JPH04502105A

JPH04502105A - 酵素安定化

Info

Publication number: JPH04502105A
Application number: JP2500226A
Authority: JP
Inventors: ギブソン　ティモシイ　ダビイド; ウッドワード　ジョン　ロバート
Original assignee: クランフィールド　バイオテクノロジー　リミテッド
Priority date: 1988-11-11
Filing date: 1989-11-13
Publication date: 1992-04-16
Also published as: EP0376361B2; DE68907707T3; US5240843A; GB8826429D0; AU4639589A; DE68907707D1; EP0376361A3; EP0444111A1; ATE91712T1; AU637776B2; DE68907707T2; WO1990005182A1; EP0376361B1; EP0376361A2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明はたんばく質類の安定化に関し、特に、しかしこれのみに限らない乾燥状態に８ける酵素類の安定化に関する。

溶液に、本来、安定する酵素類は数少ない。　多くのものは溶液中にあっては変成する傾向がある。　多くの研究者は当該溶液に糖類又はグリセロールといった化合物を添加したり、又は冷凍乾燥によって酵素類を安定化することを試みてきた。　こうした方法はしばしば活性度の喪失の原因となる。他方、別な方法としてセルロウス　ファイバー又はポリアクリルアミドのごとき固体支持の存在下、安定剤で酵素類を乾燥するものもある。　［ＪＳ４４５１５６９はアラビノーゼ、グルコース、キシリトール及びソルビトールを含む数多くの糖類の１つで酵素を冷凍することによるグルタチオン　ペルオキシダーゼの安定化を開示している。　冷凍乾燥は大規模での操業では高値な費用がかかり、かつしばしば変成を豐す。

ＰＣＴ／ＧＢ８６１００３６９は、１ｉＩＩ′ｌＲトレハロースの使用による蛋白質類の安定化について開示している。

本発明の第一の特徴によれば、乾燥に際して蛋白質類をその変成から防ぐ方法は、蛋白質水溶液を水溶性陽イオン高分子電解質及びサイクリック　ポリオールと混合し、かつ該水溶液から水を除去することからなる。

本発明にもとすく安定化でもって新鮮に乾燥した酵素類及び他の蛋白質類の活性を増大させる。　貯蔵での安定化もまた増大する。

前期蛋白質類は酵素類、抗体類、抗原類、血清補体、牛痘戊分及び生物活性ペプチドを含むものである。

蛋白類、特に酵素類の乾燥は数多くの適用面、例えば使用前に長期間貯蔵されるかもしれない試片のごとき診断又は分析助成での使用の際に重要である。

溶液中での酵素類又は他の蛋白ｆｌ類の輸送は不便であるしまた高値でもある。

冷凍乾燥が用いられるかもしれないが、本発明によれば変成を起こすことなく真空乾燥及び空気乾燥の使用を促進しうる。真空乾燥及び空気乾燥はその操作が簡単であり極めて安値である。

サイクリック　ポリオールは１つ又は複数の脂環リングを含むものでもよく又少なくとも１つの側鎖を持つものでもよい。　５及至１０の水酸基を有する化合物が好ましい。　非還元ポリ−オル類も好ましい。　三糖及び三糖類は特に有効であるが、その他のサイクリックポリオール類、例えば、イノシトールも又使用可能である。該ポリオールは酵素又は他の蛋白質及び高分子電解質に適ごうするように選択され得る。　ラクチトール、ラクトーゼ、マルトーゼ及びスフローゼは数多くの適用に好適であることが判明しているＤＥＡＥ−デキストランと併用して特に好ましい。　ソルビトールはコレステロール　オキシタ−ゼ、コレステロール　エステラーゼ　及び他の酵素類と併用するのに好適である。　七ロビオーゼも又使用可能である。　ポリオールの量は１及至２０％の範囲が好ましく、より好ましくは２及至】０％、最も好ましくは５至及１０％の範囲である。

