CN1213059C - 蛋白质的快速脱水 - Google Patents

蛋白质的快速脱水 Download PDF

Info

Publication number
CN1213059C
CN1213059C CNB008096031A CN00809603A CN1213059C CN 1213059 C CN1213059 C CN 1213059C CN B008096031 A CNB008096031 A CN B008096031A CN 00809603 A CN00809603 A CN 00809603A CN 1213059 C CN1213059 C CN 1213059C
Authority
CN
China
Prior art keywords
coprecipitator
biopolymer
particle
protein
water soluble
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CNB008096031A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1361789A (zh
Inventor
巴里·道格拉斯·穆尔
玛丽·克莱尔·帕克
彼得·詹姆斯·哈林
约安·帕特里奇
霍华德诺曼欧内斯特·史蒂文斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Glasgow
University of Strathclyde
Original Assignee
University of Glasgow
University of Strathclyde
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Glasgow, University of Strathclyde filed Critical University of Glasgow
Publication of CN1361789A publication Critical patent/CN1361789A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1213059C publication Critical patent/CN1213059C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/30—Extraction; Separation; Purification by precipitation
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y15/00—Nanotechnology for interacting, sensing or actuating, e.g. quantum dots as markers in protein assays or molecular motors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/30—Extraction; Separation; Purification by precipitation
    • C07K1/32—Extraction; Separation; Purification by precipitation as complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C30—CRYSTAL GROWTH
    • C30B—SINGLE-CRYSTAL GROWTH; UNIDIRECTIONAL SOLIDIFICATION OF EUTECTIC MATERIAL OR UNIDIRECTIONAL DEMIXING OF EUTECTOID MATERIAL; REFINING BY ZONE-MELTING OF MATERIAL; PRODUCTION OF A HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; SINGLE CRYSTALS OR HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; AFTER-TREATMENT OF SINGLE CRYSTALS OR A HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; APPARATUS THEREFOR
    • C30B29/00—Single crystals or homogeneous polycrystalline material with defined structure characterised by the material or by their shape
    • C30B29/54—Organic compounds
    • C30B29/58—Macromolecular compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C30—CRYSTAL GROWTH
    • C30B—SINGLE-CRYSTAL GROWTH; UNIDIRECTIONAL SOLIDIFICATION OF EUTECTIC MATERIAL OR UNIDIRECTIONAL DEMIXING OF EUTECTOID MATERIAL; REFINING BY ZONE-MELTING OF MATERIAL; PRODUCTION OF A HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; SINGLE CRYSTALS OR HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; AFTER-TREATMENT OF SINGLE CRYSTALS OR A HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; APPARATUS THEREFOR
    • C30B7/00—Single-crystal growth from solutions using solvents which are liquid at normal temperature, e.g. aqueous solutions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Metallurgy (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Paints Or Removers (AREA)
  • Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
  • General Preparation And Processing Of Foods (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及蛋白质包膜的微晶及其制备方法，该蛋白质包膜的微晶具有以下用途：制备用于生物催化剂的酶；制备用于药物制剂的治疗蛋白质；生产含有酶的清洗剂；生产含有具有防护和/或防污性能蛋白质的油漆、清漆、涂料、薄膜等；生产含有蛋白质的薄膜、聚合物、墨水、涂料、电极和/或光学材料，其可用于诊断用具和/或生物传感器；使用蛋白质研究在非水介质中的分子识别、分子粘合、分子印刻或抑制剂粘合，以及制备蛋白质基食品添加剂。

