CA2131637A1 - Procede de synthese enzymatique d'esters alkyliques de peptides, produits ainsi obtenus et utilisation desdits produits - Google Patents
Procede de synthese enzymatique d'esters alkyliques de peptides, produits ainsi obtenus et utilisation desdits produitsInfo
- Publication number
- CA2131637A1 CA2131637A1 CA002131637A CA2131637A CA2131637A1 CA 2131637 A1 CA2131637 A1 CA 2131637A1 CA 002131637 A CA002131637 A CA 002131637A CA 2131637 A CA2131637 A CA 2131637A CA 2131637 A1 CA2131637 A1 CA 2131637A1
- Authority
- CA
- Canada
- Prior art keywords
- alcohol
- peptides
- agents
- enzyme
- product
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Abandoned
Links
Classifications
-
- D—TEXTILES; PAPER
- D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- D06M—TREATMENT, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE IN CLASS D06, OF FIBRES, THREADS, YARNS, FABRICS, FEATHERS OR FIBROUS GOODS MADE FROM SUCH MATERIALS
- D06M15/00—Treating fibres, threads, yarns, fabrics, or fibrous goods made from such materials, with macromolecular compounds; Such treatment combined with mechanical treatment
- D06M15/01—Treating fibres, threads, yarns, fabrics, or fibrous goods made from such materials, with macromolecular compounds; Such treatment combined with mechanical treatment with natural macromolecular compounds or derivatives thereof
- D06M15/15—Proteins or derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
- A23J3/00—Working-up of proteins for foodstuffs
- A23J3/30—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis
- A23J3/32—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis using chemical agents
- A23J3/34—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis using chemical agents using enzymes
- A23J3/341—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis using chemical agents using enzymes of animal proteins
- A23J3/342—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis using chemical agents using enzymes of animal proteins of collagen; of gelatin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
- A23J3/00—Working-up of proteins for foodstuffs
- A23J3/30—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis
- A23J3/32—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis using chemical agents
- A23J3/34—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis using chemical agents using enzymes
- A23J3/346—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis using chemical agents using enzymes of vegetable proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
- A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
- A23L33/18—Peptides; Protein hydrolysates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/20—Reducing nutritive value; Dietetic products with reduced nutritive value
- A23L33/21—Addition of substantially indigestible substances, e.g. dietary fibres
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
- A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
- A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
- A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
- A61K8/645—Proteins of vegetable origin; Derivatives or degradation products thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
- A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
- A61K8/65—Collagen; Gelatin; Keratin; Derivatives or degradation products thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
- A61Q19/00—Preparations for care of the skin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
- A61Q19/00—Preparations for care of the skin
- A61Q19/10—Washing or bathing preparations
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
- A61Q5/00—Preparations for care of the hair
- A61Q5/12—Preparations containing hair conditioners
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/12—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by hydrolysis, i.e. solvolysis in general
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
- C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
- C11D1/00—Detergent compositions based essentially on surface-active compounds; Use of these compounds as a detergent
- C11D1/02—Anionic compounds
- C11D1/32—Protein hydrolysates; Fatty acid condensates thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21014—Microbial serine proteases (3.4.21.14)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21062—Subtilisin (3.4.21.62)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/22—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
- C12Y304/22002—Papain (3.4.22.2)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Birds (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Textile Engineering (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Cosmetics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
2131637 9318180 PCTABS00163 L'invention concerne un procédé de synthèse enzymatique d'esters alkyliques de peptides comprenant la mise en contact simultanée d'un substrat protéique d'origine animale ou végétale avec, d'une part, au moins une enzyme ayant à la fois une activité protéolytique et une activité estérolytique sur des protéines ou sur des peptides et, d'autre part, avec au moins un alcool, ledit alcool étant soit entièrement miscible à l'eau, soit au moins partiellement soluble dans l'eau, caractérisé en ce que la mise en contact simultanée du substrat protéique, de l'enzyme et de l'alcool s'effectue à un pH permettant la formation d'esters alkyliques de peptides.
Description
` 2131637 PROCEDE DE 8YNT~E~E ENZYMATIO~E D'E8TER~ AL~Y~IQ~E~ DE
PEPTIDE8, PROD~ITS AINgI OBTENUS ET ~TI~S~TION
DE8DITS PROD~IT8 .
La presente invention concerne un procede de synthese enzymatique, dit procede d'alcoolyse enzymatique de proteines, permettant d'obtenir des esters de peptides. L'invention concerne egalement les produits o~tenus par le procede, ainsi que l'utilisation de ces produits en tant qu'addi~ifs et ingredients dans des produits agroalimentaires, cosmetologiques et pharmaceutiques et chi~iques.
En raison de leur a~ondance et de leur propriet s interessantes, les proteines d'origine ani~ale (collagene, caseine, gelatine, etc...) et vegetale, et leurs dérivés peptidiques constituent d'excellentes matieres premieres pour les industries chimiques, agroalimentaires, pharmaceutiaues e~ cosme'iques.
Par exemple, la demande de ~revet inte~nat ona1 wo-~-so/o3l23 décrit la fabrication de mic.opa-ticules de proteines, destinees a être utilisee- co,-.~e su~stituts de graisses dans des produits alimentaires.
Les microparticules sont fabriquees par l'addi~ion d'une solution de proteines hydrophobes, par exe~ple une prolamine, en milieu alcoolique, a un mi1ieu aqueux. La protéine est precipitee sous forme de mi~roparticules. Avant d'etre mise en con~ac~ avec le milieu aqueux, la proteine peut etre sou~ise a une hydrolyse enzymatique. Dans ce cas, ies microparticules sont constituees de polypeptiàes ayan une masse molaire d'environ l 000 daltons.
En cosmetique, des preparations de pep~ des sont recherchées pour leur pouvoir emulsifiant, leu~
pouvoir de rétention d'e,au, leur efCe~ cond~~ionneu 21316:~7 `
pour les shampooings et leur pouvoir adoucissant. Les peptides utilises ont une masse molaire le plus souvent inferieure ~ lO 000 et plut~t inferieure à
5 000. Ils sont obtenus generalement par voie enzymatique.
L'emploi de protéines d'origine végetale en cosmetique est particulierement recherche.
Par exemple, l'utilisation de peptides de gluten de masse molaire inferieure a lO 000, preférentiellement comprise entre 3 000 et 5 000, a eté proposée en raison de leur pouvoir de retention d'eau et leur effet conditionneur (JP-63253012). De tels peptides sont obtenus par hydrolyse enzymatique a l'aide d'Alcalase, de pepsine ou de la protease acide d'AsDerqillus niaer.
Des esters de peptides ont été ~galement proposes pour des applications cosmétiques tJP-60057043, JP-60097042, JP-60084209). Ces esters de peptides sont obtenus par la condensation d'un peptide avec un ester gras ou polyhydroxylé d'un acide aminé, catalysée par une protéase a cysteine ( C 3.4.22).
Bien que les procedes décrits jusqu'a ce jour pour la fabrication de dérivés de protéines soi~nt relativement efficaces, ils présentent neanmoins certains inconvénients. Par exemple, l~ contamination microbienne du milieu reactionnel po~e souvent un probleme, les conditions opératoires favorisant la croissance de micro-organismes. En outre, lors diune hydrolyse en milieu aqueux, la masse molaire du produit est difficile a contrôler et la reaction aboutit souvent a des produits de masse molaire inférieure a celle désirée.
Le procédé de l'invention a donc eté elaboré dans le but de mettre au point un procédé économique permettant de valoriser des proteines d'origine W0~3/18180 PCT/FRg3/00213 213163~
vegetale et animale, même dans un etat brut, pour la fabrication de peptides et d'esters de peptides, ~out en minimisant le risque de contamination microbienne du milieu.
Les inventeurs ont mis au point un procede de traitement de su~strats proteiques qui se deroule dans un milieu alcoolique et qui est catalyse par une enzyme a la fois protéolytique et esterolytique.
L'activite estérase de certaines enzymes connues pour leur capacite a hydrolyser des liens peptidioues (peptides hydrolases, EC 3.4.) se caracterise par la possibilite de catalyser l'hydrolyse de liens es.e-s alkyliques d'acides amines ou de peptides de synthese presents à faible concentration dans une solu__on aqueuse tamponnée.
Les inventeurs ont constate que certaines en~y~es qui présentent a la fois une activite de protease et d'esterase, conduisent a la synthese d'este-s de peptides lorsque le substrat est un melange de proteines ou de peptides présent en milieu alcool~oue et dans certaines conditions de pH. L'enzyme uti'~se l'alcool a la place de l'eau pour couper le liPn peptidique entre 2 acides amines d'une proté~ne ou d'un peptide, ou est capable de cat31yse~ la condensation d' un peptide par 1'intermediaire de scn groupe carboxyle terminal avec 1'alcool se!on une réac~ion inverse a celle observee lors de 1'hydrol~se d'esters alkyliques de peptides ou d'acides amines.
La reaction enzymatique ou le substrat est un melange de proteines ou de peptides et le co-subs..at est l'alcsol est appelee reaction d'alcoolyse.
En milieu alcoolique et dans certaines conditions de pH, les inventeurs ont observe l'accumulat-on d'esters de peptides : 1'équilibre entre la reac__on de syn~hese d'esters (réaction d'alcoolyse) e, la ~131~3~
reaction d'hydrolyse desdits esters se trouve pousse vers la reaction de synthese.
Dans ces conditions, l'alcool joue le role du substrat et du solvant. En d'autres termes, l'alcool est responsable de la formation d'esters et, en même temps, empêche leur degradation.
Un phénomene similaire a deja éte décrit par Vidaluc et al (Tetrahedron, vol. 39 n- 2, pp 269-~74, 1983). Cet article rapporte la synthese d'esters d'acides aminés a partir d'acides amines en milieu alcoolique catalysee par l'~-chymotrypsine. Ceci etant, la synthese d'esters de peptides a partir de substrats protéiques complexes n'a pas ete decrite. En ef~et, il est tnut a fait surprenant que la réaction de synthese, cat~lysee par 1'enzyme esterolytique et dont les substrats sont normalement des acides amines ou des peptides de petite taille, peut etre effectuee sur un substrat proteique compose de proteines et de polypeptides complexes.
Le produit obtenu par la reaction de l'invention es. un melange de peptides et dlesters de peptides provenant des reactions simultanées d'hydrolyse et d'alcoolyse. Le melange présente des proprietes semblables a cell~s des peptides issus d'une hydrolyse classique, mais ont un caractere hydrophobe plus marqué, ce qui presente un avantage important pour beaucoup d'applications industrielles.
Le milieu alcoolique permet de diminuer les risgues de contamination microbienne et, de plus, de contrôler la masse molaire du produit. Le milieu alcoolique assure aussi une bonne stabilite chimique des substrats comme la glutamine, acide amine majoritaire des protéines vegetales. La réaction est catalysée par des enzymes peu coûteuses et facilement disponibles.
WO93/18180 2131 6 3 7 PCr/FR93/00213 Plus particulièrement, la presente invention concerne un procede de synt~ese enzy~atique d'esters alkyliques de peptides comprenant la mise en contac_ simultanee d'un substrat proteique d'origine animale ou ve~etale avec, d'une part, au moins une enzyme ayant a la fois une activite proteolytique et une activite esterolytique sur des proteines ou sur des peptides et, d'autre part, avec au moins un alcool, ledit alcool etant soit entie_ement misclble a l'eau, soit au moins partiellement solu~le dans l'eau, caracterise en ce que la mise en con~ac~ si~ultanee du substrat protéique, de 1'enzy~e et de 1'alc~ol s'effectue a un pH permet.ant la for~at~on d'es~e_s alkyligues de peptides.
