KR100700483B1 - 단백질의 빠른 탈수법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 단백질 코팅 미세결정 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 단백질 코팅 미세결정은 생체촉매로서 사용하기 위한 효소의 제조; 제약 제제에 사용하기 위한 치료용 단백질의 제조; 효소를 포함하는 세정제의 제조; 보호성 및(또는) 방오성을 부여하는 단백질을 포함하는 페인트, 니스, 코팅, 필름 등의 제조; 진단 키트 및(또는) 바이오센서에의 적용을 위한 단백질을 포함하는 필름, 폴리머, 잉크, 코팅, 전극 및(또는) 광학 재료의 제조; 분자 인식, 분자 결합 및 비수성 매질 결합 억제제의 연구를 위해 단백질을 사용할 경우; 및 단백질을 기재로 한 식품 첨가물의 제조에 사용될 수 있다.
단백질 코팅 미세결정, 생물학적 거대분자, 공침전

Description

단백질의 빠른 탈수법 {Rapid dehydration of proteins}
본 발명은 생물학적(biological) 거대분자를 포함하는 수용성 입자, 및 수용액으로부터 생물학적 거대분자를 단리(單離)하는 동시에 단백질을 탈수시켜 단백질 생물학적 거대분자를 제공하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 단백질이 침전되어 있는 수혼화성 유기 용매에 관한 것이다. 본 발명은 특히 생체촉매(biocatalyst)로서 사용하기 위한 효소의 조제; 제약 제제에 사용하기 위한 치료용 단백질의 조제; 효소를 포함하는 세정제의 제조; 보호성 및(또는) 방오성을 부여하는 단백질을 포함하는 페인트, 니스, 코팅, 필름 등의 제조; 진단 키트 및(또는) 바이오센서에 적용하기 위한 단백질을 포함하는 필름, 폴리머, 잉크, 코팅, 전극 및(또는) 광학 재료의 제조; 비수성 매질에서의 분자 인식, 분자 결합 및 결합 억제제의 연구를 위해 단백질을 사용할 경우; 및 단백질을 주원료로 한 식품 첨가물의 제조에 사용될 수 있다. 또한, 침전된 생물학적 거대분자는 그후, 불용성 지지체에 결합된 화합물의 부착, 분해 및(또는) 변성을 위한 촉매의 제조와 같은 고상(固相) 화학 뿐만 아니라 상기 언급한 용도 중 적어도 몇몇에 사용되기 위해 유기 용매에 용해될 수 있다.
단백질은 매우 다양한 용도로 사용된다. 그러나, 일반적으로 치료를 목적으로 사용하기 위해서는, 실질적으로 불순물이 거의 없는 단백질을 제조해야만 한다. 많은 형태의 정제 방법이 공지되어 있으며, 미분 원심분리법, 선택적 침전법, 용매 추출법 및 크로마토그래피법과 같은 방법에 의해 성취할 수 있다. 또한, 통상적으로 취급을 용이하게 하고(하거나) 저장 기간을 개선하기 위해 사용 전에 단백질을 탈수시키거나 건조시키는, 즉, 단백질로부터 물을 제거하는 것이 바람직할 수 있다.
전형적으로 단백질은 당업계에 통상적으로 알려진 동결 건조법, 진공 건조법 또는 공기 건조법으로 탈수시킬 수 있다. 그러나, 이들 기술은 많은 단점을 갖고 있다. 예를 들면, 이들 건조 공정들은 대개 매우 빠르지 않으며, 비용이 많이 들 수 있다. 더욱이, 동결 건조법은, 특히 효소와 부서지기 쉬운 단백질의 경우, 단백질의 기능을 저하시킬 수 있다. 단백질 기능을 보존하기 위해 추가 안정화 부형제가 종종 사용된다. 그러나, 안정화 부형제의 첨가는 그 자체가 바람직하지 못한데, 특히, 예를 들어, 치료용으로 사용할 단백질의 규정을 고려할 때, 그러하다.
미국 특허 제 5,198,353호는 안정한 효소 분산액 제조 방법을 개시하고 있다. 이 특허에는 수용성 액상 세제에 사용하기 위한 세밀하게 분산된 효소를 제조하기 위해 수용액으로부터 폴리머와 효소를 공(共)침전시키는 방법이 기재되어 있다. 폴리머와 효소는 염 또는 유기 용매를 첨가하여 침전시킨다. 침전제로서 유기 용매를 사용할 때 단백질을 침전시키기 위해, 유기 용매를 수성 단백질/폴리머 용액에 격렬히 교반하며 서서히 첨가해야 한다고 개시되어 있다. 그러나, 이 방법과 첨가되는 유기 용매의 양은 단백질의 광범위한 빠른 탈수법과 관련이 없다.
미국 특허 제 5,589,167호 및 동 제 5,753,219호는 유기 용매로 처리한 폴리펩티드의 부형제 안정화 방법을 개시하고 있다. 유기 용매로 처리한 건조 또는 수성 폴리펩티드를 안정화하는 것으로 트레할로즈와 같은 폴리올이 개시되어 있다. 그러나, 폴리올이 유기 용매에 첨가되어 단백질을 공침전시키기 위해 사용될 수 있다는 것이나 단백질을 탈수하는 타당성/중요성에 대해 제시되어 있지 않다.
란덴(Randen) 등(J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 761-766)은 동결 건조법에 대한 대체 방법으로서 수용성 전분과 효소의 공침전을 개시하였다. 분자량이 12,700과 100,000인 전분이 아세톤, 에탄올 또는 이소프로판올의 유기 용매와 혼합될 때 단백질분해효소를 제거하는 공침전제로서 개시되어 있다. 침전 후 생성되는 입자들은 불규칙한 침상물(針狀物)로서 밀도가 낮으며, 크기는 200 내지 700 ㎛로 기재되어 있다. 건조 후, 입자들은 분쇄 또는 연마에 의해 추가 가공하여야만 보다 균일한 크기 분포를 얻을 수 있다.
란덴 등의 논문을 인용한 최근의 논문으로, 부스토스(Bustos) 등은 공침전제로서 추가 폴리머 화합물의 사용에 대해 개시하였다(J. Chem. Teh. Biotechnol., 1996, 65, 193-199). 개시된 폴리머 화합물은 가수분해 콜라겐, 카제인 및 말토덱스트린 PSM 10(12,100 Mw) 및 PSM 100(100,000 Mw)이다.
그리하여, 본 발명의 목적은 수용액으로부터 단백질을 탈수시키는 동시에 단리하는 빠른 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 단백질/핵산 코팅 미세결정과 같은 생물활성(bioactive) 분자 코팅 입자를 제공하는 것이다.
본 발명의 한 양태에 따르면,
a) 공침전제와 생물학적 거대분자를 포함하는 수용액을 조제하는 단계;
b) 공침전제와 생물학적 거대분자를 포함하는 수용액을 과량의 수혼화성 유기 용매와 빠르게 혼합하여, 공침전제 및 생물활성 분자가 용액으로부터 즉시 공침전하도록 함으로써 입자를 형성하는 단계; 및
c) 상기 입자를 유기 용매로부터 단리하는 단계를 포함하는 수용성 입자 제조방법이 제공된다.