Description

蛋白质的快速脱水
背景技术
本发明涉及含有生物高分子的水溶性粒子，和从水溶液中分离生物高分子同时使蛋白质脱水的方法，提供了蛋白质生物高分子粒子。本发明还涉及与水可混溶的、含有沉淀于其中的蛋白质的有机溶剂。本发明还发现了以下的具体用途：制备用于生物催化剂的酶；制备用于药物制剂的治疗蛋白质；生产含有酶的清洗剂；生产含有具有防护和/或防污性能蛋白质的油漆、清漆、涂料、薄膜等；生产含有蛋白质的薄膜、聚合物、墨水、涂料、电极和/或光学材料，所述的这些材料可用于诊断用具和/或生物传感器；蛋白质用于在非水介质中对分子识别、分子粘合、抑制剂粘合的研究；制备用于食品添加剂的酶。另外，沉淀出来的生物高分子然后可溶解在有机溶剂中，以用于前述的至少一种应用中，和在固态化学中应用，例如制备用于对键合到不溶性载体上的化合物进行粘附，裂解和/或改性的催化剂。
蛋白质有很多的用途，但是一般来说，用于治疗用途时，则需要制备的蛋白质在使用时基本上不含杂质。纯化的方法有许多种，例如差速离心法、选择沉淀法、溶剂抽提法和色谱法。另外在使用前还经常需要对蛋白质进行脱水或干燥，也就是需要脱除蛋白质中的水分，以便更容易处理和/或延长蛋白质的保存期限。
众所周知，典型的蛋白质脱水方法有冷冻干燥技术、真空干燥技术或空气干燥技术。然而，这些技术却存在一些缺点，例如，干燥方法一般时间较长而且费用较高。此外，即使采用冷冻干燥的方法也会降低蛋白质的功能，特别是对于酶和脆性蛋白质。为了保持蛋白质的功能，经常需要另外添加起稳定作用的赋形剂。然而，例如从对于医用蛋白质被调整的角度看，加入稳定化赋形剂本身尤其是不受欢迎的。
US 5,198,353中公开了一种制备固定化酶分散液的方法，其中公开了将聚合物与酶从水溶液中共沉淀出来得到精细分散的酶的方法，该酶可用于水性液体洗涤剂中。通过加入盐或有机溶剂可使聚合物和酶沉淀。当使用有机溶剂作为沉淀剂时，有机溶剂在强烈的搅拌下缓慢地加入到蛋白质/聚合物水溶液中，以使蛋白质沉淀。然而，此种加入方式和有机溶剂的加入量并不足以使蛋白质充分和快速的脱水。
US 5,589,167和US 5,753,219公开了经有机溶剂处理的多肽的赋形剂稳定方法，在该方法中采用多元醇例如海藻糖来稳定干燥的或水溶性的经有机溶剂处理的多肽。然而，该方法并没有提示多元醇可以与蛋白质在有机溶剂中进行共沉淀或对于蛋白质脱水的相关性/重要性。
Randen等(J.Pharm.Pharmcol.，1988， 40，761-766)公开了采用酶与水溶性淀粉进行共沉淀来代替冷冻干燥法。在与有机溶剂丙酮、乙醇或丙醇混合时，其将分子量为12700-100000的淀粉作为磷虾蛋白酶的共沉淀剂。沉淀所得的颗粒为不规则的针形，具有较低的密度，颗粒大小为200-700μm。粒子干燥后须进一步研磨或粉碎处理以获得较均匀的颗粒尺寸分布。
后来，Bustos等(J.Chem.Tech.Biotechnol.，1996，65，193-199)引用Randen等的文章公开了可使用其它聚合物作为共沉淀剂。所公开的聚合物有水解的胶原蛋白、酪蛋白和麦芽糖糊精PSM 10(12,100Mw)和PSM100(100,100Mw)。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种从水溶液中分离蛋白质同时使蛋白质脱水的快速方法。
本发明实施方案的另一个目的是提供生物活性分子包膜的粒子，例如蛋白质/核酸包膜的微晶。
另一方面，本发明提供了一种制备水溶性粒子的方法，包括以下步骤：
a)制备含有共沉淀剂和生物高分子的水溶液；
b)将生物高分子/共沉淀剂溶液与过量的可与水混溶的有机溶剂快速掺合，使共沉淀剂和生物高分子从溶液中立即共沉淀出来，形成所述的粒子；和
c)从有机溶剂中分离出所述的粒子。
应该理解，术语“生物高分子”是指蛋白质、肽、多肽等，或核酸，例如DNA或RNA。下文所涉及的生物高分子一般均是参照蛋白质制备的。然而，应该理解，这种参照与上述其他的生物高分子是可以相同的。
术语“结晶形”是指包含平面的三维形状，因此区别于一般的球形或球状体形状。
应该理解，术语“共沉淀剂”是指在加入有机溶剂时，可与蛋白质一起从溶液中沉淀出来的化合物；术语“共沉淀物”是作为名词使用的，是指生物活性高分子与共沉淀剂的复合物。
从水溶液中分离出的蛋白质可以是任何蛋白质或蛋白质的混合物。典型的蛋白质包括：酶，如枯草杆菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和蛋白酶；血液蛋白，如清蛋白、纤维蛋白原、凝血酶和血液因子；和治疗蛋白，如胰岛素、抗体、血液和转运蛋白、调节蛋白、糖蛋白、脂蛋白、激素和干扰素。
共沉淀剂可以是固态的，例如粉末，其可以溶解在水溶液中。共沉淀剂在溶解于水溶液之前也可以是溶液或悬浮液。优选的共沉淀剂可以是完全饱和的溶液或高浓度的溶液。
共沉淀剂必须充分地溶解在水溶液中，使其在溶液中相对于蛋白质有一个适当的重量分数。所希望的共沉淀剂应该在所选择的溶剂中的溶解度应该大大地低于在水溶液中的溶解度。另外，若想得到较好分离的共沉淀物粒子，则要求共沉淀剂应该是结晶形的，并且具有较高的熔点。所要求的共沉淀剂的浓度是蛋白质在水溶液中的数量和蛋白质分子量的函数。一般而言，在沉淀之前，溶液中共沉淀剂与蛋白质的摩尔比应较高。具体地，共沉淀剂与蛋白质的摩尔比应大于50；优选大于200；更优选大于400。
当暴露于潮湿的环境中时，优选共沉淀剂的固体形式(也可以是其水合物)应该吸很少的水。在用于共沉淀的有机溶剂中，应该优选共沉淀剂具有较低的溶解度。
所选择的共沉淀剂应几乎或基本上不使蛋白质变性。
至少满足部分上述所需性能的共沉淀剂可选择如下：
无机盐，如硫酸钾和氯化钾；
糖、多糖、碳水化合物、多羟基化合物，和它们的衍生物，如海藻糖，其分子量一般小于10000Da；
氨基酸，如甘氨酸和精氨酸；
酸-碱缓冲剂，如磷酸氢钾、MOPS和POPSO；
两性离子化合物，如甜菜碱；
有机盐，如胆碱和苯甲酸钠；
含有多个碱性基团的化合物，如亚精胺和亚精胺盐；
含有多个酸性基团的化合物，如柠檬酸和柠檬酸盐；
胆汁盐；
水溶性染料；
极性或离子聚合物；和
极性或离子树枝形物(dendrimer)。
当将蛋白质-共沉淀剂溶液和与水混溶的有机溶剂或与水混溶的溶剂混合物进行混合时，优选的溶剂或溶剂混合物是可完全与水混溶的。应该指出的是，为了保证蛋白质-共沉淀剂溶液的快速脱水，蛋白质-共沉淀剂溶液优选加入到过量的有机溶剂中，而不是以其它方式加入。从而，可获得重新析出的蛋白质包膜的粒子。与水完全混溶的有机溶剂应大大地过量，使最终得到的溶剂/水溶液的混合物中，水的含量一般要小于30％，优选小于20-10％，最好小于5％(体积百分含量)。因此，优选在最初的有机溶剂中，水的含量应小于10％(体积百分含量)或基本上是干燥的，但并不需要完全干燥。合适的有机溶剂包含甲醇、乙醇、丙醇、乙腈、四氢呋喃和丙酮。在某些情况下，对有机溶剂可采用蛋白质和/或共沉淀剂进行预饱和，以保证在加入水溶液后两组分可共同沉淀出来。
应该理解，术语“掺合”是指在加入水溶液时，使有机溶剂与水溶液混合或搅拌的步骤。这种混合必须是有效的，以使蛋白质在较短的时间内，与有机溶剂和水溶液形成的中间组分的混合物进行充分地接触，例如在25％-60％的溶剂中。本行业的技术人员都会认识到，这种掺合并不意味着将全部的所需量的水溶液快速、完全地、一次性地加入到有机溶剂中，例如可采用滴加的方法。
另外，优选将蛋白质-共沉淀剂的溶液加入到过量的有机溶剂之中。也就是说，将小体积的蛋白质-共沉淀剂溶液加入到大体积的过量有机溶剂中，使蛋白质-共沉淀剂溶液中的水迅速稀释到有机溶剂中，因而可使蛋白质快速脱水，形成蛋白质包膜的粒子。另外，将水溶液加入到有机溶剂中的方法有很多，例如连续通入法、滴加法或喷洒、喷雾法。
沉淀过程的温度控制是可变化的，例如，水溶液和溶剂可被加热或冷却。对于脆性蛋白质，冷却是十分有利的。或者，水溶液混合物和溶剂的温度可以是不同的。例如可控制溶剂的温度低于水溶液混合物的凝固点。而且，压力也可以是变化的，例如高压有利于降低溶剂的挥发度。
在蛋白质-共沉淀剂溶液与过量有机溶剂掺合时，蛋白质和共沉淀剂的沉淀基本上是瞬间发生的。然而，溶剂/水溶液的混合是可以在短时间内连续进行的，例如控制在5-15分钟，以便使尽可能多的蛋白质沉淀出来。
