CS248861B3 - Mikronošiče vhodné k pěstováni živočišných buněk a způsob jejich výroby - Google Patents

Abstract

Řešení se týká mikronosičů z derivátů želatiny jež jsou vhodné k pěstování živočišných buněk a způsobu jejich výroby. Podstata biologické aktivity mikronosičů podle řešení spočívá v přítomnosti aldiminových vazebních seskupení v polymerní želatinové matrici. Tvorby aldiminového vazebného seskupení se zde zúčastňují jednak primární aminoskupiny v bočních řetězcích želatiny a jednak aminoskupiny další fyziologicky nezávadné nízkomolekulární látky, přičemž tyto primární aminoskupiny jsou kovalentně vázány s funkčními skupinami vybraných alifatických či aromatických dialdehydů. Část použitého dialdehydu způsobuje navíc i trojrozměrné zesífování polymerních řetězců želatiny, čímž se dosáhne nerozpustnosti a netavitelnosti mikronosičů za vyšších teplot. Toto pak umožňuje snadnou a bezpečnou sterilizaci mikronosičů obvyklým způsobem v autoklávu, tj. 15 minut při 120 C. Mikronošiče podle řešení mají podobu mikrokuliček o průměrné velikosti 100 až 300 /im, přičemž jejich kultivační povrch je dobře definován a je velmi vhodný k laboratornímu či velkokapacitnímu pěstování i těch nejnáročnějších typů buněk, například diploidních a primárních či embryonálních živočišných buněk. Podstatou způsobu výroby mikronosičů podle řešení je modifikace známého postupu dispergace vodného roztoku želatiny ve směsi vhodných organických rozpouštědel. Modifikace postupu spočívá ve využití isotermních podmínek při uvedené dispergaci a v použití dobře definovaných látek k likvidaci volných reaktivních aldehydických skupin na povrchu mikrokuliček.

Description

Vynález se týká mikronosičů z biologicky aktivních derivátů želetiny, připravených v podobě mikrokuliček o průměrné velikosti 100 až 300 /im, které jsou vhodné jako kultivační podložka k pěstování živočišných buněk.

V průmyslové výrobě některých biologicky aktivních látok je obvykle třeba napěstovat velké množství buněčného substrátu. Tak je tomu ve výrobě lidských i zvířecích vakcín, interferonů, hormonů, enzymů, nukleových kyselin a dalších biologicky významných látek.

K tomuto účelu byly vypracovány různé techniky pěstování buněk.

Kultivace buněk v suspenzi je dosud nejefektivnější technikou velkokapacitního pěstování buněk in vitro. Tímto způsobem se však dají pěstovat jen ty buněčné kultury, které pro své dělení nevyžadují přichycení k pevné kultivační podložce. Jsou to většinou buněčné kultury se změněnou sadou chromosomů, např. stabilní buněčné linie myších fibroblastů, tzv. buňky L, dále linie buněk z ledviny syrského křečka, tzv. buňky BHK, a lidské buňky z karcinomu děložního krčku, tzv. buňky HeLa, a další.

Mnohé buňky však k svému dělení potřebují vhodný kultivační povrch, na který se přichytí a vytváří zde buněčnou monovrstvu, tzv. monolayer. Většinou se jedná o primární buňky získané z orgánů, tkání či embryí různých živočichů, např. primární buňky z kuřecích či myších embryí. Dále jsou to diploidní buňky, které mají dvojnásobný počet chromosomů, např. diploidní buňky získané z plic lidského embrya, tzv. buňigy LEP. Tyto buněčné kultury se velkokapacitně obvykle pěstují stacionární technikou ve velkých skleněných kultivačních nádobách, např. v Roux lahvích obsahu 1 200 či 2 000 ml.

Některé buněčné kultury je možno též pěstovat rollerovou technikou, tj, ve válcovitých nádobách, na kterých se buněčná monovrstva vytváří po celé cylindrické ploše horizontálně se otáčející kultivační nádoby.