陽イオン高分子電解質は分子鎖に沿って分配された陽イオン基を持つポリマーカ好ましい。好ましくは機能を誘導された４つのアンモニウム基が好適な前記陽イオン基は鎖からぶら下がった側鎖基に配置されるか、又はその中に組み込まれ得る。　天然又は合成ポリマーは使用可能である。多糖類のごとき天然ポリマーは好適である。何故ならば多くの合成ポリマーは無機重合触媒の残余トレースを含むからである。

ジエチルアミノエチル　デキストラン（ＤＥＡＥ−デキストラン）及びキトサンは好適であるが、ポリエチレンイミンも又好適である。　ＭＷ５０００及至５０００００を有する多糖類、好ましくは５０００及至２００００、より好ましくは５０００及至１００００である。　０．１及至ｌＯ％の量が好適であり、特に０，５及至２％がより好適である。

本発明による酵素類が乾燥されるＰＨは乾燥の際及びその後の貯蔵に関して活性を最大限活用するために重要である。特定の酵素の最適のＰＨは簡単な実験によって決定しうる。

アルコール　オキシダーゼはＰＨ７及至８の間、好ましくはＰＨ７−８で活性を保持するよう形成されている。

前記ソース（ｓｏｕｒｃｅ）にもとず〈コレステロールオキシダーゼはＰＨ５又は９で最も好ましく乾燥する。

ウリカーゼはＦ’Ｈ９で乾燥されうる。

前記ソースにもとずくコレステロールエストラーゼはＰＨ７又は９で乾燥されうる。

乾燥は、好ましくは湿潤剤の存在下でなされるのが好ましい。　４度及至５０度の間、好ましくは２５度から３５度の温度である。

本発明の第２の特徴は蛋白質、サイクリック　ポリオール及び陽イオン高分子電解質を含む乾燥生成物を提供することにある。

前記乾燥生成物はフリーランニング粉末であり、又は試片、その他の分析用又は診療用装置の１部分からなる。

以下、本発明を実施例にもとすいて述べるが、該実施例のものに限定されるものではない。

実験手法当該明細書で使用するパーセンテージは特に記載されない限り重量比である。

安定化システムはすべて安定なＰＨ条件を維持するため緩衝液を使用するＮ　ａ　ＨｙＰ　０４２　Ｈ２Ｏ（６，０８４ｇ）及びＮａ、Ｈｐｏ、２ＨｚＯ（１０゜８５５　ｇ）を含む緩衝液をリッターにつき１００ミリモルの濃度でＰＨ７，０の溶液を作るため１．０リツターの蒸留水中に溶解させた。

他の緩衝液としてはＭＯＰＳ　（４−モルホリン　プロパン硫酸）で５２゜２５／２．５１蒸留水、４．０Ｍ、ＮａＯＨの７．８７までのＰＨである。

湿潤剤は酵素システムがポリスチレン　キュベツト（ｃｕｖｅｔｔｅ）内で安定化されているかどうかによって使用されうる。　好適な湿潤剤はパイ；（Ｂｙｃｏ）Ａと呼ばれるゼラチンからの蛋白加水分解物である。これらはりン酸塩緩衝液中において１％ｗ　／　ｖまで作り得る。　必要に際して１００ｍｍｏ１．１ −’、ＰＨ７−０までなし得る。

酵素溶液は使用の前に新鮮なものを用意した。　硫酸アンモニラ溶液中の貯蔵酵素溶液はすべての塩類を除去するＩ；め、例えばｍｍｏｌ、１’−リン酸緩衝液ＰＨ７，０について透析された。

貯蔵酵素濃度は溶液ミリリッタについて活性単位１０がら１０００である。　蛋白濃度については０．５及至２００ｍｇｃｍ−”である。　代表的には最終蛋白濃度は１．０ｍｇｃｍ”であっＩ；。

可溶解性高分子電解質、ポリオール、酵素、緩衝塩及び湿潤剤（使われるならば）一定温度で混合され、デシカン（（ｄｅｓｓｉｃａｎｔ）例えば、シリカゲル　０．１ｍｍ／Ｈｇ、３０ＫＣで４及至１０時間、真空オープンで乾燥された。

