DE69434290T2 - Stabilisierung von proteinen in lösung - Google Patents

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Description

  • Diese Erfindung bezieht sich die Stabilisierung von Proteinen in Lösung, insbesondere, aber nicht ausschließlich, auf die Stabilisierung von Enzymen. Alternative Proteine beinhalten Antikörper, Antigene, Serumkompliment, Vakzinkomponenten und bioaktive Peptide.
  • Die Verwendung von Enzymen bei analytischen Anwendungen ist bekannt geworden, weil Enzyme eine Anzahl von signifikanten Vorteilen gegenüber konventioneller analytischer Chemie zeigen. Enzyme haben Spezifität, Sensitivität und arbeiten unter milden analytischen Bedingungen. Ein Hauptnachteil von Enzym-basierten Assays ist, dass die Enzymkomponente oft instabil ist. Dies kann zum Abbau des Reagens während der Lagerung und zu verfälschten Ergebnissen führen. Verschiedene Verfahren sind verwendet worden, um die Stabilität von Enzymen zu erhöhen, einschließlich Immobilisierung, chemische Modifikation durch Quervernetzung, Polymerimplantierung oder Substitutionsreaktionen, physisches Einschließen oder Einkapseln in Polymermatrizen oder Membranen und die Zugabe von Chemikalien oder Lösungsmitteln zur Enzympräparation. Enzympräparationen zur Verwendung bei analytischen Verfahren werden oft in einer trockenen stabilisierten Form unter Verwendung einer Kombination von chemischen Additiven zur Förderung der Stabilität geliefert. WO 90/05182 und WO 91/14773 offenbaren die Stabilisierung von Enzymen beim Trocknen durch Mischen wässriger Lösungen des Enzyms mit löslichen Polyelektrolyten und zyklischen Polyolen vor Entfernung von Wasser aus der Lösung. Es hat sich nicht erwiesen, dass solche Zusammensetzungen eine signifikante Stabilisierung vor der Dehydrierung vermitteln.
  • Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Stabilisieren eines wässrigen Proteins, umfassend den Schritt des Kontaktierens des Proteins mit einer wässrigen Lösung eines Proteinstabilisatoradditivs, das umfasst:
    • a. eine Tris(hydroxymethyl)-Methylverbindung der Formel 1 (HOCH2)3C-R (1) wobei R ist: C1-C4-Alkyl, substituiertes C1-C4-Alkyl, NH2, NR1R2, wobei R1 und R2 unabhängig sein können: H, C1-C4-Alkylsulphonat, C1-C4-Hydroxyalkylsulphonat, C1-C4-Alkyl-NHC(CH2OH)3, CP1-C4-Alkyl, C1-C4-Hydroxyalkyl, C1-C4-Alkylcarboxylat;
    • b. ein kationisches oder anionisches Polyelektrolyt;
    • c. ein Polyol, und optional
    • d. eine oder mehrere zusätzliche Verbindungen.
  • Komponente (a) kann als eine "Tris"-Verbindung bezeichnet werden. Beispiele von "Tris"-Verbindungen beinhalten: 1,1',1''-Tris(hydroxymethyl)ethan, 1,1',1''-Tris(hydroxymethyl)propan, Tris(hydroxymethyl)-Aminomethan oder Salze derselben, beispielsweise Chlorid, Maleat, Phosphat, Succinatsalze; 1,3-Bis[Tris(hydroxymethyl)methylamino]propan; Bis(2-hydroxyethyl)aminotris(hydroxymethyl)methan; N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-2-aminoethansulphonat; N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropansulphonat; N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-amino-2-hydroxypropansulphonat; N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-glycin.