La réaction d'alcoolyse se de-oule se7On le schema suivant :
O O
Il 11 .
~-~-NH-~2 + X-OH ~ 2~ R.~
<--Substrat Alcool rs.e~ de ~ep._de protéique Dans le contexte de la presen~e invent_on, 1'expression "un substrat proteique d'origine ani~.ale ou vegétale" signifie toute source de proteines ou de polypeptides capable de joue- le role de subs.,at pour 1'enzyme proteolytique/estérolytisue. Comme subst-at protéique dlorigine animale, la gelatine ou toute matiere contenant la gelatine est prefe~ee.
Comme substrat protéioue d'or~gine vegetale, on peut citer des proteines provenant de ce-eales telles que le blé, le maïs, l'orge, l'avoine, le ri , le seigle, le sarrasin, le sorgho et le ;-itic~le, ~63~l eventuellement sous forme de grain entier, ou de fractions de grains ou de tout produit issu du broyage du grain, tel que la farine ou la semoule. Les produits issus du broyage du grain sont particulierement preferés.
Le substrat proteique n'est pas necessairement pur et peut etre utilise sous forme de melange ~omplexe associé a des matieres non-proteiques. Ceci est le cas lorsque le substrat proteique est constitue de fractions ou de farine de grains. Il est egalement possible d'utiliser la fraction proteique de la cé-éale, séparee de la fraction non prote.ique. Le gluten de blé est un exemple de ce type de substrat.
Il est particulierement préféré, selon 1'invention, d'utiliser comme substrat les protéines hydrophobes connues sous le nom de "prolamines", par exemple la gliadine, la zeine, l'hordéine et la kafirine. Ces proteines sont insolubles dans l'eau, mais solu~les dans l'alcool, e~ sont un constituant majoritaire des graines de céreales. Le gluten de blé contient par exemple environ 45 ~ de gliadine, et la frac~ion protéique du mais contient environ 60 S de zeine.
Le substrat proteique de la reaction d'alcoolyse peut aussi être une matiere peptidique ou polypeptidique.
Selon cette variante de l'invention, la matiere peptidique peut provenir d`une prehydrolyse partielle d'une matiere protéique. Dans ce cas, la reaction d'alcoolyse est précédée par une étape d'hydrolyse partielle. Les esters de peptides sont alors obtenus par condensation des peptides sur l'alcool. La préhydrolyse partielle peut être effectuee par voie enzymatique, chimique ou thermique~ La voie enzymatique est préférée. Pour le pro~ede d'hydrolyse partielle, il est avantageux de mettre en oeuvre la
PEPTIDE8, PROD~ITS AINgI OBTENUS ET ~TI~S~TION
DE8DITS PROD~IT8 .
La presente invention concerne un procede de synthese enzymatique, dit procede d'alcoolyse enzymatique de proteines, permettant d'obtenir des esters de peptides. L'invention concerne egalement les produits o~tenus par le procede, ainsi que l'utilisation de ces produits en tant qu'addi~ifs et ingredients dans des produits agroalimentaires, cosmetologiques et pharmaceutiques et chi~iques.
En raison de leur a~ondance et de leur propriet s interessantes, les proteines d'origine ani~ale (collagene, caseine, gelatine, etc...) et vegetale, et leurs dérivés peptidiques constituent d'excellentes matieres premieres pour les industries chimiques, agroalimentaires, pharmaceutiaues e~ cosme'iques.
Par exemple, la demande de ~revet inte~nat ona1 wo-~-so/o3l23 décrit la fabrication de mic.opa-ticules de proteines, destinees a être utilisee- co,-.~e su~stituts de graisses dans des produits alimentaires.
Les microparticules sont fabriquees par l'addi~ion d'une solution de proteines hydrophobes, par exe~ple une prolamine, en milieu alcoolique, a un mi1ieu aqueux. La protéine est precipitee sous forme de mi~roparticules. Avant d'etre mise en con~ac~ avec le milieu aqueux, la proteine peut etre sou~ise a une hydrolyse enzymatique. Dans ce cas, ies microparticules sont constituees de polypeptiàes ayan une masse molaire d'environ l 000 daltons.
En cosmetique, des preparations de pep~ des sont recherchées pour leur pouvoir emulsifiant, leu~
pouvoir de rétention d'e,au, leur efCe~ cond~~ionneu 21316:~7 `
pour les shampooings et leur pouvoir adoucissant. Les peptides utilises ont une masse molaire le plus souvent inferieure ~ lO 000 et plut~t inferieure à
5 000. Ils sont obtenus generalement par voie enzymatique.
L'emploi de protéines d'origine végetale en cosmetique est particulierement recherche.
Par exemple, l'utilisation de peptides de gluten de masse molaire inferieure a lO 000, preférentiellement comprise entre 3 000 et 5 000, a eté proposée en raison de leur pouvoir de retention d'eau et leur effet conditionneur (JP-63253012). De tels peptides sont obtenus par hydrolyse enzymatique a l'aide d'Alcalase, de pepsine ou de la protease acide d'AsDerqillus niaer.
Des esters de peptides ont été ~galement proposes pour des applications cosmétiques tJP-60057043, JP-60097042, JP-60084209). Ces esters de peptides sont obtenus par la condensation d'un peptide avec un ester gras ou polyhydroxylé d'un acide aminé, catalysée par une protéase a cysteine ( C 3.4.22).
Bien que les procedes décrits jusqu'a ce jour pour la fabrication de dérivés de protéines soi~nt relativement efficaces, ils présentent neanmoins certains inconvénients. Par exemple, l~ contamination microbienne du milieu reactionnel po~e souvent un probleme, les conditions opératoires favorisant la croissance de micro-organismes. En outre, lors diune hydrolyse en milieu aqueux, la masse molaire du produit est difficile a contrôler et la reaction aboutit souvent a des produits de masse molaire inférieure a celle désirée.
Le procédé de l'invention a donc eté elaboré dans le but de mettre au point un procédé économique permettant de valoriser des proteines d'origine W0~3/18180 PCT/FRg3/00213 213163~
vegetale et animale, même dans un etat brut, pour la fabrication de peptides et d'esters de peptides, ~out en minimisant le risque de contamination microbienne du milieu.
Les inventeurs ont mis au point un procede de traitement de su~strats proteiques qui se deroule dans un milieu alcoolique et qui est catalyse par une enzyme a la fois protéolytique et esterolytique.
L'activite estérase de certaines enzymes connues pour leur capacite a hydrolyser des liens peptidioues (peptides hydrolases, EC 3.4.) se caracterise par la possibilite de catalyser l'hydrolyse de liens es.e-s alkyliques d'acides amines ou de peptides de synthese presents à faible concentration dans une solu__on aqueuse tamponnée.
Les inventeurs ont constate que certaines en~y~es qui présentent a la fois une activite de protease et d'esterase, conduisent a la synthese d'este-s de peptides lorsque le substrat est un melange de proteines ou de peptides présent en milieu alcool~oue et dans certaines conditions de pH. L'enzyme uti'~se l'alcool a la place de l'eau pour couper le liPn peptidique entre 2 acides amines d'une proté~ne ou d'un peptide, ou est capable de cat31yse~ la condensation d' un peptide par 1'intermediaire de scn groupe carboxyle terminal avec 1'alcool se!on une réac~ion inverse a celle observee lors de 1'hydrol~se d'esters alkyliques de peptides ou d'acides amines.
La reaction enzymatique ou le substrat est un melange de proteines ou de peptides et le co-subs..at est l'alcsol est appelee reaction d'alcoolyse.
En milieu alcoolique et dans certaines conditions de pH, les inventeurs ont observe l'accumulat-on d'esters de peptides : 1'équilibre entre la reac__on de syn~hese d'esters (réaction d'alcoolyse) e, la ~131~3~
reaction d'hydrolyse desdits esters se trouve pousse vers la reaction de synthese.
Dans ces conditions, l'alcool joue le role du substrat et du solvant. En d'autres termes, l'alcool est responsable de la formation d'esters et, en même temps, empêche leur degradation.
Un phénomene similaire a deja éte décrit par Vidaluc et al (Tetrahedron, vol. 39 n- 2, pp 269-~74, 1983). Cet article rapporte la synthese d'esters d'acides aminés a partir d'acides amines en milieu alcoolique catalysee par l'~-chymotrypsine. Ceci etant, la synthese d'esters de peptides a partir de substrats protéiques complexes n'a pas ete decrite. En ef~et, il est tnut a fait surprenant que la réaction de synthese, cat~lysee par 1'enzyme esterolytique et dont les substrats sont normalement des acides amines ou des peptides de petite taille, peut etre effectuee sur un substrat proteique compose de proteines et de polypeptides complexes.
Le produit obtenu par la reaction de l'invention es. un melange de peptides et dlesters de peptides provenant des reactions simultanées d'hydrolyse et d'alcoolyse. Le melange présente des proprietes semblables a cell~s des peptides issus d'une hydrolyse classique, mais ont un caractere hydrophobe plus marqué, ce qui presente un avantage important pour beaucoup d'applications industrielles.
Le milieu alcoolique permet de diminuer les risgues de contamination microbienne et, de plus, de contrôler la masse molaire du produit. Le milieu alcoolique assure aussi une bonne stabilite chimique des substrats comme la glutamine, acide amine majoritaire des protéines vegetales. La réaction est catalysée par des enzymes peu coûteuses et facilement disponibles.
WO93/18180 2131 6 3 7 PCr/FR93/00213 Plus particulièrement, la presente invention concerne un procede de synt~ese enzy~atique d'esters alkyliques de peptides comprenant la mise en contac_ simultanee d'un substrat proteique d'origine animale ou ve~etale avec, d'une part, au moins une enzyme ayant a la fois une activite proteolytique et une activite esterolytique sur des proteines ou sur des peptides et, d'autre part, avec au moins un alcool, ledit alcool etant soit entie_ement misclble a l'eau, soit au moins partiellement solu~le dans l'eau, caracterise en ce que la mise en con~ac~ si~ultanee du substrat protéique, de 1'enzy~e et de 1'alc~ol s'effectue a un pH permet.ant la for~at~on d'es~e_s alkyligues de peptides.
La réaction d'alcoolyse se de-oule se7On le schema suivant :
O O
Il 11 .
~-~-NH-~2 + X-OH ~ 2~ R.~
<--Substrat Alcool rs.e~ de ~ep._de protéique Dans le contexte de la presen~e invent_on, 1'expression "un substrat proteique d'origine ani~.ale ou vegétale" signifie toute source de proteines ou de polypeptides capable de joue- le role de subs.,at pour 1'enzyme proteolytique/estérolytisue. Comme subst-at protéique dlorigine animale, la gelatine ou toute matiere contenant la gelatine est prefe~ee.
Comme substrat protéioue d'or~gine vegetale, on peut citer des proteines provenant de ce-eales telles que le blé, le maïs, l'orge, l'avoine, le ri , le seigle, le sarrasin, le sorgho et le ;-itic~le, ~63~l eventuellement sous forme de grain entier, ou de fractions de grains ou de tout produit issu du broyage du grain, tel que la farine ou la semoule. Les produits issus du broyage du grain sont particulierement preferés.
Le substrat proteique n'est pas necessairement pur et peut etre utilise sous forme de melange ~omplexe associé a des matieres non-proteiques. Ceci est le cas lorsque le substrat proteique est constitue de fractions ou de farine de grains. Il est egalement possible d'utiliser la fraction proteique de la cé-éale, séparee de la fraction non prote.ique. Le gluten de blé est un exemple de ce type de substrat.