삭제
상기 용어 "생물학적 거대분자"는 단백질, 펩티드, 폴리펩티드 등, 또는 DNA 또는 RNA와 같은 헥산을 나타낸다. 이후, 생물학적 거대분자로 불리는 것은 대개 단백질을 나타낼 것이다. 그러나, 상기 언급한 다른 생물학적 거대분자도 그와 동등할 수 있음을 양지해야 할 것이다.
용어 "결정형"은 평면을 포함하는 3차원 형상을 나타내고자 한 것이며, 따라서, 일반적으로 구형 또는 타원형 형상과는 구별된다.
용어 "공침전제(corprecipitant)"는 유기 용매에 첨가되었을 때 단백질과 함께 용액으로부터 침전하는 화합물을 나타내고, 용어 "공침전물(동사 corprecipitate가 명사로 쓰인 경우)"은 생물활성 분자-공침전제 복합체를 나타낸다.
수용액으로부터 단리하려는 단백질은 임의의 단백질 또는 단백질 혼합물일 수 있다. 전형적인 단백질로는 서브틸리신, 키모트립신 및 단백질분해효소와 같은 효소; 알부민, 피브리노겐, 트롬빈 및 혈액 인자와 같은 혈액 단백질; 및 인슐린, 항체, 혈액 및 수송 단백질, 규정 단백질, 당단백질, 지단백질, 호르몬 및 인터페론과 같은 치료용 단백질이 포함된다.
공침전제는 고체로서, 예를 들면 수용액에 용해될 수 있는 분말로서 제공될 수 있다. 또한, 공침전제는 수용액에 용해되기 전에 용액 또는 현탁액 상태일 수 있다. 대개, 공침전제는 실질적으로 포화되거나 고농도인 용액으로 제공될 수 있다.
공침전제는 용액 중에서 단백질에 대해 적합한 중량비율을 얻을 수 있도록 수용액에 충분히 용해될 수 있어야 한다. 공침전제가 수용액 보다 선택된 용매에 훨씬 더 낮은 용해도를 갖는 것이 바람직하다. 또한, 보다 한정된 입자가 필요하다면, 공침전제는 입자를 형성할 필요가 있으며, 따라서, 융점이 높은 공침전제가 바람직하다. 요구되는 공침전제의 농도는 용액 중의 단백질의 양과 단백질의 분자량의 함수이다. 일반적으로, 침전 전의 용액은 단백질에 대한 공침전제의 몰비가 크다. 전형적으로 공침전제 : 단백질의 몰비는 50 이상, 바람직하게는 200 이상, 보다 바람직하게는 400 이상일 수 있다.
고체 형태의 공침전제(수화물 형태로 존재할 수 있음)는 습한 환경에 노출되었을 때 매우 적은량의 물만 흡수하는 것이 바람직하다. 공침전제는 공침전에 사용되는 유기 용매에 대해 매우 낮은 용해도를 갖는 것이 바람직하다.
공침전제는 또한 단백질을 거의 또는 실질적으로 전혀 변성시키지 않는 것을 선택해야 한다.
상기 바람직한 특성들 중 적어도 몇몇을 나타낼 수 있는 공침전제는, 무기염, 예를 들면, 황산칼륨 및 염화칼륨; 전형적으로는 분자량이 10,000 Da 미만인, 당, 다당, 탄수화물, 폴리올, 및 이들의 유도체, 예를 들면, 트레할로즈; 글리신 및 알기닌과 같은 아미노산; 산을 베이스로 한 완충제, 예를 들면, 인산수소칼륨, MOPS 및 POPSO; 양성이온 화합물, 예를 들면, 베타인; 유기염, 예를 들면, 콜린 및 벤조산나트륨; 스페르미딘 및 그의 염과 같은, 다수의 염기성 기를 갖는 화합물; 시트르산 및 그의 염과 같은, 다수의 산성 기를 갖는 화합물; 담즙산염; 수용성 염료; 극성 또는 이온성 폴리머; 및 극성 또는 이온성 덴드리머(dendrimer)로부터 선택될 수 있다.
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단백질-공침전제 용액을 수혼화성 유기 용매 또는 수혼화성 용매들의 혼합물, 바람직하게는 용매 또는 용매 혼합물이 충분히 혼화된 물질과 혼합한다. 반드시 단백질/공침전제 용액의 빠른 탈수가 일어나도록 단백질-공침전제 용액을 과량의 유기 용매에 첨가(용액이 과량이면 안됨)하는 것이 바람직함을 유의해야 한다. 그 결과, 단백질-코팅 입자가 재생가능하게 얻어진다. 충분히 수혼화성인 유기 용매의 과량은 용매/수용액의 최종 물 함량이 일반적으로 30% (부피/부피) 미만, 전형적으로는 20 내지 10% (부피/부피) 미만, 편의상 5% (부피/부피) 미만인 것이다. 이러한 경우, 유기 용매는 초기에는 10% (부피/부피) 미만의 물을 함유하거나, 실질적으로 건조한 것이 바람직하지만 완전히 건조할 필요는 없다. 적합한 유기 용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 아세토니트릴, 테트라히드로푸란 및 아세톤을 포함한다. 특정 예에서는, 유기 용매가 수용액에 첨가되었을 때 반드시 두 성분(단백질 및 공침전제)이 함께 침전되도록 하기 위해 단백질 및(또는) 공침전제로 사전에 포함된 상태일 수 있다.
용어 "혼합하다"는 수용액을 첨가할 때 유기 용매를 수용액과 혼합 또는 교반하는 공정 단계를 나타낸다. 혼합 방법은 단백질을 단시간 동안 중간 조성 혼합물, 즉, 수용액 및 유기 용매, 예를 들면 25% 내지 60% 용매와 접촉시키는 데 효과적이어야 한다. 당업자라면, 혼합이 전체 수용액이 유기 용매에 재빨리, 실질적으로 단일 단계로 첨가되어야 한다는 것을 의미하지 않으며 적가될 수도 있다는 것을 이해할 것이다.
또한, 단백질-공침전제 용액은 과량의 유기 용매에 첨가되는 것이 바람직하다. 이는 단백질-공침전제 용액이 유기 용매에 의해 빠르게 희석되어 단백질이 빠르게 탈수되는 동시에 단백질-코팅 입자가 형성되도록 작은 부피의 단백질-공침전제 용액이 큰 부피의 과량 유기 용매에 첨가되는 것을 의미한다. 그밖에도, 수용액은 연속 흐름, 적하(滴下) 또는 스프레이 또는 미스트와 같은 다양한 방법을 이용하여 유기 용매에 첨가될 수 있다.
침전을 실행하는 온도는 다양할 수 있다. 예를 들어, 수용액 및 용매를 가열하거나 냉각할 수 있다. 단백질이 손상되기 쉬운 경우에는 냉각이 유용할 수 있다. 또는, 용매와 수용액이 다른 온도일 수 있다. 예를 들면, 용매를 수성 혼합물의 어는점 이하의 온도에 유지할 수 있다. 압력 또한 다양할 수 있으며, 예를 들면, 용매의 휘발성을 저하시키기 위해서는 보다 높은 압력이 유용할 수 있다.
단백질-공침전제 용액을 과량의 유기 용매에 혼합할 때, 단백질과 공침전제의 침전은 거의 순간적으로 일어난다. 그러나, 가능한 한 많은 단백질이 침전하도록 용매/수용액의 혼합은 단시간 동안, 예를 들면, 5 내지 15분간 계속될 수 있다.