  • Auch amphotere Polyelektrolyte können eingesetzt werden. Der kationische Polyelektrolyt ist vorzugsweise ein Polymer mit längs der Molekülkette verteilten kationischen Gruppen. Die kationischen Gruppen, die vorzugsweise quaternäre Ammonium-abgeleitete Funktionen sind, können in von der Kette herabhängenden Seitengruppen angeordnet oder in sie inkorporiert sein. Beispiele kationischer Polyelektrolyte beinhalten: Copolymere von Vinylpyrollidon and quaternärem Methylmethacrylat, z.B. die Gafquat-Reihe (755N, 734, HS-100), erhalten von ISP, substituierte Polyacrylamide, Polyethylenimin, Polypropylenimin und substituierte Derivate derselben; Polyaminhomopolymere (Golchem CL118), Polyamincopolymere (z.B. Kondensate von Epichlorhydrin und Mono- oder Dimethylamin), Polydiallyldimethylammoniumchlorid (polyDADMAC), substituierte Dextrane, modifiziertes Guargummi (Mit Hydroxypropyltrimoniumchlorid substituiert), substituierte Proteine (z.B. quarternäre Gruppen, die auf Sodaprotein und hydrolysiertem Kollagen substituiert sind); Polyaminsäuren (z.B. Polylysin); niedermolekulargewichtige Polyaminoverbindungen (z.B. Spermin und Spermidin). Natürliche oder künstliche Polymere können eingesetzt werden. Kationische Polyelektrolyte mit MG 150 bis 5.000.000, vorzugsweise 5.000 bis 500.000, bevorzugtererweise 5.000 bis 100.000, können eingesetzt werden. Eine Menge von 0,01 bis 10% wird bevorzugt, bevorzugtererweise 0,1 bis 2% G/V, insbesondere 0,05 bis 5%.
  • Der anionische Polyelektrolyt ist vorzugsweise ein Polymer mit anionischen Gruppen, die längs der Molekülkette verteilt sind. Die anionischen Gruppen, welche Carboxylat, Sulfonat, Sulfat oder andere negativ geladene ionisierbare Gruppierungen enthalten können, können auf von der Kette herabhängenden Gruppen angeordnet oder direkt mit dem Polymerrückgrat verbunden sein. Es können natürliche oder künstliche Polymere eingesetzt werden.
  • Beispiele anionischer Polyelektrolyte beinhalten: Gantrez (S-Reihen; AN-Reihen); Alginsäuren und -Salze, Carboxymethylcellulose und -Salze; substituierte Polyacrylamide (z.B. mit Carboxylgruppen substituiert); Polyacrylsäuren und -Salze; Polystyrolsulphonsäuren und -Salze; Dextransulfate; substituierte Saccharide; z.B. Saccharoseoctosulfat; Heparin. Anionische Polyelektrolyte mit MG von 150 bis 5.000.000, vorzugsweise 5.000 bis 500.000, bevorzugtererweise 5.000 bis 100.000 können verwendet werden. Eine Menge von 0,01% bis 10% wird bevorzugt, insbesondere 0,05 bis 5%, besonderererweise 0,1 bis 2% G/V.
  • Die genannte weitere Komponente kann aus der Gruppe ausgewählt werden, die divalente Metallionen, Chelatoren, beispielsweise EDTA, EGTA oder Citrat (nicht mit Peroxidasen) oder Polyole, umfasst. Bevorzugte divalente Metalle beinhalten Calcium- und Magnesiumsalze. Kobalt-, Zink- oder Mangansalze können ebenfalls verwendet werden.
  • Die Polyole, die verwendet werden können, sind vorzugsweise niedermolekulargewichtige Polyole, obwohl polymere Derivate verwendet werden können. Bevorzugte Polyole erniedrigen das Dielektrikum der Lösung. Solche Polyole beinhalten Ethylenglykol, Glycerin, Erythritol und Mannit. Zyklische Polyole, die verwendet werden können, beinhalten eine oder mehrere alizyklische Ringe und können zumindest eine Seitenkette aufweisen. Bevorzugte cyclische Polyole beinhalten Disaccharide und Zuckeralkohole, beispielsweise Lactit, Sorbit und Inosit. Verbindungen mit 2 bis 10 Hydroxylgruppen werden bevorzugt. Die Menge des Polyols kann im bevorzugten Bereich 1 bis 5%, bevorzugterer 1 bis 20%, am bevorzugtesten 2 bis 10% G/V betragen.
  • Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung stabilisieren Enzyme oder andere Proteine, ohne kovalente oder andere irreversible Bindung an den letzteren. Die Enzyme können intakt aus der Lösung durch einfache physische Mittel wiedergewonnen werden, beispielsweise durch Einstellen des pHs auf einen geeigneten Wert, gefolgt von Salz- oder Lösungsmittelpräzipation, praktischerweise mit Ammoniumsulfat.
  • Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung bestehen vorzugsweise im wesentlichen aus einem oder mehreren Enzymen oder anderen Proteinen gemeinsam mit Puffern und Stabilisatoren, wie in der Spezifikation beschrieben. Natürlich auftretende komplexe Mischungen, wie etwa Plasma, Serum, oder andere physiologische Fluide, die Polyelektrolyte, Hydroxyverbindungen und Salze beinhalten können, sind von der vorliegenden Erfindung ausgeschlossen. Wie auch immer immobilisierte, quervernetzte, eingefangene oder kovalent vernetzte Proteine sind in die vorliegende Erfindung eingeschlossen.
  • Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung werden als ein Protein stabilisierend angesehen, falls die Aktivität des Proteins bei erhöhten Temperaturen nach einem Inkubationszeitraum im Vergleich mit dem Protein bei Abwesenheit der Stabilisatoren nicht signifikant vermindert ist. Beispielsweise zeigt Meerrettichperoxidase, die bei 60°C für 120 Minuten inkubiert wurde, keinen Aktivitätsverlust bei Stabilisatoren der Erfindung, verglichen mit 50% Aktivitätsverlust nach 18 Minuten unter denselben Bedingungen.
  • Die vorliegende Erfindung findet insbesondere Einsatz in der Herstellung einer analytischen Analysevorrichtung. Ein bevorzugter Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt eine analytische Assayformulierung bereit, welche ein Stabilisatoradditiv, wie oben definiert, inkorporiert.
  • Die Erfindung wird weiterhin mittels eines Beispiels, jedoch nicht in irgendeinem beschränkenden Sinne, weiter beschrieben.
  • Es wurde die Stabilität von Proteinlösungen in Anwesenheit von Stabilisatoren bei erhöhten Temperaturen untersucht. Es wurden Stabilisatoren enthaltende Pufferlösungen auf den erforderlichen Temperaturen in einem Techne Trocken-Heizblock inkubiert. Nach mehreren Minuten Inkubation wurde die Temperatur der gepufferten Mischung unter Verwendung eines Thermistors gemessen. Wenn die Temperatur auf dem erforderlichen Pegel konstant war, wurde Proteinlösung zugegeben und das Röhrchen wurde rasch gekippt, um gründlich zu mischen, und in den Trockenblock zurückgesetzt. Es wurden zu festen Zeitpunkten danach Proben genommen und auf eine Aktivität mittels Standardprozeduren untersucht. Alle Ergebnisse wurden als Menge an Proteinaktivität relativ zur Nullzeitaktivität ausgedrückt. Nullzeitproben wurden durch Inkubation des Systems bei 25°C erhalten, wobei Duplikatproben genommen und auf Proteinaktivität untersucht wurden.
  • Die vorliegende Erfindung wird durch Bezugnahme auf die Daten in den Tabellen 1 bis 20 demonstriert, welche die relativen spezifischen Aktivitäten verschiedener Proteine als Funktion der Zeit zeigen. Lösungen der Proteine ohne Stabilisatoren erfuhren rasche Denaturierung, wie durch Aktivitätsverlust gezeigt, während bei einem Polyelektrolyt vorliegend größere Aktivität für längere Zeiträume bewahrt wurde. Das Einschließen einer oder mehrerer "Tris"-Verbindungen ergab eine weitere Steigerung der Stabilität, wobei die Proteinaktivität erhalten blieb. Die Tabellen 1 und 2 zeigen die Effekte eines Polyelektrolyten (Gafquat 755N), von Tris-Verbindungen und EDTA (als Metallchelator) auf die Lösungsstabilität von Alkoholoxidase bei 60°C.
  • Tabelle 1: Effekt von Stabilisatoren auf die Alkoholoxidase-Aktivität in Lösung
    Figure 00050001
  • Der in diesem Beispiel verwendete Puffer war 200 mM Phosphat, pH 8,0.
  • Tabelle 2: Effekt von Tris und EDTA bei Alkoholoxidase
    Figure 00050002
  • Figure 00060001
  • Das Enzym war Alkoholoxidase aus Hansenula polymorpha (50 Einheiten·ml–1). Die Trislösung wurde mit Phosphorsäure auf pH 8,0 gepuffert.
  • Das Polyelektrolyt war Gafquat 755N (1% G/V).
  • Die Enzymlösung wurde bei 60°C für 30 min thermisch gestresst, wobei die aufgezeichneten Werte Prozente verbleibender Enzymaktivität in 5 Minuten-Intervallen während der Inkubation waren.