Technika kultivace buněk ve skleněných lahvích vyhovuje v laboratoři, ale ne v průmyslové výrobě. Nevýhodou je zde náročnost na prostor a spotřebu elektrické energie v termostatech, pracnost v péči o velký počet kultivačních lahví s buňkami, kde je navíc i zvýšené nebezpečí jejich kontaminace, a v neposlední řadě též velká pracnost při mytí kultivačního skla pro jeho opětné použití. Zvětšováním objemu a počtu kultivačních lahví nelze tedy řešit potřebu zvýšené produkce živočišných buněk.

Velmi progresivním způsobem, který výrobu radikálně zhospodárňuje, je kultivace buněk na mikronosičích. Principem tohoto pěstování je růst a vytváření buněčné monovrstvy na mikrokuličkách, které jsou suspendovány do kultivačního média a v něm se pak za míchání volně vznáší. Průměr mikrokuliček se pohybuje v rozmezí od 70 do 300 ;u, optimálně kolem 200 Λΐ.

Výhodou tohoto způsobu pěstování buněk je velká kultivační plocha úhrnného povrchu mikrokuliček, na kterých se buňky množí. To dovoluje získat velké množství buněk v poměrně malém objemu kultivačního média. Při stejné spotřebě kultivačního média se tak povrch použitelný pro zakotvení buněk zvětší přibližně šestkrát.

Tak například 1 gram mikronosičů připravených na základě dietylaminového derivátu dextránového gelu, které jsou již běžně vyráběny a jsou dostupné na světových trzích, jsou-li suspendovány v 1 litru kultivačního média, mají stejnou plochu jako 327 ks Petriho mlsek o průměru 10 cín, nebo jako 21 ks rollerových kultivačních nádob obsahu 1 litru.

Příprava jedné výrobní šarže virové vakcínv, při starém způsobu stacionární kultivace v lahvích, vyžaduje použití 500 ks Roux lahví obsahu 1,2 litru. Každá z nich obsahuje 0,12 litru kultivačního média, tedy celkem 60 litrů. Při novém způsobu kultivace na mikronosičích lze dosáhnout téhož růstu buněk s použitím 250 ml usazené suspenze mikrokuliček o průměru kolem 200 /im, které jsou pak rozptýleny ve 20 litrech kultivačního média.

*'

Postačí zde jeden či dva kultivační tanky, o příslušném obsahu 20 či 10 litrů, které může snadno obsloužit jeden pracovník.

Buněčné kultury se pěstují na mikronosičích v kultivačních médiích, sestávajících z anorganických solí, aminokyselin, vitaminů a koenzymů, jako např. v bazálním či minimálním Eaglově médiu a dalších. Médium se obvykle doplňuje živočišnými séry, např. inaktivovaným telecím sérem, fetálním bovinním sérem, nebo kuřecím sérem, v koncentraci 1 až 20 i obj. V některých případech se médium doplňuje bílkovinným hydrolyzátem, jako např. laktátalbuminovým hydrolyzátem, sojovým peptonem, kvasničným hydrolyzátem a jinými živinami.

Kultivační média mají optimální pH v rozmezí 7,0 až 7,6 a osmolalitu 260 až 350 mOsm. Teplota při kultivaci živočišných buněk se pohybuje v rozmezí 35 až 40 °C, podle druhu buněčné kultury, v některých případech se používá atmosféra obsahující 95 4 vzduchu a 5 % oxidu uhličitého.

Mikronosiče k pěstování živočišných buněk se v současné době vyrábějí především z aminoderivátů agarosy, dextranu, celulózy či polystyrenu, a dále ze želatiny zesítěné pomocí glutarového aldehydu, nebo kovalentně vázané na povrchu agarosových miktokuliček.

V základní čsl. přihlášce vynálezu AO č. 247 431 jsou popsány rozmanité polymerní kompozice, obsahující definované množství aldiminových vazebních seskupení, které výrazně stimulují adhezi, růst a diferenciaci živočišných buněk.

