CN115322937B - 一种提高乳双歧杆菌稳定性的培养方法及产品和应用 - Google Patents
一种提高乳双歧杆菌稳定性的培养方法及产品和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种提高乳双歧杆菌稳定性的培养方法及产品和应用，所述培养方法包括：将乳双歧杆菌发酵培养液在先梯度升温后降温的环境中培养。本发明创造性地将“先梯度升温后降温”的温度程序应用于乳双歧杆菌的发酵培养，显著提高了乳双歧杆菌产物的稳定性，这可能是因为“梯度高温”的处理过程可以刺激乳双歧杆菌代谢出更多的耐热酶，从而提高乳双歧杆菌菌粉的耐受性和储存的稳定性。且所述培养方法简单易操作，适宜工业放大。总的来说，此法简单易行且显著提高了乳双歧杆菌储存稳定性，解决了活菌数低和乳双歧杆菌产物储存不稳定的问题，有利于规模化的生产应用。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种提高乳双歧杆菌稳定性的培养方法及产品和应用。
背景技术
乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)是一种存在于人体内，衡量人体健康指数的重要指标。乳双歧杆菌能够定植于肠道内通过生命活动达到调节宿主微生态平衡的作用，其代谢产生的乙酸、乳酸等，能够降低环境pH值，抑制有害菌的繁殖，达到增强机体免疫力、防治相关疾病、降低胆固醇、延缓衰老等效果，是人体内的重要益生菌。因其独特的益生功效，已广泛应用于食品、医疗保健、畜禽养殖等领域。
专利文件CN112813000A公开了一种乳双歧杆菌高密度发酵培养基及发酵方法，此发明的高密度发酵培养基配方为：乳糖20-30g/L、牛肉浸粉10-15g/L、酵母浸粉10-15g/L、牛骨蛋白胨5-10g/L、磷酸氢二钾2-5g/L、柠檬酸氢铵2-5g/L、乙酸钠2-5g/L、硫酸镁0.2-0.5g/L、硫酸锰0.1-0.2g/L、吐温-80 1-2mL/L、L-半胱氨酸盐酸盐1-2g/L。此发明的高密度发酵方法为：将乳双歧杆菌种子液接种到高密度发酵培养基中进行发酵，发酵过程中流加中和剂的任一种维持发酵液pH值为5.5～6.0。本发明实现了乳双歧杆菌的高密度发酵，降低了生产成本、提高了生产效率。
CN108277178B公开了一种双歧杆菌和乳酸杆菌的工业化高密度混合发酵培养基、发酵培养方法以及菌粉包埋方法；所述发酵培养基为：玉米浆干粉0.3-1.5％，大豆蛋白胨0-1.8％，低聚果糖0-1％，葡萄糖0.5-1％，磷酸氢二钾0.4-1.35％，磷酸二氢钾0.4％，硫酸镁0.015-0.02％，L-半胱氨酸盐酸盐0.05％；或者玉米浆干粉0.3-1.5％，牛肉膏0-1％，低聚果糖0-1％，葡萄糖0.5-1％，磷酸氢二钾0.4-1.35％，磷酸二氢钾0.4％，硫酸镁0.015-0.02％，L-半胱氨酸盐酸盐0.05％；所述发酵方法包括菌种活化培养、一级菌种培养、二级种子液制备、车间200L小罐培养和车间1T大罐发酵培养。此发明提供的培养基组方相对传统TPY培养基，活菌数提高10倍以上，成本降低60％，且该组方原料易于购买，成分简单，适合工业化生产需求。所述菌种包埋技术，大大提高菌种耐受人体及外界环境的能力。
目前，乳双歧杆菌工业化生产中存在产量低和储存稳定性差等问题，因此，探索控制发酵过程的增强菌体耐受性和储存稳定性的方法是非常有意义的。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种乳双歧杆菌的培养方法及产品和应用，具体提供一种提高乳双歧杆菌稳定性的培养方法及产品和应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种提高乳双歧杆菌稳定性的培养方法，所述培养方法包括：将乳双歧杆菌发酵培养液在先梯度升温后降温的环境中培养。