随着时间的进行，共沉淀物被沉淀出来后，需要对蛋白质包膜的粒子进行回收。可采用如下方法进行共沉淀，例如，可采用离心分离和/或过滤的方法来快速地回收已沉淀出的蛋白质包膜的粒子。然后采用简单地干燥方法蒸发残留的溶剂，以对蛋白质包膜的粒子进行干燥，使其不含溶剂。
现已发现，将沉淀出的蛋白质包膜的粒子置于有机溶剂中贮存是十分有利的，经过长时间的存放后，蛋白质仍然很好地保持了活性和稳定性。另外，由于将沉淀的蛋白质保存于有机溶剂中，也可以防止细菌的侵蚀，因此增加了贮存寿命。
如果需要，可将沉淀出的蛋白质包膜的粒子通过进一步采用新鲜有机溶剂洗涤的方法，进一步脱水。
所沉淀出的蛋白质在使用前可重新溶于水溶液中。也可以将所沉淀出的蛋白质直接溶解在有机溶剂中。这需要采用以下试剂，例如：可以采用有机溶解性的离子对试剂，非共价键键合的两性化合物例如非离子洗涤剂，或共价键连接的有机溶解性基团，例如PEG、长链烷基链、树枝形分子或聚合物。
现有技术曾经教导我们，离子对试剂可以用来将酶溶解于有机溶剂中，而离子对的产生使蛋白质溶解在水溶液中。而本发明的方法则在很低水含量的条件下产生离子对，因此会带来一些潜在的优点，例如：不会发生界面蛋白的变性；可以加强静电作用和/或极性作用；有可能直接溶解在极性溶剂中；可采用对水敏感的离子对试剂；可采用不同离子对试剂的混合物；可采用并不干扰离子化过程的固态酸碱缓冲剂来控制蛋白质的离子化态；蛋白质的溶解过程可以在控制水活性的条件下进行；不需要冷冻干燥步骤，并且该溶解过程仅需要简单的设备，因此很容易扩大生产。
本发明的方法也可使存在于水溶液中的可溶于有机溶剂的组分与蛋白质分离。例如：缓冲剂如三羟甲基氨基甲烷(Tris)，其游离碱形式可溶解于有机溶剂如乙醇中，通过沉淀可将其与蛋白质分离。然而，需要通过向水溶液或有机溶剂中加入另一种可溶于有机溶剂的碱的方法，来使所有的缓冲剂转化为游离碱。因此，本发明还公开了一种从蛋白质中除去不需要组分的方法，使不需要组分不与蛋白质一起共沉淀出来，而溶解在有机相中。这可通过在蛋白质沉淀之前，向水溶液或有机溶剂中加入以下添加物的方法来实现，如酸、碱、离子对试剂和螯合剂。
本发明有很多方面的应用。例如，酶-共沉淀剂粒子可用于生物催化剂，特别适用于在低水含量体系、有机溶剂和超临界流动的反应中。
与冻干法获得的粒子相比，本发明方法可得到精细、干燥的酶-共沉淀物粒子，其很好地保持了具有催化活性的酶结构，在低水含量体系、有机溶剂和超临界流动的生物催化作用中显示了突出的优点。其应用包括：精细化工和医药中间体有机合成反应中的生物催化作用、农用化学品、洗涤剂、脂肪、乳化剂、食品、维生素、甜味剂、香料和香水、单体和聚合物以及合成高分子和天然高分子的改进。其他的应用还包括在组合生物催化作用中的应用，例如：新的导向化合物的鉴定、酶催化的固-固态合成反应、肽的合成以及高温和低温的生物催化反应。另外，酶-共沉淀物粒子中的生物催化剂还可以应用于化学品和聚合物的降解反应，例如有毒废物、化学和生化武器、家用和工业垃圾和自然资源中的废物的降解。酶催化的方法与化学方法相比，通常具有区域专一性，结构对映性和立体定向性的优点。
另外，本发明的方法还可以用于药物制剂中具有治疗作用的生物活性分子的制备。
本发明的方法可以制备精细的、干燥的含有蛋白质和共沉淀剂的粒子。因此，本发明的另一个方面是提供水溶性的、结晶形的、直径小于50μm的粒子，该粒子中含有共沉淀剂和脱水生物高分子，该脱水生物高分子位于或接近于粒子的外表面。
应该理解，术语“脱水生物高分子”是指基本上不与水缔合的生物高分子，术语“共沉淀剂”如前所定义。
典型地，所述的脱水生物高分子位于或接近于共沉淀剂的表面。一般来讲，生物高分子经脱水后仍保持或基本保持其原来的结构，即其不会发生不可逆的变性。例如：如果生物高分子是酶时，则希望其保存于溶剂和/或在水溶性介质中再生时仍保持酶的大部分活性。
另外，酶和其他的生化催化剂处于脱水状态时，在低含量水的条件下，如有机溶剂中仍可有效地催化反应。通过在低含量水的有机溶剂中，进行活性中心滴定试验可以探查在水解过程中蛋白质构型的保持程度。
在粒子中共沉淀剂优选为结晶的。结晶的沉淀剂为粒子提供了一个致密中心，而脱水的蛋白质则位于或接近于粒子的表面。这种最低程度的扩散限度使生物高分子的脱水状态很容易接近如溶剂、反应试剂、基材(培养基)、稳定剂或改性剂。
一般地，粒子的尺寸小于10μm，例如，小于5-1μm。
典型地，共沉淀物内的粒子具有非常均匀的尺寸和十分规则的结晶形状，例如立方体、菱形、片状和针形。共沉淀物的结晶形状随共沉淀剂和蛋白质的不同而变化。结晶形粒子所具有的平面表面使其非常适合于进行扫描探测显微镜和表面张力显微镜，例如原子力显微镜。使用上述的技术可以记录脱水蛋白质在粒子表面的图象，并可探测其分布、组织和结构。这种技术也可以用来探测蛋白质如膜蛋白的三级和四级结构，而采用X-射线晶体学是很难获得这种结构的。
应该理解，采用多种多样的如前所述的共沉淀剂均可以产生共沉淀物结晶。
一般地，这些粒子可以迅速地重新溶解在水溶液中或很容易地形成悬浮液，也可以采用如移液管(手动的或自动的)将其重新分散，因此对于医学用途来说，这些粒子作为复配蛋白质的起点是有吸引力的。如果使用治疗蛋白，这些粒子可以应用于制药的多种形式的生产中，其包括：片剂、膏状物、粉末、胶体、泡沫、气雾剂、悬浮液、绷带和膜片。生物高分子包膜的粒子非常适于在粘膜表面上的运输，因此适于通过吸入法给药。其粒子的尺寸大小非常适于通过吸入法进行肺部的给药，以达到肺脏中较低的肺泡区域，以利于血液的吸收，这样使对药物的吸收最为有效。对于此种应用，最适宜的粒子尺寸为0.5-5μm。需要时也可将蛋白质-共沉淀剂粒子与外加的赋形剂进行混合，所述赋形剂可起到例如填充剂、松散剂和/或粘合剂的作用。还可将该粒子作为原料进一步进行加工，包括采用天然和合成的高分子对其进行包封以生产珠子、薄膜、纤维、绷带和胶布。也可采用对粒子表面的包膜来改变其溶解性、加工性和分散性。使用包膜后可以改变药的释放速度和改变粒子的表面性能。
本发明的方法还可以生产含有酶的清洗剂。
如前所述，本发明的方法可以制备精细的、干燥的含蛋白质和共沉淀剂的粒子，该粒子可以快速地重新溶解在水溶液中，因此该方法对于制备含酶的清洗剂也同样是具有吸引力的。作为清洗应用时，可将酶结合进入片剂、膏状物、粉末、胶体、泡沫、气雾剂和悬浮液中。需要时也可将蛋白质-共沉淀剂粒子与外加的赋形剂进行混合，所述赋形剂可起到例如填充剂、松散剂和/或粘合剂的作用。实例包括：a)制备可清洗隐形眼镜的含酶如蛋白酶或过氧化物酶的片剂，和b)制备含酶如蛋白酶、脂肪酶或纤维素酶的片剂、粉末或悬浮液，这些酶包含在用于对织物或洗碗机的洗涤粉末中。还可将该粒子作为原料进一步进行加工，包括采用天然和合成的高分子对其进行包封。可采用对粒子表面的包膜来改变粒子的溶解性、加工性和分散性。包膜也可用来改变粒子的表面性能和改变粒子在溶剂中的性能或在水中的悬浮性能。
本发明的方法也可以用于生产油漆、清漆、涂料和薄膜，其含有起防护或防污作用的蛋白质。
可将精细的蛋白质—共沉淀剂粒子分散于载体介质中以制备涂料、清漆、涂层和薄膜，其分散方法类似于染料的分散。如果采用酶如蛋白酶、脂肪酶或纤维素酶，则可使所得的涂料具有防污性能以防止活性生物体如细菌、酵母、真菌、微生物和软体动物的附着。
采用本发明的方法，也可以制备含有蛋白质的薄膜、聚合物、墨水、涂料、电极和光学材料，它们可用于诊断用具和生物传感器。
本发明精细的蛋白质—共沉淀剂粒子可分散于载体介质如涂料或墨水中，和用于制备测试带上的薄膜或涂层、电极或光学材料。这些材料可用作诊断用具和生物传感器中的活性元件。
另外，根据本发明方法制备的蛋白质—共沉淀剂粒子还可以应用于在非水介质中对分子识别、分子粘合、分子印刻和抑制剂粘合的研究。
在蛋白质—共沉淀剂粒子中，蛋白质仍保持了类似原来的结构，酶仍具有高的催化活性。因此，该沉淀物可以用来在非水介质中对分子识别、分子粘合和抑制剂粘合进行定量的研究。例如在医学、鉴定科学和农业等应用中，其也可以用来对抑制剂和基材(培养基)设计的改进。
另外，本发明的蛋白质—共沉淀剂粒子还可以用做蛋白质基食品添加剂。
可以选择对人或动物的摄取或吸收无害的沉淀溶剂和共沉淀剂，使本发明的方法可用来快速和便宜地生产干燥的蛋白质基食品添加剂或药品。
下面将以实施例和参考附图对本发明作进一步地说明。
附图说明
图1是本发明方法分离得到的蛋白质—共沉淀剂粒子的典型透射电镜照片；
图2是图1所示的蛋白质—共沉淀剂粒子的高度放大照片；
图3所示为未加入盐时在1-丙醇中沉淀出的枯草杆菌蛋白酶；
图4所示为在含水26％的1-丙醇中共沉淀出的枯草杆菌蛋白酶；