Il est particulierement préféré, selon 1'invention, d'utiliser comme substrat les protéines hydrophobes connues sous le nom de "prolamines", par exemple la gliadine, la zeine, l'hordéine et la kafirine. Ces proteines sont insolubles dans l'eau, mais solu~les dans l'alcool, e~ sont un constituant majoritaire des graines de céreales. Le gluten de blé contient par exemple environ 45 ~ de gliadine, et la frac~ion protéique du mais contient environ 60 S de zeine.
Le substrat proteique de la reaction d'alcoolyse peut aussi être une matiere peptidique ou polypeptidique.
Selon cette variante de l'invention, la matiere peptidique peut provenir d`une prehydrolyse partielle d'une matiere protéique. Dans ce cas, la reaction d'alcoolyse est précédée par une étape d'hydrolyse partielle. Les esters de peptides sont alors obtenus par condensation des peptides sur l'alcool. La préhydrolyse partielle peut être effectuee par voie enzymatique, chimique ou thermique~ La voie enzymatique est préférée. Pour le pro~ede d'hydrolyse partielle, il est avantageux de mettre en oeuvre la
2 1 31 6 3 7 PCT/FR93/00213 même enzyme proteolytique/esterolytique que celle utilisee ultérieurement dans la reaction d'alcoolyse.
La reaction d'alcoolyse peut ainsi être initiee par la simple addition de l'alcool et l'ajustement du pH aux valeurs permettant la formation stable d'esters. Ceci permet un controle facile du degre d'hydrolyse et evite une hydrolyse totale du substrat proteique. Le substrat peptidique a normalement une masse molaire moyenne de 4 000 à 6 000 Daltons environ. Il s'agit donc de polypeptides de taille moyenne.
Dans tous les cas, le substrat du procéde a une masse molaire moyenne supérieure a l 000 Daltons.
Le substrat proteique peut etre soluble dans l'eau ou soluble dans l'alcool. La reac~_on d'alcoolyse eta~t effectuée dans un milieu alcoolioue, l'utilisation d'une proteine non soluble dans 1'alcool, telle que la gelatine, donne lieu a un milieu reactionnel heterogene. Lorsque le subs~rat est un substrat complexe tel que le gluten, qui est compose de différentes protéines d~nt environ 50 ~
sont solu~les dans l'alcool et ~0 % solubles dans l'eau, le milieu reactionnel est multiphasique.
Selon le procedé de l'invention, le subs~-at proteique d'origine animale ou vegetale est mis en contact avec au moins une enzyme ayant une ac~ivite proteolytique et esterol~tique sur des pr~teines ou sur des peptides. L'enzyme est de préference soit une protéase, soit une carboxypeptidase. Les proteases a serine ou a cystéine respectivement exemplifiees par la -su~tilisine ~provenant de Baclllus SD., de préférence Bacillus licheniformis~, ou la papalne . .
(provenant de latex de papayer) sont particulierement préféxées. L'activité double de protease et d'esterase n'est pas une propriété possédée par toutes les protéases. Ceci étant, en appliquant le tes' déc~~t WO93/18180 ~63~ PCT/FR93/00213 ci-dessous pour détecter la formation d~esters, l'homme de 1'art peut facilement identifier celles qui conviennent au procede de l'invention. L'enzyme peut etre sous forme de preparation enzymatique, par exemple sous forme de melange grossier d'enzyme, tel qu'~n surnageant de culture microbien, ou peut en revanche être sous forme purifiee depourvue de tout autre type d'activité enzymatique et de tout autre contaminant. La preparation enzymati~ue peut aussi être un melange de proteases d'origines différentes, a condition que ces differentes enzymes puissent fonc'ionner ensemble.
Normalement, l'enzyme est utilisée sous forme li~re, mais elle peut aussi etre immobilisée sur un support solide tel que la silice, ou sur des billes ou sur des mem~ranes connues dans l'art. L'immobilisation de 1'enzyme permet d'effectuer le procede de l'invention de maniere continue.
Les conditions operatoires et notamment l~ pH
sont critiques, selon le procede de l'invention, pour l~efCicacite de la réaction d'alcoolyse. Les réactions d'hydrolyse e~ d'alcoolyse se déroulent en parallele, mais dans certaines conditions de pH, les esters ne s'accumulent pas dans le milieu reactionnel. Il existe cependant une gamme de pH a laquelle la formation d'esters est effec~ive. Les inventeurs ont constaté
que, pour une meme enzyme, le pH optimum pour la réaction d'al~oolyse est sensiblement plus bas que le pH optimum pour la réac_ion d'hydrolyse telle ~u'elle est pratiquée conventionnellement en milieu exclusivement aoueux. Par exemple, le pH optimum pour la réaction d'hydrolyse par la subtilisine est autour de pH 8 tandis que le pH optimum pour la réaction d'alcooiyse est autour de pH 5- La papaïne ~ui presente un pH optimum pour la réaction d'hydrolyse WO93/18180 2 1 3 1 ~ 3 7 PCT/FR93/00213 d'environ 7 catalyse la reaction d'alcoolyse entre pH
5 et 7, particulierement autour de pH 6. De maniere generale, le pH doit être acide pour permettre la formation stable d'esters. La mise en contact du substrat proteique avec la subtilisine et l'alcool s'effectue à pH 3 a 8, de preference a pH 4 ~ 6, par exemple pH 5 environ.
Selon la methode de la presente invention, l'homme du metier peut sans difficulté deter~iner le pH auquel la formation d'esters alkyliques de peptide est obtenue. Il suffit d'effectuer le test de déterminatisn de la quantite d'alcool liee au produit par hydrolyse basique du groupe ester decrit dans 1'exemple l ci-dessous. Cette determination est effectuee pour une serie de valeurs de pH differentes et les valeurs qui permettent la formation d'esters alkyliques sont ainsi déterminees. Dans le contexte de la presente invention, le taux d'esterification du produit considere comme significatif est d'au moins lO
% environ. De preference le taux d'esterification est d'au moins 25 % et avantageusement d'au moins ~0 %.
Selon le procede de l'invention, l'alcoolyse est effectuee en mettant en contact simultane le subs.rat proteique, 1'enzyme et un alcool qui est soit entiërement miscible a l'eau, soit au moins partiellement soluble dans l'eau. Comme exemples de ce type d'alcools, on peut citer des alcanols aliphatiques possédant entre l et 5 atomes de carbone, par exemple le méthanol, l'ethanol, le propanol, le butanol et le pentanol. Le n-propanol, le n-butanol et le n-pentanol sont preféres. Les alcools qui sont totalement miscibles, en toutes proportions, a l'eau tels que le methanol, l'ethanol et le n-propanol sont particulierement avantageux. Neanmoins, lorsque l'alcool est partiellement miscible ou non miscible a ?,~3~63rl l'eau, l'efficacite de la reaction d'alcoolyse peut être augmentee par la présence d'un autre compose a la fois miscible a l'eau et miscible a l'alcool, par exemple le 2-propanol.
LR produit obtenu par le procedé de 1'invention est un melange de peptides et d'esters de peptides issus des reactions simultanées d'hydrolyse et d'alcoolyse. Le melange est constitue d'une population hetérogene de peptides et d'esters de peptides de longueurs de chaînes variables, ~e groupement alkylique des esters provenant directement de l'alcool, et ayant donc- entre 1 et 5 atomes de carbone. La nature precise du produit est influencee, d'une part, par la nature du substrat et, d'autre part, par la pureté ~e 1'enzyme. Par exemple, un substrat protéique compose d'un mélange de protéines différentes donnera lieu a un mélange très complexe d'esters et de peptides. De même, une protéase ou une carboxypepsidase contaminee par d'autres enzymes présentant d'autres activités enzymatiques pourrait conduire a la présence d'autres substances chi~iques dans le produit, surtout si le substrat est également impur. Les mélanges de peptides et d'esters de peptides peuvent être soumis a une étape - de purification pour obtenir un mélange enrichi en esters.
La solubilite du produit dans l'eau ou dans l'alcool varie selon les réactifs et n'est pas toujours la même que celle du substrat. Par exemple, l'utilisation de la gliadine de ble comme substrat donne lieu a des esters qui sont solubles dans 1'eau, tandis que l'utilisation de la zéine de maïs conduit à
la formation d'esters solubles dans 1'alcool.
Pourtant, la gliadine et la zeine sont toutes deux solubles dans 1'alcool. Lorsque le substrat protéi~ue WO93~18180 21 3 I ~ 3 7 PCT/FR93/00213 est un melange complexe de pr~teiines présentant des solubilites differentes, il est probable que le produit de la reaction d'alcoolyse sera constitue d'esters et de peptides posseidant des solubilites differentes. Dans ce cas, la fraction soluble dans l'eau ou soluble dans l'alcool peut être récuperee selon l'utilisation ulterieure du produit. Par exemple, en cosmetique, des produits solubles dans l'eau sont préferes.
La duree de la reaction d'alcoolyse varie entre 2 a 30 heures selon la nature du substrat proteique et de l'alcool. Par exempl~, l'alcoolyse d'un substrat proteique complexe tel que le gluten se deroule de preference pendant environ 24 heures. En revanche, un substrat protéique pur tel que les gliadines de ble do~ne lieu, dans un milieu alcoolique miscible a l'eau, a des taux d'esterification important apres seulement 2 a 6 heures. La reaction est arretée par dénaturation de 1'enzyme par ajustement du pH a une valeur fortement acide, éventuellement accompagne par un chauffage a 50 environ pendant 30 a 50 minutes.
La réaction d'alcoolyse se déroule normalement a une temperature comprise entre 20 et 45 C, par exemple autour de 25.
La concentration de l'alcool est d'au moins 30 %
v/v et de préférence, d'au moins 70 % v/v. Lorsque l'alcool est l'éthanol, la concentration peut etre de go % v/v. Si la concentration de l'alcool est trop basse, la reiaction d'alcoolyse ne peut avoir lieu et la réaction-d'hydrolyse domine.
La masse molaire moyenne du produit peut etre déterminee par chromatoqraphie par permeation de gel (FPLC) et reflete la taille des peptides et des es~ers de peptides obtenus. La masse molaire moyenne du produit varie selon la nature du substrat proteique, W093~18180 PCT/FR93/00213 2~3~63~
c'est-a-dire proteique ou peptidique, et selon la durée de la reaction et la concentration de l'enzyme.
En général, la masse molaire moyenne du produit issu de l'alcoolyse de protéines est inferieure a 10 000, par exemple entre 6 000 et 10 000, et celle du produit issu de l'alcoolyse de peptides est inférieure à
5 000, par exemple entre 3 000 et 5 000. Dans tous les cas, la masse molaire moyenne du produit est supérieure a 1 000 Daltons. La réaction de l'invention aboutit donc a des produits ayant une masse molaire moyenne plus elevée que la masse moilaire moyenne obtenue apres une réaction d'hydrolyse en milieu aqueux. En effet, en milieu alcoolique (n-propanol, 70 % v/~), la masse molaire moyenne du produit de la réaction d'alcoolyse de gluten, soluble dans l'eau est de 6 200 (exemple 1), alors que le produit de la reaction d'hydrolyse de gluten, soluble dans l'eau est de 4 200 (exemple 2). La condensation de peptides de ~als sur le n-propanol conduit a la formation d'une population de peptides estérifiés de masse molaire moyenne 4 200.
