ES2223727T3

ES2223727T3 - Metodo para producir una preparacion de peptidos libre de gluten y preparacion asi obtenida.

Info

Publication number: ES2223727T3
Application number: ES01200387T
Authority: ES
Inventors: Debra Ann Merrill; Edward Allan Hunter
Original assignee: Campina Melkune BV
Current assignee: Campina Melkune BV
Priority date: 2001-01-12
Filing date: 2001-02-02
Publication date: 2005-03-01
Anticipated expiration: 2021-02-02
Also published as: US20040254109A1; DE60105753T2; EP1224869B1; EP1224869A1; US6692933B2; DK1224869T3; DE60105753D1; US20020165125A1; ATE276672T1

Abstract

Un método para producir una preparación de péptidos rica en glutamina y libre de gluten a partir de proteína de gluten, que comprende las etapas de: a) hidrolizar enzimáticamente gluten usando una o más proteasas para obtener un hidrosilato; b) acidificar el hidrosilato hasta un pH entre 4 y 5; y c) filtrar el hidrosilato para obtener como filtrado la preparación de péptidos rica en glutamina y libre de gluten.

Description

Método para producir una preparación de péptidos libre de gluten y preparación así obtenida.

La presente invención se refiere a un método para producir una preparación de péptidos que es rica en glutamina y a la vez está libre de gluten, y a la preparación así obtenida. La invención también se refiere al uso de la preparación en diversos productos y a los productos que contienen la preparación.

El gluten es una combinación de proteínas que se encuentra en el endosperma de varias plantas, tales como el trigo, la cebada y el centeno, avenas y otras variantes de trigo que contienen gluten, tales como el triticale, el spelt y el kamut. En el trigo, el gluten suma el 90% de las proteínas y supone hasta casi el 15% del peso total del grano. Por tanto, es una importante fuente de proteínas.

Sin embargo, el gluten es la causa de un desorden genético conocido como enfermedad celíaca o intolerancia al gluten. Los síntomas de la enfermedad celíaca pueden ir desde los efectos clásicos, tales como diarrea, pérdida de peso, y malnutrición, hasta síntomas latentes tales como deficiencias nutrientes aisladas. La enfermedad afecta principalmente a personas de procedencia europea, y se manifiestas más difícilmente en poblaciones negras o asiáticas. Los afectados sufren daños en las vellosidades (reducción de la longitud y aplanamiento de las mismas) en las regiones de lámina propia y cripta de sus intestinos, cuando comen los antígenos específicos de comida en grano (secuencias de aminoácidos tóxicas) que se encuentran en el trigo, el centeno, y la cebada, avenas y otras variantes de trigo que contienen gluten, tales como el triticale, el spelt y el kamut. El gluten que se encuentra en el arroz y el maíz no causa la intolerancia.

Para personas con la enfermedad celiaca, la parte tóxica de la molécula de gluten es la porción de prolamina: gliadina en el trigo, secalina en el centeno y horedina en la cebada. Después de una dieta libre de gluten, la gente puede recuperarse de los síntomas de la enfermedad, pero no pueden ser curados. La reintroducción de gluten en la dieta volverá a dar lugar a los síntomas.

La glutamina es un aminoácido que existe en abundancia en el gluten. Aunque no es un aminoácido esencial, es deseable en cualquier caso para determinados individuos, en particular para aquellos que se están recuperando de cirugía, que sufren desórdenes gastrointestinales, deficiencias en la función inmune, estados de estrés metabólico, estado de shock o que realizan deportes de resistencia. Dichos individuos se beneficiarían de un suplemento de este aminoácido, por ejemplo tomando una preparación de péptidos rica en glutamina. El documento EP0672352 describe un proceso para la preparación de mezclas de péptidos ricas en glutamina, que comprende someter una proteína rica en glutamina (por ejemplo, proteína de trigo) a hidrólisis mediante una endopeptidasa (por ejemplo, papaina), disminuyendo el pH hasta 4.0, calentando para desactivar la enzima y centrifugando para eliminar parcialmente el material sin disolver.

El gluten es una fuente muy interesante económicamente de dichas preparaciones de péptidos ricas en glutamina. Sin embargo, las preparaciones conocidas no son adecuadas para pacientes celiacos puesto que todavía contienen las partes tóxicas de la gliadina.

Por lo tanto, el objetivo de la presente invención es proporcionar una preparación de péptidos que sea rica en glutamina ligada, pero al mismo tiempo esté libre de gluten.