V případě biologicky aktivních polymerních kompozic v podobě mikrokuliček podle současného vynálezu vycházíme z aldiminových derivátů želatiny. Tvorby aldiminových vazebných seskupení se zde zúčastňují jednak volné aminoskupiny lysylových bočních skupin v polymerních řetězcích želatiny a.jednak primární aminoskupiny další fyziologicky nezávadné látky, která je nízkomolekulární a obsahuje nejméně jedriu primární aminoskupinu ve své molekule.

Příkladem takových látek jsou především esenciální či neesenciální alfa-aminokyseliny, např. glycin, alanin, lysin a kyselina glutamová či asparagová, dále aminocukry, např. glukosamin či galaktosamin, nebo je zde možno použít i některých biogenních aminů, např. etanolaminu, cysteaminu, serotoninu, tryptaminu, dopaminu, histaminu a dalších podobných aminů a biologickou aktivitou, případně dalších látek, např. kyselinu 4-aminomáselnou či 6-aminokapronovou, hydroxylamin apod.

S uvedenými primárními aminoskupinami snadno reagují aldehydické funkční skupiny vybraných alifatických či aromatických dialdehydů, jako je glyoxal, glutaraldehyd, nebo dialdehyd kyseliny tereftalové či ortho-ftalové. Vzniklé aldiminy, tzv. Schiffovy báze, pak mají uvedenou biologickou aktivitu, tj. stimulují adhezi, růst a diferenciaci živočišných buněk.

Použité alifatické či aromatické dialdehydy navíc způsobují i prostorové sítování polymerních řetězců želatiny, která tvoří základní matrici mikrokuliček. Dosáhne se tak jejich nerozpustnosti i netavitelnosti za vyšších teplot a tím i potřebné tvarové stability. Toto pak umožňuje snadnou a bezpečnou sterilizaci mikrokuliček v autoklávu za obvyklých podmínek, tj. 15 minut při 120 °C.

Hydrolytická stabilita aldiminového vazebného seskupení, která je sice v kyselém prostředí malá, je v oblasti pH 7,0 až 7,6 výborná a tím je umožněno využití popsané biologické aktivity aldiminů v technice tkáňových či buněčných kultur.

Mikronosiče připravené způsobem podle přítomného vynálezu je však možno hydrolyticky Štěpit za pomoci proteolytlckých enzymů, které obvykle štěpí samotnou želatinu, např.

kolagenáza, trypsin, dispáza apod. Enzymatického štěpení je možno využít v těch případech, kdy půjde o potřebu izolace samotných buněk. Podmínky takového enzymatického štěpení jsou obecně známy.

Způsob přípravy mikrokuliček podle přítomného vynálezu vychází ze známé techniky, kterou popsali K. Nilsson a K.Mosbach ve FEBS Lett., 145-150, 1980. Principem této metody jes a/ příprava vodného roztoku želatiny, o sušině 20 % hmot., při teplotě 50 °c, b/ dispergace teplého roztoku želatiny, sub a, ve směsi organických rozpouštědel, tj.

objemových dílů toluenu a 27 objemových dílů chloroformu, za použití 1 až 3 % obj. vhodné povrchově aktivní látky, např. glycerolmonooleátu, přičemž se tato dispergace provede za intenzivního míchání a lázeň uvedených organických rozpouštědel má teplotu místnosti, c/ praní zformovaných želatinových mikrokuliček v přebytku acetonu a jejich následné vysušení, d/ sítování rehydratovaných mikrokuliček ve vodném roztoku glutaraldehydu, o koncentraci ca 5 S obj., po dobu 30 minut při teplotě místnosti, e/ praní zesítěnýoh faikrokuliček pomocí 0,15 M-NaCl, f/ rozdělení mikrokuliček do frakcí podle jejich velikosti, kde užitečná frakce k pěstování buněk je mezi 100-250 g/ sterilizace mikrokuliček dispergovaných v 0,15 M-NaCl pomocí autoklávu, tj. 15 minut při 120 °C, h/ sterilní mikrokuličky se před vlastním použitím ještě kondicionují a perou desetinásobným objemem příslušného kultivačního média, které obsahuje, dle typu buněčné kultury, lo až 20 % obj., fetalního telecího séra.