Selon une variante de l'invention, le procédé
peut comporter une étape supplémentaire permettant de récupérer le produit de 1'invention, sous forme de microparticules. Selon cette variante, le produit doit être soluble en milieu alcoolique. Normalement, cette étape comprend la precipitation du produit (soluble en milieu alcoolique) d~ns une phase aqueuse. La phase aqueuse contient avantageusement au moins un agent antiagrégant facilitant la formation de particules de petite taille. Comme agents antiagrégants, on peut citer des agents tensio-actifs et des gommes telles que la gomme arabique et la carboxymethylcellulose.
L'agent antiagrégant est présent dans la phase agueuse a une concentration comprise entre 0,2 % et 1,0 %
WO93~18180 213 1 ~ 3 7 PCT/FR93/00213 (p/v). Par microparticules, il faut comprendre dans le co~texte de la presente invention, des particules ayant une taille de 0,2 a lO ~, de preference autour de l ~, par exemple 0,8 a 1,2 ~. L'introduction de la solution alcoolique dans la solution aqueuse est accompagnee d'une agitation vigoureuse. Bien entendu, il est important de veiller a ce que le produit ne soit pas denature.
Le produit obtenu par ce mode de realisation de 1'invention, est une dispersion aqueuse stable de microparticules de peptides et d'esters de peptides.
Ils peu~ent être utilises pour des applications agroalimentaires, pharmaceutiques et cosmétiques.
L'utilisation des microparticules de l'invention dans 1'industrie agroalimentaire comme substituts de graisse s'est averee particulierement avantageuse.
Les propriétés du produit sont en partie dependantes de la masse molaire moyenne. Les conditions operatoires et les matieres de diepart peu~ent donc etre choisies en fonction de l'utilisation ulterieure du produit.
Par exemple, pour un produit destiné a etre utilise comme substitut de graisse, il est avantageux d'effectuer la reaction d'alcoolyse directement sur le substrat protéique sans effectuer de prehydrolyse partielle préala~le.
Les produits de l'invention ont des proprietes émulsifiantes, adoucissantes et un pouvoir de retention d'eau. Ces proprietes physiques et chimiques sont avantageusement exploitees dans des produits cosmetiques comme agents emulsifiants, comme agents filmogenes par exemple comme conditionneurs dans les shampooin~s, comme adoucissants, comme agents épaississants, comme agents hydratants, comme base 2l3~63~
lavante et moussante, ou comme tout autre additif ou ingrédient.
Les produits de l'invention peuvent également etre utilises dans l'industrie agroalimentaire ou pharmaceutigue comme additifs ou ingrédients texturants, comme substituts de matière grasse, comme agents moussants ou comme agents émulsifiants. Il est en outre possible d'utiliser les produit~ de 1'invention dans des produits chimiques, comme agents mouillants par exemple pour des produits de lessive, comme agents emulsifiants, comme a~ents adouc~ssants, comme agents filmogenes et comme agents de filage.
Différents modes de realisation de l'invention seront illustres par les exemples suivants.
EXEMP~E8 E~EMPLE ~ : ALCOOLY8E DE~ PROTEINE~ D~ GL~E~ DE BLE :_ Le ~luten de blé vital utilisé est commercialisé
par la société Roquette (Lestrem, France~.
300 g de gluten sont disperses dans 1,2 1 de n-propanol a 70 % v/v. Le pH de la suspension est ajusté
a 5,2 a 1'aide de 17 mmoles de HCl. La subtilisine de qualité alimentaire (AlcalaseR 2,4 L : subtilisine Carlsberg) est commercialisee par NOVO NORDIS~
(Fontenay sous bois, France). 24 ml de préparation de subtilisine sont ajoutés a la suspension . Le mélange est incubé 24 heures sous agitation douce a 2S-C.
La subtilisine est ensuite dénaturee par ajustement du pH du melange a 3,5 avec 115 mmoles de HCl et chauffage a ~0C pendant 40 minutes.
Le n-propanol est éliminé par évaporation à 55~C, et le produit mis en suspension dans de l'eau (~olume de la suspension aqueuse : 3,3 1, pH = 3,1~.
WO93tl8180 PCT/FR93/00213 2 1 ~ 7 Le pH de la suspension aqueuse est ajuste a 6,0 a 1'aide de 113 mmoles de NaOH. LRS produits solubles sont collectes par centrifuqation (5000 g, 15 min), microfiltres sur filtre 0,2 micron et lyophilises. Les insolubles sont éliminés.
Apres lyophilisation, la quantité collectee de produit soluble est de 110 g.
Determination de la masse molai-e movenne du Produit :
La masse molaire moyenne du produit est determinée par chromatographie par permeation de gel a l'aide d'une colonne Superose 12 R HR 10/30 PharmaciaR
(F.P.L.C.). L'éluant est du tampon phosphate de sodium 50 mM, pH 7,0 contenant 150 mM de NaCl. Le debit d'élution est 0,5 ml/min. Les produits d'elution sont detectes a l'aide d'un spectrophotometre dont la longue~r d'onde d'absorbtion est fixee a 280 nm~ La calibration de la colonne (correspondance masse molaire/temps d'élution) et la determination du volume total sont effec~ues comme indique dans la documentation technique Pharmacia.
La droite de calibration du systeme a~alytique est o~tenue en exprimant le logarithme decimal de la masse molaire de proteines de calibration en fonction du temps ou du volume d'élution. La masse molaire moyenne du produit de glu~en soluble dans l'eau apres reaction d'alcoolyse est calculée d'apres le chromatogramme d'elution a 1'aide de la formule :
~hiMi ~ hi avec, pour un temps ou un volume d'elution i W093/l8180 PCT/FR93/002l3 ~ .
~.3~63~ 16 - Mi, la masse molaire du produit ~ilue au temps ou au volume d'~ilution i gur la droite de calibration, - hi, la hauteur sous le pic pour un temps ou un volume d'élution i.
L'echantillon est préparé a une concentration de 5 g/l dans le tampon d'élution et centrifugé si nécessaire.
Détermination de la quantite d'alcool liée au produit Par hYdrol~se basique du qroupe ester :
L'alcool total c~ntenu d~ns l'échantillon correspond a l'alcool lié au produit et eventuellement a l'alcool li~re résiduel, non éliminé par évaporati~n et lyophilisation.
L'al~ool lié au produit correspond donc a 1'alcool total par gramme de produit moins 1'alcool li~re par gramme de produit.
Alcool total :
67 mg de produit sont introduits dans un tube Eppendorf. 0,3 ml d'eau, puis 0,3 ml de NaOH 2N sont ajoutés et le tube est bouché. Le mélange est agité et incubé a température a~biante pendant 2 heures.- LR
mélange est ensuite acidifié à l'aide de 0,3 ml de H2SO4 2,lN. LRj mélange est centrifugé et la quantité
d'alcool total par gramme de produit est déterminée par analyse HPLC du surnageant de centrifugation.
Alcool libre : --67 mg de produit sont introduits dans un tubeEppendorf. 0,3 ml d'eau, puis 0,~ ml de H2SO4 lOmN sont aj outés et le tube est bouché. Le mélange est agite, incubé à température ambiante pendant 2 heures, WO93/18180 2131~ 3 7 PCT/FR93/00213 centrifuge et la quantite d'alcool libre par gramme de produit est determinée comme precedemment.
L'alcool est analyse par ~PLC a l'aide d'une colonne Polypore H (Brownlee Labs, 250 x 7,O mm, 10 microns). L'eluant est une solution aqueuse de H2S0~, lOmN a un debit compris entre 0,35 et 0,70 ml/min. Le volume injecte est de 20 ~1. Le detecteur est un refractometre.
Taux d'esterification :
Le taux d'esterification correspond au no~bre de micromoles d'alcool lie par gramme de produit divisé
par le nombre de micromoles de peptides et d'esters de peptides par gramme de produit.
Caracterisation du produit obtenu par alcoolvse du qluten Par la subtilisine en présence de n-proPanol 70 % v/v:
- teneur en peptides : 71 %
(methode de Kjeldahl) - masse molaire moyenne : 6200 - n-propanol lié : 2,7 mg/g pep~ides - taux d'esterification 28 %
EXE:~SPLE 2: ALCOOLY8E DE PEPT:rDE8 DE GL~JTEN DE ~LE:
, Les peptides de gluten de ~lé ont ete prepares par hydrolyse du gluten par la subtilisine (Alcalase) a pH = 8 : la masse molaire moyenne des peptides solu~les dans l'eau déterminée selon les conditions décrites dans l'Exemple 1 est de 4 200.
75 g d'hydrolysat de gluten sont disperses dans o,75 1 de n-propanol a 70 % v/v. Le pH du milieu réactionnel est ajusté a 5,1 a 1'aide de 120 mmoles de HCl. 15 ml de subtilisine (Alcase Q 2,4L) sont ajou~es W093/18l80 PCT/FR93/00213 2~3l63~
la suspension. Le melange est incubé 20 heures sous agitation douce ~ 25-C.
La subtilisine est ensuite dénaturée par ajustement du pH du melange a 3,5 avec 80 mmc,les de HCl et chauffage à 50-C pendant 40 minutes. Le n-propanol est elimine par~ ëvaporation a 55-C et le produit mis en suspension dans de l'eau (volume de la suspension aqueuse : O,75 1, pH -~ 2,9).
Le pH de la suspension aqueuse est ajuste à 6,0 a 1'aide de 85 mmoles de NaOH. Les produits solubles sont collectés par centrifugation, microfiltrés sur filtre 0,2 micron et lyophilisés. Les insolubles sont éliminés . Après lyophilisation, la quantité collectée de produit soluble est de 61 g.
Caracterisation du Produit obtenu Par alcool~se de pePtides de qluten Par la subtilisine en Présence de n-~ropanol 70 % v/v :
- teneur en peptides : 62 %
(methode de Xjeldahl) - masse molaire moyenne : 3900 - n-propanol lié : 8,2 mg/g - taux d'estérification : 53 %
LSE:~PIE 3: ALCOs~lY8E: DE8 GLIADINE~ PRE8E~CE
D'J~COOL~; MIBCIBLE~ ET NON MI~;CIBIæ8 A L'EAlJ
Des milieux réactionnels contenant :
- gliadines (Sigma G-3375) : 30 g/l - su~tilisine (Alcalase 2,4L) : 2 % v/v - alcool 70 %
ont été préparés à pH = 5 (ajusté avec HCl) et incubés a 25 C sous agitation douce. Apres incubation, la subtilisine est dénaturée par ajustement du pH a 2 ~ X ~ '~ ' ~ S ' ;~ 's~ 'J~Y~;~ ",~"; r" ,~ ",:" ~ ,~, ,, avec HCl, l'alcool evapore, le produit mis en suspension dans 1'eau. Les melanges sont ensuite lyophilises et les produits de reaction caracterlses.
Tableau 1 : Alcoolvse des qliadines en Presence d'alcools miscibles et non miscibles 2 1' eau :
Alcool, Duree Masse mol. Taux 70 % v/v d'incuba- (produits d'esteri-tion h solubles fication a pH = 7,0 % (a), Ethanol 2 9 900 7g n-propanol 6 ~ 8 400 50 n-butanol 15 8 100 15 n-butanol:45% 15 8 200 32 2-propanol:25%
:~ n-pentanol 15 4 800 4 . ~ n-pentanol 15 ~8 300 2-propanol (a) LR taux d'esterification est donne pour l'alcool primaire.
L'efficacite de la réaction d'alcoolyse diminue lorsque la longueur de la chalne aliphatique augmente (ethanol, propanol).
Lorsque 1'alcool est partiellement miscible (n-butanol) ou immiscible a l'eau (n-pentanol), 1'efficacité de la réaction d'alcoolyse est augmentee par la présence d'un tiers composé a la fois miscible a l'eau et misci~le a l'alcool (par exemple, le 2-propanol).