Dicha preparación de péptidos puede ser obtenida mediante un método, que comprende las etapas de:

a): Hidrolizar enzimáticamente el gluten, usando una o más proteasas para obtener un hidrolisato;

b): Acidificar el hidrolisato hasta un pH entre 4 y 5; y

c): Filtrar el hidrolisato para obtener la preparación de péptidos libre de gluten y rica en glutamina como filtrado.

Se pretende que el término "libre de gluten" indique que cuando el producto es evaluado en un ELISA en base a anticuerpos de anti-\Omega-gliadina dé como resultado un valor de < 200 ppm. Un ELISA adecuado para evaluar la propiedad de estar libre de gluten es el descrito en la Association of Official Analytical Chemists' (AOAC's) Official Methods of Analysis, 15^{a} Edición, 2º suplemento (1991).

Está claro que las proteasas que van a usarse pueden ser seleccionadas de un amplio abanico de proteasas conocidas en la técnica, puesto que la hidrólisis realizada con dicha proteasa da como resultado una preparación que proporciona < 200 ppm en el anteriormente descrito ELISA. Las proteasas incluyen proteasas ácidas, básicas y neutras procedentes de fuentes bacterianas, fúngicas, animales o botánicas. Se descubrió que las proteasas neutras o básicas activas a un pH por encima de 6 son particularmente muy adecuadas. Ejemplos de dichas proteasas son Proleather N (Amano), Neutrase (NOVO), PROMOD 192P (Biocatalysts), Alcalase 2.4L (NOVO), Protease S (Amano), Peptidase A (Amano), Peptidasa R (Amano). De todas ellas, las proteasas preferidas son: Proleather N (Alamo) y Alcalase 2.4L (NOVO).

Sorprendentemente, los fragmentos de proteína que provocan hipersensibilidad en los pacientes celiacos son eliminados cuando el hidrosilato es acidificado y posteriormente filtrado. El pH al que se acidifica el hidrosilato cae entre 4 y 5, preferiblemente entre 4.1 y 4.9, más preferiblemente entre 4.3 y 4.8, aún más preferiblemente entre 4.5 y 4.7, y, de forma óptima, es 4.6.

La hidrólisis es una etapa esencial en el método de la invención, puesto que sin hidrólisis los fragmentos tóxicos no pueden ser eliminados.

Las preparaciones de péptidos que se pueden obtener mediante el método de la invención, que consisten en péptidos que no inducen síntomas de hipersensibilidad al gluten en los pacientes celiacos, constituyen un aspecto adicional de esta invención. Dichas preparaciones son adecuadas como aditivo de alimentos o como materia de alimento para suministrar glutamina adicional a un sujeto. Por tanto, la preparación tiene aplicaciones deportivas y clínicas, y puede ser usada en nutrición enteral y en comida para mascotas.

La preparación de péptidos de la invención puede ser usada en otros productos adicionales que pueden ser tomados o administrados a sujetos que necesiten un suplemento. Realizaciones particulares de dichos productos son las pastillas de péptido de glutamina que comprenden los vehículos, diluyentes y excipientes habituales para pastillas y una preparación de péptidos de la invención como fuente de péptidos de glutamina, una bebida líquida de péptidos de glutamina que comprende los ingredientes habituales en bebidas y una preparación de péptidos de la invención como fuente de péptidos de glutamina, y una nutrición enteral de péptidos de glutamina que comprende los vehículos, diluyentes y excipientes habituales para la nutrición enteral, y una preparación de péptidos de la invención como fuente de péptidos de glutamina.

Aunque la invención es más ampliamente aplicable al gluten procedente de todos los granos que pueden causar la enfermedad celiaca, se prefiere el uso de trigo debido a su elevado contenido en glutamina.

La presente invención será presentada más en detalle en los siguientes ejemplos, que se muestran solo a modo de ilustración y en modo alguno pretenden limitar el alcance de la invención.

Ejemplos Ejemplo 1 Producción de una preparación de péptidos libre de gluten y rica en glutamina

Se llevó a cabo una serie de experimentos para ilustrar los parámetros críticos del proceso.

Se produjo una serie de hidrosilatos de péptido calentando agua desionizada hasta una temperatura de 63ºC \pm 1ºC. A este agua se añade una mezcla de hidróxido de potasio líquido al 45%, hidróxido de sodio al 50%, e hidróxido de calcio hidratado en una proporción de 1:0,78:0,70, respectivamente, para obtener un pH adecuado para la proteasa que se va a utilizar.