  • Tabelle 3: Meerrettichperoxidase in 20 mM Tris pH 8,0
    Figure 00060002
  • Tabelle 3 zeigt die Stabilisierung von Meerrettichperoxidase in 20 mM Tris bei pH 8,0 bei einer Temperatur von 60°C. Die Kombination des kationischen Polymers Gafquat 755N und Ethylenglykol erzeugte bessere Stabilisierung als ihre Komponenten alleine.
  • Tabelle 4: Meerrettichperoxidase in 20 mM Tris-Puffer pH 8,0
    Figure 00070001
  • Tabelle 4 zeigt die Stabilisierung von Meerrettichperoxidase über einen ausgedehnten Zeitraum bei einer Temperatur von 60°C. Calciumchlorid alleine erzeugte eine gute Stabilität, aber eine Kombination von kationischem Polyelektrolyt, Ethylenglykol und Calciumchlorid ergab einen hohen Pegel an Stabilisierung über bis zu 240 Minuten.
  • Tabelle 5: Arthromyces-Peroxidase
    Figure 00080001
  • Tabelle 5 zeigt die Stabilisation von Arthromyces-Peroxidase bei 4,5 E·ml–1 in 20 mM Bis-Tris bei pH 7,3 bei einer Temperatur von 59°C. Die Stabilisierung wurde mit dem kationischen Polyelektrolyten Gafquat 755N und auch mit Calciumchlorid erhalten. Jedoch wurde mit einer Kombination beider Stabilisatoren eine überlegene Stabilisierung erhalten.
  • Tabelle 6: Schweineleberesterase, Gafquat/EDTA
    Figure 00080002
  • Tabelle 6 zeigt die Stabilisierung von Schweinleberesterase mit Gafquat und EDTA in 20 mM Bis-Tris pH 7,3 und einer Inkubationstemperatur von 68,9°C.
  • Tabelle 7: Schweineleberesterase. Tris(hydroxymethyl)ethan
    Figure 00090001
  • Tabelle 7 zeigt die Stabilisierung von Schweineleberesterase in 20 mM Bis-Tris pH 7,3 mit Tris(hydroxymethyl)ethan bei 68,9°C.
  • Tabelle 8: Stabilisierung von Meerrettichperoxidase während der Verdünnung in 20 mM Trispuffer pH 8,0 bei einer Temperatur von 25°C
    Figure 00090002
  • Tabelle 8 zeigt die Stabilisierung von Meerrettichperoxidase in 20 mM Tris bei pH 8,0. DEAE-Dextran sowohl alleine als auch in Anwesenheit von Ethylenglykol und Calciumchlorid verlieh überraschenderweise eine Stabilität bei extremen Verdünnungen.
  • Tabelle 9: Stabilität von verdünnten Lösungen von Meerrettichperoxidase (3,66 μg/ml) bei 37°C
    Figure 00100001
  • Tabelle 9 zeigt die Stabilität von sehr verdünnten Lösungen von Meerrettichperoxidase (3,66 μg/ml–1) bei 37°C. Eine Kombination von DEAE-Dextran, Ethylenglykol und Calciumchlorid ergab eine exzellente Stabilisierung für bis zu 180 Minuten.
  • Tabelle 10: Trypsin-Selbstverdau (Phosphatpuffer)
    Figure 00110001
  • Die Tabellen 10 und 11 zeigen, dass die Anwesenheit von Polyelektrolyt den Selbstverdau von Trypsin verzögert; dieser Effekt wurde in Anwesenheit von Tris-Stabilisator verstärkt.
  • Tabelle 11: Trypsin-Selbstverdau (Trispuffer)
    Figure 00110002
  • Tabelle 12: Alkalische Phosphatase (Rind)
    Figure 00120001
  • Tabelle 12 zeigt die Stabilisierung von boviner alkalischer Phosphatase in 50 mM Trispuffer bei pH 8,0 und 61°C. Magnesiumchlorid, Ethylenglykol, Rinderserumalbumin und DEAE-Destran umfassende Stabilisatoren stellten eine verbesserte Stabilisierung bereit.
  • Tabelle 13: Effekt von Kombinationen von Stabilisatoren auf die Stabilität von Meerrettichperoxidase(Biozyme)-Lösungen (20 mM Tris/HCl-Puffer pH 8,0) bei 69°C
    Figure 00130001
  • Tabelle 13 zeigt den Effekt von Kombinationen von Stabilisatoren auf die Stabilität von Meerrettichperoxidase in 20 mM Tris/HCl-Puffer bei pH 8,0 und 69°C. Dieses Beispiel zeigt die Verwendung von substituierten Dextranen als Polyelektrolyte, wobei eine gute Stabilisierung mit DEAE-Dextran, Ethylenglykol und Calciumchlorid in Kombination erhalten wird.
