的混合物在制备益生菌保护剂中的应用，其特征在于：
所述魔芋多糖降解产物KGM-1k平均分子量为1kDa；所述魔芋多糖降解产物KGM-5k平均分子量为5kDa；所述魔芋多糖降解产物KGM-1k中Man与Glc相对摩尔比为1：4.5；所述魔芋多糖降解产物KGM-5k中Man与Glc相对摩尔比为1：2.1。
3.根据权利要求1所述的魔芋多糖降解产物KGM-1k与KGM-5k的混合物在制备益生菌保护剂中的应用，其特征在于：步骤1中过氧化氢浓度为10 mmol/L，处理温度为50℃，处理时间为60分钟；步骤3中反应时间为60分钟；步骤4中，两次离心过程的离心力均为4000rpm，离心时间均为10分钟。
4.权利要求1-3任一项中所述的益生菌保护剂在益生菌保护工艺中的应用，将保护剂与益生菌菌泥充分混合形成混合物，其中保护剂与益生菌菌泥湿重质量比为1：5 ~ 4：1，所述益生菌为长双歧杆菌。
CN202110552218.8A 2021-05-20 2021-05-20 魔芋多糖降解产物KGM-1k与KGM-5k在制备益生菌保护剂中的应用 Active CN113215047B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110552218.8A CN113215047B (zh) 2021-05-20 2021-05-20 魔芋多糖降解产物KGM-1k与KGM-5k在制备益生菌保护剂中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110552218.8A CN113215047B (zh) 2021-05-20 2021-05-20 魔芋多糖降解产物KGM-1k与KGM-5k在制备益生菌保护剂中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113215047A CN113215047A (zh) 2021-08-06
CN113215047B true CN113215047B (zh) 2022-08-09

Family

ID=77093308

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110552218.8A Active CN113215047B (zh) 2021-05-20 2021-05-20 魔芋多糖降解产物KGM-1k与KGM-5k在制备益生菌保护剂中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113215047B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113880961B (zh) * 2021-11-10 2023-05-02 澳门大学 葡甘六糖、其制备方法、其应用和毛发再生制剂
CN114806883B (zh) * 2022-06-01 2023-05-26 微康益生菌(苏州)股份有限公司 一种发酵液中活菌的保护、回收方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102443616A (zh) * 2011-10-13 2012-05-09 西南科技大学 一种不同分子量魔芋葡甘聚糖及葡甘露低聚糖的制备方法
CN103690568A (zh) * 2013-12-09 2014-04-02 湖北花果山实业有限公司 利用高渗低聚糖液制备固态益生菌制剂的方法
CN111393536A (zh) * 2020-03-31 2020-07-10 华中农业大学 魔芋葡甘聚糖的降解方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102009731B1 (ko) * 2019-04-15 2019-08-12 주식회사 쎌바이오텍 단백질 가수분해물을 이용한 단백질-다당류 이중코팅 유산균의 제조방법

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102443616A (zh) * 2011-10-13 2012-05-09 西南科技大学 一种不同分子量魔芋葡甘聚糖及葡甘露低聚糖的制备方法
CN103690568A (zh) * 2013-12-09 2014-04-02 湖北花果山实业有限公司 利用高渗低聚糖液制备固态益生菌制剂的方法
CN111393536A (zh) * 2020-03-31 2020-07-10 华中农业大学 魔芋葡甘聚糖的降解方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"纤维素酶制备魔芋葡甘低聚糖";张迎庆 等;《吉首大学学报（自然科学版）》;20030925;第24卷(第3期);摘要，材料和方法 *
"魔芋低聚糖对植物乳杆菌在加工过程中活性的影响";董会娟 等;《粮食与油脂》;20190610;第32卷(第6期);摘要，第82页左栏第1段，材料和方法 *
"魔芋葡甘聚糖酶解过程及各种不同分子量葡甘露低聚糖制备条件的研究";姚雪 等;《食品工业科技》;20110830;第32卷(第9期);摘要，材料和方法，第97页右栏第1段 *
"魔芋葡甘露聚糖对高热能膳食诱导小鼠认知功能及脑部氧化应激状态的影响";刘茜 等;《食品科学》;20211109;第1.3.1节 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113215047A (zh) 2021-08-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101605516B1 (ko) 유산균의 생존율, 저장안정성, 내산성 또는 내담즙성을 증가시키는 방법
CN113215047B (zh) 魔芋多糖降解产物KGM-1k与KGM-5k在制备益生菌保护剂中的应用
CN106387923B (zh) 一种富含半乳甘露聚糖的可溶性膳食纤维及其制备方法
CN109453207B (zh) 一种硒化海藻酸钠与硒化壳聚糖包覆的益生菌双层微胶囊、制备方法及其应用
CN111820419B (zh) 靶向调控肠道艾克曼菌和短链脂肪酸产生菌的组合物
WO2010098217A1 (ja) フルクタン含有食品からの免疫賦活発酵食品
CN115349639B (zh) 一种提高免疫力的益生菌缓释体系及其制备方法和应用
CN111440750B (zh) 一株具有缓解乳糖不耐受和降甘油三酯功能的动物双歧杆菌乳亚种及其应用
JP2549638B2 (ja) ビフイズス菌増殖促進組成物
CN114874951A (zh) 一种新型鼠李糖乳杆菌菌株及其应用
WO2023170426A1 (en) Galactooligosaccharide composition
JP2835894B2 (ja) ビフィズス菌増殖促進剤
Simonelli et al. Kefiran
Wongputtisin et al. Prebiotic properties of crude oligosaccharide prepared from enzymatic hydrolysis of basil seed gum
CN111345473A (zh) 一种含卵黄抗体IgY的益生菌组合物及应用制剂
JP4054697B2 (ja) 便秘改善剤
WO2020010644A1 (zh) 一种球毛壳菌右旋糖酐酶的发酵制备及其应用
CN114606280B (zh) 一种合生元组合物及其制备方法
CN113826900A (zh) 一种结冷胶寡糖及其在益生元中的应用
CN110846241B (zh) 具有分解利用人乳低聚糖能力的动物双歧杆菌及其培养方法和食品或药品
Wang et al. In vitro simulated digestion and fecal fermentation of exopolysaccharides from Lacticaseibacillus paracasei GL1
JPH05292947A (ja) ラクトバチルス・アシドフィルスｐｎ−ｒｉ−２−４、それを用いた乳酸菌製剤及びその製造方法
CN114532540B (zh) 麦芽五糖基海藻糖及其微球在调节肠道菌群中的应用
RU2262530C2 (ru) Способ изготовления сухого препарата на основе бифидо- и/или лактобактерий и препарат, изготовленный этим способом
CN114343185A (zh) 一种具有高活菌数的益生菌冻干粉

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant