DE68907707T3 - Enzymstabilisierung. - Google Patents
Enzymstabilisierung.Info
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Description
- Die Erfindung betrifft die Stabilisierung von Proteinen, besonders, jedoch nicht ausschließlich, die von Enzymen im trockenen Zustand.
- Wenige Enzyme sind inhärent in Lösung stabil. Viele besitzen die Tendenz, denaturiert zu werden, wenn sie in Lösung gehalten werden. Verschiedene Forscher haben versucht, Enzyme entweder durch Zugabe von Verbindungen wie von Zuckern oder Glycerin zu deren Lösungen oder durch Gefriertrocknen zu stabilisieren. Diese Methoden verursachen oft einen Aktivitätsverlust. Alternative Methoden der Stabilisierung haben das Trocknen der Enzyme mit Stabilisatoren in Gegenwart eines festen Trägers wie einer Cellulosephase oder Polyacrylamid beinhaltet. Die US-4451569 offenbarte die Stabilisierung von Glutathionperoxidase durch Einfrieren des Enzyms mit einem aus einer Zahl von Zuckern einschließlich Arabinose, Glukose, Xylitol und Sorbitol. Das Gefriertrocknen ist zu kostspielig, um es im großen Maßstab zu betreiben, und führt oft zur Denaturierung.
- PCT/GB 86/00396 offenbart aie Stabilisierung von Proteinen über die Verwendung des Disaccharids Trehalose.
- Gemäß eines ersten Aspektes der vorliegenden Erfindung umfaßt ein Verfahren zum Schutz von Proteinen gegen die Denaturierung beim Trocknen das Mischen einer wäßrigen Lösung des Proteins mit einem löslichen, kationischen Polyelektrolyten und einem cyclischen Polyol, und das Entfernen des Wassers aus der Lösung.
- Die Stabilisierung in Übereinstimmung mit dieser Erfindung steigert die Aktivität frisch getrockneter Enzyme und anderer Proteine. Die Stabilität gegenüber Lagerung wird auch verbessert.
- Die Proteine können Enzyme, Antikörper, Antigene, Hilfsmittelkomponenten und bioaktive Peptide einschließen.
- Das Trocknen von Proteinen und besonders von Enzymen ist für viele Anwendungsbereiche wichtig, z.B. bei der Verwendung in diagnostischen oder analytischen Hilfsmitteln wie Teststreifen, die vor der Verwendung über längere Zeiträume gelagert werden können. Der Transport der Enzyme oder anderer Proteine in Lösung ist unbequem und teuer.
- Obgleich die Gefriertrocknung verwendet werden kann, erleichtert die vorliegende Erfindung die Verwendung der Vakuumtrocknung und der Lufttrocknung ohne Denaturierung. Die Vakuumtrocknung und die Luftrocknung sind mildere Verfahren und viel billiger zu betreiben.
- Der cyclische Polyol kann ein oder mehrere alicyclische Ringe umfassen und wenigstens eine Seitenkette besitzen. Verbindungen mit 5 bis 10 Hydroxylgruppen können bevorzugt sein. Nichtreduzierende Polyole sind bevorzugt. Di- und Trisaccharide sind besonders wirksam, jedoch können andere cyclische Polyole, zum Beispiel Inositol auch verwendet werden. Der Polyol kann in Abstimmung auf das Enzym oder das andere Protein und auf den betreffenden Polyelektrolyten ausgewählt werden. Lactitol, Lactose, Maltose und Sucrose sind in Verbindung mit DEAE-Dextran besonders bevorzugt, wobei sich Lactitol für viele Anwendungen als besonders geeignet erwiesen hat. Sorbitol ist für die Verwendung mit Cholesterinoxidase, Chlolesterinesterase und anderen Enzymen geeignet. Cellobiose kann auch verwendet werden. Die Menge an Polyol kann im bevorzugten Bereich von 1 bis 20 %, mehr bevorzugt 2 bis 10 %, und ganz besonders bevorzugt 5 bis 10 % liegen.
- Der kationische Polyelektrolyt ist vorzugsweise ein Polyol mit kationischen Gruppen, die über die Molekülkette verteilt sind. Die kationischen Gruppen, die vorzugsweise von einem quaternären Ammonium abgeleitete Funktionen darstellen, können in Seitengruppen, die von der Kette abzweigen, untergebracht sein, oder darin eingebaut sein. Natürliche oder künstliche Polymere können verwendet werden. Natürliche Polymere wie Polysaccharide sind bevorzugt, da viele künstliche Polymere Restspuren des anorganischen Polymerisationskatalysators enthalten.
- Diethylaminoethyldextran (DEAE-Dextran) und Chitosan sind bevorzugt, obgleich auch Polyethylenimin geeignet ist. Polysaccharide mit MW 5000 bis 500.000, vorzugsweise 5000 bis 20.000, besonders bevorzugt 5000 bis 10.000 können verwendet werden. Eine Menge von 0,1 bis 10 % ist bevorzugt, besonders 0,5 bis 2 %.
- Der pH, bei dem die Enzyme gemäß der Erfindung getrocknet wernen, kann wichtig sein, um die Aufrechterhaltung der Aktivität sowohl beim Trocknen als auch bei der nachfolgenden Lagerung zu optimieren. Der optimale pH für ein besonderes Enzym kann durch eine einfache Versuchsreihe bestimmt werden.
- Bei Alkoholoxidase hat sich herausgestellt, daß sie die Aktivität zwischen pH 7 und 8, vorzugsweise bei pH 7.8 beibehält.
- Cholesterinoxidase trocknet in Abhängigkeit von der Herkunft am besten bei pH 5 oder 9.
- Uricase kann bei pH 9 getrocknet werden.
- Cholesterinesterase kann in Abhängigkeit von der Herkunft bei pH 7 oder 9 getrocknet werden.
- Die Trocknung wird vorzugsweise in Gegenwart eines Feuchthaltemittels durchgeführt. Temperaturen zwischen 4º und 50º, besonders 25º bis 35º sind bevorzugt.
- Gemäß eines weiteren Aspekts der vorliegenden Erfindung wird ein Trockenprodukt bereitgestellt, das ein Protein, einen cyclischen Polyol und einen kationischen Polyelektrolyten enthält.
- Das Trockenprodukt kann ein freifließendes Pulver sein oder einen Teil eines Teststreifens oder eines anderen analytischen oder diagnostischen Geräts darstellen.
- Die vorliegende Erfindung wird beispielhaft, jedoch nicht in einer beschränkenden Weise beschrieben.
- Die In der Beschreibung verwendeten Prozentsätze beziehen sich auf das Gewicht, soweit nichts anderes angegeben ist.
- Alle Stabilisierungssysteme verwenden Puffer, um stabile pH-Bedingungen beizubehalten, e.g.
- Pufferlösungen mit Na&sub2;HPO&sub4;.2H&sub2;0 (10,855 g) und NaH&sub2;PO&sub4;.2H&sub2;0 (6,084 g) wurden in einem Liter destillierten Wasser aufgelöst, wobei man eine Lösung mit pH 7,0 einer Konzentration von 100 mmol/Liter erhielt.
- Ein alternativer Puffer ist MOPS - (4-Morpholinpropan- Schwefelsäure) - 52,25 g/2,5 l destilliertes Wasser, pH auf 7,87 mit 4,0 M NaOH.
- Ein Feuchthaltemittel kann in Abhängigkeit davon verwendet werden, ob das Enzymsystem in einer Polystyrolküvette stabilisiert wird oder nicht. Ein geeignetes Feuchthaltemittel ist ein Proteinhydrolysat aus als Byco A bezeichneter Gelatine. Diese machen bis zu 1 % Gew./V im Phosphatpuffer, 100 mmol.1&supmin;¹, pH 7,0 wie erforderlich aus.
- Die Enzymlösungen wurden direkt vor der Verwendung hergestellt. Die Vorratslösungen von Enzymen in Ammoniumsulfatlösung wurden erschöpfend gegen Puffer, e.g. 100 mmol.1&supmin;¹ Phosphatpuffer, pH 7,0 dialysiert, um alle Salze zu entfernen.
- Die Vorratsenzymkonzentrationen können im Bereich von 10 bis 1000 Einheiten Aktivität pro Milliliter Lösung liegen. In Einheiten der Proteinkonzentration ist das zwischen 0.5 bis 200 mg.cm&supmin;³. Üblicherweise beträgt dann die Proteinendkonzentration 1,0 mg.cm&supmin;³.
- Lösliche Polyelektrolyte, Polyole, Enzym, Puffersalze und Feuchthaltemittel (wenn verwendet) wurden bei einer konstanten Temperatur gemischt und in einem Vakuumofen über einem Trockenmittel e.g. Kieselgel, 0,1 mm/Hg, 30ºC über 4 bis 10 Stunden getrocknet.
- Die untersuchten Oxidaseenzyme können über kolorimetrische Bestimmung des Wasserstoffperoxids, das durch Einwirkung des Enzyms gebildet wird, bestimmt werden. Die Peroxidase wirkt auf das gebildete Wasserstoffperoxid in Gegenwart von aromatischen Alkoholen oder Ammen und der heterocyclischen Verbindung 4-Aminoantipyrin ein, wobei man Chinoniminfarbstoffe erhält. Andere Standardtestsysteme können verwendet werden, z.B. UV- Spektrometrie.
- Die folgenden Systeme wurden untersucht:
- Phenolsulfonsäure 25 mmol.1&supmin;¹
- 4-Aminoantitprin 0,4 mmol.1&supmin;¹
- Peroxidase 1000 Einneiten/l
- Der erhaltene Farbstoff wurde bei 500 nm gemessen.
- 3,5-Dichlor-2-hydroxybenzol-sulfonsäure 10 mmol.1&supmin;¹
- 4-Aminoantipyrin 0,4 mmol.1&supmin;¹
- Peroxidase 1000 Einheiten/l
- Der erhaltene Farbstoff wurde bei 520 nm gemessen.
- Standardtemperatur von, e.g. 25ºC, und Inkubationszeiten von, e.g. 5 Minuten wurden verwendet. Reagenzblindversuche enthielten alle Komponenten außer dem Substrat. Trockene Zubereitungen in Küvetten wurden mit den Systemen 1 oder 2 direkt wiederaufgenommen.
- Trockene gepulverte Zubereitungen wurden mit Phosphatpuffer wiederaufgenommen, und geeignete aliquote Mengen wurden zu System 1 oder System 2 hinzugegeben.
- Für Stabilitätsversuche betrug die Lagertemperatur 37ºC, wobei die Proben periodisch entnommen wurden, um die Restaktivität des Enzyms zu testen. Dieses Verfahren wurde für alle untersuchten Enzyme standardmäßig verwendet.
- Ein löslicher Polyelektrolyt wurde in destilliertem Wasser bei einer Konzentration bis zu 20 % Gew./V, üblicherweise bis zu 10 % Gew./V aufgelöst. Der Zuckeralkohol oder das Saccharid wurde in destilliertem Wasser bis zu einer Konzentration von 40 % Gew./V, üblicherweise bis zu 20 % Gew./V aufgelöst. Diese Lösungen wurden innerhalb von 4 Wochen nach der Herstellung verwendet, wobei sie in der Kälte bei 4ºC gelagert wurden. Beispiel 1
- Lösung 1 wurde unter der langsamen Zugabe von Lösung 2 bei 4ºC ständig gerührt. Die Mischung wurde für 5 Minuten gerührt, um eine vollständüge Mischung sicherzustellen. 0,1 ml Volumeneinheiten wurden wie beschrieben in Küvetten getrocknet, bei 37ºC gelagert und wie beschrieben (Tabelle 1) in Hinblick auf die Aktivitat untersucht. Beispiel 2
- Lösung 2 wurde langsam unter Rühren zu Lösung 1 zugegeben. Die gemischten Lösungen wurden in Petrischalen pipettiert und über Kieselgel bei 30ºC über 8 Stunden Vakuum getrocknet, wobei ein dünner glasiger Film aus getrocknetem Enzym und Stabilisierungsmittel gebildet wurde. Dieser wurde entfernt und mit einem Glaspistill und einem Mörser zu einem feinen Pulver zermahlen.
- Zur Stabilitätsuntersuchung wurden 10mg Proben des Enzympulvers in sterile Polystyrolröhrchen gewogen und bei 37º in einen verschlossenen Behälter über Kieselgel inkublert. Die Proben wurden periodisch entfernt und in destilliertem Wasser wiederaufgenommen. 60 µl der wiederaufgenommenen Enzymlösung wurden zu jeder Testküvette, die Peroxidase und Färbemittel enthielt wie beschrieben hinzugegeben (Tabelle 2). Beispiel 3
- Lösung 2 wurde unter Rühren zu Lösung 1 hinzugegeben und intensiv bei 4ºC gemischt. 0,1 cm³ Volumina wurden in Küvetten wie oben beschrieben vakuumgetrocknet, bei 37ºC gelagert und in bezug auf die Aktivität wie oben beschrieben (Tabelle 3) untersucht. Beispiel 4 Glycerol-3-Phosphatoxidase
- Lösung 2 wurde unter Rühren bei 4ºC zu Lösung 1 hinzugegeben und innig gemischt. 0,1 cm³ Volumina wurden in Küvetten wie oben beschrieben (Tabelle 4) vakuumgetrocknet. Beispiel 5
- Lösung 1 wurde unter der langsamen Zugabe von Lösung 2 bei 4ºC kontinuierlich gerührt. Die Mischung wurde für 5 Minuten gerührt, um eine vollständige Mischung sicherzustellen, und 0,1 cm³ Volumina wurden in Küvetten wie beschrieben (Tabelle 5) getrocknet.
- Lösliche Polysaccharide wurden in destilliertem Wasser zu einer Konzentration von 30 % Gew./V, üblicherweise bis zu einer Konzentration von 10 % Gew./V aufgelöst. Diese Lösungen wurden innerhalb von 4 Wochen nach der Herstellung verwendet und bei 4ºC gelagert. Beispiel 6
- Lösung 2 wurde unter Rühren bei 4ºC langsam zu Lösung 1 hinzugegeben, und das Rühren wurde über 5 Minuten fortgesetzt, um eine vollständige Mischung zu gewährleisten. 0,1 cm³ Volumina wurden in Küvetten vakuumgetrocknet, beil 37ºC gelagert und wie oben beschrieben in Hinblick auf die Aktivität untersucht.
- Wenn Dextrane mit verschiedenen Molekulargewichten verwendet wurden, wurden Abweichungen in der Stabilität festgestellt (Tabelle 6). Beispiel 7
- Lösung 2 wurde unter Rühren bei 4ºC zu Lösung 1 hinzugegeben, und das Rühren wurde über 5 Minuten fortgesetzt, um eine vollständige Vermischung zu gewährleisten. 0,1 ml aliquote Mengen wurden vakuumgetrocknet, bei 37ºC gelagert und in bezug auf die Aktivität wie oben beschrieben (Tabelle 7) untersucht.
- Der cyclische Polyalkohol wurde in destillierten Wasser bis zu einer Konzentration von 10 % Gew./V aufgelöst. Die Lösungen wurden bei 4ºC gelagert und innerhalb von 4 Wochen nach der Herstellung verwendet. Beispiel 8
- Lösung 2 wurde unter Rühren bei 4ºC zu Lösung 1 hinzugegeben, und das Rühren wurue für 5 Minuten fortgesetzt, um eine vollständige Vermischung zu gewährleisten. 0,1 cm³ aliquote Mengen wurden vakuumgetrocknet, bei 37ºC gelagert und in bezug auf die Aktivität wie beschrieben (Tabelle 8) untersucht. Beispiel 9
- Lösung 2 wurde bei 4ºC unter Rühren zu Lösung 1 hinzugegeben, und das Rühren wurde über 5 Minuten fortgesetzt, um eine vollständige Vermischung zu gewährleisten. 0,1 cm³ aliquote Mengen wurden wie beschrieben vakuumgetrocknet, bei 37ºC gelagert und in bezug auf die Aktivität wie beschrieben (Tabelle 9) untersucht.
- Die folgenden Ergebnisse zeigen die Stabilisierung der Alkoholoxidase (Hansenula polymorpha).
- Nichtstabilisiertes Enzym behielt 26 % Aktivität nach 7 Tage Inkubation bei 37ºC. Die Zugabe von Chitosan oben ergab die Retention von 48,9 % Aktivität nach 9 Tagen. Die Aktivität in bezug auf frisch getrocknetes Enzym wurde nach der Inkubatlon bei 37ºC gemessen.