  • Tabelle 14: Die Stabilität von HRP-4(Biozyme)-Lösungen I (20 mM Tris/HCl-Puffer pH 8,0) bei 50°C
    Figure 00140001
  • Tabelle 14 zeigt die Stabilisierung von Meerrettichperoxidase-Lösung in 20 mM Tris/HCl-Puffer bei pH 8 und 50°C. Die Degradierung ohne Stabilisator ist rasch, aber es wurde eine gute Stabilisierung bei Zeiträumen bis zu 8 Tagen unter Verwendung einer Kombination von DEAE-Dextran, Ethylenglykol und Calciumchlorid erhalten.
  • Tabelle 15: Der Effekt der Temperatur auf die Stabilität von HRP-4(Biozyme)-Lösungen (20 mM Tris/HCl-Puffer pH 8,0) in Anwesenheit von Ethylenglykol (10% V/V), DEAE-Dextran MG 500K (0,5% G/V) und Calciumchlorid (10 mM)
    Figure 00150001
  • Tabelle 15 zeigt den Effekt der Temperatur auf die Stabilität von Meerrettichperoxidase-Lösungen (20 mM Tris/HCl-Puffer pH 8,0) in Anwesenheit von Ethylenglykol, DEAE-Dextran (MG 500K) und Calciumchlorid.
  • Tabelle 16: Langzeitstabilität von HRP-4-Lösungen
    Figure 00160001
  • Tabelle 16 illustriert die Langzeitstabilität von Meerrettichperoxidase-Lösungen bei unterschiedlichen Temperaturen. Der Stabilisationspuffer war derselbe wie bei Beispiel 15.
  • Tabelle 17: Die Stabilisierung der HRP-Aktivität von Antikörper/HRP-Konjugat(Sigma)-Lösungen (20 mM Tris/HCl-Puffer pH 8,0) bei 50°C
    Figure 00160002
  • Tabelle 17 illustriert die Stabilisierung von Meerrettichperoxidase-Aktivität von Antikörper-Meerrettichperoxidase-Konjugatlösungen unter Verwendung des folgenden Stabilisators: CaCl2 10 mM, Ethylenglykol 10 Vol.-%, DEAE-Dextran 0,5% G/V, Puffer Tris/HCl 20 mM pH 8,0.
  • Die Stabilisierung des HRP-Labels des IgG-HRP-Konjugats (Sigma A 6029) mit der beschriebenen Kombination führte nicht zu einem Verlust an Aktivität über 3 Tage Inkubation bei 50°C.
  • Tabelle 18: Galactoseoxidase: Stabilität bei 66,5°C in 20 mM Trisphosphat pH 7,84
    Figure 00170001
  • Tabelle 19: Galactoseoxidase: Stabilität bei 66,4°C in 20 mM Trisphosphat pH 7,84
    Figure 00170002
  • Tabelle 20: Alkoholoxidase in 20 mM Bis-Tris pH 6,0
    Figure 00180001

Claims (17)

  1. Verfahren zum Stabilisieren eines wässrigen Proteins, umfassend den Schritt des Kontaktierens des Proteins mit einer wässrigen Lösung eines Proteinstabilisatoradditivs, das umfasst: a. eine Tris(hydroxymethyl)-Methylverbindung der Formel 1 (HOCH2)3C-R (1)wobei R ist: C1-C4-Alkyl, substituiertes C1-C4-Alkyl, NH2, NR1R2, wobei R1 und R2 unabhängig sein können: H, C1-C4-Alkylsulphonat, C1-C4-Hydroxyalkylsulphonat, C1-C4-Alkyl-NHC(CH2OH)3, CP1-C4-Alkyl, C1-C4-Hydroxyalkyl, C1-C4-Alkylcarboxylat; b. ein kationisches oder anionisches Polyelektrolyt; c. ein Polyol, und optional d. eine oder mehrere zusätzliche Verbindungen.