图5表明了将1-丙醇加入到枯草杆菌蛋白酶和K2SO4水溶液的效果；
图6所示为枯草杆菌蛋白酶包膜K2SO4结晶的AFM照片；
图7所示为无枯草杆菌蛋白酶存在时的K2SO4单晶表面的AFM照片；
图8所示为枯草杆菌蛋白酶包膜的K2SO4单晶表面的AFM照片；
图9表明了不同氨基酸共沉淀剂对于枯草杆菌蛋白酶活性的影响；
具体实施方式
实施例1枯草杆菌蛋白酶的制备
枯草杆菌蛋白酶Carlsberg(VIII型：细菌，从地衣芽孢杆菌中提取，经结晶和冷冻干燥制得，得自Sigma，Poole，U.K.)。将2mg枯草杆菌蛋白酶(原始样品)溶解在50μl缓冲剂(Tris，10mM，pH7.8)中，并向其中加入150μl共沉淀剂、硫酸钾(K2SO4，120g/l)的饱和溶液。所得溶液中蛋白质的最终浓度为0.37mM，在沉淀物中K2SO4与酶的摩尔比大约为1400，相当于枯草杆菌蛋白酶重量百分含量约为11％。
制备后，立即用移液管将200μl的共沉淀剂-酶溶液移入盛有3ml丙醇的7ml的玻璃小瓶中。采用Gilson微量移液管，分四次将溶液移入(4×50μl)，同时用定轨摇床摇动，摇动速度约为100rpm。水溶液加入到干燥的有机溶剂中会立即产生K2SO4与蛋白质的共沉淀。将盛有非常精细分散的共沉淀剂-酶颗粒的反应瓶盖上盖子，并进一步在800rpm摇动速度下搅拌15分钟；所得混合物中水的含量大约为6.25％(v/v)。从搅拌器上取下反应瓶，使沉淀物沉降。沉淀物沉降后(约30分钟)，移出上层清液，留下约100μl的有机溶剂。(可采用轻度的离心作用加速沉降约1分钟)。再向反应瓶中加入3ml的溶剂，并将混合物在定轨摇床上摇动15分钟，最终水的含量约为0.2％(v/v)。将混合物沉降或离心沉降，移出大部分的有机溶剂，剩下盐-酶的沉淀物，其悬浮在大约100μl的溶剂中。根据应用需要，将该悬浮液贮存或进一步处理。
也可采用氯化钾KCl(饱和溶液，281.5g/l)作为共沉淀剂，并按照上述K2SO4的相同的方法进行试验。采用相同的酶浓度和相同的饱和盐溶液体积，最终盐与酶的摩尔比大约为7500，相当于枯草杆菌蛋白酶重量百分含量约为5％。试验发现，由于形成了两液相的混合物，因此加入乙腈(CH3CN)之中并不适合KCl-酶混合物的沉淀。
氨基酸作为共沉淀剂
采用得自Aldrich U.K.的甘氨酸、赖氨酸、精氨酸和谷氨酸作为共沉淀剂进行试验。
沉淀
将在100μl氨基酸共沉淀剂的饱和溶液中的4mg枯草杆菌蛋白酶加入到6ml丙醇中进行沉淀。将所得到的悬浮液进行离心分离(分装在Eppendorf试管中，6×1ml)，然后用1-丙醇洗涤一次(每一个Eppendorf试管中加入1ml 1-丙醇)。
沉淀物样品也可以采用D(+)海藻糖(α-D-吡喃葡糖-α-D-吡喃葡糖苷)(Sigma，Poole，U.K.)作为共沉淀剂来制备。将海藻糖溶解于蒸馏水中制成饱和溶液(约76g/l)，采用上述相同的方法进行制备。最终糖与蛋白质的摩尔比为406，相当于枯草杆菌蛋白酶重量百分含量约为15％。
共沉淀剂-枯草杆菌蛋白酶沉淀物的一般外观和性能
当蛋白质-共沉淀剂溶液加入到有机溶剂中后立即形成非常细的白色沉淀，每一个沉淀粒子都非常小，在溶剂中经过一定的时间后会沉淀下来。其粒子大小与无蛋白质存在时共沉淀剂沉淀物(如K2SO4、KCl和海藻糖)的颗粒尺寸有明显的差别，无蛋白质存在时共沉淀剂沉淀物的颗粒尺寸较大。如果将不含有共沉淀剂的蛋白质溶液加入到溶剂中，则所得的沉淀物的颗粒形态也非常不同，为纤维状的白色沉淀物。沉淀出来的K2SO4-枯草杆菌蛋白酶的粒子在溶剂中保存几个星期后，其颗粒形态或聚集没有明显地变化。K2SO4-枯草杆菌蛋白酶的共沉淀物可很容易地重新溶解在pH值为7.8的水溶液中或蒸馏水中，以在水溶液中进行分析。
就一切情况而论，采用氨基酸作为共沉淀剂均可以得到很细的白色沉淀物。电镜显示，得到的是具有甘氨酸的针形粒子。
实施例2不同有机溶剂的试验
表1给出了迄今为止用于沉淀试验的溶剂种类。这些溶剂均为Aldrich公司的产品，并且是分析/光谱级产品(99+％)。
            表1用于沉淀的溶剂的水含量。
采用卡尔·费歇尔自动水滴定法、使用Metrohm 684F
库仑仪(Metrohm，瑞士)测定水含量
    溶剂     得到的水含量(％w/w)
    甲醇     0.13
    乙醇     0.05
    丙醇     0.14
    乙腈     0.013
    丙酮     0.08
测定采用不同有机溶剂制备的共沉淀剂-酶的生物活性
众所周知，丝氨酸蛋白酶例如枯草杆菌蛋白酶Carlsberg或α-胰凝乳蛋白酶在悬浮于有机溶剂时具有催化活性。这种体系可以很方便地用于测定脱水过程对于蛋白质生物活性的影响。通过在相同条件下对一系列从不同溶剂中分离出的酶-共沉淀剂沉淀物的测试，可以测定出哪些溶剂和共沉淀剂可最小程度地使蛋白质变性。另外，可将其结果与通过冷冻干燥法获得的酶颗粒进行比较。将按上述制备的酶-共沉淀剂悬浮液用测试溶剂洗涤一次，以清除残留的沉淀溶剂，然后按下述方法进行测试。测试结果见表2和表3。
在两种不同的、并控制水含量的溶剂(CH3CN和正己烷)中，测定催化活性。培养基是N-乙酰基-L-苯丙氨酸乙酯(10mM)和1-丙醇(1M)。采用CH3CN作为反应溶剂，选择如前所述的N-乙酰基-L-酪氨酸乙酯(10mM)和1-丙醇(1M)作为培养基。酶的浓度为1mg/ml。典型地，在配有螺旋盖和四氟乙烯垫的4ml反应瓶中装有2ml溶剂。在试验过程中，将反应瓶置于定轨摇床上进行摇动，摇动速度约为250rpm。定时地，将50μl溶剂混合物移出，并用适当的溶剂进行稀释(450μl)。然后将这些反应瓶在-4℃下存放，以备以后进行气相色谱分析(G.C.)。
表2在干燥正己烷中制备的枯草杆菌蛋白酶Carlsberg的催化活性。沉淀是按2.0部分所述进行的，但采用溶解于水中的枯草杆菌蛋白酶，而不使用缓冲剂。
    共沉淀剂     沉淀溶剂   相对的酶活性     注释
    无     无     1 经冷冻干燥的粉末
    K2SO4     乙腈     31.6     饱和盐
    K2SO4     丙酮     11.6     饱和盐
    K2SO4     甲醇     7.5     饱和盐
    K2SO4     乙醇     18.6     饱和盐
    K2SO4     乙醇     7.1     饱和/5
    K2SO4     乙腈     1.4     饱和/5
    KCl     丙酮     10     饱和盐
    KCl     乙腈     1.7     饱和盐
    KCl     乙醇     5.58     饱和盐
    KCl     甲醇     饱和盐
    KCl     乙醇     7.3     饱和/3.8
    KCl     丙酮     4.1     饱和/3.8
从表2可以看到，通常采用K2SO4作为共沉淀剂时，在正己烷中的活性要高于采用KCl作为共沉淀剂时的活性。而当将K2SO4的浓度降低至其饱和浓度的五分之一时，观察到活性也降低了。另外，如前所述，KCl-酶(水溶液)在乙腈(CH3CN)中沉淀时形成两相的混合物。在几乎所有的情况下，共沉淀剂-酶沉淀物的生物活性均高于冷冻干燥得到的粉末。
表3在含0.5％水的乙腈中制备的枯草杆菌蛋白酶Carlsberg和胰凝乳蛋白酶的催化活性，所述酶是按实施例1所述的方法，在缓冲剂存在下沉淀得到的。
  共沉淀剂     沉淀溶剂，洗涤溶剂   相对速率        注释
    无     无     ＜0.01   sub，chy，冻干法
    K2SO4     丙醇，×1丙醇×1乙腈     4.2   sub，K2SO4，饱和
    KCl     丙醇，×1丙醇×1乙腈     8.6   sub，KCl，饱和
    KCl     丙醇，×1丙醇×1乙腈     5.6   sub，KCl，饱和/3.8
    K2SO4     丙醇，×1丙醇×1乙腈     0.8   chy，K2SO4，饱和
    KCl     丙醇，×1丙醇×1乙腈     0   chy，KCl，饱和
    KCl     丙醇，×1丙醇×1乙腈     1.3   chy，KCl，饱和/3.8
    K2SO4     乙腈，×1乙腈     2.1   sub，K2SO4，饱和