Přestože takto připravené želatinové mikronosiče jsou velmi vhodné a dobře použitelné k pěstování živočišných buněk, má uvedený postup některé nedostatky:

- při dispergaoi teplého roztoku želatiny do lázně se směsí organických rozpouštědel při teplotě místnosti se výrazně mění fyzikálněchemioké parametry povrchového napětí., vyvolané hlavně vzrůstem teploty lázně při postupném dávkování roztoku želatiny, což má za následek změnu velikosti formovaných mikrokuliček a jejich neobyčejně širokou distribuci, podíl nevhodně malých či velkých částic je tak poměrně vysoký;

- za výše uvedených podmínek dochází k rychlému tuhnutí roztoku želatiny do pevného gelu, nedostatečně rozmíchané podíly roztoku želatiny vytváří nevhodně velké kuličky a rovněž tím narůstá podíl kulově nesymetrických či dokonce vláknitých částic;

- při sííování želatinových mikrokuliček pomocí glutaraldehydu dochází také k navázání jen jedné aldehydické funkční skupiny k polymernímu řetězci želatiny a druhá aldehydická funkce zůstane nezreagovaná ač stále reaktivní, proto uvedení autoři používají zmíněné kondiclonace mikronosičů pomocí živného média s přídavkem séra;

- pokud se likvidace nezreagovaných aldehydíckých funkcí provádí výše uvedeným způsobem, tj. pomocí přebytku živného média a přidaného séra, dochází k naprosto nedefinovanému vyvázání některých jeho složek na povrchu mikronosičů, což má za následek také nedostatečně definované složení vlastního kultivačního povrchu těchto nosičů, přičemž nutno hlavně brát v úvahu kolísání kvality a neúplnou charakterizaci použitého séra.

Všechny shora uvedené nedostatky jsou eliminovány při použití způsobu přípravy mikronosičů podle přítomného vynálezu, který se liší následovně:

1. Dispergace teplého roztoku želatiny se provádí v podstatě za isotermních podmínek, tj. lázeň je ohřátá na stejnou teplotu jakou má výchozí roztok želatiny. Roztok želatiny se tak může dispergovat za dobře definovaných fyzikálněchemických podmínek do pravidelných mikročástic kulovitého tvaru, přičemž je celá soustava udržována v dynamické rovnováze, díky stále kapalnému charakteru želatinových mikrokuliček. Velikost a distribuce mikrokuliček jsou určovány řadou parametrů, z nichž možno uvést densitu a viskozitu roztoku želatiny při dané teplotě, složení organické fáze, tj. směsi organických rozpouštědel, která má být isodensní s roztokem želatiny, koncentraci použité povrchové aktivní látky, velikost a geometrii reaktoru a použitého míchadla, rychlost otáčení michadla, charakter míchání a řadu dalších faktorů,

2. Kapalná soustava, která je udržovaná v dynamické rovnováze se rychle ochladí na teplotu, při které dojde ke zgelování původně kapalných mikrokuliček a tím se fixuje jejich konečný tvar, velikost i distribuce velikosti částic, přičemž lze dosáhnout podílu požadovaných parametrů výsledných mikrokuliček. Jejich výroba se tím velmi zhospodárňuje. Podstatně se zde snižuje podíl nepravidelných částic. Nutno zde zdůraznit, že na rychlosti ochlazení závisí zdar celé operace, neboř při velmi pomalém ochlazování kapalné soustavy dochází zpravidla ke slepování částic a jejich agregaci do obtížně oddělitelných shluků.

3. Sítování želatinových mikrokuliček může být regulováno, kromě koncentrace použitého vodného glutaraldehydu a jeho objemového poměru, teploty a doby působení, též koncentrací a typem použité nízkomolekulární látky s obsahem primárních aminoskupin, jak dříve uvedeno v popisu vynálezu. Taktéž vyvázání nezreagovaných aldehydických skupin glutaraldehydu, či jiného použitého dialdehydu, se provádí definovaným způsobem, tj. známou a dobře definovanou látkou, např. určitou alfa-amino kyselinou, nebo případně silně zředěným vodným roztokem výchozí želatiny. Tím se získají mikronosiče s dobře definovaným kultivačním povrchem.