オキシダーゼ酵素群は酵素の活性により生成されｔ；過酸化水素の比色検出によって検定されされうる。　ペルオキシダーゼは芳香族アルコール又はアミン及び複素環式化合物４−アミノアンティビリンの存在下で生成された過酸化水素に作用し、キノンイミン染料を作り出す。　その他の標準的検定システムとしては、例えばｕ、ｖ、分光計を使用することである。

下記のシステムが用いられた。

システム　ｌフェノール　スルホン厳　２５　ｍｍｏｌ、ｌ−１４−アミノアンティビリン　０．４ｍｍｏ１．ｌ−’ペルオキシダーゼ　１０００　ユニット／１生成染料は５００ｎｍで測定された。

システム　２３．５ジクロロ　２−石炭酸スルホン酸　１０ｍｍｏ１．ｌ−’ ４−アミノアンティビリン　０．４ｍｍｏ１．Ｉ−’ペルオキシダーゼ　１０００　ユニット／１生成染料は５２０ｎｍで測定された。

探準温度、例えば２５度Ｃ及び温置時間、例えば５分を採用した。　試薬生成品（ｂｌａｎｋｓ）は基体を除いて総ての成分を含むものであった。　キュベツト（ｃｕｖｅｔｔｅｓ）内での乾燥調整は直接システム１又は２によって再構成された。

乾燥粉末調合されたものはリン酸塩緩衝液で再構成され、適当なアリコツトがシステムｌ又は２に加えられた。

安定化目的から、貯蔵温度は３７度Ｃであり、酵素の残存活性を調べるために定期的にサンプルを摘出した。　この手法はテストされたすべての酵素ｊ；ついて標準的なものであった。

可溶解性高分子電解質及び糖アルコール又は糖類可溶解性高分子電解質可溶解性高分子電解質は、通常ｌＯ％ｗ／ｖであるが、２０％までの濃度の蒸留水中に溶解された。　これらの溶液４度Ｃで貯蔵され調合後４週間以内に使用された。

実施例　ｌ溶液　Ｉ　ＤＥＡＥ−デキストラン１０％　１００ｕＪラクチトール　２０％　５００ｕｌバイコＡ　１％　１００ｕｌ溶液　２　アルコール　オキシダーゼ７ユニツト　３５ｕ　１（１，７ｍｇ　蛋白質リン酸塩緩衝液　１００ｍｍｏ１．ｌ−’　２６５ｕｌＰＨ７，０溶液ｌは４度Ｃで溶液２をゆっくりと添加しながら絶えず撹拌した。　該混合物は完全に混合するように５分間撹拌された。　キュベツト内で０．１°ｍ１の量が上述のごとく乾燥され、３７度Ｃで貯蔵され、かつ上述したごとく活性を検定した。、（表　１）実施例　２ｆｆＪＨｌ　アルコール　オキシダーゼ　２４１１ユニツト　２．７ｃｍ３（＝４２２ｍｇ蛋白質）リン酸塩緩衝液中３００ｍｍｏ１．ｌ−’ 溶液　２　ラクチド・−ル２０％ｗ／ｖ　３．０ｃｍ３ＤＥＡＥ−デキストランｌＯ％　ｗ／ｖ　Ｏ，２７ｃｒｒ、”溶液２は撹拌しながら溶液ｌにゆっくり添加した。　該混合液はペトリ皿にピペットで移され、８時間、３０度Ｃでシリカゲル上で真空乾燥されることで薄いガラス状の膜の乾燥酵素及び安定剤が生成した。　該安定剤は除去されガラスの乳棒と乳鉢とで微細粉末にした。