本发明创造性地将“先梯度升温后降温”的温度程序应用于乳双歧杆菌的发酵培养，显著提高了乳双歧杆菌产物的稳定性，这可能是因为“梯度高温”的处理过程可以刺激乳双歧杆菌代谢出更多的耐热酶，从而提高乳双歧杆菌菌粉的耐受性和储存的稳定性。且所述培养方法简单易操作，适宜工业放大。总的来说，此法简单易行且显著提高了乳双歧杆菌储存稳定性，解决了活菌数低和乳双歧杆菌产物储存不稳定的问题，有利于规模化的生产应用。
优选地，所述梯度升温的具体过程为：以18-30℃为初始温度，恒温保持3-6h；再第一次升温至21-38℃，恒温保持3-6h；再第二次升温至24-46℃，恒温保持3-6h，以此类推直至乳双歧杆菌液OD600达10-18时开始降温。
所述18-30℃中的具体数值可以选择18℃、20℃、22℃、24℃、26℃、28℃或30℃等。
所述3-6h中的具体数值可以选择3h、3.5h、4h、4.5h、5h、5.5h或6h等。
所述21-38℃中的具体数值可以选择21℃、23℃、25℃、27℃、30℃、32℃、34℃、36℃或38℃等。
所述3-6h中的具体数值可以选择3h、3.5h、4h、4.5h、5h、5.5h或6h等。
所述24-46℃中的具体数值可以选择24℃、27℃、30℃、33℃、36℃、39℃、42℃、45℃或46℃等。
所述3-6h中的具体数值可以选择3h、3.5h、4h、4.5h、5h、5.5h或6h等。
所述OD600达10-18中的具体数值可以选择10、11、12、13、14、15、16、17或18等。
上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述升温的速率独立地为0.1-2℃/min。
所述0.1-2℃/min中的具体数值可以选择0.1℃/min、0.4℃/min、0.7℃/min、1℃/min、1.3℃/min、1.4℃/min、1.7℃/min或2℃/min等。
上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
本发明所述培养方法中梯度升温的初始温度选择18-30℃，以此温度维持3-6h，随后以0.1-2℃/min的速率升温至21-38℃，维持3-6h，再次以0.1-2℃/min的速率升温至24-46℃，维持3-6h，以此类推，直至乳双歧杆菌液OD600达10-18时开始降温。所述梯度升温的过程更适宜乳双歧杆菌的生长繁殖，且产物乳双歧杆菌的储存稳定性更强，且OD600达10-18时开始降温，发酵结束时，乳双歧杆菌处于的生长时期大致相同，从而乳双歧杆菌具有更好的均一性。
优选地，所述降温降至30℃以下。
所述30℃以下的具体数值可以选择30℃、28℃、26℃、、24℃、22℃或20℃等。上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述降温在0.3-4h内降至30℃以下。
所述0.3-4h中的具体数值可以选择0.3h、0.8h、1.3h、1.8h、2.3h、2.8h、3.3h、3.8h或4h等。
所述30℃以下的具体数值可以选择30℃、28℃、26℃、24℃、22℃或20℃等。
上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
本发明所述降温降至30℃以下，乳双歧杆菌的代谢过程迅速减弱，有利于减少乳双歧杆菌的死亡数，提高菌粉中的乳双歧杆菌的储存存活率和细胞均一性。所述降温在0.3-4h内降至30℃以下时，降温更加迅速，乳双歧杆菌菌粉的储存稳定性更高。
第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的培养方法在制备乳双歧杆菌菌粉中的应用。
第三方面，本发明提供一种乳双歧杆菌菌粉，所述乳双歧杆菌菌粉由包括如下步骤的制备方法制得：
将第一方面所述的培养方法得到的培养产物，进行离心、取乳双歧杆菌菌泥乳化、冻干、粉碎、过筛，得乳双歧杆菌菌粉。