시간이 지나면, 공침전물이 가라앉게 되고 단백질-코팅 입자를 회수할 수 있다. 그러나, 침전된 단백질 코팅 입자를 보다 빨리 회수하기 위해 공침전물을, 예를 들면, 원심분리 및(또는) 여과시킬 수 있다. 간단한 건조 과정을 이용하여 임의의 잔류 용매를 증발시킴으로써, 용매가 존재하지 않는 건조한 단백질 코팅 입자 침전물을 남길 수 있다.
침전된 단백질 코팅 입자는 유기 용매 중에 보관할 수 있으며, 단백질이 오랜 기간 동안 매우 우수한 활성 보유력과 안정성을 유지할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 또한, 침전된 단백질을 유기 용매 중에 보관하기 때문에, 박테리아의 공격을 피할 수 있고, 따라서, 저장 기간이 연장될 수 있다.
필요하다면, 침전된 단백질 코팅 입자를 새로운 유기 용매로 다시 세척하여 추가 탈수할 수 있다.
침전된 단백질은 사용 전에 수용액 중에 다시 용해시킬 수 있다. 또는, 침전된 단백질을 직접 유기 용매 중에 용해시킬 수 있다. 이는, 예를 들면, 유기 가용성의 이온쌍 형성제(ion-pairing agent), 비이온성 세제와 같은 양성(兩性) 화합물의 비공유 결합 또는 PEG, 장쇄 알킬기, 덴드리머 분자 또는 폴리머와 같은 유기 가용성 기의 공유결합을 이용하여 달성할 수 있다.
상기의 사실은 이온쌍 형성제를 사용하여 효소를 유기 용매 중에 용해시키는 경우, 이온쌍 형성이 일어날 때 단백질은 수용액 상태임을 나타낸다. 본 발명의 방법은 그러나 매우 낮은 수분 조건에서 이온쌍 형성이 일어나게 한다. 이로써 다음과 같은 몇몇 잇점이 있음을 주목해야 하는데, 예를 들면, 계면 단백질의 변성이 일어나지 않고; 정전기적 및(또는) 극성 상호작용이 강할 수 있고; 극성 용매에 의한 직접 용매화가 가능하고; 물에 민감한 이온쌍 형성제를 사용할 수 있고; 여러가지 이온쌍 형성제의 혼합물을 사용할 수 있고; 단백질 이온화 상태를 이온쌍 형성 과정을 저해하지 않는 고체 상태의 산을 베이스로 한 완충제를 사용하여 조절할 수 있고; 물 활성을 조절하면서 공정을 수행할 수 있고; 동결 건조 단계가 필요 없고; 가용화 공정을 간단한 장치만으로도 수행할 수 있고, 대규모 수행이 용이하다는 것이다.
본원에 기재된 방법은 또한 수용액 중에 존재하는 유기 가용성 성분을 단백질로부터 분리할 수 있다. 예를 들면, 유리 염기 형태로 예탄올과 같은 유기 용매 중에 용해될 수 있는 트리스(Tris)와 같은 완충제는 침전 중에 단백질로부터 분리될 수 있다. 그러나, 모든 완충제는 다른 유기 가용성 염기를 수용액 또는 유기 용매에 첨가하여 유리 염기로 전환시킬 필요가 있다. 따라서, 본 발명은 또한 바람직하지 않은 성분들이 단백질과 공침전되지 않고 유기상 중에 용해된 상태로 남아 있게 함으로써 단백질로부터 원치 않는 성분들을 제거하는 방법을 개시한다. 이는 단백질 침전 전에 수성 용매 또는 유기 용매에 산, 염기, 이온쌍 형성제 및 킬레이트화제와 같은 첨가물을 혼입시킴으로써 달성할 수 있다.
본 발명은 매우 다양한 용도에 사용될 수 있다. 예를 들면, 효소-공침전제 입자들은 생체촉매, 특히 수분 함량이 낮은 계(系), 유기 용매 및 초임계 유체 중에서의 반응을 위한 생체촉매로서 사용될 수 있다.
미세 건조 효소-공침전제 입자 내에서 촉매적으로 활성인 효소 구조를 잘 유지하는 것은 동결 건조 분말과 비교했을 때 수분 함량이 낮은 계, 유기 용매 및 초임계 유체 중에서의 생체촉매 반응에 상당한 잇점을 제공한다. 적용예로는, 정밀화학물질 및 제약 중간체, 농약, 세제, 지방, 유화제, 식품, 비타민, 감미료, 향미제 및 향료, 모노머 및 폴리머의 유기 합성, 및 합성 및 천연 폴리머의 변성 시 생체촉매가 있다. 다른 적용예로는, 예를 들면, 새로운 선도 화합물의 동정, 효소 촉매 고체-고체 합성, 펩티드 합성 및 고온 및 저온 생체촉매화반응에 사용되는 결합 생체촉매가 있다. 효소-공침전물 입자는 생체촉매 이외에도 독성 폐기물, 화학 약품 및 생물 무기, 가정 및 산업 폐기물 및 천연 자원 폐기물에서 발견되는 것들을 포함하는 화학물질 및 폴리머의 분해에도 사용될 수 있다. 효소 촉매 공정은 주로 위치 특이성, 거울이성질체 특이성 및 입체 특이성을 부여하는 화학적 방법 보다 유리하다.
또한, 본 발명의 방법에 따르면 제약 제제를 위한 치료학적 생물활성 분자의 제조가 가능하다.
본 발명의 방법은 단백질과 공침전제를 함유한 미세 건조 입자를 생성한다. 따라서, 본 발명의 다른 양면에 따르면, 공침전제와 입자의 외면에 위치한 또는 그에 가깝게 위치한 탈수된 생물학적 거대분자를 포함하는 50 ㎛ 미만의 수용성 결정형 입자가 제공된다.
용어 "탈수된 생물학적 거대분자"는 실질적으로 물과 결합되지 않는 생물학적 거대분자를 나타내고, "공침전제"는 앞서 정의한 바와 같다.
전형적으로, 탈수된 생물학적 거대분자는 공침전제의 표면에 또는 그에 가깝게 위치되어 있다. 일반적으로, 생물학적 거대분자는 탈수되었을 때 고유한 구조를 유지하거나 고유한 구조에 가까운 상태를 유지한다. 즉, 비가역적으로 변성되지 않는다. 예를 들면, 생물학적 거대분자가 효소라면, 효소는 용매 중에 보관될 때 및(또는) 수성 매질 중에 재구성되었을 때 그의 활성을 대부분 보유할 것으로 예상된다.
효소 및 다른 생체촉매는 또한 탈수된 상태에서 유기 용매에서와 같이 수분 함량이 낮은 조건에서도 효과적으로 반응을 촉매할 수 있다. 탈수시 고유한 구조를 유지하는 것은 예를 들면, 수분 함량이 낮은 유기 용매 중에서 활성 부위 적정을 수행하여 입증할 수 있다.
입자 내의 공침전제는 결정질인 것이 바람직하다. 결정질 침전제는 입자 표면에 또는 그에 가깝게 탈수된 단백질이 위치되어 있는 단단한 코어를 제공한다. 이로써 확산 한계가 감소되며, 탈수된 상태의 생물학적 거대분자는 용매, 시약, 기질, 안정화제 또는 조절제에 쉽게 접근할 수 있다.
일반적으로, 입자의 크기는 10 ㎛ 미만이며, 예를 들면 5 내지 1 ㎛ 미만이다.