EXEMPLE ~ : INFL~ENCE D~ P~ 8~R L'EFFICACIT~ D~ LA
REACTION D'ALCOOLY~E :
~3~63~ 20 ~ Des milieux reactionnels ont ~té prepareis comme détaillé dans l 'Exemple 3 avec seulement l'ethanol et le n-propanol comme alcools utili~és et les pH des milieux reactionnels ajustes ~ 5,0 ou ~ 7,0 avec HCl.
LRS produits de la réaction apreis 6 heures d'incubation ont éte obtenus comme indiqué dans l'Exemple 3 et caractérisés (Tableau 2).
L'hydrolyse de protéines par la Subtilisine est efficace ~ pH basique, 7 a lO. Néanmo~ns, il a eté
observé que 1'efficacité de la reiacti~n d'alcoolyse est significativement augmentée lorsque le pH du milieu reactionnel est acide, le pH étant ajusté à 5,0 notamment.
Tableau 2 : Influence du PH sur llefficacité de la reaction d'alcoolYse des qliadines ~ar la su~tilisine :
pH Milieu Taux Alcool de synthese Mw d'estéri-fication Ethanol ~ 7,o 6 700 14 . . .
Ethanol 5,0 9 400 49 . _ , N-prnpanol 7,0 8 300 39 _ N-propanol 5, 0 8 4 00 50 E~EMPLE 5: Al.COOI.Y8E DES PROTEINE~ DIJ GL~rE~a DE: BLE
P~ ~ PAP~
250 g de gluten de blé vital sont disperses dans 1,O 1 de n-propanol a 70 % v/v. Le pH de la suspension est ajusté à 6,0 a l'aide de HCl. lO0 g de papaïne (6~00 NF Gist Brocades, Seclin, France ), et de la cystéine (concentration finale : lO mM) sont ajoutés à
la suspension. Le melange est incube 24 heures sous agitation douce a 25-C. Le produit de la reaction est récupere comme indique dans 1'Exemple 1. La masse molaire moyenne des peptides solubles a pH 6,0 est 5 700 et le taux d'esterification est egal à 9 %.
E~EMPLE 6 : ALCOCLY8L D~ LA GELATINE PAR LA
-8~TILI8IN~ :
25 g de gelatine alimentaire (140-160 bloom) sont dispersés dans 250 ml de n-propanol a 70 % v/v. Le pH
est ajuste a 5,0 avec HCl (0,3 mmole). La subtilisine (2,5 ml d'Alcalase 2,4~) est ajoutee et le melange est incube pendant 22 heures sous agitation douce a 25 C.
lZ,S ml de preparation de Subtilisine sont alcrs ajoutés et le melange incubé pendant 4 heures. La Subtilisine est enfin denaturee par ajout de 11 mmoles de HCl (pH = 3,5) et le mélange chauffe a 50'C pendant 30 minutes. L'alcool est evaporé et le produit dilue dans 1'eau est lyophilisé. Læ masse molaire moyenne des produ~ts solubles dans l'eau a pH = 7 est 12 000 et le taux d'esterificati~n est égal a 29 %.
EXEHPLE 7 : PREPAR~TION DE MICROYARTIC~E8 A P~RTIR D~
PRODtJIT D ' ALCS~OLY8E DE ZEINE DE M~ PAR LA
8~BTILISINE EN P~E8ENC~ D'ET~ANOL :
.
10 g de zéine (matière azotée totale : 80, 7 %
Sigma Z-3625) sont solubilises dans 100 ml d'éthanol a 90 % v/v ou 70 % v/v. LRS melanges sont ajustes a pH 5 avec HCl. La subtilisine (2 ml d'Alcalase 2,4L) est ajoutée et les melanges sont incubes 48 heures a 25 C.
Les solutions sont ensuite filtrées sur papier et les microparticules sont preparées selon le protocole suivant :
~3 ~631 22 - la solution a~coolique (100 ml) maintenue A 40-C
est pompee ~ un d~bit de 4 ml/min dans 0,8 1 d'une solution aqueu~e de gomme arabique a 10 g/l maintenue à 70-C et agitee fortement. La solution alcoolique entre en contact avec la solution aqueuse à travers une aiguille de diamètre 0,8 mm plongeant dans la solution aqueuse, - la suspension de microparticules est incubée au moins 4 heures à 4-C et filtrée sur papier, - l'alcool contenu dans le filtrat est é~aporé, - les microparticule~ sont obtenues en suspension dans l'eau et séchées par.lyophilisation.
Les caractéristiques des produits obtenus sont indiquees dans le Tableau 3.
Tableau 3 : PréParation de microParticules à martir du roduit d'alcoolvse de la zéine de maïs ~ar la subtilisine en Présence d'ét~anol :
Ethanol dans la réaction d'alcoolyse, % v~v 70 90 M.A~T. dans produit sec, % 55 54 Rendement de microparticulation de la M.A.T., % 100 94 Ethanol lié aux peptides mg/g peptides 0,98 1,14 . _ ESEMPI~ 8 ~ COOLY8E DE: PEPTIDE~ DE~ EN PRE82NCE:
DE N--PROPA17OL:
Les peptides de maïs ont été prepares selon la méthode de l'exemple 2 et soumis ensuite a une réaction d'alcoolyse. Le milieu et les conditions réactionels étaient les suivants :
WO93/18180 2 f 31 6 3 PCT/FR93/00213 - peptides de maïs : 100 g/l (masse molaire : 5 700) - n-propanol : 70 % v/v - Alcalase : 2 % v/v - pH : 5,0 - temperature : 25 C
- duree : 20 h Le produit de la reaction de condensation avait les caracteristiques suivantes :
- masse molaire : 4 100 - taux d'estérification : 55 %
La reaction d'alcoolyse peut ainsi être initiee par la simple addition de l'alcool et l'ajustement du pH aux valeurs permettant la formation stable d'esters. Ceci permet un controle facile du degre d'hydrolyse et evite une hydrolyse totale du substrat proteique. Le substrat peptidique a normalement une masse molaire moyenne de 4 000 à 6 000 Daltons environ. Il s'agit donc de polypeptides de taille moyenne.
Dans tous les cas, le substrat du procéde a une masse molaire moyenne supérieure a l 000 Daltons.
Le substrat proteique peut etre soluble dans l'eau ou soluble dans l'alcool. La reac~_on d'alcoolyse eta~t effectuée dans un milieu alcoolioue, l'utilisation d'une proteine non soluble dans 1'alcool, telle que la gelatine, donne lieu a un milieu reactionnel heterogene. Lorsque le subs~rat est un substrat complexe tel que le gluten, qui est compose de différentes protéines d~nt environ 50 ~
sont solu~les dans l'alcool et ~0 % solubles dans l'eau, le milieu reactionnel est multiphasique.
Selon le procedé de l'invention, le subs~-at proteique d'origine animale ou vegetale est mis en contact avec au moins une enzyme ayant une ac~ivite proteolytique et esterol~tique sur des pr~teines ou sur des peptides. L'enzyme est de préference soit une protéase, soit une carboxypeptidase. Les proteases a serine ou a cystéine respectivement exemplifiees par la -su~tilisine ~provenant de Baclllus SD., de préférence Bacillus licheniformis~, ou la papalne . .
(provenant de latex de papayer) sont particulierement préféxées. L'activité double de protease et d'esterase n'est pas une propriété possédée par toutes les protéases. Ceci étant, en appliquant le tes' déc~~t WO93/18180 ~63~ PCT/FR93/00213 ci-dessous pour détecter la formation d~esters, l'homme de 1'art peut facilement identifier celles qui conviennent au procede de l'invention. L'enzyme peut etre sous forme de preparation enzymatique, par exemple sous forme de melange grossier d'enzyme, tel qu'~n surnageant de culture microbien, ou peut en revanche être sous forme purifiee depourvue de tout autre type d'activité enzymatique et de tout autre contaminant. La preparation enzymati~ue peut aussi être un melange de proteases d'origines différentes, a condition que ces differentes enzymes puissent fonc'ionner ensemble.
Normalement, l'enzyme est utilisée sous forme li~re, mais elle peut aussi etre immobilisée sur un support solide tel que la silice, ou sur des billes ou sur des mem~ranes connues dans l'art. L'immobilisation de 1'enzyme permet d'effectuer le procede de l'invention de maniere continue.
Les conditions operatoires et notamment l~ pH
sont critiques, selon le procede de l'invention, pour l~efCicacite de la réaction d'alcoolyse. Les réactions d'hydrolyse e~ d'alcoolyse se déroulent en parallele, mais dans certaines conditions de pH, les esters ne s'accumulent pas dans le milieu reactionnel. Il existe cependant une gamme de pH a laquelle la formation d'esters est effec~ive. Les inventeurs ont constaté
que, pour une meme enzyme, le pH optimum pour la réaction d'al~oolyse est sensiblement plus bas que le pH optimum pour la réac_ion d'hydrolyse telle ~u'elle est pratiquée conventionnellement en milieu exclusivement aoueux. Par exemple, le pH optimum pour la réaction d'hydrolyse par la subtilisine est autour de pH 8 tandis que le pH optimum pour la réaction d'alcooiyse est autour de pH 5- La papaïne ~ui presente un pH optimum pour la réaction d'hydrolyse WO93/18180 2 1 3 1 ~ 3 7 PCT/FR93/00213 d'environ 7 catalyse la reaction d'alcoolyse entre pH
5 et 7, particulierement autour de pH 6. De maniere generale, le pH doit être acide pour permettre la formation stable d'esters. La mise en contact du substrat proteique avec la subtilisine et l'alcool s'effectue à pH 3 a 8, de preference a pH 4 ~ 6, par exemple pH 5 environ.
Selon la methode de la presente invention, l'homme du metier peut sans difficulté deter~iner le pH auquel la formation d'esters alkyliques de peptide est obtenue. Il suffit d'effectuer le test de déterminatisn de la quantite d'alcool liee au produit par hydrolyse basique du groupe ester decrit dans 1'exemple l ci-dessous. Cette determination est effectuee pour une serie de valeurs de pH differentes et les valeurs qui permettent la formation d'esters alkyliques sont ainsi déterminees. Dans le contexte de la presente invention, le taux d'esterification du produit considere comme significatif est d'au moins lO
% environ. De preference le taux d'esterification est d'au moins 25 % et avantageusement d'au moins ~0 %.
Selon le procede de l'invention, l'alcoolyse est effectuee en mettant en contact simultane le subs.rat proteique, 1'enzyme et un alcool qui est soit entiërement miscible a l'eau, soit au moins partiellement soluble dans l'eau. Comme exemples de ce type d'alcools, on peut citer des alcanols aliphatiques possédant entre l et 5 atomes de carbone, par exemple le méthanol, l'ethanol, le propanol, le butanol et le pentanol. Le n-propanol, le n-butanol et le n-pentanol sont preféres. Les alcools qui sont totalement miscibles, en toutes proportions, a l'eau tels que le methanol, l'ethanol et le n-propanol sont particulierement avantageux. Neanmoins, lorsque l'alcool est partiellement miscible ou non miscible a ?,~3~63rl l'eau, l'efficacite de la reaction d'alcoolyse peut être augmentee par la présence d'un autre compose a la fois miscible a l'eau et miscible a l'alcool, par exemple le 2-propanol.