本发明所涉及的根据第一方面所述的培养方法得到的培养产物，随后进行离心、乳化、冻干、粉碎、过筛等操作，得乳双歧杆菌菌粉，所述乳双歧杆菌菌粉中的菌体耐受性更强，且储存稳定性更优。且此制备方法操作简单，适宜工业放大。
优选地，所述乳化步骤前还包括乳双歧杆菌菌泥与冻干保护剂的混合步骤。
优选地，所述冻干保护剂包括海藻糖、脱脂乳粉、麦芽糊精、蔗糖、谷氨酸钠和水。
优选地，所述冻干保护剂以质量份数计包括海藻糖1-25份、脱脂乳粉1-8份、麦芽糊精1-5份、蔗糖1-5份、谷氨酸钠0.5-3份和水54-95份。
所述海藻糖的质量份数可以选择1份、4份、7份、10份、13份、16份、19份、22份或25份等。
所述脱脂乳粉的质量份数可以选择1份、2份、3份、4份、5份、6份、7份或8份等。
所述麦芽糊精的质量份数可以选择1份、2份、3份、4份或5份等。
所述蔗糖的质量份数可以选择1份、2份、3份、4份或5份等。
所述谷氨酸钠的质量份数可以选择0.5份、1份、2份或3份等。
所述水的质量份数可以选择54份、59份、64份、69份、74份、79份、84份、89份、94份或95份等。
上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述冻干保护剂与乳双歧杆菌菌泥混合步骤前还包括冻干保护剂的灭菌步骤。
优选地，所述灭菌的温度为100-118℃，灭菌的时间为20-40min。
所述100-115℃中的具体数值可以选择100℃、104℃、108℃、112℃、116℃或118℃等。
所述20-40min中的具体数值可以选择20min、24min、28min、32min、36min或40min等。
上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述乳双歧杆菌菌泥与冻干保护剂的质量比为(3-8):1。
所述(3-8)中的具体数值可以选择3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5或8等。
上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
本发明所涉及的乳双歧杆菌菌粉的制备过程中，于乳化前将离心后的乳双歧杆菌菌泥与冻干保护剂混合，制得的乳双歧杆菌菌粉的细胞耐受性强、生长时期均一度高，储存稳定性强；当进一步加入冻干保护剂时，所述乳双歧杆菌菌粉的储存稳定性更强。当所述乳双歧杆菌菌泥与冻干保护剂的质量比特定选择(3-8):1时，冻干保护剂对菌体的保护作用更强，储存稳定性将进一步增强。
第四方面，本发明提供一种如第一方面所述的培养方法或如第三方面所述的乳双歧杆菌菌粉在制备含乳双歧杆菌的食品、保健品或药品中的应用。
优选地，所述培养的乳双歧杆菌接种量为发酵培养基体积的3-10％。
所述3-10％中的具体数值可以选择3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％等。上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述乳双歧杆菌发酵培养液的pH维持在4-8之间。
所述4-8中的具体数值可以选择4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5或8等。
优选地，调节所述pH使用的酸碱调节剂包括氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、氨水或碳酸氢钾中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合包括氢氧化钠和碳酸钠的组合、碳酸钠和碳酸氢钠的组合、氨水和碳酸氢钾的组合等，其他组合均可选择，在此便不一一赘述。
优选地，所述pH调节用酸碱调节剂包括氢氧化钠或碳酸钠。
优选地，所述培养前还包括乳双歧杆菌的活化、扩大培养操作。
优选地，所述活化的乳双歧杆菌接种量为活化用培养基体积的3-10％。