安定化テスト目的で、酵素粉末１０ｍｇを無菌ポリスチレン管内に置きシリカゲル上密封容器内で３７度Ｃで装置した。　サンプルを定期的に取り出し蒸留水中で再構成した。　再構成しｌ；酵素溶液６０ｕ１をベルオキシダーゼ及び色試薬を含む各検定キュベツト上述のごとく添加した。（表　２）実施例　３溶液　Ｉ　ＤＥＡＥ−デキストラン　ｌＯ％ｗ／ｖ　１００ｕｌラクチトール　２０％ｗ　／　ｖ　５００　ｕ　１バイコＡ　１％ｗ／ｖ　１００ｕｌ溶液　２　コリン　オキシダーゼ　１０ユニツト（Ｑ、７９４ｍｇ蛋白質）リン酸塩中、ＰＨ７，Ｏ１００ｃｍ３００ｕ　ｌ溶液２を撹拌下、溶液１に添加し４度Ｃで完全に混合した。０．１ｃｍ３の量を上述のごとくキュベツト内で真空乾燥し３７度Ｃで貯蔵して上述のごとく活性を検定した。（表３）実施例　４グリセロール　３　リン酸塩オキシダーゼ溶液　ｌ　ＤＥＡＥ−デキストラン　１０％ｗ　／　ｖ　Ｉ　００　ｕ　１ラクヂｌ−−ル　２０％ｗ／ｖ　５００ｕｌバイコＡ　１％ｗ／ｖ　１００ｕｌｉＷｅ２　グリセロール　３　リン酸塩オキ／ターゼｌＯユニット（０，５２６ｍｇ蛋白質）ＰＨ７，０、リン酸塩緩衝液中　３００ｕ　１溶液２を４度Ｃで溶液ｌに撹拌下添加し、完全に混合した。　０．１ｃｍ３の量を上述のごとくキュベツト内で真空乾燥しＩ；。（表４）実施例　５溶液　Ｉ　ＤＥＡＥ−デキストラン　１０％　ｌ００ｕｌラクトース　２０％　５００ｕ　ｌバイコＡ　１％　１ｏｏｕｉ溶液　２　アルコール　オキシダーゼ　５ユニツト（ＰＨ７，０、リン酸塩１００ｍｍｏ１．Ｉ−’中１．０ｍｇ蛋白質００ｕ　Ｉ溶液ｌを４度Ｃで溶液２にゆっくりと添加しながら絶えず撹拌した。　完全に混合したＯ、１ｃｍ”の量が上述したごとくキュベツト内で乾燥されたことを確認するため５分間前記混合物を撹拌した。　（表５）可溶性多糖類可溶性多糖類を、通常１０％ｗ　／　ｖの濃度であるが、３０％ｗ　／　ｖの濃度までの蒸留水中で溶解した。　これら溶液は調合後４週間以内に使用され、４度Ｃで貯蔵した。

実施例　６溶液　ｌ　デキストラン（分子ｗｔ、１００００）　ｌ　００ｕ　ｌｌＯ％ｗ／ｖバイコＡ　１％ｗ　／　ｖ　ｌ　００　ｕ　１蒸留水　５００ｕ　ｌ溶液　２　アルコール　オキシダーゼ７ユニット（１，３２ｍｇ蛋白質）ＰＨ７，０での１００ｍｍｏ１．ｌ−’りく酸塩中　３００ｕ　ｌ溶液２を４）度Ｃで、撹拌子溶液１に添加し、完全な混合を確認するため５分間該撹拌を継続した。　Ｏ，１ｃｍ３の量をキュベツト内で真空乾燥し３７度Ｃで貯蔵して上述のごとく活性を検定した。

異なる分子重量のデキストランが使用された場合は安定化の変化が注目さＪ’１．ｌこ。（表６）実施例　７溶液　ｌ　デキストラン分子ｗｉ　］、ｏｏｏｏ　５００ｕ　１１０％ｗ　／　ｖ溶液リン酸塩緩衛液１０ｍｍｏ１．ｌ−’ ＰＨ７，０３００ｕｌ溶液　２　ガラクトース　オキシダーゼ　０．５２ユニツト（０，８ｍｇ蛋白ｊ！ｊ）ＰＨ７，０でのＩＯｍｍｏｌ、ｌ−’リン酸塩緩衝液中溶液２を４度Ｃで、撹拌子溶液ｌに添加し、完全な混合を確認するため５分間該撹拌を継続した。　アリコート１ｍｌを真空乾燥した。３７度Ｃで貯蔵し上述のごとく活性を検定した。（表７）サイクリック　ポリアルコールサイクリ・り　ポリアルコールを１０％Ｗ／Ｖの濃度まで蒸留水中で溶解した。

該溶液を４度Ｃで貯蔵し調合後４週間以内に使用した。

実施例　８溶液　ｌ　イノ／１−−ル１０％ｗ／ｖ　５００ｕｌ蒸留水　２００ｕ　ｌ溶液　２　アルコール　オキソダーゼ４．フユニットリン酸塩緩衝液１００ｍｍｏ１．Ｉ−’中、９１．１５ｍｇ／蛋白質００ｕ　Ｉ溶液２を４度Ｃで、撹拌子溶液１に添加し、完全な混合を確認するため５分間該撹拌を継続した。　アリコート０．１ｃｍ’を真空乾燥した。３７度で貯蔵し上述のごとく活性を検定した。（表８）実施例　９溶液　ｌ　イノントール　ｌＯ％ｗ／ｖ　５００ｕｌリン酸塩緩衝液１００ｍｍｏ１．ｌ−’ＰＨ７，０３００ｕｌ溶液　２　ガラクトース　オキシダーゼ０．５２ユニツト（０，８ｍｇ蛋白質）リン酸塩１０ｍｍｏ１．１−’ＰＨ７，０００ｕ　ｌ溶液２を４度Ｃで、撹拌子溶液ｌに添加し、完全な混合を確認するため５分間該撹拌を継続した。　アリコー）［，１ｃｍ’を上述のごとく真空乾燥し、３７度Ｃで貯蔵し、上述のごとく活性を検定した。（表９）実施例　１０下記の結果はアルコール　オキシダーゼ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）の安定化を示す。

非安定化酵素は７日間の３７度Ｃでの＠直後２６％の活性を保持しｔこ。

上記キトサンの添加で９日間後４８．９％活性緩化を保持した。　新鮮１こ乾燥された酵素に関する活性化は３７度Ｃでの＠直後測定された。

１６　８６．１ラクチトール５％　１　８７．４キトサン０．０１％　６　８７．２ポリエチレンイミン０．１％　６　７７、５ラクチト一ル５％　１　９１．１ポリエチレンイミン０．０１％　６　８４．４ラクチト一ル５％　１　９４．９ＤＥＡＥ−デキストラン　０．１％　６　８５．１ラクチト一ル５％　１　９８．３ＤＥＡＥ−デキストラ　６　８８．８実施例　ＩＩ下記の結果はアルコール　オキシダーゼ（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉＳ）の安定化を示す。　非安定化酵素は３７度Ｃで２日後及び１３日後活性度をそれぞれ４９．８％及び３６．１％を示した。　乾燥に際して増大されＩ；活性度は（即ちｌ−％より大である）阻害不純物の選択的劣化に起因する。

ラクチトール５％　１　１０２．５ＤＥＡＥ−デキストラン　４　１１６．６実施例　１２下記の結果はコレステロール　オキシダーゼ（Ｎｅｏｃａｒｄｉａ　ｅｒｙｔｈｏｐｏｌｉｓ）の安定化を示す。　非安定化酵素は３７度Ｃでの１４日後活性度３４．３％を保持した。

ラクチトール５％　３　９６．２ＤＥＡＥ−デキストラン１％　５　ＩＯ２，６１０９１，７実施例　１３下記の結果は冷凍乾燥ウリカーゼの安定化を示す。

ラクチトール５％　１０９．９ＤＥＡＥ−デキストラン１％　５　１１４．３実施例　１４下記の結果は非乾燥酵素の活性化と比較した乾燥中においてラクチトール（１５％）及びＤＥＡＥ−デキストラン（１％）を有する各種の酵素の安定化を示す。

