CS247431B1 - Polymerní kompozice k stimulaci adheze, růstu a diferenciace živočišných buněk - Google Patents

Abstract

Řešení se týká polymerních kompozic schopných) stimulovat adhezi, růst a diferenciaci živočišných buněk. Podstata biologické aktivity polymerních kompozic spočívá v přítomnosti aldiminových vazebných seskupení v polymerní matrici kompozice. Polymerní matrici tvoří syntetické nebo přírodní polymery či kopolymery. Tvorby aldiminového vazebného seskupení se mohou zúčastnit látky obsahující reaktivní aldehydické skupiny a látky obsahující primární aminoskupiny. Aidehydické skupiny nebo primární aminoskupiny mohou být případně nedílnou součástí polymerní matrice. Biologicky aktivní polymerní kompozice se používají zejména v podobě kultivačních podložek při kultivacích živočišných buněk. Kultivace těchto buněk se provede za jinak obvyklých podmínek, např. v rozmezí pH 7,2 až 7,4, kde je aldiminové vazebné seskupení zcela stabilní. Polymerní kompozice jsou určeny hlavně pro kultivaci živočišných buněk v laboratořích či biotechnologiích a mohou případně nalézt uplatnění i v oboru medicíny.

Description

(54) Polymerní kompozice k stimulaci adheze, růstu a diferenciace živočišných buněk

Řešení se týká polymerních kompozic schopných) stimulovat adhezi, růst a diferenciaci živočišných buněk.

Podstata biologické aktivity polymerních kompozic spočívá v přítomnosti aldiminových vazebných seskupení v polymerní matrici kompozice. Polymerní matrici tvoří syntetické nebo přírodní polymery či kopolymery. Tvorby aldiminového vazebného seskupení se mohou zúčastnit látky obsahující reaktivní aldehydické skupiny a látky obsahující primární aminoskupiny. Aidehydické skupiny nebo primární aminoskupiny mohou být případně nedílnou součástí polymerní matrice.

Biologicky aktivní polymerní kompozice se používají zejména v podobě kultivačních podložek při kultivacích živočišných buněk. Kultivace těchto buněk se provede za jinak obvyklých podmínek, např. v rozmezí pH 7,2 až 7,4, kde je aldiminové vazebné seskupení zcela stabilní.

Polymerní kompozice jsou určeny hlavně pro kultivaci živočišných buněk v laboratořích či biotechnologiích a mohou případně nalézt uplatnění i v oboru medicíny.

Vynález se týká polymerních kompozic ke stimulaci adheze, růstu a diferenciaci živočišných buněk.

Jsou známy přirozené látky, které umožňují přichycení buněk ke kultivační podložce. Jsou to některé vysokomolekulární složky tkání, proteiny či glykoproteiny, jako je kolagen či elastin, fibronektin a laminin.

K danému účelu se též používají některé syntetické polymery a polymerní kompozity, nebo chemicky modifikované pevné kultivační povrchy v podobě misek, lahví, plošných či kapilárních membrán. V poslední době jsou dostupné i sférické mikronosiče, které jsou vhodné pro kultivace buněk v laboratořích i biotechnologiích. Paleta dosud zde používaných materiálů je velmi rozmanitá. Patří sem například polylysin, kompozit polyHEMA-kolagen, chemicky modifikovaný polystyren, dextran, agaróza, celulóza, želatina a další látky. Nevýhodou uvedených materiálů je jejich nízká biologická účinnost a/nebo neúplná charakterizace vlastních kultivačních povrchů.

Novým řešením uvedené problematiky jsou biologicky aktivní polymerní kompozice podle vynálezu, vyznačené tím, že sestávají z matrice syntetického nebo přírodního polymeru či kopolymeru, z monofunkčního nebo difunkčního či polyfunkčního aldehydu, a z fyziologicky nezávadné látky, která obsahuje nejméně jednu primární aminoskupinu ve své molekule, přičemž všechny reaktivní aldehydické skupiny jsou vázány s primárními aminoskupinami v podobě aldiminového seskupení.

Polymerní kompozice podle vynálezu se odlišují od všech známých materiálů používaných k pěstování živočišných buněk tím, že obsahují definované množství aldiminových vazebních seskupení. Přestože existence aldiminového vazebného seskupení je již dlouho známa, jeho biologická aktivita, ve smyslu stimulace adheze, růstu a diferenciace živočišných buněk, nebyla dosud nikde popsána. Známé je pouze využití aldiminové vazby k imobílizací farmak, enzymů a některých dalších látek. U takových systémů má aldiminové vazebné seskupení pouze funkci ligandu, sloužícího k navázání látek, které samy o sobě a podle své povahy vykazují určitou biologickou aktivitu.

K přípravě biologicky aktivních polymerních kompozic, podle přítomného vynálezu, je možno použít následujících látek, které lze formálně rozdělit do tří skupin:

I. Látky tvořící základní polymerní matrici.

Tuto skupinu tvoří fyziologicky nezávadné syntetické nebo přírodní polymery či kopolymery. Podle své povahy mohou být hydrofilní nebo hydrofobní, rozpustné či nerozpustné, příp. trojrozměrně zesitěné. Výchozí polymerní látky mohou být zcela inertní, nebo mohou obsahovat bud aldehydové nebo primární aminové skupiny, které se dále zúčastní tvorby vlastního aldiminového vazebného seskupení. Příkladem vhodných polymerních látek jsou zejména:

Syntetické polymery a kopolymery na základě esterů nebo amidů kyseliny methakrylové či akrylové, např. typu glykolesterů, jako je póly(2-hydroxyetylmethakryláť) či póly(4-hydroxybutylakrylát), typu glykoléter-esterů, jako je póly(5-hydroxy-3-oxapentylmethakrylát), typu polyhydroxylovýoh esterů, jako je polyglycerylmethakrylát či polysorbitylmethakrylát, typu alkoxy-alkylových esterů, jako je póly(2-etoxy-etylmetakrylát), typu akrylových esterů, jako je polymetylmethakrylát či póly(n-butylakrylát), dále typu akrylamidu či methakrylamidu, které mohou být případně N-mono či Ν,Ν-disubstituované, jako je poly/N-(2-hyroxypropyl)-methakrylamid/ či poly/Ν,Ν-(dietyl)-akrylamid/.

Syntetické polymery a kopolymery na základě jiných vinylíckých monomerů, jako je polystyren, polyvinylacetát, polyvinylmetyléter, polyvinyíalkohol, polyvinylbutyral a polyvinylpyrrolidon.

Syntetické polymery a kopolymery etylenioky nenasycených monomerů, jako je polyetylén, polypropylén, pólyisobutylén, polyisoprén a polytetrafluoretylén.

- Syntetické polykondenzáty, například typu polyamidů, polyesterů, polyéterů a polydimetylsiloxanu.

Podobně zde mohou být použity i polymerní hydrogely na základě chitosanu, alginátu, agaru, škrobu, dextranu, agarózy a jiných fyziologicky nezávadných přírodních polymerů či jejich derivátů.

- Jako příklad polymerních látek, které obsahují reaktivní aldehydické skupiny, je zde možno uvést zejména polymery a kopolymery methakroleinu či akroleinu, methakrylaldehydu a oxoderiváty pólysacharidů, např. škrobu nebo celulózy.

- Jako příklad polymerních látek, které obsahují primární aminoskupiny, je zde možno uvést zejména póly(2-aminoetylmethakrylát), póly(vinyl-4-aminobenzoát), 2-aminoetylcelulózu, 4-aminobenzoylcelulózu, dále bílkoviny typu želatiny, kolagenu či elastinu, příp. i další polyaminoderiváty.