所述3-10％中的具体数值可以选择3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％等。上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述活化的培养温度为30-40℃，所述培养时间为8-15h。
所述30-40℃中的具体数值可以选择30℃、32℃、34℃、36℃、38℃或40℃等。
所述8-15h中的具体数值可以选择8h、9h、10h、11h、13h或15h等。
上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述扩大培养的乳双歧杆菌接种量为扩大用培养基体积的3-10％。
所述3-10％中的具体数值可以选择3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％等。上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述扩大培养的培养温度为30-40℃，所述培养时间为6-12h。
所述30-40℃中的具体数值可以选择30℃、32℃、34℃、36℃、38℃或40℃等。
所述6-12h中的具体数值可以选择6h、8h、9h、10h、11h或12h等。
上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述扩大培养时使用的发酵罐体积为20-500L。
所述20-500L中的具体数值可以选择20L、50L、100L、200L或500L等。
上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述活化、所述扩大培养、所述培养使用的培养基，独立地包括MRS培养基。
本发明所述乳双歧杆菌菌种接种使用的培养基包括MRS培养基，其中MRS培养基为常规培养基，主要成分包括蛋白胨、牛肉浸粉、酵母浸粉、葡萄糖、吐温-80、磷酸氢二钾、乙酸钠、柠檬酸氢二铵、硫酸镁、硫酸锰、琼脂粉。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明创造性地将“先梯度升温后降温”的温度程序应用于乳双歧杆菌的发酵培养，显著提高了乳双歧杆菌的稳定性，这可能是因为“梯度高温”的处理过程可以刺激乳双歧杆菌代谢出更多的耐热酶，从而提高乳双歧杆菌菌粉的耐受性和储存的稳定性。且所述培养方法简单易操作，适宜工业放大。总的来说，此法简单易行且显著提高了乳双歧杆菌储存稳定性，解决了活菌数低和乳双歧杆菌产物储存不稳定的问题，有利于规模化的生产应用。
附图说明
图1为实施例1和对比例1发酵培养过程中，乳双歧杆菌菌体密度随发酵时间变化图。
图2为实施例1制得乳双歧杆菌菌粉的显微镜图片。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例、对比例、测试例中所使用的MRS商用培养基为购买自青岛海博生物技术有限公司的产品。
制备例1
本制备例提供一种乳双歧杆菌发酵培养时使用的活化液，其制备方法如下：将甘油管菌种乳双歧杆菌(CGMCC1.15623)按照10％v/v的接菌量接种于MRS商用培养基中进行菌种活化，厌氧瓶中静置发酵，装液量250mL/500mL，温度37℃，培养12h，制得活化液。
实施例1
本实施例提供一种乳双歧杆菌菌粉，其制备方法如下：
将活化液接种于500L发酵罐中，使用MRS商用培养基，培养基初始pH为6.5，培养温度为37℃，转速30rpm，接种量5％v/v，发酵罐装液量250L/500L，通入压缩空气维持罐压0.03±0.02MPa，培养至OD600≥2.0时停止，得所述种子液；