전형적으로 공침전물내의 입자는 매우 균일한 크기를 갖고, 입방체, 장사방형, 판형 및 침형과 같은 특정의 규칙적인 결정형을 보인다. 공침전물의 결정형은 공침전제 및 단백질 모두에 따라 변한다. 결정형 입자에 의해 나타나는 평면은 예를 들면, 원자력 현미경과 같은 주사형 탐침현미경 및 표면력 현미경을 수행하는 데 적합하다. 이러한 기술을 사용하면, 탈수된 단백질을 입자의 표면 상에 영상화할 수 있으며, 그의 분포, 조직 및 구조를 입증할 수 있다. 이는 X선 결정구조 해석에 의해 구조를 얻기 어려운 막 단백질과 같은 단백질의 3차 및 4차 구조를 입증하는 데 사용할 수 있다.
공침전물 결정은 앞서 기재한 바와 같은 매우 다양한 공침전제를 사용하여 생성할 수 있다.
일반적으로 이들 입자는 수용액에 빠르게 재용해시키거나 또는 현탁액을 형성하기 쉽고 예를 들면 피펫(수동 또는 자동)을 사용하여 재생가능하게 분배할 수 있으며, 따라서, 의약 용도로 단백질을 제제화하는 출발 시점에서 유용할 것이다. 치료학적 단백질을 사용한다면, 입자들은 정제, 크림, 분말, 겔, 포움, 에어로졸, 현탁액, 테이프 및 패치를 포함하는 여러 형태의 약물 제제를 제조하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 생물활성 분자 코팅 입자는 점막 표면을 가로지르는 수송에 특히 적합할 수 있으며, 따라서, 흡입 투여에 적합할 수 있다. 입자의 크기는 혈류에의 흡수가 가장 효과적인 폐의 하엽 영역에 흡입에 의한 폐투여시 특히 적합하다. 이러한 용도에 맞는 입자는 0.5 ㎛ 내지 5 ㎛ 범위인 것이 가장 바람직하다. 단백질-공침전제 입자와, 충전제, 증량제 및(또는) 결합제로 작용하는 추가 부형제의 혼합이 요구될 수 있다. 본 발명의 입자는 비드, 필름, 섬유, 붕대 및 고약의 제조를 위해 천연 및 합성 폴리머에 캡슐화하는 것을 비롯한 추가 변형을 위한 출발 시점에 사용될 수 있다. 용해도, 가공도 및 분산도를 조절하기 위해 입자의 표면에 코팅이 적용될 수 있다. 코팅은 약물 전달속도를 조정하고, 입자의 표면 특성을 변화시키는 데 유용하다.
본 발명에 따르면, 또한 효소를 함유한 세정제의 제조가 가능하다.
앞서 언급한 바와 같이, 본 발명의 방법은 수용액 중에 빠르게 재용해될 수 있고, 따라서, 효소를 함유한 세정제의 제조에 유용한 단백질 및 공침전제를 함유한 미세 건조 입자를 생성한다. 효소는 세정에 사용되는 정제, 크림, 분말, 겔, 포움, 에어로졸 및 현탁액에 혼입될 수 있다. 단백질-공침전제 입자와 충전제, 벌커 및(또는) 결합제로 작용하는 추가 부형제의 혼합이 요구될 수 있다. 예를 들면, a) 콘택트 렌즈 세정을 위한 단백질분해효소 또는 과산물분해효소와 같은 효소를 함유한 정제의 제조, 및 b) 의류 또는 식기 세척기용 세척 분말에 포함되는 단백분해효소, 지질분해효소 또는 셀루로오즈 분해효소와 같은 효소를 함유한 정제, 분말 또는 현탁액의 제조에 사용될 수 있다. 본 발명의 입자는 천연 및 합성 폴리머에 캡슐화하는 것을 비롯한 추가 변형을 위한 출발 시점에 사용될 수 있다. 용해도, 가공도 및 분산도를 조절하기 위해 입자의 표면에 코팅이 적용될 수 있다. 코팅은 입자의 표면 특성을 변화시키고, 용매 중에 또는 물 중에 재현탁 시 거동을 조정하는 데 유용하다.
본 발명의 방법은 보호 또는 방오 특성을 부여하기 위해 단백질을 함유하는 페인트, 니스, 코팅 및 필름을 제조하는 데 사용될 수 있다.
미세 단백질-공침전제 입자는 페인트, 니스, 코팅 및 필름의 제조를 위해 안료에 사용되는 것과 유사한 방법으로 담체 매질 중에 분산될 수 있다. 만일 단백질분해효소, 지질분해효소 또는 셀룰로오즈분해효소와 같은 효소를 사용한다면, 생성되는 코팅은 박테리아, 효모, 곰팡이, 미생물 및 연체동물과 같은 살아있는 생물체의 부착을 방지하는 방오 특성을 가질 수 있다.
진단 키트 및 바이오센서 적용을 위한 단밸질을 함유하는 필름, 폴리머, 잉크, 코팅, 전극 및 광학 재료의 제조 또한, 본 발명을 이용하여 달성할 수 있다.
미세 단백질-공침전제 입자는 페인트 또는 잉크와 같은 담체 매질에 분산시킬 수 있고, 검사 스트립, 전극 또는 광학 재료 상의 필름 또는 코팅을 형성하는 데 사용할 수 있다. 상기 물품들은 또한 진단 키트 및 바이오센서에의 적용에 활성 요소로 사용될 수 있다.
그밖에, 본 발명에 따라 제조된 단백질-공침전제 입자는 비수성 매질 중에서의 분자 인식, 분자 결합, 분자 각인 및 억제제 결합에 대한 연구에 사용할 수 있다.
단백질은 단백질-공침전제 입자 내에서 고유한 구조를 유지하고, 효소는 높은 촉매 활성을 유지한다. 따라서, 침전물은 비수성 매질 중에서의 분자 인식, 분자 결합, 분자 각인 및 억제제 결합에 대한 연구에 사용될 수 있다. 이것은 억제제의 개선, 및, 예를 들어, 의학, 수의학 및 농학에 적용하는 데 적합한 기질 설계에 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 단백질-공침전제 입자는 단백질을 기재로 하는 식품 첨가물로 사용될 수 있다.
본 발명에 사용되는 침전 용매 및 공침전제는 인간 또는 동물이 섭취하거나 흡입했을 때 독성을 보이지 않는 것을 선택할 수 있으며, 따라서, 본 발명의 방법은 건조한 단백질 기재 식품 첨가물 및 제약의 빠르고 저렴한 생산에 사용될 수 있다.
이제, 본 발명을 예로서 제시된 하기 첨부된 도면을 참조하여 추가 서술할 것이다.
도 1은 본 발명의 방법에 의해 단리된 단백질-공침전제 입자의 투과형 전자 현미경으로 얻은 전형적인 영상이다.
도 2는 도 1에 나타낸 단백질-공침전제 입자의 고배율 영상이다.
도 3은 염이 존재하지 않는 1-PrOH에 침전된 서브틸리신을 나타낸다.
도 4는 26% H2O를 함유한 1-PrOH에 공침전된 서브틸리신을 나타낸다.
도 5는 서브틸리신 및 K2SO4의 수상(水相) 용액에 1-PrOH를 첨가한 효과를 나타낸다.
도 6은 서브틸리신이 코팅된 K2SO4 결정의 AFM 영상을 나타낸다.
도 7은 서브틸리신이 없는 K2SO4 단일 결정의 표면에 대한 AFM 영상을 나타낸다.
도 8은 서브틸리신이 코팅된 K2SO4 단일 결정의 표면에 대한 AFM 영상을 나타낸다.
도 9는 서브틸리신 활성에 대한 다양한 아미노산 공침전제의 효과를 나타낸다.
실시예 1- 서브틸리신의 제조
서브틸리신 칼스버그(유형 VIII: 박테리아, 바실루스 리켄포르미스(bacillus lichenformis), 결정화되고 동결건조된 상태)를 시그마(Sigma, 영국, 풀레 소재)로부터 입수하였다. 서브틸리신(공급된 그대로) 2 ㎎을 완충액 50 ㎕(트리스 10 mM, pH 7.8)에 용해하고, 여기에 공침전제, 황산칼륨, K2SO4(120 gl-1)의 포화용액 150 ㎕를 첨가하였다. 용액 중의 최종 단백질 농도는 0.37 mM이었고, 침전물 중의 K2SO4:효소의 몰비는 서브틸리신 -11 중량%에 대응하는 대략 1400이었다.
공침전제-효소 용액 200 ㎕를 조제 직후 피펫으로 7 ㎖ 유리 바이알에 담긴 프로판올 3 ㎖로 옮겼다. 용액은 약 100 rpm으로 진탕하는 안구형 진탕기로 교반하며 길슨 마이크로피펫을 사용하여 약 4 × 50 ㎕로 피펫팅하였다. 수용액을 건조 유기 용매에 첨가하는 즉시 K2SO4와 단백질의 공침전이 일어났다. 매우 미세한 공침전제-효소 고체 분산액이 담긴 바이알에 뚜껑을 덮고 속도를 800 rpm으로 높여 15분 더 진탕하였으며, 결과 혼합물의 수분 함량은 대략 6.25% (부피/부피)였다. 바이알을 진탕기에서 꺼내고 침전물을 가라앉혔다. 침전물이 가라앉으면(30 분), 상층액을 제거하고, 원 용매 약 100 ㎕를 남겼다. (약 1 분 동안 온건한 원심분리에 의해 침전물 침강을 빨리 진행할 수 있다) 용매 3 ㎖를 추가로 첨가하고, 혼합물을 안구형 진탕기에서 15 분 동안 진탕하면, 최종 수분 함량이 약 0.2% (부피/부피)가 되었다. 혼합물을 가라앉도록 방치하거나 원심분리하고, 용매 대부분을 제거하여 용매 약 100 ㎕ 중에 염-효소 침전물을 현탁된 상태로 두었다. 현탁액은 그대로 보관하거나 용도에 따라 추가 처리할 수 있다.
또한, 공침전제로서 염화 칼륨, KCl(포화 용액, 281.5 gl-1)을 K2SO4에 대해 상기 기재한 것과 동일한 절차를 따라 검사하였다. 동일한 효소 농도 및 동일한 포화 염 용액 부피를 사용하여 염:효소 몰비를 서브틸리신 -5 중량%에 대응하는 7500으로 하였다. 아세토니트릴(CH3CN)로 침전을 형성시킬 경우, KCl-효소 혼합물은 2개의 액체 상 혼합물을 형성하기 때문에 적합하지 않은 것으로 밝혀졌다.
공침전제로서의 아미노산
알드리히(Aldrich, 영국)로부터 글리신, 라이신, 아르기닌 및 글루탐산을 얻어 공침전제로서의 여부를 검사하였다.
침전
아미노산 공침전제 포화 용액 100 ㎕ 중의 서브틸리신 4 ㎎을 6 ㎖ 1-PrOH에 침전시켰다. 얻어진 현탁액을 원심분리하고(에펜도르프 튜브에 분배, 6 x 1 ㎖), 1-PrOH로 1회 세척하였다(에펜도르프 튜브 한개 당 1 ㎖).
공침전제로서 시그마로부터 입수한 D(+) 트레할로즈(α-D-글루코피라노실-α-D-글루코피라노사이드)를 사용하여 침전된 샘플을 또한 제조하였다. 트레할로즈를 증류수에 용해시켜 포화시키고(-76 gl-1), 상기 기재된 것과 동일한 방법으로 침전을 형성시켰다. 당:단백질의 최종 몰비는 서브틸리신 15%에 대응하는 406이었다.
공침전제-서브틸리신 침전물의 일반적인 외관 및 특성
단백질-공침전제 용액을 유기 용매에 첨가하는 즉시 매우 미세한 백색 침전물이 형성되며; 개개의 입자들은 매우 작아 용매 중에 가라앉히기 위해 일정 시간이 걸렸다. 입자의 크기는 존재하는 단백질 없이 침전된 공침전제(K2SO4, KCl 및 트레할로스)와 달라 보였으며, 이 경우 더 컸다. 어떠한 침전제도 함유하지 않은 단백질 용액을 용매에 첨가하면, 다시 입자 형태가 매우 달라졌으며, 점질의 백색 침전물이 형성되었다. 침전된 K2SO4서브틸리신 입자를 용매 중에 방치했을 때 수주가 지나도 형태나 응집 상태의 뚜렷한 변화가 나타나지 않았다. K2SO4-서브틸리신 공침전물은 pH 7.8의 수용액 또는 수용액 분석을 위한 증류수에 쉽게 재용해될 수 있었다. 용해는 작은 부피의 프로판올 용액(전형적으로 50 ㎕ 미만의 1-프로판올)으로부터 pH 7.8의 완충제 1 ㎖에 용해시키거나 침전물을 건조시키고 수용액에 재용해시킴으로써 수행할 수 있다.
모든 경우에서 공침전제로서 아미노산을 사용하면, 미세한 백색 침전물이 얻어졌다. 전자현미경하에서 글리신 침상 입자가 얻어진 것을 확인하였다.
실시예 2- 다양한 유기 용매에 대한 검사
침전에 대해 검사된 용매들을 표 1에 나타낸다. 이들 용매는 모두 알드리히 캄퍼니(Aldrich, Co.)에서 입수하였으며, 분석/스펙트럼 등급(99+%)이었다.
침전에 사용된 용매의 수분 함량(수분 함량은 메트롬(Metrohm) 684F 전량계(메트롬, 스위스랜드)를 사용하여 칼 피셔 자동 수분 적정법(Karl Fischer automatic water titration)에 의해 분석하였다)
용매 수분 함량(% 부피/부피)
메탄올 0.13
에탄올 0.05
프로판올 0.14
아세토니트릴 0.013
아세톤 0.08
다양한 유기 용매 중에서 공침전제-효소 침전물의 생물활성 측정
서브틸리신 칼스버그와 같은 세린 단백질분해효소 또는 α-키모트립신은 유기 용매 중에 현탁했을 때 촉매 활성을 나타내는 것으로 널리 알려져 있다. 따라서, 이러한 유형의 시스템은 어떻게 단백질의 생물활성이 탈수 공정에 의해 영향을 받는지를 측정하는 편리한 방법으로 사용될 수 있다. 동일한 조건 하에서 여러 용매로부터 단리된 효소-공침전제 침전물의 범위를 분석하면, 어떠한 용매를 사용했을 때 공침전제가 가장 적은 단백질 변성을 초래했는지를 결정할 수 있다. 그밖에도, 상기 결과를 냉동 건조 효소 분말에서 얻은 결과와 비교하였다. 상기 기재한 바와 같이 제조된 효소-공침전제 현탁액을 분석 용매로 1회 헹구어 잔류 침전 용매를 제거한 후 이하 기재되는 바와 같이 분석하였다. 실험 결과는 표 2 및 3에 개시하였다.