LR produit obtenu par le procedé de 1'invention est un melange de peptides et d'esters de peptides issus des reactions simultanées d'hydrolyse et d'alcoolyse. Le melange est constitue d'une population hetérogene de peptides et d'esters de peptides de longueurs de chaînes variables, ~e groupement alkylique des esters provenant directement de l'alcool, et ayant donc- entre 1 et 5 atomes de carbone. La nature precise du produit est influencee, d'une part, par la nature du substrat et, d'autre part, par la pureté ~e 1'enzyme. Par exemple, un substrat protéique compose d'un mélange de protéines différentes donnera lieu a un mélange très complexe d'esters et de peptides. De même, une protéase ou une carboxypepsidase contaminee par d'autres enzymes présentant d'autres activités enzymatiques pourrait conduire a la présence d'autres substances chi~iques dans le produit, surtout si le substrat est également impur. Les mélanges de peptides et d'esters de peptides peuvent être soumis a une étape - de purification pour obtenir un mélange enrichi en esters.
La solubilite du produit dans l'eau ou dans l'alcool varie selon les réactifs et n'est pas toujours la même que celle du substrat. Par exemple, l'utilisation de la gliadine de ble comme substrat donne lieu a des esters qui sont solubles dans 1'eau, tandis que l'utilisation de la zéine de maïs conduit à
la formation d'esters solubles dans 1'alcool.
Pourtant, la gliadine et la zeine sont toutes deux solubles dans 1'alcool. Lorsque le substrat protéi~ue WO93~18180 21 3 I ~ 3 7 PCT/FR93/00213 est un melange complexe de pr~teiines présentant des solubilites differentes, il est probable que le produit de la reaction d'alcoolyse sera constitue d'esters et de peptides posseidant des solubilites differentes. Dans ce cas, la fraction soluble dans l'eau ou soluble dans l'alcool peut être récuperee selon l'utilisation ulterieure du produit. Par exemple, en cosmetique, des produits solubles dans l'eau sont préferes.
La duree de la reaction d'alcoolyse varie entre 2 a 30 heures selon la nature du substrat proteique et de l'alcool. Par exempl~, l'alcoolyse d'un substrat proteique complexe tel que le gluten se deroule de preference pendant environ 24 heures. En revanche, un substrat protéique pur tel que les gliadines de ble do~ne lieu, dans un milieu alcoolique miscible a l'eau, a des taux d'esterification important apres seulement 2 a 6 heures. La reaction est arretée par dénaturation de 1'enzyme par ajustement du pH a une valeur fortement acide, éventuellement accompagne par un chauffage a 50 environ pendant 30 a 50 minutes.
La réaction d'alcoolyse se déroule normalement a une temperature comprise entre 20 et 45 C, par exemple autour de 25.
La concentration de l'alcool est d'au moins 30 %
v/v et de préférence, d'au moins 70 % v/v. Lorsque l'alcool est l'éthanol, la concentration peut etre de go % v/v. Si la concentration de l'alcool est trop basse, la reiaction d'alcoolyse ne peut avoir lieu et la réaction-d'hydrolyse domine.
La masse molaire moyenne du produit peut etre déterminee par chromatoqraphie par permeation de gel (FPLC) et reflete la taille des peptides et des es~ers de peptides obtenus. La masse molaire moyenne du produit varie selon la nature du substrat proteique, W093~18180 PCT/FR93/00213 2~3~63~
c'est-a-dire proteique ou peptidique, et selon la durée de la reaction et la concentration de l'enzyme.
En général, la masse molaire moyenne du produit issu de l'alcoolyse de protéines est inferieure a 10 000, par exemple entre 6 000 et 10 000, et celle du produit issu de l'alcoolyse de peptides est inférieure à
5 000, par exemple entre 3 000 et 5 000. Dans tous les cas, la masse molaire moyenne du produit est supérieure a 1 000 Daltons. La réaction de l'invention aboutit donc a des produits ayant une masse molaire moyenne plus elevée que la masse moilaire moyenne obtenue apres une réaction d'hydrolyse en milieu aqueux. En effet, en milieu alcoolique (n-propanol, 70 % v/~), la masse molaire moyenne du produit de la réaction d'alcoolyse de gluten, soluble dans l'eau est de 6 200 (exemple 1), alors que le produit de la reaction d'hydrolyse de gluten, soluble dans l'eau est de 4 200 (exemple 2). La condensation de peptides de ~als sur le n-propanol conduit a la formation d'une population de peptides estérifiés de masse molaire moyenne 4 200.
Selon une variante de l'invention, le procédé
peut comporter une étape supplémentaire permettant de récupérer le produit de 1'invention, sous forme de microparticules. Selon cette variante, le produit doit être soluble en milieu alcoolique. Normalement, cette étape comprend la precipitation du produit (soluble en milieu alcoolique) d~ns une phase aqueuse. La phase aqueuse contient avantageusement au moins un agent antiagrégant facilitant la formation de particules de petite taille. Comme agents antiagrégants, on peut citer des agents tensio-actifs et des gommes telles que la gomme arabique et la carboxymethylcellulose.
L'agent antiagrégant est présent dans la phase agueuse a une concentration comprise entre 0,2 % et 1,0 %
WO93~18180 213 1 ~ 3 7 PCT/FR93/00213 (p/v). Par microparticules, il faut comprendre dans le co~texte de la presente invention, des particules ayant une taille de 0,2 a lO ~, de preference autour de l ~, par exemple 0,8 a 1,2 ~. L'introduction de la solution alcoolique dans la solution aqueuse est accompagnee d'une agitation vigoureuse. Bien entendu, il est important de veiller a ce que le produit ne soit pas denature.
Le produit obtenu par ce mode de realisation de 1'invention, est une dispersion aqueuse stable de microparticules de peptides et d'esters de peptides.
Ils peu~ent être utilises pour des applications agroalimentaires, pharmaceutiques et cosmétiques.
L'utilisation des microparticules de l'invention dans 1'industrie agroalimentaire comme substituts de graisse s'est averee particulierement avantageuse.
Les propriétés du produit sont en partie dependantes de la masse molaire moyenne. Les conditions operatoires et les matieres de diepart peu~ent donc etre choisies en fonction de l'utilisation ulterieure du produit.
Par exemple, pour un produit destiné a etre utilise comme substitut de graisse, il est avantageux d'effectuer la reaction d'alcoolyse directement sur le substrat protéique sans effectuer de prehydrolyse partielle préala~le.
Les produits de l'invention ont des proprietes émulsifiantes, adoucissantes et un pouvoir de retention d'eau. Ces proprietes physiques et chimiques sont avantageusement exploitees dans des produits cosmetiques comme agents emulsifiants, comme agents filmogenes par exemple comme conditionneurs dans les shampooin~s, comme adoucissants, comme agents épaississants, comme agents hydratants, comme base 2l3~63~
lavante et moussante, ou comme tout autre additif ou ingrédient.
Les produits de l'invention peuvent également etre utilises dans l'industrie agroalimentaire ou pharmaceutigue comme additifs ou ingrédients texturants, comme substituts de matière grasse, comme agents moussants ou comme agents émulsifiants. Il est en outre possible d'utiliser les produit~ de 1'invention dans des produits chimiques, comme agents mouillants par exemple pour des produits de lessive, comme agents emulsifiants, comme a~ents adouc~ssants, comme agents filmogenes et comme agents de filage.
Différents modes de realisation de l'invention seront illustres par les exemples suivants.
EXEMP~E8 E~EMPLE ~ : ALCOOLY8E DE~ PROTEINE~ D~ GL~E~ DE BLE :_ Le ~luten de blé vital utilisé est commercialisé
par la société Roquette (Lestrem, France~.
300 g de gluten sont disperses dans 1,2 1 de n-propanol a 70 % v/v. Le pH de la suspension est ajusté
a 5,2 a 1'aide de 17 mmoles de HCl. La subtilisine de qualité alimentaire (AlcalaseR 2,4 L : subtilisine Carlsberg) est commercialisee par NOVO NORDIS~
(Fontenay sous bois, France). 24 ml de préparation de subtilisine sont ajoutés a la suspension . Le mélange est incubé 24 heures sous agitation douce a 2S-C.
La subtilisine est ensuite dénaturee par ajustement du pH du melange a 3,5 avec 115 mmoles de HCl et chauffage a ~0C pendant 40 minutes.
Le n-propanol est éliminé par évaporation à 55~C, et le produit mis en suspension dans de l'eau (~olume de la suspension aqueuse : 3,3 1, pH = 3,1~.
WO93tl8180 PCT/FR93/00213 2 1 ~ 7 Le pH de la suspension aqueuse est ajuste a 6,0 a 1'aide de 113 mmoles de NaOH. LRS produits solubles sont collectes par centrifuqation (5000 g, 15 min), microfiltres sur filtre 0,2 micron et lyophilises. Les insolubles sont éliminés.
Apres lyophilisation, la quantité collectee de produit soluble est de 110 g.
Determination de la masse molai-e movenne du Produit :
La masse molaire moyenne du produit est determinée par chromatographie par permeation de gel a l'aide d'une colonne Superose 12 R HR 10/30 PharmaciaR
(F.P.L.C.). L'éluant est du tampon phosphate de sodium 50 mM, pH 7,0 contenant 150 mM de NaCl. Le debit d'élution est 0,5 ml/min. Les produits d'elution sont detectes a l'aide d'un spectrophotometre dont la longue~r d'onde d'absorbtion est fixee a 280 nm~ La calibration de la colonne (correspondance masse molaire/temps d'élution) et la determination du volume total sont effec~ues comme indique dans la documentation technique Pharmacia.
La droite de calibration du systeme a~alytique est o~tenue en exprimant le logarithme decimal de la masse molaire de proteines de calibration en fonction du temps ou du volume d'élution. La masse molaire moyenne du produit de glu~en soluble dans l'eau apres reaction d'alcoolyse est calculée d'apres le chromatogramme d'elution a 1'aide de la formule :
~hiMi ~ hi avec, pour un temps ou un volume d'elution i W093/l8180 PCT/FR93/002l3 ~ .
~.3~63~ 16 - Mi, la masse molaire du produit ~ilue au temps ou au volume d'~ilution i gur la droite de calibration, - hi, la hauteur sous le pic pour un temps ou un volume d'élution i.
L'echantillon est préparé a une concentration de 5 g/l dans le tampon d'élution et centrifugé si nécessaire.
Détermination de la quantite d'alcool liée au produit Par hYdrol~se basique du qroupe ester :
L'alcool total c~ntenu d~ns l'échantillon correspond a l'alcool lié au produit et eventuellement a l'alcool li~re résiduel, non éliminé par évaporati~n et lyophilisation.
L'al~ool lié au produit correspond donc a 1'alcool total par gramme de produit moins 1'alcool li~re par gramme de produit.
Alcool total :
67 mg de produit sont introduits dans un tube Eppendorf. 0,3 ml d'eau, puis 0,3 ml de NaOH 2N sont ajoutés et le tube est bouché. Le mélange est agité et incubé a température a~biante pendant 2 heures.- LR
mélange est ensuite acidifié à l'aide de 0,3 ml de H2SO4 2,lN. LRj mélange est centrifugé et la quantité
d'alcool total par gramme de produit est déterminée par analyse HPLC du surnageant de centrifugation.
Alcool libre : --67 mg de produit sont introduits dans un tubeEppendorf. 0,3 ml d'eau, puis 0,~ ml de H2SO4 lOmN sont aj outés et le tube est bouché. Le mélange est agite, incubé à température ambiante pendant 2 heures, WO93/18180 2131~ 3 7 PCT/FR93/00213 centrifuge et la quantite d'alcool libre par gramme de produit est determinée comme precedemment.
L'alcool est analyse par ~PLC a l'aide d'une colonne Polypore H (Brownlee Labs, 250 x 7,O mm, 10 microns). L'eluant est une solution aqueuse de H2S0~, lOmN a un debit compris entre 0,35 et 0,70 ml/min. Le volume injecte est de 20 ~1. Le detecteur est un refractometre.