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Tris(hydroxymethyl)-Methylverbindung aus der Gruppe ausgewählt wird, die 1,1',1''-Tris(hydroxymethyl)ethan, 1,1',1''-Tris(hydroxymethyl)propan, Tris(hydroxymethyl)-Aminomethan oder Salze derselben, beispielsweise ein Chlorid, Maleat, Phosphat, Succinatsalze; 1,3-Bis[Tris(hydroxymethyl)methylamino]propan; Bis(2-hydroxyethyl)aminotris(hydroxymethyl)methan; N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-2-aminoethansulphonat; N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropansulphonat; N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-amino-2-hydroxypropansulphonat; N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-glycin umfasst.
  3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Polyelektrolyt ein kationisches Polyelektrolyt ist.
  4. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei das kationische Polyelektrolyt ein Polymer mit längs der molekularen Kette verteilten quarternären Ammoniumgruppen ist.
  5. Verfahren gemäß Anspruch 3 oder 4, wobei das kationische Polyelektrolyt ausgewählt ist aus: Copolymeren von Vinylpyrollidon and quaternärem Methylmethacrylat, substituierten Polyacrylamiden, Polyethylenimin, Polypropylenimin und substituierten Derivaten derselben; Polyaminhomopolymeren, Polyamincopolymeren, Polydiallyldimethylammoniumchlorid, substituierten Dextranen, modifiziertem Guargummi, substituierten Proteinen; Polyaminsäuren und niedermolekulargewichtigen Polyaminoverbindungen einschließlich Spermin und Spermidin.
  6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei das kationische Polyelektrolyt ein Molekulargewicht von 150 bis 5000000 aufweist.
  7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 3 bis 6, wobei das kationische Polyelektrolyt in einem Anteil von 0,01 bis 10 Gew./Vol.-% vorliegt.
  8. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Polyelektrolyt ein anionisches Polyelektrolyt ist.
  9. Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei das anionische Polyelektrolyt ausgewählt wird aus der Gruppe, die Alginsäuren und -Salze, Carboxymethylcellulose und -Salze; substituierte Polyacrylamide; Polyacrylsäuren und -Salze; Polystyrolsulphonsäuren und -Salze; Dextransulfate; substituierte Saccharide; substituierte Oligosaccharide; substituierte Polysaccharide und Heparin umfasst.
  10. Verfahren gemäß Anspruch 8 oder 9, wobei das anionische Polyelektrolyt ein Molekulargewicht von 150 bis 5000000 aufweist.
  11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei das anionische Polyelektrolyt in einem Anteil von 0,01 bis 10 Gew./Vol.-% vorliegt.
  12. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die zusätzliche Komponente ausgewählt ist aus divalenten Metallionen und Chelatoren.
  13. Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei die zusätzliche Verbindung ein Calzium- oder Magnesiumsalz ist.
  14. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Polyol ausgewählt wird aus: Ethylenglykol, Glycerin, Erythritol und Mannit.
  15. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Polyol ein zyklisches Polyol ist.
  16. Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei das Polyol ausgewählt ist der Gruppe, die Lactit, Sorbit und Inosit umfasst.
  17. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 14 bis 16, wobei das Polyol in einem Anteil von 0,1 bis 25 Gew./Vol-% vorliegt.
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Families Citing this family (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6689265B2 (en) 1995-10-11 2004-02-10 Therasense, Inc. Electrochemical analyte sensors using thermostable soybean peroxidase
GB9708641D0 (en) 1997-04-29 1997-06-18 Knoll Ag Enzyme concentrate
AU764138B2 (en) * 1999-02-05 2003-08-14 Merck Sharp & Dohme Corp. Human papilloma virus vaccine formulations