（Ｐｉｃｈｉａ）コリンオキシダーゼ　６３．３　９７．７乳酸塩　７７．１　９０．０アルコール　オキシダーゼ（Ｈｅｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）６８．２　１１９．６コレステロール　オキシダーゼ（ＩＬ空乾燥）　８０．６　９２．５（イノシトール５％）（冷凍乾燥）　７９．０　９１．０調合　装置３７度Ｃ新鮮に乾燥した酵素の活性度と対比した残余活性ラクチトール１０％　７日　１２０ＤＥＡＥ−デキストラン１％　１４日　１１４非活性酵素は７日後２６％の活性度を保持した。

表　２半製品（ｂｕｌｋ）調合　装置３７度Ｃ新鮮に乾燥した酵素と対比した保持活性度％アルコール　オキシダーゼ　１２日　１２１非活性酵素は４日後３４％の活性度を保持した。

表　３調合　装置３７度　新鮮に乾燥した酵素の活性度と対比した残余活性ＤＥＡＥ−デキストラン１％　５日　８４ラクチト一ル１０％　１０日　８１表　４調合　偏置３７度Ｃ新鮮に乾燥した酵素の活性度と対比した残余活性度％グリセロール３　リン酸塩オクンダーゼ　１日　１０４５日　１２０ＤＥＡＥ−デキストラン１％　１０日　１１７非活性酵素は１日後９４％の活性度を示し、１５日後は５４％であった。

表　５調合　偏置３７度Ｃ新鮮に乾燥した酵素の活性度と対比した残余活性ＤＥＡＥ−デキストラ〉・１％ｖ【／ｖｏｉ　６日　１０３乳糖ｌＯ％ｗｔ／ｖｏｌ　ｌ　０日　１０８調合　（新鮮に乾燥した酵素と対比した）残余活性度ＭＷＬ。

Ｔ２Ｏ４００００８２７５−’　６１　６４Ｔ７０７００００　８４　８６　６５　６０Ｔ５００　５０００００　８３　８６　６２　４９非活性酵素は６日後３０％の活性度を示した。

デキストラン　濃度５％（Ｍ、Ｗｌｏｏｏｏ）偏置３７度Ｃ新鮮に乾燥した酵素の活性度と対比した残余調合　偏置３７度Ｃ新鮮に乾燥した酵素の活性度と対比した残余活性度％アルコール非活性酵素は７日後２６％の活性度を示した。

表　９調合　偏置３７度Ｃ　新鮮に乾燥した酵素の活性度と対比しｔ；残余活性国際調査報告国際調査報告ＧＢ　８９０１３４６Ｓ＾　３２７６８

Claims

【特許請求の範囲】

１．蛋白質の水溶液と可溶性陽イオン高分子電解質及びサイクリックポリオールとを混合し、該溶液から水を除去する工程からなる乾燥に際して変性から蛋白質を保護する方法。
２．前記高分子電解質は４つのアンモニウム基官能化多糖類からなる請求項１に記載の方法。
３．前記高分子電解質はジエチルアミノエチル−デキストラン又はキトサンからなる前記請求項２に記載の方法。
４．前記高分子電解質はポリエチレンイミンからなる前記請求項１に記載の方法。
５．前記ポリオールは二糖又は三糖である前記各請求項に記載の方法。
６．前記ポリオールはラクチトール、ラクトース、マルトーススクロース及びゼオビオースからなる群から選ばれたものである前記請求項５に記載の方法。
７．水は４度Ｃと５０度Ｃの間の温度で除去される前記各請求項に記載の方法。
８．前記温度が２５度Ｃと３５度Ｃの間の温度である前記請求項７に記載の方法。
９．蛋白質、サイクリックポリオール及び陽イオン高分子電解質を含有することを特徴とする乾燥生成物。
１０．酵素、サイクリックポリオール及び４つのアンモニウ基官能化多糖類を含有する前記請求項９に記載の乾燥生成物。
１１．酵素、サイクリックポリオール及びポリエチレンイミンを含有する前記請求項１０に記載の方法。
１２．前記ポリオールは二糖又は三糖である前記請求項９及至１１に記載の方法。