Se añade gluten de trigo vital ("VWG", Cargill B. V., Bergen op Zoom, Holanda) a esta disolución para producir una mezcla de sólidos del 12% de gluten solubilizado.

Se lleva a cabo la hidrólisis con la proteasa deseada, tal como se indica en la descripción de los experimentos anexa mostrada más adelante. La reacción de hidrólisis se lleva a cabo durante 3 horas a una temperatura que es adecuada para la proteasa usada, habitualmente de 60ºC \pm 2ºC.

Después de la hidrólisis, se añade ácido, en particular ácido sulfúrico, para alcanzar el pH deseado (véase la descripción de experimentos) con agitación. La reacción es detenida mediante un HTST (tiempo corto a elevada temperatura, del inglés "high temperature short time") calentando a 116ºC \pm 2ºC. Posteriormente, la disolución es enfriada hasta 66ºC \pm 2ºC y filtrada usando tierra diatomácea (Eagle-Picher Minerals Inc., Reno, NV, EE.UU.) a un 40% de alimento corporal. La disolución es recirculada a través de un filtro prensa durante un mínimo de 3 minutos.

El pH del filtrado es ajustado a 6,4-6,8 mediante una disolución alcalina. Después de evaporar el líquido y secar, se obtiene una preparación de péptidos en polvo de la invención.

Con el objetivo de evaluar si el producto está libre de gluten, se realizó un ensayo ELISA de acuerdo con AOAC 991.19 (Official Methods of Analysis (1990), 15^{a} Edición, 2º suplemento (1991)).

El contenido de glutamina ligada fue determinado de acuerdo con P. E. Wilcox, "Determination of Amide Residues by Chemical Methods", Methods of Enzymology, 11, 63-76 (1967).

Una medida del grado de hidrólisis de la proteína es la relación AN/TN. AN es el nivel de nitrógeno-amino, que puede ser determinado usando el método de titración de formol, o de acuerdo con J. Adler-Nissen, Enzymatic hydrolysis of food proteins. Elsevier Applied Science Publishers, 1986. TN es el contenido total de nitrógeno-amino que es determinado de acuerdo con el método Kjeldahl de determinación de nitrógeno. Cuanto mayor es la relación AN/TN, mayor es el grado de hidrólisis de la preparación de proteínas.

Experimentos

Experimento 1

Se dispersa gluten de trigo en agua. Se ajusta el pH a 4,6 con ácido sulfúrico y la disolución es filtrada.

Experimento 2

Se dispersa gluten de trigo en agua. Se ajusta el pH a 3,2-3,4 con ácido sulfúrico. El gluten es digerido usando Acid Protease II (Amano). La enzima es desactivada con calor y la disolución es filtrada.

Experimento 3

Se dispersa gluten de trigo en agua cáustica. El gluten es digerido usando las proteasas alcalinas y neutras Alcalase 2.4L (NOVO) y Proleather N (Amano), y amilasas BAN 240L (NOVO). Después de la desactivación de la enzima, el pH es ajustado hasta aproximadamente pH neutro con ácido sulfúrico, y la disolución es filtrada.

Experimento 4

Se dispersa gluten de trigo en agua cáustica. El gluten es digerido usando las proteasas alcalinas y neutras Alcalase 2.4L (NOVO) y Proleather N (Amano). Se ajusta el pH a 3,8-4,1 con ácido sulfúrico. Después de desactivar con calor la enzima, la disolución es filtrada. A continuación el pH es ajustado a pH neutro con sosa cáustica.

Experimento 5

Se dispersa gluten de trigo en agua cáustica. El gluten es digerido usando las proteasas alcalinas y neutras Alcalase 2.4L (NOVO) y Proleather N (Amano). El pH es ajustado a pH neutro usando sosa cáustica.

Experimento 6

Se dispersa gluten de trigo en agua cáustica. El gluten es digerido usando las proteasas alcalinas y neutras Alcalase 2.4L (NOVO) y Proleather N (Amano). Se ajusta el pH a 4,3 con ácido sulfúrico. Después de desactivar con calor las enzimas y de filtrar, el pH es ajustado a pH neutro usando sosa cáustica.

Experimento 7

Se dispersa gluten de trigo en agua cáustica. El gluten es digerido usando las proteasas alcalinas y neutras Alcalase 2.4L (NOVO) y Proleather N (Amano). Posteriormente se ajusta el pH a 4,5 con ácido sulfúrico. Después de desactivar con calor a las enzimas y de filtrar, se ajusta el pH de nuevo a un pH neutro usando sosa cáustica.