US6734162B2 (en) 2000-01-24 2004-05-11 Minimed Inc. Mixed buffer system for stabilizing polypeptide formulations
TW496745B (en) 2000-11-29 2002-08-01 Novartis Ag Aqueous disinfecting systems
CA2439422A1 (en) * 2001-03-07 2002-10-03 Instrumentation Laboratory Company Reference electrode
EP1252879A1 (de) * 2001-04-27 2002-10-30 Cosmoferm B.V. Stabilisierte Enzym Zusammensetzungen
US6960466B2 (en) * 2001-05-31 2005-11-01 Instrumentation Laboratory Company Composite membrane containing a cross-linked enzyme matrix for a biosensor
US6652720B1 (en) 2001-05-31 2003-11-25 Instrumentation Laboratory Company Analytical instruments, biosensors and methods thereof
US6872297B2 (en) * 2001-05-31 2005-03-29 Instrumentation Laboratory Company Analytical instruments, biosensors and methods thereof
EP1412384B1 (de) * 2001-06-28 2007-12-26 Novo Nordisk A/S Stabile formulierung von modifiziertem glp-1
US6737401B2 (en) 2001-06-28 2004-05-18 Metronic Minimed, Inc. Methods of evaluating protein formulation stability and surfactant-stabilized insulin formulations derived therefrom
WO2004053483A2 (en) * 2002-12-11 2004-06-24 Instrumentation Laboratory Company Multi-analyte reference solutions
US20040256227A1 (en) * 2003-02-11 2004-12-23 Jungwon Shin Electrochemical urea sensors and methods of making the same
US20040154933A1 (en) * 2003-02-11 2004-08-12 Instrumentation Laboratory Company Polymeric membranes for use in electrochemical sensors
EP2292254A3 (de) * 2003-06-03 2011-12-14 Novo Nordisk A/S Stabilisierte pharmazeutische Peptidzusammensetzungen
JP2007524592A (ja) * 2003-06-03 2007-08-30 ノボ・ノルデイスク・エー／エス 安定化された薬学的ペプチド組成物
CA2545034C (en) 2003-11-20 2013-03-05 Novo Nordisk A/S Propylene glycol-containing peptide formulations which are optimal for production and for use in injection devices
JP4896006B2 (ja) 2004-04-08 2012-03-14 バイオマトリカ， インコーポレイテッド ライフサイエンスのためのサンプル保存とサンプル管理との統合
US8007814B2 (en) * 2004-06-16 2011-08-30 University Of Massachusetts Therapy for lysosomal enzyme deficiencies
US7740861B2 (en) * 2004-06-16 2010-06-22 University Of Massachusetts Drug delivery product and methods
PL1789434T3 (pl) * 2004-08-31 2014-07-31 Novo Nordisk As Zastosowanie tris(hydroksymetylo)aminometanu do stabilizacji peptydów, polipeptydów i białek
EP1817048B1 (de) * 2004-11-12 2014-02-12 Novo Nordisk A/S Stabile formulierungen insulinoptropischer peptide
CA2609038A1 (en) 2005-05-18 2006-11-23 Trinity Biosystems, Inc. Methods and compositions for immunizing against chlamydia infection
US20070031914A1 (en) * 2005-08-05 2007-02-08 Wei Zhu Devices for analyte assays and methods of use
AU2008289225A1 (en) * 2007-08-17 2009-02-26 Amgen Inc. Formulations of antibodies and Fc-fusion molecules using polycations
CA2704056A1 (en) * 2007-10-29 2009-05-07 University Of Massachusetts Encapsulated nanoparticles for nucleic acid delivery
US8815818B2 (en) 2008-07-18 2014-08-26 Rxi Pharmaceuticals Corporation Phagocytic cell delivery of RNAI
CA2746527A1 (en) 2008-09-22 2010-03-25 Rxi Pharmaceuticals Corporation Rna interference in skin indications
US9493774B2 (en) 2009-01-05 2016-11-15 Rxi Pharmaceuticals Corporation Inhibition of PCSK9 through RNAi
WO2010090762A1 (en) 2009-02-04 2010-08-12 Rxi Pharmaceuticals Corporation Rna duplexes with single stranded phosphorothioate nucleotide regions for additional functionality
DK2898890T3 (da) 2010-03-31 2019-11-25 Stabilitech Biopharma Ltd Stabilisering af viruspartikler
AU2011234264B2 (en) 2010-03-31 2016-02-04 Stabilitech Ltd Excipients for stabilising viral particles, polypeptides or biological material
US9376709B2 (en) 2010-07-26 2016-06-28 Biomatrica, Inc. Compositions for stabilizing DNA and RNA in blood and other biological samples during shipping and storage at ambient temperatures