将活化的乳双歧杆菌种子液接种于装有MRS商用培养基的5000L发酵罐中进行发酵培养，接种前调节培养基初始pH为6.2，转速30rpm，发酵罐装液量4000L/5000L，罐压0.03±0.02MPa，接种量为5％v/v，发酵过程pH维持在6，梯度升温培养：初始温度为27℃，恒温保持4h；0.5℃/min升温10min，第一次升温至32℃，维持4h；0.5℃/min升温10min，第二次升温至37℃，维持4h；0.5℃/min升温10min，第三次升温至42℃，维持2h。菌液OD600值达到13时降温(图1)，在1h内降温至30℃，12000rpm离心，得乳双歧杆菌的菌泥；
将海藻糖10份、脱脂乳粉6份、麦芽糊精3份、蔗糖3份、谷氨酸钠1份和水77份混合，105℃的温度条件下灭菌30min，得冻干保护剂；
按乳双歧杆菌的菌泥:冻干保护剂＝5:1的质量比混匀，随后在剪切转速为2000rpm的条件下乳化30min，并使用真空冷冻干燥机冻干，随后进行粉碎，使用80目筛网过筛，得所述乳双歧杆菌菌粉。
实施例2
本实施例提供一种乳双歧杆菌菌粉，其制备方法如下：
将活化液接种于500L发酵罐中，使用MRS商用培养基，培养基初始pH为6.3，培养温度为38℃，转速30rpm，接种量10％v/v，发酵罐装液量250L/500L，通入压缩空气维持罐压0.03±0.02MPa，培养至OD600≥2.0时停止，得所述种子液；
将活化的乳双歧杆菌种子液接种于装有MRS商用培养基的5000L发酵罐中进行发酵培养，接种前调节培养基初始pH为6.5，转速30rpm，发酵罐装液量4000L/5000L，罐压0.03±0.02MPa，接种量为10％v/v，发酵过程pH维持在6.3，梯度升温培养：初始温度为22℃，恒温保持5h；0.6℃/min升温10min，第一次升温至28℃，维持5h；0.6℃/min升温10min，第二次升温至34℃，维持4h；0.6℃/min升温10min，第三次升温至40℃，维持1.5h，菌液OD600值达到13时降温，在0.5h内降温至30℃，11000rpm离心，得乳双歧杆菌的菌泥；
将海藻糖1份、脱脂乳粉6份、麦芽糊精1份、蔗糖3份、谷氨酸钠1份和水88份混合，110℃的温度条件下灭菌30min，得冻干保护剂；
按乳双歧杆菌的菌泥：冻干保护剂＝3:1的质量比混匀，随后在剪切转速为2200rpm的条件下乳化30min，并使用真空冷冻干燥机冻干，随后进行粉碎，使用70目筛网过筛，得所述乳双歧杆菌菌粉。
实施例3
本实施例提供一种乳双歧杆菌菌粉，其制备方法如下：
将活化液接种于装有MRS商用培养基的20L发酵罐中进行发酵培养，接种前调节培养基初始pH为6.0，转速30rpm，发酵罐装液量16L/20L，罐压0.03±0.02MPa，接种量3％v/v，梯度升温培养：初始温度为28℃，恒温保持3h；0.3℃/min升温10min，第一次升温至31℃，维持5h；0.3℃/min升温10min，第二次升温至34℃，维持5h；0.3℃/min升温10min，第三次升温至37℃，维持4h，菌液OD600值达到13时降温，在1.2h内降温至30℃，13000rpm离心，得乳双歧杆菌的菌泥；
将海藻糖20份、脱脂乳粉2份、麦芽糊精5份、蔗糖4份、谷氨酸钠2份和水67份混合，108℃的温度条件下灭菌30min，得冻干保护剂；
按乳双歧杆菌的菌泥:冻干保护剂＝8:1的质量比混匀，随后在剪切转速为2100rpm的条件下乳化30min，并使用真空冷冻干燥机冻干，随后进行粉碎，使用90目筛网过筛，得所述乳双歧杆菌菌粉。
实施例4
本实施例提供一种乳双歧杆菌菌粉，其制备方法与实施例1的区别仅在于将初始温度为27℃，恒温保持4h；0.5℃/min升温10min，第一次升温至32℃，维持4h；0.5℃/min升温10min，第二次升温至37℃，维持4h；0.5℃/min升温10min，第三次升温至42℃，维持2h，菌液OD600值达到13时降温替换为初始温度为27℃，恒温保持1h；0.5℃/min升温10min，第一次升温至32℃，维持7h；0.5℃/min升温10min，第二次升温至37℃，维持1h；0.5℃/min升温10min，第三次升温至42℃，维持42℃的培养温度直至OD600等于13时开始降温，其余均与实施例1一致。