촉매 활성 분석은 물의 함량이 조절된 2개 용매(CH3CN 및 n-헥산) 중에서 수행하였다. 기질은 N-아세틸-L-페닐알라닌 에틸 에스테르(10 mM) 및 1-프로판올(1M)이었다. 반응 용매로 CH3CN을 사용하면, 전과 같이 N-아세틸-L-티로신 에틸 에스테르(10 mM) 및 1-프로판올을 선택하였다. 효소 농도는 1 ㎎/㎖였다. 전형적으로 반응 바이알은 테플론으로 라이닝된 4 ㎖ 스크류 캡 바이알에 용매 2 ㎖가 담겨있었다. 반응 바이알을 실험 중에 안구형 진탕기 상에서 대략 250 rpm으로 진탕하였다. 주기적으로 용매 혼합물 50 ㎕을 제거하고, 적절한 용매(450 ㎕)로 희석하였다. 이어서, 이들 바이알을 -4℃에 보관하고, 다음날 기체 크로마토그래피 분석하였다.
건조 n-헥산 중의 서브틸리신 칼스버그 제제의 촉매 활성(침전은 완충제가 존재하지 않는 물 중에 용해된 서브틸리신을 사용하여 섹션 2.0에서와 같이 수행하였다)
공침전제 침전 용매 상대적 효소 활성 비고
없음 없음 1 냉동 건조 분말
K2SO4 아세토니트릴 31.6 포화상태의 염
K2SO4 아세톤 11.6 포화상태의 염
K2SO4 메탄올 7.5 포화상태의 염
K2SO4 에탄올 18.6 포화상태의 염
K2SO4 에탄올 7.1 포화/5
K2SO4 아세토니트릴 1.4 포화/5
KCl 아세톤 10 포화상태의 염
KCl 아세토니트릴 1.7 포화상태의 염
KCl 에탄올 5.58 포화상태의 염
KCl 메탄올 포화상태의 염
KCl 에탄올 7.3 포화/3.8
KCl 아세톤 4.1 포화/3.8
표 2로부터, K2SO4를 공침전제로 사용하면 KCl을 사용했을 때 보다 n-헥산 중에서 촉매 활성이 더욱 증가됨을 알 수 있다. K2SO4를 포화 상태보다 5배 낮은 농도로 사용하면, 활성이 저하되는 것으로 관찰되었다. 또한, 앞서 언급한 바와 같이, 아세토니트릴(CH3CN) 중에서 침전시켰을 때, KCl-효소(수용액)는 2개 상의 혼합물을 형성하였다. 거의 모든 경우에서, 공침전제-효소 침전물은 동결건조 분말 보다 우수한 생물활성을 보였다.
0.5% 물을 함유한 아세토니트릴 중에서 서브틸리신 칼스버그 및 키모트립신 제제의 촉매 활성(효소는 실시예 1에 기재된 바와 같이 완충제 존재 하에 침전시켰다)
공침전제 침전 용매, 세척 용매 상대 비율 비고
없음 없음 <0.01 sub, chy, 동결건조
K2SO4 PrOH, x1 PrOH x1 AcN 4.2 sub, K2SO4, 포화상태
KCl PrOH, x1 PrOH x1 AcN 8.6 sub, KCl 포화상태
KCl PrOH, x1 PrOH x1 AcN 5.6 sub, KCl 포화상태/3.8
K2SO4 PrOH, x1 PrOH x1 AcN 0.8 chy, K2SO4, 포화상태
KCl PrOH, x1 PrOH x1 AcN 0 chy, KCl 포화상태
KCl PrOH, x1 PrOH x1 AcN 1.3 chy, KCl 포화상태/3.8
K2SO4 AcN, x1 AcN 2.1 sub, K2SO4, 포화상태
KCl AcN, x1 AcN 1.3 sub, KCl 포화상태
KCl AcN, x1 AcN <0.4 sub, KCl 포화상태/3.8
K2SO4 AcN, x1 AcN 1.76 chy, K2SO4, 포화상태
KCl AcN, x1 AcN <0.4 chy, KCl 포화상태
KCl AcN, x1 AcN <0.4 chy, KCl 포화상태/3.8
a) chy = 키모트립신, sub = 서브틸리신
표 3으로부터 공침전제-효소 침전물이 동결건조 분말보다 AcN에서 훨씬 더 활성이 큰 것을 알 수 있으며, 이는 생물활성 구조를 더 잘 유지함을 나타낸다.
아미노산 침전물의 활성 분석
상기 기재한 바와 같이 제조한 1 에펜도르프(0.67 ㎎ 효소)로부터 얻은 침전물을 각각의 효소 분석에 사용하였다. 용매로서 아세토니트릴/1% H2O를 사용하며 N-아세틸-L-티로신 에틸 에스테르(10 mM)와 1-프로판올(1 M)의 트랜스에스테르화에 따라 HPLC에 의해 활성을 측정하였다.
도 9는 K2SO4에 비교한 서브틸리신 활성에 대한 다양한 아미노산 공침전제의 효과를 나타낸다. 아르기닌은 초기 전환율을 증가시킨 반면, 글리신과 라이신은 3시간 후 최종 전환율을 약간 증가시켰다. 글루탐산의 경우는 전환이 무척 느렸으며, 동결건조 효소를 사용한 경우에는 1% 미만의 전환율이 관찰되었다. 이 결과는 일반적으로 예상된 것으로 아미노산이 유기 용매 중에서 고체 상태의 산을 베이스로 한 완충제로 작용할 수 있기 때문이다. 라이신과 글리신은 가수분해 부산물에 의해 생성된 양자(proton)를 제거할 수 있다. 글루탐산은 서브틸리신의 양자화 상태를 증가시켜 촉매 활성을 저하시킨다.
실시예 3- K 2 SO 4 -서브틸리신 칼스버그의 재용해 및 수용액에서의 활성
침전된 K2SO4-서브틸리신은 충분히 그리고 빠르게 완충제에 재용해될 수 있는데, 이는 탈수 중에 어떠한 비가역적 변성도 일어나지 않았음을 나타낸다. 수용액에서의 서브틸리신 칼스버그의 활성은 하기 절차를 이용하여 분석하였다. 분석은 가수분해되었을 때 천연색 니트로페놀을 방출하는 ρ-니트로페닐 아세테이트(97%, 알드리히)를 사용하여 수행하였다. 반응속도는 UV 스펙트럼으로 모니터링하였으며, 검색 파장(λ)은 400 ㎚였다. ρ-니트로페닐 아세테이트(97%)(알드리히, 영국) 3 mM 용액 중의 200 ㎕에 1 ㎖ 수정 셀을 넣고, 트리스 버퍼(pH 7.8) 800 ㎕ 및 K2SO4-서브틸리신 분취량(20 ㎕)을 완충 용액(1 ㎎/㎖) 중에 재 용해시켰다.