US9845489B2 (en) 2010-07-26 2017-12-19 Biomatrica, Inc. Compositions for stabilizing DNA, RNA and proteins in saliva and other biological samples during shipping and storage at ambient temperatures
ES2614181T3 (es) 2010-08-14 2017-05-30 University Of Massachusetts Partícula de pared celular de levadura para suministro de nanopartículas direccionadas al receptor
US11246915B2 (en) 2010-09-15 2022-02-15 Applied Molecular Transport Inc. Cholix toxin-derived fusion molecules for oral delivery of biologically active cargo
CN103249401B (zh) 2010-09-15 2016-01-20 兰德尔·J·米斯尼 使用细菌毒素衍生的转运序列递送生物活性剂的系统和方法
GB201117233D0 (en) * 2011-10-05 2011-11-16 Stabilitech Ltd Stabilisation of polypeptides
US9725703B2 (en) 2012-12-20 2017-08-08 Biomatrica, Inc. Formulations and methods for stabilizing PCR reagents
GB201406569D0 (en) 2014-04-11 2014-05-28 Stabilitech Ltd Vaccine compositions
IL285716B (en) 2014-05-07 2022-09-01 Applied Molecular Transp Llc Compacted molecules derived from colic toxin for oral delivery of biologically active cargo
CN106572650B (zh) 2014-06-10 2021-08-31 生物马特里卡公司 在环境温度下稳定凝血细胞
EP3319930A4 (de) * 2015-07-07 2019-04-10 NanoBio Corporation Verfahren und zusammensetzungen zur stabilisierung von proteinen
GB2556002B (en) 2015-07-07 2020-12-16 Bluewillow Biologics Inc Methods and compositions for nanoemulsion vaccine formulations
EP4242628A3 (de) 2015-12-08 2023-11-08 Biomatrica, INC. Verringerung der erythrozytensedimentationsrate
GB2562241B (en) 2017-05-08 2022-04-06 Stabilitech Biopharma Ltd Vaccine compositions
PL3474820T3 (pl) 2017-08-24 2024-05-13 Novo Nordisk A/S Kompozycje glp-1 i ich zastosowania
EP4082558B1 (de) 2018-03-08 2023-08-23 Applied Molecular Transport Inc. Von toxinen abgeleitete konstrukte zur oralen verabreichung
AU2019230230A1 (en) 2018-03-08 2020-10-22 Applied Molecular Transport Inc. Toxin-derived delivery constructs for oral delivery
TW202120521A (zh) 2019-08-16 2021-06-01 美商應用分子運輸公司 組合物、配方及介白素生產及純化
GB202001501D0 (en) 2020-02-04 2020-03-18 Fabricnano Ltd Nucleic acid nanostructures
EP4106724A1 (de) 2020-02-18 2022-12-28 Novo Nordisk A/S Glp-1-zusammensetzungen und verwendungen davon
GB202007428D0 (en) 2020-05-19 2020-07-01 Fabricnano Ltd Polynucleotide synthesis
GB202110595D0 (en) 2021-07-22 2021-09-08 Fabricnano Ltd Functionalised nucleic acid structure
CN115494232B (zh) * 2022-10-31 2023-10-27 江苏三联生物工程股份有限公司 4,4-二甲基噁唑啉在制备含辣根过氧化物酶的试剂中的应用

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4282316A (en) * 1979-09-11 1981-08-04 Modrovich Ivan Endre Stabilized enzymic solutions for determining urea
US4318818A (en) * 1979-11-09 1982-03-09 The Procter & Gamble Company Stabilized aqueous enzyme composition
GB2064543A (en) * 1979-12-07 1981-06-17 Slovenska Akademia Vied An Agent for the Release of Cells From Tissues or From the Surface of a Cultivation Vessel
JPS61176532A (ja) * 1985-01-30 1986-08-08 Green Cross Corp:The プラスミノ−ゲンアクチベ−タ−前駆体の安定化方法
GB8826429D0 (en) * 1988-11-11 1988-12-14 Univ Leeds Ind Service Ltd Enzyme stabilisation systems
US5116729A (en) * 1989-03-10 1992-05-26 Miles Inc. Stabilization of oxidase enzyme-based test strips
GB9006642D0 (en) * 1990-03-24 1990-05-23 Gibson Timothy D Enzyme stabilisation
WO1992011844A1 (en) * 1991-01-03 1992-07-23 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Stabilization of proteins by cationic biopolymers
US5356800A (en) * 1992-11-30 1994-10-18 Buckman Laboratories International, Inc. Stabilized liquid enzymatic compositions

Also Published As

Publication number Publication date
EP0722492A1 (de) 1996-07-24
DE69434290D1 (de) 2005-04-14
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EP0722492B1 (de) 2005-03-09
GB9320782D0 (en) 1993-12-01
WO1995010605A1 (en) 1995-04-20
DK0722492T3 (da) 2005-07-11
US6133229A (en) 2000-10-17

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