Experimento 8

Se dispersa gluten de trigo en agua cáustica. El gluten es digerido usando las proteasas alcalinas y neutras Alcalase 2.4L (NOVO) y Proleather N (Amano). El pH es ajustado a 4.6 con ácido sulfúrico. Después de desactivar mediante calefacción las enzimas la disolución es filtrada. A continuación el pH es ajustado a pH neutro usando sosa cáustica.

Experimento 9

Se dispersa gluten de trigo en agua cáustica. El gluten es digerido usando las proteasas alcalinas y neutras Alcalase 2.4L (NOVO) y Proleather N (Amano). El pH se ajusta a 4,8 con ácido sulfúrico. Después de desactivar con calor las enzimas y de filtrar, el pH es ajustado hasta pH neutro usando sosa cáustica.

La Tabla 1 muestra el resultado de los experimentos. Es evidente a partir del ejemplo anterior que tanto la hidrólisis del gluten como la filtración a un pH ácido son esenciales para que el producto esté libre de gluten.

TABLA 1

Muestra	AN (%)	Gluten (ppm)	Glutamina ligada (%)
1	0,5	1200	19
2	0,67	>320	31
3	1,4	438	25
4	1,62	300	25
5	1,59	310	27

TABLA 1 (continuación)

Muestra	AN (%)	Gluten (ppm)	Glutamina ligada (%)
6	1,7	<20	28
7	2,03	<20	27
8	1,95	<20	26
9	1,96	<20	27
TN = 13%

Ejemplo 2 Aplicación de la preparación de péptidos libre de gluten y rica en glutamina de la invención

A continuación se presentan tres ejemplos de aplicaciones de la preparación de la invención.

1. Pastillas de Péptidos de Glutamina Ingredientes

(1) Proteína de Trigo Hidrolizada Enzimáticamente (granular) (preparación de acuerdo con la invención).

(2) Pharmacel 102.

(3) CAB-O-SIL M-5.

Receta

Proteínas de trigo hidrolizada enzimáticamente (1)	91,1%
Celulosa microcristalina (2)	5,0%
Fosfato de dicalcio	2,0%
Dióxido de silicio (3)	0,9%
Ácido esteárico	0,5%
Estearato de magnesio	0,5%
Total	100,0%

Método de preparación

Los polvos son mezclados previamente (dejando el estearato de magnesio para los últimos minutos de mezcla). Las pastillas son preparadas por compresión directa.

Propiedades de las pastillas:
Péptidos de Glutamina por pastillas	170 mg
Peso de la pastilla	758 mg
Longitud de la pastilla (Rectángulo)	19,04 mm
Presión de compresión	13,3 kN
Dureza	140 N

2. Bebida Líquida de Péptidos de Glutamina Ingredientes

(1) Proteína de trigo hidrolizada enzimáticamente (preparación de la invención).

(2) Proteína de suero hidrolizada enzimáticamente (WE80BG, DMV International).

(3) Aromatizante de fruto de uva Tastemaker 946068.

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Receta

Agua (QS hasta 1 litro)	920,00 g \;
Gluten de Trigo Hidrolizado Enzimáticamente (1)	13,21 g \;
Suero Hidrolizado Enzimáticamente (2)	13,04 g \;
Sacarosa	26,60 g \;
Glucosa	15,00 g \;
Fructosa	5,00 g \;
Polímeros de Glucosa (Maltodextrin DE18)	10,00 g \;
Ácido Málico	3,33 g \;
Ácido Cítrico	0,67 g \;
Citrato de Sodio	1,00 g \;
Aromatizante de fruto de uva (3)	0,60 g \;
Aspartame	0,10 g \;
Acesulfame de potasio	0,10 g \;
	1000,00 ml

Método de preparación

Todos los ingredientes son añadidos al agua y bien mezclados. Los ácidos son añadidos al final para alcanzar un pH de 3,9. El líquido es embotellado, procesado con calor durante 1 minutos a 85ºC y enfriado

Información nutricional (por 100 ml):
Proteínas	2,09 g
Péptidos de Glutamina	0,26 g
Carbohidratos	6,0 g

3. Prototipo de Nutrición Enteral Clínica con Péptidos de Glutamina y Péptidos de Suero Ingredientes

Receta

Agua (QS hasta 1 litro)	720,00 g \;
Gluten de Trigo Hidrolizado Enzimáticamente (1)	40,00 g \;
Suero Hidrolizado Enzimáticamente (2)	35,60 g \;
Almidón de comida, Modificado	84,00 g \;
Maltodextrina	59,00 g \;
Aceita de soja	30,00 g \;
Aceite MCT	10,00 g \;
Citrato de Potasio	2,20 g \;
Citrato de Sodio	1,60 g \;
Cloruro de Magnesio	3,20 g \;
Fosfato de Calcio	2,80 g \;
Fosfato de Potasio	2,00 g \;
Fosfato de Sodio	1,00 g \;
Carrageno	0,50 g \;
	1000,00 ml

Método de preparación

Los minerales son disueltos en agua bajo agitación constante. Los carbohidratos premezclados son añadidos a la mezcla. La mezcla es calentada a 70ºC y mantenida durante 10 minutos con agitación constante. La proteína es añadida a la mezcla, que a continuación es calentada a 70ºC con agitación constante. Se añade el aceite a la mezcla, que a continuación es agitada a conciencia. A continuación la mezcla es doblemente homogeneizada a 4000 psig (276 bar). Se ajusta el pH al valor apropiado. El contenido de sólidos es ajustado a un valor apropiado. El producto es esterilizado y el calentado mediante un proceso de calefacción a 121ºC durante 10 minutos.

Información nutricional (por 100 ml):
Proteínas	6,0 g
Péptidos de Glutamina	1,0 g
Carbohidratos	13,8 g
Grasas	4,0 g

Claims

1. Un método para producir una preparación de péptidos rica en glutamina y libre de gluten a partir de proteína de gluten, que comprende las etapas de:

a): hidrolizar enzimáticamente gluten usando una o más proteasas para obtener un hidrosilato;

b): acidificar el hidrosilato hasta un pH entre 4 y 5; y

c): filtrar el hidrosilato para obtener como filtrado la preparación de péptidos rica en glutamina y libre de gluten.

2. Un método como el reivindicado en la reivindicación 1, en el que las proteasas son proteasas alcalinas o neutras.

3. Un método como el reivindicado en la reivindicación 1 ó 2, en el que el pH está entre 4,2 y 4,8.

4. Un método como el reivindicado en la reivindicación 1-3, en el que el pH está entre 4,5 y 4,7.

5. Un método como el reivindicado en la reivindicación 1-4, en el que las proteasas son usadas de tal modo que son activas a un pH por encima de 6.

6. Un método como el reivindicado en la reivindicación 1-5, en el que entre la etapas b) y c) las enzimas son desactivadas.

7. Un método como el reivindicado en la reivindicación 6, en el que las enzimas son desactivadas por medio de calor.

8. Un método como el reivindicado en las reivindicaciones 1-7, en el que el gluten es gluten de trigo.

9. Una preparación de péptidos preparada a partir de proteína de gluten, que es rica en glutamina y está libre de gluten y que se puede obtener mediante un método como el reivindicado en las reivindicaciones 1-8.

10. Una preparación de péptidos como la reivindicada en la reivindicación 9, en la que el gluten a partir del cual es fabricada la preparación es gluten de trigo.

11. Una preparación de péptidos como la reivindicada en las reivindicaciones 9 y 10 para su uso como un ingrediente en pastillas de péptidos de glutamina.

12. Una preparación de péptidos como la reivindicada en las reivindicaciones 9 y 10 para su uso como un ingrediente de bebidas líquidas de péptidos de glutamina.

13. Una preparación de péptidos como la reivindicada en las reivindicaciones 9 y 10 para su uso como un ingrediente en nutrición enteral de péptidos de glutamina.

14. Pastillas de péptidos de glutamina que comprenden los vehículos, diluyentes y excipientes habituales para pastillas y una preparación de péptidos como la reivindicada en las reivindicaciones 9 y 10 como fuente de péptidos de glutamina.

15. Una bebida líquida de péptidos de glutamina que comprende los ingredientes habituales de bebidas y una preparación de péptidos como la reivindicada en las reivindicaciones 9 y 10 como fuente de péptidos de glutamina.

16. Una nutrición enteral de péptidos de glutamina que comprende los vehículos, diluyentes y excipientes habituales de nutriciones enterales y una preparación de péptidos como la reivindicada en las reivindicaciones 9 y 10 como fuente de péptidos de glutamina.