    KCl     乙腈，×1乙腈     1.3   sub，KCl，饱和
    KCl     乙腈，×1乙腈     ＜0.4   sub，KCl，饱和/3.8
    K2SO4     乙腈，×1乙腈     1.76   chy，K2SO4，饱和
    KCl     乙腈，×1乙腈     ＜0.4   chy，KCl，饱和
    KCl     乙腈，×1乙腈     ＜0.4   chy，KCl，饱和/3.8
a)chy＝胰凝乳蛋白酶，sub＝枯草杆菌蛋白酶
从表3可以看到，在乙腈中共沉淀剂-酶沉淀物的活性大大地高于冷冻干燥法得到的粉末，而且也显示了较好的生物活性构造保持力。
氨基酸沉淀物的活性测定：
使用前述制备的每一个Eppendorf反应瓶(0.67mg酶)的沉淀物用来测试每一种酶的活性。以乙腈/1％H2O为溶剂，N-乙酰基-L-酪氨酸乙酯(10mM)和1-丙醇(1M)进行酯交换以后，用HPLC测定活性。
图9所示为各种氨基酸共沉淀剂与K2SO4相比，对枯草杆菌蛋白酶活性的影响。精氨酸可提高初始速率，而甘氨酸和赖氨酸在3小时后可略微提高最终的转化速率。谷氨酸的转化速率较低，而采用冻干法制备酶的转化速率则小于1％。所得到的结果可认为在有机溶剂中，氨基酸可能起到了一种固态酸-碱缓冲剂的作用。赖氨酸和甘氨酸通过副产物的水解作用可以吞掉质子。而谷氨酸则增加了枯草杆菌蛋白酶的质子化状态，使催化活性降低。
实施例3 K2SO4-枯草杆菌蛋白酶Carlsberg的重新溶解及其在水溶液中的活性
K2SO4-枯草杆菌蛋白酶的沉淀物可以迅速完全地重新溶解在缓冲剂中，说明在脱水过程中，并没有不可逆的变性发生。用以下方法测试水溶液中枯草杆菌蛋白酶Carlsberg的活性：采用ρ-醋酸硝基苯酯(97％，Aldrich，Poole，U.K.)进行测定，在水解时其可以释放出发色的硝基苯酚。通过紫外光谱仪可以监控反应速度，检测波长(λ)＝400nm。1ml石英杯，含有200μl 3mM的ρ-醋酸硝基苯酯溶液(97％，Aldrich，U.K.)；800μl的tris缓冲剂(pH7.8)和一份K2SO4-枯草杆菌蛋白酶(20μl)重新溶解在缓冲剂溶液中(1mg/ml)。
将K2SO4-枯草杆菌蛋白酶的沉淀物在丙醇中悬浮72小时后，发现当重新溶解在水溶液中时，仍保留100％的活性。同样，将K2SO4-枯草杆菌蛋白酶的沉淀物风干两天后，也可迅速地溶解在水中，并仍具有100％的活性。采用ρ-醋酸硝基苯酯的定性试验也表明，K2SO4-枯草杆菌蛋白酶的沉淀物在P2O5(室温)中贮存3个星期后，很容易地溶解在缓冲溶液(pH7.8)中，并仍保持着催化活性。
实施例4酶沉淀物在丙醇中的活性中心滴定
将约2mg的枯草杆菌蛋白酶Carlsberg和约18mg的硫酸钾溶解在200μl、2.5mM的Tris缓冲剂(pH7.8)中，按实施例1所述的方法，将所得的样品加入含1％水的3ml丙醇中，进行共沉淀。在颗粒沉降后，滗去大部分溶剂，然后用3ml同样的溶剂洗涤沉淀物一次。其中样品的一半，采用10mM甲苯磺酰基氟化物(PMSF)活性中心滴定剂的3ml丙醇溶液培育1小时。然后滗去大部分的滴定剂混合液，将固体物分别用每份3ml的纯丙醇洗涤3次。采用实施例3所述的标准测试方法，分别测定经PMSF处理和未处理样品在水溶液中的催化活性。然后将结果与那些非沉淀的枯草杆菌蛋白酶Carlsberg进行比较。测试结果表明，正常酶沉淀物保留＞95％的活性，而经PMSF处理的酶显示＜10％的最初活性。对照试验表明，洗涤操作有效地除去了过量的PMSF，而将沉淀物重新溶解在水中时，无明显的滴定反应发生。这说明蛋白质在经脱水并在溶剂中悬浮时，其催化活性的降低是由于用PMSF滴定酶活性中心引起的。该试验结果也证明在经过脱水和沉淀后，沉淀物中＞90％的枯草杆菌蛋白酶分子仍保持生物活性构型。
实施例5透射电镜
将标准的枯草杆菌蛋白酶/K2SO4的蛋白质-共沉淀剂颗粒悬浮于丙醇中，并将等量的悬浮液滴在涂碳的电镜栅格上。样品风干后，采用JeolJEM 1200EX透射电镜(Jeol Tokyo，日本)进行测试。
图1和2给出了所获得的典型的透射电镜照片。从照片中可以看到，蛋白质-共沉淀剂形成了规则形状的结晶。从比例尺(分别为500nm和200nm)中可以观察到，蛋白质-共沉淀剂颗粒的尺寸一般要小于2微米。在高度放大的照片中，可观察到在晶体上有一较薄的包层。可以认为这一包层是由蛋白质层构成的，该蛋白质是在结晶过程中从晶格中脱出的。如果没有任何的蛋白质，通过沉淀步骤也可以得到形状相似，但颗粒较大的结晶。
图3给出了蛋白质的聚集照片，其是在没有盐存在时枯草杆菌蛋白酶沉淀时形成的。它很容易地与蛋白质包膜的晶体(图4)进行比较，图4为枯草杆菌蛋白酶-K2SO4在1-丙醇中形成的共沉淀物。从图5中可以看出，如果将1-丙醇加入到枯草杆菌蛋白酶和K2SO4的水溶液中，则形成了蛋白质链连接在盐结晶之间的不同沉淀物结构(即蛋白质并没有包膜在结晶的表面)。
实施例6采用显微镜观察从枯草杆菌蛋白酶和K2SO4的混合物中得到的共沉淀物的表面
从电子显微镜中可以观察到，按实施例1方法，从枯草杆菌蛋白酶和K2SO4的混合物中得到的共沉淀物具有规则的结晶晶体，晶体表面为较大的平面。因此，非常适用于采用扫描加载显微镜(SFM)方法来研究结晶表面的细致结构。如果结晶的表面是平面，那么扫描加载显微镜(SFM)则也可以用来研究结晶表面上的分子结构。在所述的研究中，还可以采用数字化超高频示波器原子力显微镜来检测共沉淀物，使用螺旋式扩大状态距离测定的方法。图6给出了一堆晶体的照片，其扫描尺寸为6μm×6μm和Z-高度为1.5μm。从图片中可以看到晶体具有非常均匀的尺寸，而且为规则的片状形状，并且具有扁平的表面。从相同比例的照片中可以看到没有蛋白质存在的K2SO4沉淀物的结晶尺寸也十分相似。从高分辨的照片中，可以观察到在蛋白质存在和不存在下K2SO4沉淀物的部分单晶表面。图7为典型的没有蛋白质存在时得到的400nm×400nm的晶体照片。在Z-轴4nm的范围观察，晶体的表面完全没有特征并且非常平坦。
图8为典型的盐与蛋白质共沉淀得到的500nm×500nm晶体的照片。在Z-轴15nm较大的范围内，可直接观察到晶体的表面是非常粗糙的。更近的观察可以发现，晶体的表面被一层纳米级的蛋白质颗粒所包覆。
实施例7胰岛素的沉淀
从英国的Sigma公司购得得自牛胰腺的胰岛素(产品编号I-5500)。
沉淀：
将2mg胰岛素溶解于200μl HCl(0.010M)中，并加入333μl的NaOH(0.010M)来增加pH值。将所得的胰岛素溶液与150μl饱和的K2SO4溶液进行混合，然后加入5.317ml含1.3％水的丙醇中进行沉淀。将所得的悬浮液进行离心分离，并用1-丙醇/1.3％水洗涤一次。得到很细的沉淀物颗粒，在外观上基本上与枯草杆菌蛋白酶沉淀物(见实施例1)相同。
胰岛素的圆二色光谱
在由PC机控制的JASCO J-600旋光分光计上测试下列样品。
从瓶中直接取出的胰岛素
按上述方法制备的胰岛素与K2SO4的共沉淀物
两者所得的光谱谱图十分相近，而且与文献报道的也很相近，这说明经过沉淀和重新溶解后，胰岛素基本上保持了其天然的结构。
实施例8DNA的沉淀
从小牛胸腺提取的超纯的DNA-基因，平均分子量＝8.6MDa，相当于13千碱基对(购于Sigma)。
沉淀：
将0.5单位的DNA溶解于100μl中，并与300μl饱和的K2SO4溶液进行混合，然后加入到4.5ml 1-丙醇(预先用分子筛干燥)中，立即形成很细的沉淀物。将所得的悬浮液在摇动速度为600rpm下摇动2分钟，使其沉降，并在eppendorf中在6000rpm转速下进行离心分离。将含丙醇的上层清液除去，沉淀物重新溶解于1ml的10mM Tris-HCl缓冲剂(10mM，pH7.8)中，该缓冲剂中含有1mM EDTA和1mM NaCl。
比较
将DNA沉淀物和初始的DNA同样溶于1ml的Tris-HCl缓冲剂(10mM，pH7.8)中，该缓冲剂中含有1mM EDTA和1mM NaCl。所得溶液的浓度为0.5单位/ml，将两样品得到的紫外光谱图进行比较。
购于Sigma的从瓶中直接取出的样品：在260nm处的吸收＝0.421，在280nm处的吸收＝0.219；
在缓冲剂中重新溶解的沉淀物样品：在260nm处的吸收＝0.415，在280nm处的吸收＝0.237。
通过以上数据表明，沉淀的方法是非常有效的，DNA的损失很少或没有损失。