- Die folgenden Ergebnisse zeigen die Stabilisierung von Alkoholoxidase (Pichia pastoris). Nichtstabilisiertes Enzym behielt 49,8 % und 36,1 % Aktivität nach 2 Tagen, bzw. 13 Tagen bei 37ºC. Die gesteigerte Aktivität (i.e. größer als 1-%) nach dem Trocknen kann dem selektiven Abbau inhibierender Verunreinigungen zuzuschreiben sein.
- Die folgenden Ergebnisse zeigen die Stabilisierung von Cholesterinoxidase (Norcardia erythropolis), Nichtstabilisiertes Enzym behielt 34,3 % Aktivität nach 14 Tagen bei 37ºC.
- Die folgenden Ergebnisse veranschaulichen die Stabilisierung von gefriergetrockneter Uricase.
- Die folgenden Ergebnisse veranschaulichen die Stabilisierung von verschiedenen Enzymen mit Lactitol (15 %) und DEAE-Dextran (1 %) während der Trocknung im Vergleich zu der Aktivität nicht getrockneter Enzyme. Aktivität nach dem Trocknen/% Tabelle 1
- Das nichtstabilisierte Enzym behielt 26 % Aktivität nach 7 Tagen. Tabelle 2
- Das nichtstabilisierte Enzym behielt 34 % Aktivität nach 4 Tagen. Tabelle 3
- Das nichtstabilisierte Enzym behielt 24 % Aktivität nach 1 Tag, was auf 11 % nach 5 Tagen abnahm. Tabelle 4
- Das nichtstabilisierte Enzym behielt 94 % Aktivität nach 1 Tag, jedoch behielt es nur 54 % Aktivität nach 15 Tagen. Tabelle 5
- Das nichtstabilisierte Enzym behielt 23 % der Aktivität nach 10 Tagen bei 37ºC. Tabelle 6
- Das nichtstabilisierte Enzym behielt 30 % der Aktivität nach 6 Tagen. Tabelle 7 Galactoseoxidase Tabelle 8
- Das nichtstabilisiertes Enzym behielt 26 % Aktivität nach 7 Tagen. Tabelle 9
Claims (9)
1. Ein Verfahren zum Schutz von Enzymen gegen den
Aktivitätsverlust beim Trocknen, das umfaßt die Schritte von:
Mischen einer wäßrigen Lösung des Enzyms mit einem
löslichen kationischen Polyelektrolyten mit Gruppen, ausgewählt
aus: primären, sekundären und tertiären Amino- oder quaternären
Ammoniumgruppen und einem zyklischen Polyol, und
Entfernen des Wassers aus der Lösung.
2. Ein Verfahren wie in Anspruch 1 beansprucht, worin der
Polyelektrolyt ein mit quaternärem Ammonium funktionalisiertes
Polysaccharid umfaßt.
3. Ein Verfahren wie in Anspruch 2 beansprucht, worin der
Polyelektrolyt die Diethylaminoethyl-Dextran oder -Chitosan
umfaßt.
4. Ein Verfahren wie in Anspruch 1 beansprucht, worin der
Polyelektrolyt Polyethylenimin umfaßt.
5. Ein Verfahren wie in einem vorhergehenden Anspruch
beansprucht, worin der Polyol ein Di- oder Trisaccharid ist.
6. Ein Verfahren wie in Anspruch 5 beansprucht, worin der
Polyol ausgewählt wird aus der Gruppe, die umfaßt: Lactitol,
Lactose, Maltose, Sucrose oder Cellobiose.
7. Ein Verfahren wie in einem vorhergehenden Anspruch
beansprucht, worin das Wasser bei einer Temperatur zwischen 4º
und 50ºC entfernt wird.
8. Ein Verfahren wie in Anspruch 7 beansprucht, worin die
Temperatur 25º bis 35ºC beträgt.
9. Ein getrocknetes Produkt, das ein Enzym, einen löslichen
kationischen Polyelektrolyten mit Gruppen, ausgewählt aus:
primären, sekundären und tertiären Amino- und quaternären
Ammoniumgruppen und einen zyklischen Polyol enthält, wobei das
Enzym gegen den Aktivitätsverlust in Übereinstimmung mit dem
Verfahren eines vorhergehenden Anspruches stabilisiert wurde,
mit der Maßgabe, daß das Enzym nicht Rennin ist.
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