Ostatní detaily způsobu přípravy mikrokuliček jsou již v podstatě shodné s původně navrženým postupem výše uvedených autorů.

Výsledné mikrokuličky z aldiminových derivátů želatiny, vyrobené způsobem podle přítomného vynálezu, slouží jako speciální kultivační podložka - mikronosič - k pěstování živočišných buněk in vitro.

Dále uvedené příklady zde slouží pro ilustraci vynálezu a nevymezují počet možných kombinací, vzájemného zastoupení a využití jednotlivých látek.

Příklad 1 gramů kvalitní fotoželatiny bylo přelito 80 ml destilované vody a ponecháno botnat při laboratorní teplotě 2 hodiny. Pak byla směs zahřívána v termostatu při 56 °c za mírného míchání, až došlo ke ztekucení zbotnalých částic želatiny. K roztoku želatiny byly přidány za míchání 2 gramy glycinu čistoty p. a. a směs byla temperována při uvedené teplotě 20 minut. Tekutý roztok byl při dané teplotě pomalu dávkován do směsi organických rozpouštědel celkového objemu 1 litr.

Doba dávkování byla 6-8 minut. Lázeň organických rozpouštědel obsahovala 700 ml toluenu 300 ml chloroformu a příslušné množství povrchově aktivní látky - PAL, kterou zde byl glycerol-mono-oleát. Proces dispergace probíhal ve skleněném reaktoru obsahu 2 litrů a tvaru “U”, za použití třílistového míchadla Faundlerova typu.

V závislosti na rychlosti míchání, teplotě dispergace a množství PAL byly získány různé výsledky, které jsou shrnuty v následující tabulce. Pevné mikrokuličky byly získány ochlazením disperze z uvedené teploty na teplotu 20 °c, během 5-8 minut při nezměněném míchání.

Rychlost	Doba	PAL	Teplota	Velikost a
otáčení	míchání		dispergace	distribuce
min 1	min.	ml	°C	částic
400	15	2	20 až 22	asi 500/u,
600	'·	It	II II	velmi široká
800	II	II	II II	distribuce částic
1 200	II	II	II II
400	30	2	42	asi 500 /i, široká
600	li	II	II	350 až 500 jn
800	II	II	It	250 až 500 JU
800	II	3	II	200 až 300 ja
800	30	II	50	75%! 100 až 250 /1
800		It	53	85%: ». n
800	u	It	56	90%: “

Z uvedené tabulky jsou zřejmé výhody postupu isotermní dispergace roztoku želatiny v uvedené směsi rozpouštědel. Rozmez! velikosti částic mikrokuliček mezi 100 až 250 /i je optimální pro pěstování živočišných buněk na mikronosičích in vitro.

Příklad 2

Mikrokuličky z aldiminového derivátu želatiny vyrobené podle příkladu 1, za podmínek uvedených v posledním řádku tabulky, byly následně prány desetinásobným objemem 1% roztoku glycinu. Tím zreagovaly všechny zbývající volné aldehydické skupiny použitého dialdehydu. Mikrokuličky pak byly převedeny do roztoku 0,15 M-NaCl a sterilizovány ve skleněné ampuli autoklávováním 15 minut při 120 °C.

Příklad 3

Postupováno podle příkladu 1 a 2, avšak namísto 1% roztoku glycinu bylo zde použito roztoku glukosaminu, nebo etanolaminu či kyseliny 6-amino-kapronové za jinak podobných podmínek.

Příklad 4

Postupováno podle příkladu 1 a 2, avšak k likvidaci volných aldehydických funkčních skupin bylo zde použito přebytku vodného roztoku výchozí želatiny ó koncentraci 0,5 % hmot..