Všechny výchozí polymerní látky musí být pečlivě zbaveny nežádoucích příměsí tak, aby nepůsobily cytotoxicky. Polyfunkční aldehydové deriváty polymerů či kopolymerů, než přijdou ve styk s živými buňkami, musí být nejdříve převedeny na příslušné deriváty s primárními aminoskupinami, tj. do formy aldiminů.

II. Látky obsahující reaktivní aldehydové skupiny.

Kromě polyfunkčních aldehydových derivátů polymerů či kopolymerů, uvedených v I. skupině lze podle přítomného vynálezu použít i běžné nízkomolekulární aldehydy. Tyto mohou být alifatické či aromatické, příp. dále substituované, např. skupinou hydroxylovou, ketoskupinou, nebo skupinou karboxylovou. Příkladem vhodných látek jsou alifatické aldehydy, jako je aldehyd kyseliny mravenčí, octové, máselné, enanthové, stearové apod., alifatické dialdehydy, jako je glyoxal či glutaraldehyd, ketonaldehydy, jako je metylglyoxal, hydroxyaldehydy, jako je beta-hydroxybutyral neboli acetaldol, semialdehydy dikarboxylových kyselin, jako je semialdehyd kyseliny štavelové, aromatické aldehydy, jako je aldehyd kyseliny benzoové, salicylové, skořicové, fenyloctové apod. Podobně zde mohou být použity i některé biologicky významné látky obsahující volnou aldehydickou skupinu, např. glyceraldehyd či pyridoxal.

Je důležité, aby všechny reaktivní aldehydické skupiny byly dále vázány s primárními aminoskupinami, tj. ve formě aldiminů“, nebot volné aldehydy jsou značně cytotoxické.

Pro zjednodušení budou látky II. skupiny dále uváděny jako aldehydy.

III. Látky obsahující primární aminové skupiny.

Kromě polyfunkčních aminových derivátů polymerů či kopolymerů, uvedených v I. skupině, lze podle přítomného vynálezu použit i nízkomolekulární látky, které obsahují ve své molekule nejméně jednu primární aminoskupinu. Příkladem vhodných látek jsou zejména alifatické primární aminy či diaminy, jako je n-butylamin, etylendiamin či hexametylendiamin, aminokyseliny, jako je kyselina 4-aminomáselná či 6-aminokapronová, alfa-aminokyseliny, jako je glycin, lysin a další esenciální či neesenciální aminokyseliny, aminoketony, jako je aminoaceton, aminocukry, jako je glukosamin či galaktosamin, biogenní aminy, jako je etanolamín či propanoiamin, cysteamin, serotonin, tryptamin, adrenalin, dopamin, histamin, tyramin a další.

Kromě již uvedených primárních aminů může být podle současného vynálezu použito i dalších reaktivních látek, např. typu hydroxylaminu, hydrazinu, semikarbazidu a thiosemikarbazidu.

I když reakcí těchto látek s aldehydy nevznikají klasické aldiminy, vzniklé vazebné seskupení je chemicky velmi příbuzné a vykazuje též podobné vlastnosti.

Uvedené látky mohou mít své aminoskupiny vyvázány, např. hydrochloridem či kyselinou sírovou, a proto musí být napřed uvolněny přídavkem ekvivalentu alkalického hydroxidu nebo uhličitanu. Toto provádíme nejvhodněji přímo v reakčnim prostředí, před tvorbou vlastního aldiminů.

Pro zjednodušení budou látky III. skupiny dále uváděny obecně jako aminy.

Z praktických důvodů je žádoucí, aby aldimin byl dobře zakotven v materiálu, jenž tvoří vlastní kultivační podložku. Nízká stabilita aldiminového vazebního seskupeni v kyselém prostředí je obecně známa, avšak při fyziologických hodnotách pH 7,2 až 7,4 jsou aldiminy velice stálé. Toto umožňuje i jejich využití pro řešené biologické aplikace, v podobě polymerních kompozic podle současného vynálezu.

Protože výčet látek, uvedených ve skupinách I, II a III, je neobyčejně široký a každá látka má své specifické vlastnosti, je třeba přípravu a použití výsledných produktů posuzovat případ od případu. Je třeba zde připomenout, že podstatou přítomného vynálezu není příprava o sobě známých či méně známých aldiminů”, ale jejich zcela nové využití v oblasti biologie.

Dále uvedené příklady zde slouží pro ilustraci vynálezu a nikterak nevymezují počet možných kombinací, vzájemného zastoupení a využití jednotlivých látek.

Příklad 1

Synteticky hydrogel na základě póly(2-hydroxyetylmethakrylátu) - polyHEMA - v nezesítěné 5 formě, o střední molekulární hmotnosti 8,7x10 g/mol, byl připraven v podobě tenkého filmu uvnitř standardních plastikových Petriho misek o 0 60 mm. Polymerní film byl získán odpařením roztoku uvedeného polyHEMA v čistém etanolu, o sušině 10 % hmot., v bezprašném prostředí při teplotě místnosti. Film v misce byl pak během dvou hodin zbotnán ve 4 ml vodného roztoku glutarového aldehydu, o koncentraci 2,5 % hmot. Nadbytečný roztok aldehydu byl odlit a do misky nalito 5 ml vodného roztoku hydrochloridu etylendiaminu, o koncentraci 5 % hmot. a 1 ml roztoku uhličitanu sodného, o koncentraci 10 % hmot.

Reakční směs byla ponechána v klidu do druhého dne, přičemž se polymerní film zbarvil červenohnědě vzniklým aldiminem. Misky byly potom louženy přebytkem roztoku 0,9 % hmot. chloridu sodného, jehož pH bylo upraveno pomocí fosfátového pufru 0,016 M na hodnotu 7,4.

Misky s vypranými polymerními filmy byly sterilizovány ultrafialovým světlem pomocí germicidní lampy po dobu 2 hodin.

Prd testování biologických vlastností polymerního kompozitu byla zvolena technika tkáňových kultur, kde testovaný materiál sloužil jako kultivační podložka. Do misek bylo dávkováno 8 až 10x10® disociovaných embryonálních svalových buněk, které byly získány pomocí známých technik z desetidenních kuřecích embryí. Pro každý typ polymerní kompozice byly testovány 3 misky, filmy samotného polyHEMA sloužily jako negativní kontrola. Misky potažené kolagenem, izolovaným kyselou extrakcí šlach krysích ocasů, zde sloužily jako pozitivní kontrola. Svalové buňky byly kultivovány za jinak běžných standardních podmínek.

V průběhu kultivace bylo pomocí světelného mikroskopu sledováno jednak přichycení buněk ke kultivační podložce, jednak jejich další růst a diferenciace, šestého dne kultivace, kdy bylo dosaženo nejvyšší hustoty myotub v kultuře, byly provedeny srovnávací odečty. Nejvyšší hustoty myotub bylo dosaženo u misek kontrolních s kolagenem, tj. 11 myotub/mm. Téměř stejné byly výsledky u misek s pokusným aldiminem, tj. 10,4 myotub/mm. U misek se samotným polyHEMA, použitým za jinak stejných podmínek, se žádné myotuby nevytvořily, i když jednotlivé mononukleárnl buňky byly sporadicky přichycené k podložce. Z výsledku tohoto pokusu vyplývá, že aldiminové vazebné seskupení má zcela nepochybně uvedenou biologickou aktivitu.

Pí í k 1 a d 2

Postupováno podle příkladu 1, avšak k přípravě polymerních filmů s aldiminem bylo zdě použito jiných výchozích látek.

Ke 100 ml vodného roztoku polyvinylalkoholu koncentrace 5 % hmot., o molekulové hmotnosti

7,2xl0⁴ g/mol a stupni hydrolýzy 98,5 % mol., bylo přidáno 1,2 ml glyoxalu koncentrace 40 % hmot. a směs byla krátce homogenizována. Polymerní filmy byly získány odpařením 0,5 ml této směsi v každé misce za shora uvedených podmínek. Na polymerní filmy bylo následně působeno 5 ml roztoku n-butylaminu koncentrace 2 % objem, po dobu 15 hodin. Filmy s aldiminem byly pak obvyklým způsobem vyprány od všech balastních látek, sterilizovány a podrobeny příslušnému testování na tkáňových kulturách. Také zde bylo dosaženo požadované biologické aktivity, která je naprosto srovnatelná s kontrolními vzorky samotného kolagenu.

Příklad 3

Postupováno podle příkladu 1, avšak bylo zde použito následujících látek:

Byl připraven vodný roztok kvalitní želatiny, která se obvykle používá k přípravě fotografických emulzí, o koncentraci 15 % hmot., přičemž bylo použito předchozího botnání želatiny při teplotě místnosti po dobu 2 hodin a roztavení zbotnalých částic při 60 °C za současného míchání. Teplý roztok želatiny byl nalit do misek, přebytek byl odlit tak, že uvnitř misek zbytek roztoku vytvořil souvislou vrstvičku, jež následně ztuhla při běžné teplotě místnosti. Na želatinové vrstvy bylo pak působeno vodným roztokem glutarového aldehydu koncentrace 2,5 % hmot. po dobu 5 hodin, 4 ml na každou misku. Po odlití přebytku uvedeného roztoku aldehydu bylo do misek nalito po 5 ml vodného roztoku glycinu koncentrace 1 % hmot., jehož pH bylo upraveno na hodnotu 7,4 přídavkem roztoku IM-NaOH.

Praní, sterilizace a vlastní testování biologických vlastnosti bylo stejné, jak bylo již dřivé uvedeno. Želatinové vrstvy se zakotveným aldiminem měly dokonce vyšší biologickou aktivitu pro diferenciaci myoblastů v myotuby, než jakou vykazoval kontrolní kolagen. Vrstvy připravené ze samotné hydratované želatiny uvedené biologické vlastnosti postrádají.

Přikládá

Komerčně dostupné filmy z regenerované celulózy, tzv. celofán, byly chemicky modifikovánx na oxoderivát, s obsahem 42,7 % mol. aldehydových skupin stanovených oximaění metodou.

K oxidaci celofánu byla použita obvyklá jodistanová metoda. Tyto filmy zbotnalé vodou byly následně převedeny do formy aldiminu pomocí roztoku n-butylaminu v isopropylalkoholu, koncentrace 1 % objem., kterým bylo působeno v přebytku, po dobu 15 hodin, při teplotě místnosti. Upravené filmy celofánu byly pak důkladně prány destilovanou Vodou, uvedeny do rovnováhy s fyziologickým roztokem NaCl, jehož pH bylo upraveno fosfátovým pufrem na hodnotu 7,4, a následně sterilizovány pomocí germicidni lampy, jak bylo dříve uvedeno.

Disky, vyseknuté kruhovým nožem o 0 55 mm z uvedeného materiálu byly ještě před vlastní sterilizací umístěny v plastikových miskách o 0 60 mm a zde odzkoušeny ve tkáňové kultuře embryonálních svalových buněk, jak je uvedeno v příkladu 1. Celofánové filmy s aldiminem prokazovaly významnou biologickou aktivitu v přichycení buněk, jejich dalším růstu a diferenciaci. Samotné celofánové filmy neumožňovaly ani prosté přichycení mononukleárních buněk na svém hydratovaném povrchu.

Příklad 5

Běžné plastikové misky pro tkáňové kultury o 0 60 mm, vyrobené z polystyrenu, byly podrobeny následující chemické úpravě: 5 ml roztoku n-butyralu v amylalkoholu, koncentrace 10 % objem., bylo dávkováno do misky a tento roztok nechán difundovat do povrchové vrstvy materiálu uvedených misek. Po 15 hodinách byl roztok aldehydu z misek odlit, misky byly vypláchnuty čistým amylalkoholem a dávkováno do nich po 5 ml roztoku hexametylendiaminu v amylalkoholu, koncentrace 2 % hmot. Doba působení uvedeného roztoku, během které se v povrchové vrstvičce plastikové misky vytváří aldimin, postačuje pouhých 4 až 6 hodin, neboť difúze;' druhé z reagujících složek je poněkud usnadněna předchozím zbotnáním povrchové vrstvy uvedeného materiálu. Následuje důkladná extrakce misek pomocí vodného etanolu koncentrace 40 % objeli a potom přebytkem destilované vody. Takto upravené kultivační misky měly požadované biologické vlastnosti, t j. umožňovaly přichycení, dalSí růst a diferenciaci embryonálních svalových buněk. Původní misky sice umožňovaly přichycení buněk, avšak v žádném případě jejich diferenciaci.

Přfklad6

Postupováno podle příkladů 1 a 2, avšak namísto vodného roztoku polyvinylalkoholu bylo zde použito následujících vodorozpustných polymerních látek: karboxymetylový derivát škrobu, hydroetylový derivát celulózy, dextrin, alginát sodný, kopolymer s obsahem 83,5 % mol. 2-hydroxyetylmethakrylátových a 16,5 % mol. vinylpyrrolidonových jednotek, a poly/N-(2-hydroxypropyl)-methakrylamid/. Polymerní filmy zesítěné glyoxalem a převedené do formy aldiminu, způsobem uvedeným v příkladu 2, vykazovaly požadovanou biologickou aktivitu, která je nezávislá na typu použitého polymerního materiálu.

Příklad 7

Postupováno podle příkladu 6, avšak namísto vodného glyoxalu zde bylo použito odpovídajícího množství glutarového aldehydu koncentrace 25 % hmot., th. 2 ml na 100 ml vodného roztoku příslušného polymeru či kopolymeru. Výsledky byly obdobné a nezávislé na typu použitého dialdehydu.

*

Příklad 8

Postupováno podle přikladu 3, avšak namísto glycinu zde bylo použito následujících látek s primárními aminoskupinami: fenylalanin, kyselina 4-amino máselná, galaktosamin, hydroxylamin, etanolamin a fenylhydrazin. Nehledě na rozdílnost použitých látek ze skupiny aminů, ve všech těchto případech prokázaly příslušné aldiminy požadovanou biologickou aktivitu.

Claims (5)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   1. Polymerní kompozice k stimulaci adheze, růstu a diferenc⁴ ’ > živočišných buněk, vyznačené tím, že sestávají z matrice syntetického nebo přírodního polymeru či kopolymeru a obsahující definované množství aldiminových vazebných seskupení obecného vzorce -CH=N-.
2. 2. Polymerní kompozice podle bodu 1, vyznačené tím, že tvorby aldiminového vazebného seskupení se zúčastní látky obsahující reaktivní aldehydické skupiny, např. typu alifatických nebo aromatických aldehydů či dialdehydů.
3. 3. Polymerní kompozice podle bodu 1, vyznačené tím, že tvorby aldiminového vazebného seskupení se zúčastní látky obsahující primární aminové skupiny, např. typu primárních aminů, aminokyselin, aminocukrů, hydroxylaminu, hydrazinu, semikarbazinu či thiosemikarbazidu.
4. 4. Polymerní kompozice podle bodů 1 až 3, vyznačené tím, že tvorby aldiminového vazebného seskupeni se zúčastní buS aldehydické, nebo primární aminové skupiny, které jsou nedílnou součástí základní polymerní matrice.
5. 5. Polymerní kompozice podle bodů 1 až 4, vyznačené tím, že tyto jsou substrátem při kultivaci živočišných buněk za obvyklých podmínek kultivace, např. v rozmezí pH 7,2 áž 7,4.