Taux d'esterification :
Le taux d'esterification correspond au no~bre de micromoles d'alcool lie par gramme de produit divisé
par le nombre de micromoles de peptides et d'esters de peptides par gramme de produit.
Caracterisation du produit obtenu par alcoolvse du qluten Par la subtilisine en présence de n-proPanol 70 % v/v:
- teneur en peptides : 71 %
(methode de Kjeldahl) - masse molaire moyenne : 6200 - n-propanol lié : 2,7 mg/g pep~ides - taux d'esterification 28 %
EXE:~SPLE 2: ALCOOLY8E DE PEPT:rDE8 DE GL~JTEN DE ~LE:
, Les peptides de gluten de ~lé ont ete prepares par hydrolyse du gluten par la subtilisine (Alcalase) a pH = 8 : la masse molaire moyenne des peptides solu~les dans l'eau déterminée selon les conditions décrites dans l'Exemple 1 est de 4 200.
75 g d'hydrolysat de gluten sont disperses dans o,75 1 de n-propanol a 70 % v/v. Le pH du milieu réactionnel est ajusté a 5,1 a 1'aide de 120 mmoles de HCl. 15 ml de subtilisine (Alcase Q 2,4L) sont ajou~es W093/18l80 PCT/FR93/00213 2~3l63~
la suspension. Le melange est incubé 20 heures sous agitation douce ~ 25-C.
La subtilisine est ensuite dénaturée par ajustement du pH du melange a 3,5 avec 80 mmc,les de HCl et chauffage à 50-C pendant 40 minutes. Le n-propanol est elimine par~ ëvaporation a 55-C et le produit mis en suspension dans de l'eau (volume de la suspension aqueuse : O,75 1, pH -~ 2,9).
Le pH de la suspension aqueuse est ajuste à 6,0 a 1'aide de 85 mmoles de NaOH. Les produits solubles sont collectés par centrifugation, microfiltrés sur filtre 0,2 micron et lyophilisés. Les insolubles sont éliminés . Après lyophilisation, la quantité collectée de produit soluble est de 61 g.
Caracterisation du Produit obtenu Par alcool~se de pePtides de qluten Par la subtilisine en Présence de n-~ropanol 70 % v/v :
- teneur en peptides : 62 %
(methode de Xjeldahl) - masse molaire moyenne : 3900 - n-propanol lié : 8,2 mg/g - taux d'estérification : 53 %
LSE:~PIE 3: ALCOs~lY8E: DE8 GLIADINE~ PRE8E~CE
D'J~COOL~; MIBCIBLE~ ET NON MI~;CIBIæ8 A L'EAlJ
Des milieux réactionnels contenant :
- gliadines (Sigma G-3375) : 30 g/l - su~tilisine (Alcalase 2,4L) : 2 % v/v - alcool 70 %
ont été préparés à pH = 5 (ajusté avec HCl) et incubés a 25 C sous agitation douce. Apres incubation, la subtilisine est dénaturée par ajustement du pH a 2 ~ X ~ '~ ' ~ S ' ;~ 's~ 'J~Y~;~ ",~"; r" ,~ ",:" ~ ,~, ,, avec HCl, l'alcool evapore, le produit mis en suspension dans 1'eau. Les melanges sont ensuite lyophilises et les produits de reaction caracterlses.
Tableau 1 : Alcoolvse des qliadines en Presence d'alcools miscibles et non miscibles 2 1' eau :
Alcool, Duree Masse mol. Taux 70 % v/v d'incuba- (produits d'esteri-tion h solubles fication a pH = 7,0 % (a), Ethanol 2 9 900 7g n-propanol 6 ~ 8 400 50 n-butanol 15 8 100 15 n-butanol:45% 15 8 200 32 2-propanol:25%
:~ n-pentanol 15 4 800 4 . ~ n-pentanol 15 ~8 300 2-propanol (a) LR taux d'esterification est donne pour l'alcool primaire.
L'efficacite de la réaction d'alcoolyse diminue lorsque la longueur de la chalne aliphatique augmente (ethanol, propanol).
Lorsque 1'alcool est partiellement miscible (n-butanol) ou immiscible a l'eau (n-pentanol), 1'efficacité de la réaction d'alcoolyse est augmentee par la présence d'un tiers composé a la fois miscible a l'eau et misci~le a l'alcool (par exemple, le 2-propanol).
EXEMPLE ~ : INFL~ENCE D~ P~ 8~R L'EFFICACIT~ D~ LA
REACTION D'ALCOOLY~E :
~3~63~ 20 ~ Des milieux reactionnels ont ~té prepareis comme détaillé dans l 'Exemple 3 avec seulement l'ethanol et le n-propanol comme alcools utili~és et les pH des milieux reactionnels ajustes ~ 5,0 ou ~ 7,0 avec HCl.
LRS produits de la réaction apreis 6 heures d'incubation ont éte obtenus comme indiqué dans l'Exemple 3 et caractérisés (Tableau 2).
L'hydrolyse de protéines par la Subtilisine est efficace ~ pH basique, 7 a lO. Néanmo~ns, il a eté
observé que 1'efficacité de la reiacti~n d'alcoolyse est significativement augmentée lorsque le pH du milieu reactionnel est acide, le pH étant ajusté à 5,0 notamment.
Tableau 2 : Influence du PH sur llefficacité de la reaction d'alcoolYse des qliadines ~ar la su~tilisine :
pH Milieu Taux Alcool de synthese Mw d'estéri-fication Ethanol ~ 7,o 6 700 14 . . .
Ethanol 5,0 9 400 49 . _ , N-prnpanol 7,0 8 300 39 _ N-propanol 5, 0 8 4 00 50 E~EMPLE 5: Al.COOI.Y8E DES PROTEINE~ DIJ GL~rE~a DE: BLE
P~ ~ PAP~
250 g de gluten de blé vital sont disperses dans 1,O 1 de n-propanol a 70 % v/v. Le pH de la suspension est ajusté à 6,0 a l'aide de HCl. lO0 g de papaïne (6~00 NF Gist Brocades, Seclin, France ), et de la cystéine (concentration finale : lO mM) sont ajoutés à
la suspension. Le melange est incube 24 heures sous agitation douce a 25-C. Le produit de la reaction est récupere comme indique dans 1'Exemple 1. La masse molaire moyenne des peptides solubles a pH 6,0 est 5 700 et le taux d'esterification est egal à 9 %.
E~EMPLE 6 : ALCOCLY8L D~ LA GELATINE PAR LA
-8~TILI8IN~ :
25 g de gelatine alimentaire (140-160 bloom) sont dispersés dans 250 ml de n-propanol a 70 % v/v. Le pH
est ajuste a 5,0 avec HCl (0,3 mmole). La subtilisine (2,5 ml d'Alcalase 2,4~) est ajoutee et le melange est incube pendant 22 heures sous agitation douce a 25 C.
lZ,S ml de preparation de Subtilisine sont alcrs ajoutés et le melange incubé pendant 4 heures. La Subtilisine est enfin denaturee par ajout de 11 mmoles de HCl (pH = 3,5) et le mélange chauffe a 50'C pendant 30 minutes. L'alcool est evaporé et le produit dilue dans 1'eau est lyophilisé. Læ masse molaire moyenne des produ~ts solubles dans l'eau a pH = 7 est 12 000 et le taux d'esterificati~n est égal a 29 %.
EXEHPLE 7 : PREPAR~TION DE MICROYARTIC~E8 A P~RTIR D~
PRODtJIT D ' ALCS~OLY8E DE ZEINE DE M~ PAR LA
8~BTILISINE EN P~E8ENC~ D'ET~ANOL :
.
10 g de zéine (matière azotée totale : 80, 7 %
Sigma Z-3625) sont solubilises dans 100 ml d'éthanol a 90 % v/v ou 70 % v/v. LRS melanges sont ajustes a pH 5 avec HCl. La subtilisine (2 ml d'Alcalase 2,4L) est ajoutée et les melanges sont incubes 48 heures a 25 C.
Les solutions sont ensuite filtrées sur papier et les microparticules sont preparées selon le protocole suivant :
~3 ~631 22 - la solution a~coolique (100 ml) maintenue A 40-C
est pompee ~ un d~bit de 4 ml/min dans 0,8 1 d'une solution aqueu~e de gomme arabique a 10 g/l maintenue à 70-C et agitee fortement. La solution alcoolique entre en contact avec la solution aqueuse à travers une aiguille de diamètre 0,8 mm plongeant dans la solution aqueuse, - la suspension de microparticules est incubée au moins 4 heures à 4-C et filtrée sur papier, - l'alcool contenu dans le filtrat est é~aporé, - les microparticule~ sont obtenues en suspension dans l'eau et séchées par.lyophilisation.
Les caractéristiques des produits obtenus sont indiquees dans le Tableau 3.
Tableau 3 : PréParation de microParticules à martir du roduit d'alcoolvse de la zéine de maïs ~ar la subtilisine en Présence d'ét~anol :
Ethanol dans la réaction d'alcoolyse, % v~v 70 90 M.A~T. dans produit sec, % 55 54 Rendement de microparticulation de la M.A.T., % 100 94 Ethanol lié aux peptides mg/g peptides 0,98 1,14 . _ ESEMPI~ 8 ~ COOLY8E DE: PEPTIDE~ DE~ EN PRE82NCE:
DE N--PROPA17OL:
Les peptides de maïs ont été prepares selon la méthode de l'exemple 2 et soumis ensuite a une réaction d'alcoolyse. Le milieu et les conditions réactionels étaient les suivants :
WO93/18180 2 f 31 6 3 PCT/FR93/00213 - peptides de maïs : 100 g/l (masse molaire : 5 700) - n-propanol : 70 % v/v - Alcalase : 2 % v/v - pH : 5,0 - temperature : 25 C
- duree : 20 h Le produit de la reaction de condensation avait les caracteristiques suivantes :
- masse molaire : 4 100 - taux d'estérification : 55 %
Claims (21)
1. Procédé de synthèse enzymatique d'esters alkyliques de peptides comprenant la mise en contact simultanée d'un substrat protéique d'origine animale ou végétale avec, d'une part, au moins une enzyme ayant à la fois une activité protéolytique et une activité estérolytique sur des protéines ou sur des peptides et, d'autre part, avec au moins un alcool, ledit alcool étant soit entièrement miscible à l'eau, soit au moins partiellement soluble dans l'eau, caractérisé en ce que la mise en contact simultanée du substrat protéique, de l'enzyme et de l'alcool s'effectue à un pH permettant la formation d'esters alkyliques de peptides.
2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé
en ce que le substrat protéique est une protéine végétale provenant d'une céréale telle que le blé, le maïs, l'orge, l'avoine, le riz, le seigle, le sarrasin, le sorgho et le triticale, éventuellement sous forme de grain entier, ou de fractions de grains ou de tout produit issu du broyage du grain, tel que la farine ou la semoule.
en ce que le substrat protéique est une protéine végétale provenant d'une céréale telle que le blé, le maïs, l'orge, l'avoine, le riz, le seigle, le sarrasin, le sorgho et le triticale, éventuellement sous forme de grain entier, ou de fractions de grains ou de tout produit issu du broyage du grain, tel que la farine ou la semoule.
3. Procédé selon la revendication 1 caractérisé
en ce que le substrat protéique est d'origine animale et comprend la gélatine.
en ce que le substrat protéique est d'origine animale et comprend la gélatine.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'alcool est un alcanol aliphatique possédant entre 1 et 5 atomes de carbone, de préférence le méthanol, l'éthanol, ou le n-propanol.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que l'enzyme ayant une activité d'estérase sur des protéines ou sur des peptides est une protéase ou une carboxypeptidase.
6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé
en ce que l'enzyme est une protéase à sérine ou une protéase à cystéine, par exemple la subtilisine ou la papaïne.
en ce que l'enzyme est une protéase à sérine ou une protéase à cystéine, par exemple la subtilisine ou la papaïne.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé
en ce que la protéase est la subtilisine.
en ce que la protéase est la subtilisine.
8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé
en ce que la mise en contact du substrat protéique avec la subtilisine et l'alcool s'effectue à pH 3 à 8, de préférence à pH 4 à 6, par exemple pH 5 environ.
en ce que la mise en contact du substrat protéique avec la subtilisine et l'alcool s'effectue à pH 3 à 8, de préférence à pH 4 à 6, par exemple pH 5 environ.
9. Procédé selon la revendication 6 caractérisé
en ce que la protéase est la papaïne.
en ce que la protéase est la papaïne.
10. Procédé selon la revendication 9 caractérise en ce que la mise en contact s'effectue entre pH 5 et 7 environ.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 caractérisé en ce que la concentration de l'alcool est au moins de 30 % v/v, et de préférence, au moins de 70 % v/v, par exemple entre 70 % et 90 %.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que la réaction d'alcoolyse est précédée par une étape d'hydrolyse partielle du substrat protéique, de préférence par contact du substrat avec une protéase, notamment, la même que celle mise en oeuvre dans l'étape d'alcoolyse.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 ou 4 à 12 caractérisé en ce qu'il comporte en outre une étape permettant la formation de microparticules, par exemple la précipitation du produit soluble en milieu alcoolique dans une phase aqueuse.
14. Mélange de peptides et d'esters alkyliques de peptides tel qu'obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12.
15. Mélange selon la revendication 13 ayant un taux d'estérification d'au moins 25 %, et de préférence d'au moins 40 %.
16. Microparticules telles qu'obtenues par le procédé selon la revendication 13.
17. Microparticules selon la revendication 16 ayant une dimension d'entre 0,2 et 10 µ.
18. Utilisation des mélangés selon l'une quelconque des revendications 14 à 15 comme agents émulsifiants, comme agents filmogènes, par exemple comme conditionneurs pour les shampooings, comme adoucissants, comme agents épaississants, comme agents hydratants, comme base lavante et moussante, ou comme tout autre additif ou ingrédient dans les produits cosmétologiques.
19. Utilisation des mélanges selon l'une quelconque des revendications 14 ou 15 dans l'industrie agroalimentaire ou pharmaceutique comme additifs ou ingrédients texturants, comme agents moussants, comme substitut de graisse, ou comme agents émulsifiants.
20. Utilisation des mélanges selon l'une quelconque des revendications 14 ou 15 dans l'industrie chimique comme agents mouillants, par exemple pour des produits de lessive, comme agents émulsifiants, comme agents adoucissants, comme agents filmogènes et comme agents de filage.
21. Utilisation des microparticules, selon la revendication 16, comme substituts de qraisse.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR92/02789 | 1992-03-09 | ||
| FR9202789A FR2688229B1 (fr) | 1992-03-09 | 1992-03-09 | Procede de synthese enzymatique d'esters alkyliques de peptides, produits ainsi obtenus et utilisation desdits produits. |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CA2131637A1 true CA2131637A1 (fr) | 1993-09-16 |
Family
ID=9427497
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CA002131637A Abandoned CA2131637A1 (fr) | 1992-03-09 | 1993-03-02 | Procede de synthese enzymatique d'esters alkyliques de peptides, produits ainsi obtenus et utilisation desdits produits |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5554508A (fr) |
| EP (1) | EP0630411A1 (fr) |
| JP (1) | JPH07504566A (fr) |
| AU (1) | AU679172B2 (fr) |
| CA (1) | CA2131637A1 (fr) |
| FI (1) | FI944138A (fr) |
| FR (1) | FR2688229B1 (fr) |
| NO (1) | NO943212L (fr) |
| WO (1) | WO1993018180A1 (fr) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2714390B1 (fr) * | 1993-12-23 | 1996-03-08 | Agronomique Inst Nat Rech | Procédé d'obtention de produits peptidiques et produits obtenus. |
| DE4435384C1 (de) * | 1994-10-04 | 1995-09-28 | Henkel Kgaa | Kosmetische und/oder pharmazeutische Zubereitungen |
| DE19502167C2 (de) * | 1995-01-25 | 1997-02-06 | Henkel Kgaa | Verfahren zur Herstellung von Reisproteinhydrolysaten |
| DE19502168C1 (de) * | 1995-01-25 | 1996-06-27 | Henkel Kgaa | Verfahren zur Herstellung von Weizenproteinhydrolysaten |
| EP0845974A1 (fr) * | 1995-08-23 | 1998-06-10 | Quest International B.V. | Compositions contenant un promoteur de croissance cellulaire peptidique |
| US6063916A (en) * | 1996-11-27 | 2000-05-16 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Transesterification of insoluble polysaccharides |
| JP2002526430A (ja) | 1998-09-22 | 2002-08-20 | ザ、プロクター、エンド、ギャンブル、カンパニー | 水不溶性基材と結合した活性タンパク質を含有するパーソナルケア組成物 |
| US6303119B1 (en) | 1999-09-22 | 2001-10-16 | The Procter & Gamble Company | Personal care compositions containing subtilisin enzymes bound to water insoluble substrates |
| FR2802418B1 (fr) * | 1999-12-16 | 2002-02-15 | Silab Sa | Procede d'obtention d'un principe actif a effet tenseur pour lutter contre le vieillissement de la peau, tenseur obtenu et composition utilisant un tel tenseur |
| ES2223727T3 (es) * | 2001-01-12 | 2005-03-01 | Campina B.V. | Metodo para producir una preparacion de peptidos libre de gluten y preparacion asi obtenida. |
| WO2003048189A2 (fr) * | 2001-12-03 | 2003-06-12 | Diversa Corporation | Produits de fabrication et procedes de synthese peptidique |
| PL2718434T3 (pl) * | 2011-08-10 | 2018-08-31 | University Of Washington Through Its Center For Commercialization | Kompozycje i sposoby leczenia choroby trzewnej |
| EP3520808B1 (fr) | 2013-08-14 | 2021-04-21 | University Of Washington Through Its Center For Commercialization | Compositions pour le traitement de la maladie coeliaque |
| JP7325030B2 (ja) | 2015-06-08 | 2023-08-14 | ユニヴァーシティ オブ ワシントン | セリアックスプルー病を治療するための組成物および方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3482551D1 (de) * | 1983-10-26 | 1990-07-26 | Kanebo Ltd | Proteinhaltiges emulgiermittel, dessen herstellung und dieses enthaltende emulgierte kosmetische zusammensetzung. |
| US5021248A (en) * | 1988-09-19 | 1991-06-04 | Enzytech, Inc. | Hydrophobic protein microparticles and preparation thereof |
| JPH04502102A (ja) * | 1988-09-19 | 1992-04-16 | オプタ・フード・イングリディエンツ・インコーポレーテッド | 疎水性タンパク質微小粒子並びにその調製 |
| US5145702A (en) * | 1988-09-19 | 1992-09-08 | Opta Food Ingredients, Inc. | Hydrophobic protein microparticles and preparation thereof |
-
1992
- 1992-03-09 FR FR9202789A patent/FR2688229B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1993
- 1993-03-02 CA CA002131637A patent/CA2131637A1/fr not_active Abandoned
- 1993-03-02 AU AU36373/93A patent/AU679172B2/en not_active Ceased
- 1993-03-02 WO PCT/FR1993/000213 patent/WO1993018180A1/fr not_active Application Discontinuation
- 1993-03-02 EP EP93905449A patent/EP0630411A1/fr not_active Ceased
- 1993-03-02 JP JP5515385A patent/JPH07504566A/ja active Pending
- 1993-03-02 US US08/295,845 patent/US5554508A/en not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-08-30 NO NO943212A patent/NO943212L/no unknown
- 1994-09-08 FI FI944138A patent/FI944138A/fi not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU679172B2 (en) | 1997-06-26 |
| FI944138A0 (fi) | 1994-09-08 |
| AU3637393A (en) | 1993-10-05 |
| FR2688229A1 (fr) | 1993-09-10 |
| JPH07504566A (ja) | 1995-05-25 |
| WO1993018180A1 (fr) | 1993-09-16 |
| FI944138A (fi) | 1994-09-08 |
| NO943212L (no) | 1994-10-07 |
| US5554508A (en) | 1996-09-10 |
| EP0630411A1 (fr) | 1994-12-28 |
| FR2688229B1 (fr) | 1995-06-23 |
| NO943212D0 (no) | 1994-08-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2131637A1 (fr) | Procede de synthese enzymatique d'esters alkyliques de peptides, produits ainsi obtenus et utilisation desdits produits | |
| JPH10510516A (ja) | アレルゲン性を減らしたポリペプチド | |
| BRPI0611535B1 (pt) | Método para processar células de levedura para produzir beta-glucanos e mananas | |
| JP2002516615A (ja) | 変性ポリペプチド | |
| JPH06116300A (ja) | ケラチンフラグメントおよびその製造方法 | |
| WO2020109741A1 (fr) | Protéine de légumineuse soluble | |
| EP0808332B1 (fr) | Procede de preparation de collagene a partir de cnidaires, et compositions obtenues utilisables en cosmetique | |
| US5929231A (en) | Method for preparing fine-granuled and modified starches | |
| US5801022A (en) | Method of producing a product with crosslinked crystals of thermolysin | |
| Kise | Difference in catalytic activities of subtilisin Carlsberg and subtilisin BPN′ and immobilization-activation for ester synthesis and transesterification in ethanol | |
| FR2804691A1 (fr) | Composition azotee resultant de l'hydrolyse du gluten de mais et son procede de fabrication | |
| FR2541308A1 (en) | Protein hydrolysate free from bitter taste | |
| EP0736102B1 (fr) | Procede d'obtention de produits peptidiques | |
| EP0323930A1 (fr) | Procédé d'élimination de l'amertume d'hydrolysats de protéines et produit obtenu | |
| SU1699401A1 (ru) | Способ получени белкового гидролизата из отходов мехового и кожевенного производства | |
| EP2735235B1 (fr) | Utilisation d'un complexe enzymatique dans l'alimentation des animaux d'élevage | |
| Siswoyo et al. | Synthesis of Antioxidant Peptides from Melinjo (Gnetum gnemon) Seed Protein Isolated Using Sol-Gel Immobilized Alcalase | |
| EP0308330A1 (fr) | Protéines, enzymes, ou micro-organismes immobilisés sur un support à base de gélatine réticulée par un polysaccharide oxydé | |
| RU2679419C1 (ru) | Способ получения биологически активного концентрата из кожи маралов | |
| EP0899331B1 (fr) | Enzyme protéolytique purifiée et procédé de purification | |
| JP3468557B2 (ja) | ムチンの精製方法 | |
| RU2712528C1 (ru) | Способ получения препарата коллагеназы в геле на основе пищевого хитозана и сукцината хитозана | |
| JPH0638733B2 (ja) | 固定化プロテア−ゼによる加水分解グルテンの製造法 | |
| JPH10287697A (ja) | シスチン導入ペプチドおよびその製造方法 | |
| FR2589479A1 (fr) | Nouvel enzyme, son procede d'obtention et son application a la preparation de n-(l-aspartyl-1)l-phenylalaninate de methyle |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EEER | Examination request | ||
| FZDE | Discontinued |