Claims (40)

1.小于50μm的水溶性粒子，含有共沉淀剂的核，核上包有脱水的生物高分子。
2.根据权利要求1所述的水溶性粒子，其中所述的共沉淀剂为部分结晶的或完全结晶的。
3.根据前述任一权利要求所述的水溶性粒子，其中所述的脱水生物高分子选自肽、多肽、蛋白质和核酸。
4.根据权利要求1所述的水溶性粒子，其颗粒直径小于10μm。
5.根据权利要求1所述的水溶性粒子，其中共沉淀剂选自：
无机盐；
糖、碳水化合物、多羟基化合物，和它们的衍生物，其分子量一般小于10000Da；
氨基酸；
酸-碱缓冲剂；
两性离子化合物；
有机盐；
含有多个碱性基团的化合物；
含有多个酸性基团的化合物；
胆汁盐；和
水溶性染料。
6.根据权利要求5所述的水溶性粒子，其中无机盐包含硫酸钾和氯化钾。
7.根据权利要求5所述的水溶性粒子，其中糖、碳水化合物、多羟基化合物，和它们的衍生物包含海藻糖。
8.根据权利要求5所述的水溶性粒子，其中氨基酸包含甘氨酸和精氨酸。
9.根据权利要求5所述的水溶性粒子，其中酸-碱缓冲剂包含磷酸氢钾、MOPS和POPSO。
10.根据权利要求5所述的水溶性粒子，其中两性离子化合物包含甜菜碱。
11.根据权利要求5所述的水溶性粒子，其中有机盐包含胆碱和苯甲酸钠。
12.根据权利要求5所述的水溶性粒子，其中含有多个碱性基团的化合物包含亚精胺和亚精胺盐。
13.根据权利要求5所述的水溶性粒子，其中含有多个酸性基团的化合物包含柠檬酸和柠檬酸盐。
14.制备含有共沉淀剂的核，核上包有脱水生物高分子的水溶性粒子的方法，
包括以下步骤：
a)制备含有共沉淀剂和生物高分子的水溶液；
b)将生物高分子/共沉淀剂溶液与过量的可与水混溶的有机溶剂快速掺合，使共沉淀剂和生物高分子从溶液中立即共沉淀出来，形成所述的粒子；和
c)从有机溶剂中分离出所述的粒子。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述的水溶性粒子是直接形成的并且小于50微米。
16.根据权利要求14或15所述的方法，其中所述的包含共沉淀剂和生物高分子的水溶液是通过将共沉淀剂溶解于含有生物高分子的水溶液中制备的。
17.根据权利要求14所述的方法，其特征在于将生物高分子/共沉淀剂溶液加入到可与水混溶的有机溶剂中。
18.根据权利要求14所述的方法，其中共沉淀剂与生物高分子的摩尔比大于50。
19.根据权利要求14所述的方法，其中共沉淀剂选自：
无机盐；
糖、碳水化合物、多羟基化合物，和它们的衍生物，其分子量一般小于10000Da；
氨基酸；
酸-碱缓冲剂；
两性离子化合物；
有机盐；
含有多个碱性基团的化合物；
含有多个酸性基团的化合物；
胆汁盐；和
水溶性染料。
20.根据权利要求19所述的方法，其中无机盐包含硫酸钾和氯化钾。
21.根据权利要求19所述的方法，其中糖、碳水化合物、多羟基化合物，和它们的衍生物包含海藻糖。
22.根据权利要求19所述的方法，其中氨基酸包含甘氨酸和精氨酸。
23.根据权利要求19所述的方法，其中酸-碱缓冲剂包含磷酸氢钾、MOPS和POPSO。
24.根据权利要求19所述的方法，其中两性离子化合物包含甜菜碱。
25.根据权利要求19所述的方法，其中有机盐包含胆碱和苯甲酸钠。
26.根据权利要求19所述的方法，其中含有多个碱性基团的化合物包含亚精胺和亚精胺盐。
27.根据权利要求19所述的方法，其中含有多个酸性基团的化合物包含柠檬酸和柠檬酸盐。
28.根据权利要求14所述的方法，其中有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇、乙腈、四氢呋喃和丙酮。
29.按照权利要求14所述的方法得到的粒子。
30.一种药物制剂，包括权利要求1至5中任何一个或29所述的粒子和与其适合的载体。
31.一种医疗设备，包含与权利要求1至5中任何一个或29所述的与之相关的粒子。
32.权利要求1至5中任何一个或29所述的用于治疗的粒子。
33.一种生物催化剂制剂，包含权利要求1至5中任何一个或29所述的与之相关的粒子。
34.一种清洗剂，包含权利要求1至5中任何一个或29所述的酶包膜的粒子。
35.一种保护剂或防污剂，包含权利要求1至5中任何一个或29所述的粒子，该保护剂或防污剂与油漆、清漆、涂料或薄膜一起使用。
36.权利要求1至5中任何一个或29所述的粒子在制备薄膜、聚合物、墨水、涂料、电极和光学材料中的应用，其可用于诊断用具和生物传感器。
37.权利要求1至5中任何一个或29所述的粒子在非水介质中对分子识别、分子粘合、分子印刻或抑制剂粘合的定量中的应用。
38.权利要求1至5中任何一个或29所述的粒子在用显微镜对大分子结构和/或有机体的扫描探测中的应用。
39.从水溶液中分离生物高分子的方法，包括以下步骤：
a)制备水溶液，该水溶液含有共沉淀剂和需要分离的生物高分子的混合物；和
b)将生物高分子/共沉淀剂溶液与过量的可与水混溶的有机溶剂快速掺合，使共沉淀剂和生物高分子从溶液中立即共沉淀出来，同时生物高分子快速脱水。
40.小于50μm的水溶性粒子，含有共沉淀剂的核，核上包有脱水的生物高分子，通过以下方法制得：
a)制备含有共沉淀剂和生物高分子的水溶液；
b)将生物高分子/共沉淀剂溶液与过量的可与水混溶的有机溶剂快速掺合，使共沉淀剂和生物高分子从溶液中立即共沉淀出来，形成所述的粒子；和
c)从有机溶剂中分离出所述的粒子。
CNB008096031A 1999-05-13 2000-05-15 蛋白质的快速脱水 Expired - Fee Related CN1213059C (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB9910975.3 1999-05-13
GBGB9910975.3A GB9910975D0 (en) 1999-05-13 1999-05-13 Rapid dehydration of proteins