Příklad 5

Srovnávací pokusy s mikronoslči na základě agarosových gelů s kovalentně vázanou želatinou prokázaly, že mikronosiče z modifikované želatiny, připravené způsobem podle současného vynálezu, jsou přinejmenším stejně kvalitní jako nejlepší mikronosiče na světovém trhu.

Tyto mikronosiče jsou vhodné zejména pro pěstování náročných typů buněk, tj. diploidních a primárních či ebryonálních. Kultivace živočišných buněk adherovaných na našich mikronosičích prokázaly, že tyto mikronosiče výrazně zlepšují přežití, růst a diferenciaci těchto buněk. Například, diferenciace embryonálních kuřecích svalových buněk - myoblastů kosterního svalstva probíhá v myotuby snadno a úspěšně.

Příklad 6

Při suspenzní kultivaci buněk LEP_ig odherovaných na mikronosičích připravených postupem podle přikladu 1, 2 a 4, bylo při produkci herpetického viru dosaženo vysokého titru: lcJ/ml pro typ I viru a 10® ^a% ®'⁵/ml pro typ II viru.

Příklad 7

Při suspenzní kultivaci buněk LEP^_g adherovaných na mikronosičích, jak uvedeno v příkladu 6, bylo dosaženo výborných výsledků v produkci fibroblastového interferonuj bylo tak získáno 512 m.j./ml interferonu, zatímco při starém způsobu stacionární kultivace bylo získáno pouze 120 m.j./ml interferonu.

Claims (5)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   1. Mikronosiče vhodné k pěstování živočišných buněk, podle AO č. 247 431, vyznačené tím, že jsou připraveny na základě aldiminových derivátů želatiny, v podobě mikrokuliček o průměrné velikosti 100 a 300 /im, přičemž tvorby aldiminových vazebních seskupení se kromě primárních aminoskupin obsažených ve výchozí želatině také zúčastňují aminoskupiny další fiziologicky nezávadné látky, která je nízkomolekulární a obsahuje nejméně jednu primární aminoskupinu ve své molekule, a tyto aminoskupiny jsou kovalentně vázány s funkčními skupinami vybraných alifatických či aromatických dialdehydů tak, že prakticky žádné aldehydické skupiny nezůstávají volné ve výsledném produktu.
2. 2. Mikronosiče podle bodu 1, vyznačené tím, že nízkomolekulární látka obsahující primární aminoskupinu ve své molekule je vybrána ze skupiny sloučenin obsahující alfa-aminokyseliny, například glycin, alanin, lysin, kyselinu glutamovou či asparagovou, aminocukry, například glukosamin či galaktosamin, jiné aminokyseliny, například kyselinu 4-aniino-máselnou či 6-amino-kapronovou, biogenní aminy, například etanolamin, cysteamin, serotonin, dopamin, histamin a další podobné látky.
3. 3. Mikronosiče podle bodu 1, vyznačené tím, že alifatický dialdehyd je bud glyoxal nebo glutaraldehyd a aromatický dialdehyd je bud dialdehyd kyseliny ortho-ftálové nebo dialdehyd kyseliny tereftálové.
4. 4. Způsob přípravy mikronosičů podle bodů 2 až 3, vyznačený tím, že dispergace vodného roztoku želatiny v organických rozpouštědlech, s vodou prakticky nemísitelných, se provede při teplotě nad 40 °C, kdy vzniká disperze udržovaná ve stavu dynamické rovnováhy se potom ochladí tak, že roztok želatiny obsažený v mikrokuličkách přejde do formy gelu.
5. 5. Způsob přípravy mikronosičů podle bodů 1 až 4, vyznačený tím, že se mikrokuličky, po jejich zesítění příslušným dialdehydem a vyprání volného dialdehydů v přebytku prací vody, kondicionují pomocí zředěného vodného roztoku výchozí želatiny, jehož koncentrace je pod 1 % hmot., čímž se bezpečně zlikvidují volné aldehydické funkce částečně vázaného dialdehydů na povrchu mikrokuliček.