实施例5
本实施例提供一种乳双歧杆菌菌粉，其制备方法与实施例1的区别仅在于将初始温度为27℃，恒温保持4h；0.5℃/min升温10min，第一次升温至32℃，维持4h；0.5℃/min升温10min，第二次升温至37℃，维持4h；0.5℃/min升温10min，第三次升温至42℃，维持2h，菌液OD600值达到13降温替换为初始温度为27℃，恒温保持7h；0.5℃/min升温10min，第一次升温至32℃，维持1h；0.5℃/min升温10min，第二次升温至37℃，维持7h；0.5℃/min升温10min，第三次升温至42℃，维持42℃的培养温度直至OD600等于13时开始降温，其余均与实施例1一致。
实施例6
本实施例提供一种乳双歧杆菌菌粉，其制备方法与实施例1的区别仅在于将初始温度为27℃，梯度升温培养恒温保持4h；0.5℃/min升温10min，第一次升温至32℃，维持4h；0.5℃/min升温10min，第二次升温至37℃，维持4h；0.5℃/min升温10min，第三次升温至42℃，维持2h，菌液OD600值达到13降温替换为初始温度为17℃，恒温保持4h；0.5℃/min升温10min，第一次升温至22℃，维持4h；0.5℃/min升温10min，第二次升温至27℃，维持4h；0.5℃/min升温10min，第三次升温至32℃，依次类推，直至OD600等于13时开始降温，其余均与实施例1一致。
实施例7
本实施例提供一种乳双歧杆菌菌粉，其制备方法与实施例1的区别仅在于将梯度升温培养将初始温度为27℃，梯度升温培养恒温保持4h；0.5℃/min升温10min，第一次升温至32℃，维持4h；0.5℃/min升温10min，第二次升温至37℃，维持4h；0.5℃/min升温10min，第三次升温至42℃，维持2h，菌液OD600值达到13降温替换为初始温度为31℃，恒温保持4h；0.5℃/min升温10min，第一次升温至36℃，维持4h；0.5℃/min升温10min，第二次升温至41℃，依次类推，直至OD600等于13时开始降温，其余均与实施例1一致。
实施例8
本实施例提供一种乳双歧杆菌菌粉，其制备方法与实施例1的区别仅在于将初始温度为27℃，恒温保持4h；0.5℃/min升温10min，第一次升温至32℃，维持4h；0.5℃/min升温10min，第二次升温至37℃，维持4h；0.5℃/min升温10min，第三次升温至42℃，维持2h替换为初始温度为27℃，恒温保持4h；0.05℃/min升温100min，第一次升温至32℃，维持4h；0.05℃/min升温100min，第二次升温至37℃，维持4h；0.05℃/min升温100min，第三次升温至42℃，维持2h，其他均与实施例1一致。
实施例9
本实施例提供一种乳双歧杆菌菌粉，其制备方法与实施例1的区别仅在于在1h内降温至30℃替换为在0.2h内降温至30℃，其他均与实施例1一致。
实施例10
本实施例提供一种乳双歧杆菌菌粉，其制备方法与实施例1的区别仅在于在1h内降温至30℃替换为在4.2h内降温至30℃，其他均与实施例1一致。
实施例11
本实施例提供一种乳双歧杆菌菌粉，其制备方法与实施例1的区别仅在于所述乳双歧杆菌菌泥与冻干保护剂的质量比为2:1，其他均与实施例1一致。
实施例12
本实施例提供一种乳双歧杆菌菌粉，其制备方法与实施例1的区别仅在于所述乳双歧杆菌菌泥与冻干保护剂的质量比为9:1，其他均与实施例1一致。
对比例1
本对比例提供一种乳双歧杆菌菌粉，其制备方法与实施例1的区别仅在于不进行梯度升温后降温培养，在37℃下的温度持续发酵14h(图1)，其他均与实施例1一致。
测试例1