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1361789A CN1361789A (zh) 2002-07-31
CN1213059C true CN1213059C (zh) 2005-08-03

Family

ID=10853279

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB008096031A Expired - Fee Related CN1213059C (zh) 1999-05-13 2000-05-15 蛋白质的快速脱水

Country Status (16)

Country Link
US (2) US7014869B2 (zh)
EP (1) EP1189926B1 (zh)
JP (1) JP4811620B2 (zh)
KR (1) KR100700483B1 (zh)
CN (1) CN1213059C (zh)
AT (1) ATE293634T1 (zh)
AU (1) AU778491B2 (zh)
BR (1) BR0010538A (zh)
CA (1) CA2368824C (zh)
DE (1) DE60019589T2 (zh)
ES (1) ES2241609T3 (zh)
GB (1) GB9910975D0 (zh)
MX (1) MXPA01011561A (zh)
PT (1) PT1189926E (zh)
WO (1) WO2000069887A2 (zh)
ZA (1) ZA200109314B (zh)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0116074D0 (en) * 2001-06-29 2001-08-22 Univ Strathclyde Nanoparticle structures
RU2309160C2 (ru) 2001-10-22 2007-10-27 Домпе фа. р. ма с.п.а. Способ получения микрочастиц белка или полипептида и продукт
GB0300427D0 (en) * 2003-01-09 2003-02-05 Univ Strathclyde Pharmaceutical composition
WO2005000374A1 (ja) * 2003-06-30 2005-01-06 Denki Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha 脊椎・脊髄手術用癒着防止材
US20050186183A1 (en) * 2003-12-08 2005-08-25 Deangelo Joseph Stabilized products, processes and devices for preparing same
GB0416694D0 (en) * 2004-07-27 2004-09-01 Univ Strathclyde Process for preparing microcrystals
CN104758253A (zh) 2006-01-24 2015-07-08 安迅生物制药公司 大分子微球的制备技术
GB0707938D0 (en) 2007-04-25 2007-05-30 Univ Strathclyde Precipitation stabilising compositions
US20090028912A1 (en) * 2007-07-26 2009-01-29 Dave Bakul C Materials for Dissolution-Controlled Release
GB0724498D0 (en) 2007-12-15 2008-01-30 Univ Strathclyde Slow release compositions
EP3121197A1 (en) 2008-11-10 2017-01-25 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating complement-associated disorders
CA2766565A1 (en) 2009-06-23 2010-12-29 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Bispecific antibodies that bind to complement proteins
JP6012473B2 (ja) 2010-01-11 2016-10-25 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 抗ｃｄ２００抗体を用いたヒトの処置における免疫調節効果のバイオマーカー
AU2011245117B2 (en) 2010-04-30 2015-03-12 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Anti-C5a antibodies and methods for using the antibodies
US20140099380A1 (en) 2012-06-28 2014-04-10 Ansun Biopharma, Inc. Microparticle Formulations for Delivery to the Lower and Central Respiratory Tract and Methods of Manufacture
NZ631007A (en) 2014-03-07 2015-10-30 Alexion Pharma Inc Anti-c5 antibodies having improved pharmacokinetics
BR112020001703B1 (pt) 2017-07-27 2024-01-02 Alexion Pharmaceuticals, Inc Solução aquosa estável compreendendo um anticorpo anti-c5, método para produção desta solução, uso da mesma para tratar uma condição associada ao complemento e kit terapêutico compreendendo a mesma
US11802154B2 (en) 2017-12-20 2023-10-31 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Humanized anti-CD200 antibodies and uses thereof
KR102201993B1 (ko) * 2018-07-12 2021-01-12 주식회사 엑스템바이오랩 전자현미경용 그리드 샘플 제작장치
US20220119760A1 (en) 2019-02-05 2022-04-21 Lindy Biosciences, Inc. Isolated cell culture components and methods for isolating the same from liquid cell culture medium