K2SO4-서브틸리신 침전물을 프로판올 중에 현탁시켜 72 시간 동안 방치하였고 다시 수용액에 재 용해시키면 100% 활성을 유지하는 것으로 밝혀졌다. 2일 동안 공기 건조시켰을 때도 마찬가지로, K2SO4-서브틸리신을 물에 바로 용해시키면 100% 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. ρ-니트로페닐 아세테이트를 이용한 활성의 정성 검사에서도 P2O5(실온) 상에 3주 보관한 후, K2SO4-서브틸리신은 pH 7.8의 완충액에 쉽게 재용해될 수 있으며, 촉매 활성을 유지하고 있는 것으로 나타났다.
실시예 4- 프로판올 중에 침전된 효소의 활성 부위 적정
서브틸리신 칼스버그 약 2 ㎎ 및 2.5 mM 트리스 완충액(pH 7.8) 200 ㎕에 용해된 황산칼륨 약 18 ㎎의 샘플을 실시예 1에 기재된 방법을 이용하여 물 1%를 함유한 프로판올 3 ㎖ 중에서 공침전시켰다. 침전물을 가라앉히고, 용매 대부분을 기울여 따른 후, 샘플을 같은 용매 3 ㎖로 1회 헹구었다. 이어서, 샘플의 반을 프로판올 3 ㎖ 중의 활성 부위 적정 페닐메탄 술포닐 플루오라이드(PMSF)의 10 mM 용액과 함께 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션한 샘풀에서 적정 혼합물 대부분을 기울여 따라내고, 순수한 프로판올 3 ㎖ 분취량으로 3회 세척하였다. PMSF 처리한 샘플과 처리하지 않은 샘플의 촉매 활성을 실시예 3에 기재된 표준 분석법을 이용하여 수용액 중에서 측정하였다. 이어서, 결과를 침전되지 않은 서브틸리신 칼스버그와 비교하였다. 분석에 따르면, 정상적으로 침전된 효소는 >95% 활성을 유지한 반면, PMSF로 처리한 효소는 초기 활성의 <10%을 보였다. 대조 실험에서 세척하는 과정이 과잉의 PMSF를 효과적으로 제거하였으며, 침전물을 물에 다시 용해시키는 중에 유의할 적정이 일어나지 않았음을 나타냈다. 이는 따라서, 촉매 활성이 유실되는 것이 단백질이 탈수되고 용매 중에 현탁되는 동안 PMSF에 의한 효소 활성 부위의 적정에 의해 일어남을 제시한다. 상기 결과로부터 탈수 및 침전 과정 후 침전물 내 서브틸리신 분자의 >90%가 생물학적 활성 구조를 유지하는 것이 입증되었다.
실시예 5 - 투과형 전자현미경
프로판올에 현탁시킨 서브틸리신 칼스버그/K2SO4의 표준 단백질-공침전제 입자의 분취량을 탄소 코팅 전자현미경 그리드에 떨어뜨렸다. 샘플을 공기건조시킨 후 Jeol JEM 1200EX 투과형 전자현미경(제올(Jeol), 일본, 토쿄)을 이용하여 검사하였다.
도 1 및 도 2는 얻어진 전형적인 영상을 나타낸다. 단백질-공침전제가 규칙적인 형상의 결정을 형성한 것을 알 수 있다. 배율막대(각각 500 ㎚ 및 200 ㎚)로부터 단백질-공침전제 입자가 일반적으로 2 ㎛ 미만의 크기를 갖는 것으로 관찰되었다. 고배율 영상에서, 결정 상에 얇은 표면 코팅을 관찰할 수 있었다. 이 층은 결정화 과정 중에 결정 격자로부터 밀려난 단백질의 층으로 이루어진 것으로 보인다. 단백질이 전혀 존재하지 않는다면, 형상은 이와 유사하지만 더 큰 결정이 침전 과정을 통해 얻어질 것이다.
도 3은 염 없이 서브틸리신을 침전시켰을 때 형성된 단백질 응집물을 나타낸다. 이는 서브틸리신을 1-PrOH중에서 K2SO4와 공침전시켰을 때 얻어진 단백질 코팅 결정(도 4 참조)과 쉽교 비교된다. 도 5에서 알 수 있는 바와 같이, 1-PrOH를 서브틸리신 및 K2SO4의 수용액에 첨가하면, 단백질 스트랜드가 염 결정 사이에 부착된 여러 구조가 형성되었다(즉, 단백질이 결정 상에 코팅되지 않음).
실시예 6 - 서브틸리신 및 K2SO4의 혼합물로부터 얻어진 공침전물의 표면 현미경
실시예 1에 기재된 방식으로 서브틸리신 및 K2SO4의 혼합물을 공침전시키면, 전자 현미경으로 상기에서 제시한 바와 같은 넓은 편평한 표면을 갖는 규칙적인 결정이 제공되는 것으로 밝혀졌다. 이는 상세한 표면 지형학을 연구하는 데 사용될 수 있는 주사력현미경(SFM)에 의한 연구에 적합하다. 하층 표면이 편평하다면, 주사력현미경 기술은 표면에 위치한 분자를 연구하는 데도 사용될 수 있다. 이 연구에서는, 디지탈 나노스코프 원자력현미경을 사용하여 탭핑 모드 증폭상 거리 측정법으로 공침전물을 검사하였다. 도 6은 주사 크기 6 ㎛ × 6 ㎛ 및 z-높이 1.5 ㎛로 취한 결정 집합체의 영상을 나타낸다. 결정이 꽤 균일한 크기를 가지며 편평한 평면을 갖는 규칙적인 정제형 형상을 보임을 알 수 있다. 이 배율에서, 단백질 없이 침전시킨 K2SO4에 의해 형성된 결정의 영상도 유사하였다. 이어서 해상도를 높여 단백질이 부재할 때와 존재할 때 침전시킨 각각의 결정의 표면 부분에 대한 영상을 얻었다. 도 7은 단백질 없이 얻은 결정의 400 ㎚ × 400 ㎚ 영역의 대표적인 영상을 나타낸다. 4 ㎚의 z-축 범위로부터 표면이 두드러진 특징이 없으며, 꽤 편평함을 알 수 있다.
도 8은 단백질과 염을 공침전시킴으로써 얻어진 결정의 500 ㎚ × 500 ㎚ 영역의 대표적인 영상을 나타낸다. z-축 높이가 15 ㎚로 증가됨으로써 표면이 매우 거칠다는 것을 바로 알 수 있다. 가까이 관찰해보면 표면이 나노미터 크기의 단백질 입자 층으로 코팅되어 있음을 알 수 있다.
실시예 7 - 인슐린의 침전
소 췌장의 인슐린을 시그마(영국, 제품 번호 I-5500)로부터 입수하였다.
침전
인슐린 2 ㎎을 HCl(0.010 M) 200 ㎕ 중에 용해하고, NaOH(0.010 M) 333 ㎕을 첨가하여 pH를 증가시켰다. 인슐린 용액을 K2SO4 포화용액 150 ㎕와 혼합하고, 1.3% H2O를 함유한 PrOH 5.317 ㎖ 중에서 침전시켰다. 얻어진 현탁액을 원심분리하고, 1-PrOH/1.3% H2O로 1회 세척하였다. 미세 입자는 근본적으로 서브틸리신을 사용하여 얻은 것과 동일한 외관을 가졌다(실시예 1 참조).
인슐린의 원형 2색 스펙트럼
하기 샘플들을 PC 제어 하에 JASCO J-600 스펙트럼편광계에서 측정하였다.
입수한 그대로의 인슐린,
상기 기재한 바와 같이 K2SO4와 공침전한 인슐린
얻어진 스펙트럼은 서로 매우 유사하였으며, 인슐린이 침전 및 재용해 후 그의 고유한 구조를 실질적으로 유지함을 보여주는 문헌의 스펙트럼과도 매우 유사하였다.
실시예 8 - DNA의 침전
대략 13 k염기쌍에 해당하는 평균 분자량 8.6 MDa를 갖는 송아지 흉선으로부터 얻은 초순수 DNA-게놈을 시그마로부터 구입하였다.
침전
DNA 0.5 단위를 100 ㎕ 중에 용해하고, K2SO4 포화 용액 300 ㎕와 혼합하였다. 이를 1-PrOH(사전에 분자체 상에서 건조시킴) 4.5 ㎖에 첨가하여, 바로 미세 침전물을 형성하였다. 현탁액을 600 rpm에서 2 분 동안 진탕하고, 가라앉힌 후, 6000 rpm으로 에펜도르프에서 원심분리하였다. PrOH 상층액을 제거하고, 침전물을 1 mM EDTA 및 1 mM NaCl을 함유한 10 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.8) 1 ㎖에 재용해시켰다.
비교
침전물의 UV 스펙트럼을 1 mM EDTA 및 1 mM NaCl을 함유한 10 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.8) 1 ㎖ 중에 0.5 단위/㎖의 같은 농도로 용해된 원 DNA 샘플과 비교하였다.
시그마로부터 입수한 그대로의 DNA: 260 ㎚에서의 흡광도 = 0.421, 280 ㎚에서의 흡광도 = 0.219.
침전물을 완충액에 재용해시킨 후의 DNA: 260 ㎚에서의 흡광도 = 0.415, 280 ㎚에서의 흡광도 = 0.237.
이는 본 발명의 침전 과정이 DNA가 거의 또는 전혀 유실되지 않는 매우 효율적인 방법임을 나타낸다.

Claims (24)

  1. 공(共)침전제로 된 코어와, 그 코어상에 코팅된 탈수된 생물학적 거대분자를 포함하는, 직경이 50 ㎛ 미만인 수용성 입자.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 공침전제가 부분적으로 결정질인 것을 특징으로 하는 수용성 입자.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 탈수된 생물학적 거대분자가 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 및 핵산으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 수용성 입자.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 직경이 10 ㎛ 미만인 것을 특징으로 하는 수용성 입자.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 공침전제가, 황산칼륨 및 염화칼륨과 같은 무기염; 분자량이 10,000 Da 미만인, 당, 다당, 탄수화물, 폴리올, 및 이들의 유도체와 같은 트레할로즈; 글리신 및 알기닌과 같은 아미노산; 인산수소칼륨, MOPS 및 POPSO와 같은, 산을 베이스로 한 완충제; 베타인과 같은 양성이온 화합물; 콜린 및 벤조산나트륨과 같은 유기염; 스페르미딘 및 그의 염과 같은, 다수의 염기성 기를 갖는 화합물; 시트르산 및 그의 염과 같은, 다수의 산성 기를 갖는 화합물; 담즙산염; 수용성 염료; 극성 또는 이온성 폴리머; 및 극성 또는 이온성 덴드리머(dendrimer)로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 수용성 입자.
  6. 공(共)침전제로 된 코어와, 그 코어상에 코팅된 탈수된 생물학적 거대분자를 포함하는 수용성 입자를 제조하는 방법으로서,
    a) 공침전제와 생물학적 거대분자를 포함하는 수용액을 조제하는 단계;
    b) 공침전제와 생물학적 거대분자를 포함하는 수용액을 과량의 수혼화성 유기 용매와 혼합하여, 공침전제 및 생물활성 분자가 용액으로부터 즉시 공침전하도록 함으로써 상기 입자를 형성하는 단계; 및
    c) 상기 입자를 유기 용매로부터 단리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 수용성 입자 제조방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 공침전제와 생물학적 거대분자를 포함하는 수용액이 생물학적 거대분자를 포함하는 수용액 중에 공침전제를 용해함으로써 조제되는 것을 특징으로 하는 수용성 입자 제조방법.
  8. 제 6 항에 있어서, 공침전제와 생물학적 거대분자를 포함하는 수용액이 수혼화성 유기 용매에 첨가되는 것을 특징으로 하는 수용성 입자 제조방법.
  9. 제 6 항에 있어서, 공침전제:생물학적 거대분자의 몰비가 50 이상인 것을 특징으로 하는 수용성 입자 제조방법.
  10. 제 6 항에 있어서, 상기 공침전제가, 황산칼륨 및 염화칼륨과 같은 무기염; 분자량이 10,000 Da 미만인, 당, 다당, 탄수화물, 폴리올, 및 이들의 유도체와 같은 트레할로즈; 글리신 및 알기닌과 같은 아미노산; 인산수소칼륨, MOPS 및 POPSO와 같은, 산을 베이스로 한 완충제; 베타인과 같은 양성이온 화합물; 콜린 및 벤조산나트륨과 같은 유기염; 스페르미딘 및 그의 염과 같은, 다수의 염기성 기를 갖는 화합물; 시트르산 및 그의 염과 같은, 다수의 산성 기를 갖는 화합물; 담즙산염; 수용성 염료; 극성 또는 이온성 폴리머; 및 극성 또는 이온성 덴드리머(dendrimer)로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 수용성 입자 제조방법.
  11. 제 6 항에 있어서, 상기 유기 용매가 메탄올, 에탄올, 프로판올, 아세토니트릴, 테트라히드로푸란 및 아세톤으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 수용성 입자 제조방법.
  12. 제 6 항에 따른 방법에 의해 얻어지는 입자.
  13. 제 1 항에 따른 입자와 그에 적합한 담체를 포함하는 제약 제제.
  14. 제 1 항에 따른 입자를 포함하는 의학 장치.
  15. 치료에 사용하기 위한 제 1 항에 따른 입자.
  16. 제 1 항에 따른 입자를 포함하는 생체촉매 조제물.
  17. 제 1 항에 따른 입자에 효소가 코팅되어 이루어진 세정제.
  18. 페인트, 니스, 코팅 또는 필름과 관련하여 제 1 항에 따른 입자를 포함하는 보호 또는 방오제.
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 수용액으로부터 생물학적 거대분자를 단리하는 방법으로서,
    a) 단리할 생물학적 거대분자와 공침전제를 포함하는 수용액을 조제하는 단계; 및
    b) 생물학적 거대분자와 공침전제를 포함하는 수용액을 과량의 수혼화성 유기 용매와 혼합하여, 공침전제 및 생물활성 거대분자가 용액으로부터 즉시 공침전하는 동시에, 생물학적 거대분자를 신속하게 탈수시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 수용액으로부터 생물학적 거대분자를 단리하는 방법.
  23. 공침전제로 된 코어와, 그 코어상에 코팅된 탈수된 생물학적 거대분자를 포함하는, 직경이 50 ㎛ 미만인 수용성 입자로서,
    a) 공침전제와 생물학적 거대분자를 포함하는 수용액을 조제하고;
    b) 공침전제와 생물학적 거대분자를 포함하는 수용액을 과량의 수혼화성 유기 용매와 혼합하여, 공침전제 및 생물활성 분자가 용액으로부터 즉시 공침전하도록 함으로써 상기 입자를 형성하고;
    c) 상기 입자를 유기 용매로부터 단리하는 것에 의해 얻어지는 것을 특징으로 하는 수용성 입자.
  24. 삭제
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