对实施例、对比例制得的乳双歧杆菌菌粉进行储存稳定性评价。具体评价方法为：根据GB 4789.35-2016的检验方法检测，(1)分别取实施例1-12和对比例1制得的乳双歧杆菌菌粉100g，置于25℃的温度下放置6个月和12个月。(2)分别取实施例和对比例当天制得、放置6个月后和放置12个月后的菌粉各1g，加入9mL生理盐水涡旋混匀，重复一次。(3)将混匀的液体分别使用生理盐水稀释10倍、20倍、50倍，得不同浓度梯度的混合菌液。(4)吸取1ml混合菌液加入平板中，倒入已融化并冷却至50℃左右的MRS培养基，轻轻转动平板，使菌液与MRS培养基混合均匀，冷疑后倒置，37℃培养，48h后取出计数，得活菌数(cfu/g)。当天制得菌粉对应的活菌数记为初始活菌量，放置6、12个月乳双歧杆菌存活率(％)＝放置6、12个月乳双歧杆菌活菌量(cfu/g)/初始活菌量(cfu/g)。
表1
由表1数据可知，实施例4、5的梯度升温过程，部分恒温保持时间超过6h或不足1h，其放置6和12个月后存活率均较实施例1低，表明梯度升温过程中，维持恒温时间处于3-6h时制得菌粉的储存稳定性更强；实施例6、7升温的初始温度分别为17℃、31℃，其放置6和12个月后存活率较实施例1低，表明初始温度在18-30℃时，乳双歧杆菌菌粉的储存12个月后的存活率更高，稳定性更好；实施例8对应的第一次、第二次、第三次升温速率为0.05℃/min，升温缓慢，与实施例1相比放置6、12个月的存活率较低，表明升温速率在0.1-2℃/min之间时，产品乳双歧杆菌菌粉的储存稳定性更高；实施例9、10的降温降至30℃以下的时间分别为0.2h或4.2h，其放置6、12个月的乳双歧杆菌存活率较实施例1低，表明降温时间在0.3-4h之间时，乳双歧杆菌菌粉储存稳定性更优；实施例11、12所述菌粉的制备过程中所述乳双歧杆菌菌泥与冻干保护剂的质量比分别为2:1和9:1，其放置6、12个月的乳双歧杆菌存活率均低于实施例1，表明当所述乳双歧杆菌菌泥与冻干保护剂的质量比分别为(3-8):1时，冻干保护剂可以发挥更优异的保护作用，进一步地产品乳双歧杆菌菌粉制备过程中菌体损伤更少，更有利于长期储存。对比例1未采用梯度升温的温度程序，其放置6、12个月的乳双歧杆菌存活率更低，表明使用梯度升温的培养方法后，有利于增强双歧杆菌的耐受性，菌粉的储存稳定性更优。
测试例2
使用显微镜对实施例1制得的观察乳双歧杆菌菌粉中的乳双歧杆菌，结果如图2所示，乳双歧杆菌菌体大小相似，形态均一，大部分的菌处于相同的生长周期，表明应用本发明方法制得的菌粉中的乳双歧杆菌具有更优的均一性，进一步地，乳双歧杆菌在使用时具有更高的活性。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (2)
1.一种提高乳双歧杆菌稳定性的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括：将乳双歧杆菌发酵培养液在先梯度升温后降温的环境中培养；
所述梯度升温的具体过程为：以27℃为初始温度，恒温保持4h；再第一次升温至32℃，恒温保持4h；再第二次升温至37℃，恒温保持4h；再第三次升温至42℃，恒温保持2h至乳双歧杆菌液OD600达13时开始降温；所述升温的速率为0.5℃/min；所述降温在1h内降至30℃；
或者，所述梯度升温的具体过程为：以22℃为初始温度，恒温保持5h；再第一次升温至28℃，恒温保持5h；再第二次升温至34℃，恒温保持4h；再第三次升温至40℃，恒温保持1.5h至乳双歧杆菌液OD600达13时开始降温；所述升温的速率为0.6℃/min；所述降温在0.5h内降至30℃；
或者，所述梯度升温的具体过程为：以28℃为初始温度，恒温保持3h；再第一次升温至31℃，恒温保持5h；再第二次升温至34℃，恒温保持5h；再第三次升温至37℃，恒温保持4h至乳双歧杆菌液OD600达13时开始降温；所述升温的速率为0.3℃/min；所述降温在1.2h内降至30℃。
2.如权利要求1所述的培养方法在制备乳双歧杆菌菌粉中的应用。
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