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3796634A (en) * 1970-03-19 1974-03-12 Us Health Education & Welfare Insolubilized biologically active enzymes
JPS5958631U (ja) 1982-10-13 1984-04-17 本田技研工業株式会社 自動二輪車の熱交換器
CA1210328A (en) 1982-12-14 1986-08-26 James J. Capone Method and composition for the evaluation of phagocytic response
US5219554A (en) * 1986-07-03 1993-06-15 Advanced Magnetics, Inc. Hydrated biodegradable superparamagnetic metal oxides
GB8816443D0 (en) * 1988-07-11 1988-08-17 Albright & Wilson Liquid enzymatic detergents
US4994388A (en) * 1988-04-15 1991-02-19 Solohill Engineering, Inc. Collagen-coated polystyrene microcarrier beads
DK171065B1 (da) * 1988-08-24 1996-05-13 Allied Colloids Ltd Flydende enzym-holdig sammensætning og fremgangsmåde til fremstilling af samme
US5219577A (en) * 1990-06-22 1993-06-15 The Regents Of The University Of California Biologically active composition having a nanocrystalline core
US5462751A (en) * 1990-06-22 1995-10-31 The Regeants Of The University Of California Biological and pharmaceutical agents having a nanomeric biodegradable core
US5324649A (en) * 1991-10-07 1994-06-28 Genencor International, Inc. Enzyme-containing granules coated with hydrolyzed polyvinyl alcohol or copolymer thereof
US5328697A (en) * 1992-02-10 1994-07-12 Mallinckrodt Veterinary, Inc. Compositions and processes for the sustained release of drugs
US5916596A (en) * 1993-02-22 1999-06-29 Vivorx Pharmaceuticals, Inc. Protein stabilized pharmacologically active agents, methods for the preparation thereof and methods for the use thereof
RU2143889C1 (ru) 1993-02-23 2000-01-10 Генентек, Инк. Способ стабилизации полипептида, способы получения композиций полипептида и композиции
US5981719A (en) * 1993-03-09 1999-11-09 Epic Therapeutics, Inc. Macromolecular microparticles and methods of production and use
US5994314A (en) * 1993-04-07 1999-11-30 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Compositions and methods for nucleic acid delivery to the lung
US5643605A (en) * 1993-10-25 1997-07-01 Genentech, Inc. Methods and compositions for microencapsulation of adjuvants
US5958458A (en) * 1994-06-15 1999-09-28 Dumex-Alpharma A/S Pharmaceutical multiple unit particulate formulation in the form of coated cores
JP2000506534A (ja) * 1996-03-15 2000-05-30 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ タンパク質含有溶液からのタンパク質の精製方法
US6180389B1 (en) * 1997-01-03 2001-01-30 The Research And Development Institute, Inc. Virion-constrained nanoparticles comprising a plant virion coat protein shell and encapsulated guest molecules
US5997314A (en) * 1997-12-15 1999-12-07 Qualcomm Incorporated Method and apparatus for providing a dual purpose connection for interface with an antenna or connection interface
US6365362B1 (en) * 1998-02-12 2002-04-02 Immunivest Corporation Methods and reagents for the rapid and efficient isolation of circulating cancer cells
CA2361421A1 (en) * 1999-02-03 2000-08-10 Biosante Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic calcium phosphate particles and methods of manufacture and use
DE102004062475A1 (de) * 2004-12-24 2006-07-06 Bayer Healthcare Ag Feste, oral applizierbare pharmazeutische Darreichungsformen mit modifizierter Freisetzung
KR20080098616A (ko) * 2006-02-21 2008-11-11 뉴트리조이, 인크. 향상된 맛을 지닌 단백질 함유 식품 또는 음료를 제조하기 위한 조성 및 제조 방법 및 칼슘과 미량 광물질로 영양 보충된 과일 주스

Also Published As

Publication number Publication date
JP2003505342A (ja) 2003-02-12
EP1189926B1 (en) 2005-04-20
US7014869B2 (en) 2006-03-21
DE60019589D1 (de) 2005-05-25
PT1189926E (pt) 2005-09-30
KR100700483B1 (ko) 2007-03-28
US20060120992A1 (en) 2006-06-08
AU778491B2 (en) 2004-12-09
CA2368824A1 (en) 2000-11-23
US20020168414A1 (en) 2002-11-14
ZA200109314B (en) 2003-02-12
MXPA01011561A (es) 2002-11-07
WO2000069887A3 (en) 2001-08-02
ATE293634T1 (de) 2005-05-15
ES2241609T3 (es) 2005-11-01
EP1189926A2 (en) 2002-03-27
AU4933600A (en) 2000-12-05
GB9910975D0 (en) 1999-07-14
BR0010538A (pt) 2002-02-19
CA2368824C (en) 2011-08-02
WO2000069887A2 (en) 2000-11-23
JP4811620B2 (ja) 2011-11-09
KR20020019913A (ko) 2002-03-13
CN1361789A (zh) 2002-07-31
DE60019589T2 (de) 2006-03-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1213059C (zh) 蛋白质的快速脱水
Xiang et al. Covalent immobilization of lipase onto chitosan-mesoporous silica hybrid nanomaterials by carboxyl functionalized ionic liquids as the coupling agent
CN1177884C (zh) 球状线性的含多糖的微粒
Zhang et al. Surface topography, nano-mechanics and secondary structure of wheat gluten pretreated by alternate dual-frequency ultrasound and the correlation to enzymolysis
CN1178980C (zh) 一种制备球形微颗粒的方法和由所述方法获得的微颗粒
CN1152135C (zh) 酶的固定化方法
JP6810050B2 (ja) 微粒子
JP2010521146A (ja) 発酵ブロス中のプロテアーゼ結晶の可溶化
JP2012532860A (ja) 架橋されたタンパク質ナノ結晶、架橋されたタンパク質ナノ凝集体およびそれらの調製方法
Boulos et al. Unravelling the structure and function of human hair
CN1216047A (zh) 抗细菌和抗真菌的肽
Rezakhani et al. Immobilization of protease in biopolymers (mixture of alginate-chitosan)
CN1207327C (zh) 一种制备完全或部分由至少一种水不溶性含支链聚葡聚糖组成的球形微颗粒的方法,和可由所述方法获得的微颗粒
CA2131637A1 (fr) Procede de synthese enzymatique d'esters alkyliques de peptides, produits ainsi obtenus et utilisation desdits produits
CN1261271A (zh) 多肽、蛋白和核酸的稳定的药用施用形式
Cao et al. Redox modulated hydrogelation of a self-assembling short peptide amphiphile
Poojari et al. Immobilization and activity of pepsin in silicone elastomers
RU2420580C2 (ru) Способ преобразования водорастворимых активных белков в гидрофобные активные белки, их применение для получения мономолекулярных слоев ориентированных активных белков и устройства, включающие водорастворимые активные белки, преобразованные в гидрофобные активные белки
CN109896638B (zh) 微囊藻毒素降解酶在降解节球藻毒素中的应用
CN113501860B (zh) 一种可组装的纳米液态金属颗粒及其制备方法和应用
CN117510582A (zh) 一种自组装多肽及其在制备治疗炎症药物中的应用
CN118475248A (zh) 生产具有改善的流动性的生物质颗粒的方法
EP0620848A1 (en) Process for dust-free enzyme manufacture
BE804652A (fr) Perfectionnements relatifs a des enzymes immobilisees

Legal Events

Date Code Title Description
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C06 Publication
PB01 Publication
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20050803

Termination date: 20160515

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee