JPH10510516A

JPH10510516A - アレルゲン性を減らしたポリペプチド

Info

Publication number: JPH10510516A
Application number: JP8517266A
Authority: JP
Inventors: アゲルリンオルセン，アルネ; ボーエル．ハンセン，ラルス; クリスチャンベク，トーマス
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1994-12-07
Filing date: 1995-12-07
Publication date: 1998-10-13
Also published as: AU4114496A; CN1168694A; EP0796324A1; MX9704137A; FI972443A; US6201110B1; FI972443A0; WO1996017929A1; CA2206852A1; US5981718A; US5856451A; US6114509A; AU697440B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、1 kDa 〜60 kDaの範囲の分子量（Ｍ_r）を有するポリマーに結合された10 kDa〜100 kDa の分子量を有する親のポリペプチドを含んで成る、アレルゲン性を減らした改変ポリペプチドに関する。前記改変ポリペプチドは、親のポリペプチド１分子を１〜30分子のポリマー分子と結合させる段階を含んで成る方法を使って製造される。更に本発明は、前記ポリペプチドと、例えば洗剤、例えば食器洗い洗剤および固形石鹸、家庭用品、農薬、個人管理用品、化粧品、洗面用化粧品、口腔および皮膚用医薬品、織物加工用組成物、並びに食品および飼料を製造するのに使われる組成物において常用される、追加の成分とを含んで成る組成物にも関する。最後に、本発明は、多数の工業的用途の製品のアレルゲン性を減らす目的でのアレルゲン性を減らしたポリペプチドまたはその組成物の利用にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】アレルゲン性を減らしたポリペプチド発明の分野本発明は、アレルゲン性を減らした改変ポリペプチド、例えばタンパク質または酵素に関する。更に本発明は、アレルゲン性を減らした前記改変ポリペプチドの製造方法、およびその組成物にも向けられる。最後に、本発明はアレルゲン性を減らした前記改変ポリペプチドまたはその組成物の利用法に関する。発明の背景微生物により工業生産されている工業用品、家庭用品、食料品／飼料、化粧品または医薬品などに使われるポリペプチド（タンパク質および酵素を含む）の数は増加している。前記ポリペプチドは、或る状況下では、特にポリペプチドを含む製品の製造を行う被雇用者に、およびそれらの製品の使用者（例えば美容師）と化粧品や洗面用化粧品の最終使用者にもある程度、潜在的危険性を与えることがある。この先在的危険性は抑制および／または制限することが必要である。ポリペプチドのアレルゲン性一般に、ポリペプチドは潜在的な抗原であって、暴露されるとヒト免疫系はそれに対して特異抗体を生産し得る。臨床上有益な応答が得られる時にはこの過程は「免疫」として知られ、一方該応答が結果として過敏症になる時は「感作」という用語が使われる。初回暴露の間に特異的Ｂ細胞クローンのクローン選別と増殖が始まるが、これは防御またはアレルギー応答が次回の暴露の時にのみ臨床的に表れるだろうことを意味する。アレルギー反応は、他の場合には無害である物質により低濃度で惹起される異常な免疫応答として定義することができる。 IV型過敏症に至る感作の過程は特異的ＩｇＥ抗体の形成により特徴付けられる。現在のところ、サブクラス移行を制御する機構は完全には解明されていない。活性化Ｂ細胞から分泌されたＩｇＥは、化学的媒介物質（例えばヒスタミン）が詰められた無数の細胞質顆粒を含む好塩基性顆粒球とマスト細胞の表面上にあるＦｃεレセプターに結合することができる（J．Klein，“Immunology”，Blac kwell Sci．Pub.，London，1990；E．Benjamini & S．Leskowitz，“Immunology ”，Wiley-Liss，N.Y.，1991）。アトピー性個体では、それらの細胞の各々がその表面に結合した多数のＩｇＥ分子を有し、それらは何週間もアレルゲンと相互作用できる利用可能なままであることができる。アレルゲンと接触すると、表面結合型ＩｇＥがアレルゲンを架橋結合し、細胞質顆粒を該細胞の付近に放出させ、それによって炎症性のアレルギー反応を引き起こす。ＩｇＥの役割は寄生虫感染に対する天然の免疫防御系に関連することが証明されており、アレルギーの発生はこの防御機構の不運な副産物であると提唱されている。ＩｇＥ媒介型過敏症を引き起こす天然のアレルゲンは、それらの暴露方法に従って分類することができる：吸入アレルゲン（花粉、埃など）；摂取アレルゲン（牛乳、卵など）；接触アレルゲン（例えばラテックス）；および刺す昆虫からのアレルゲン（例えばハチ、アリなど）。空中アレルゲンは、工業用ポリペプチドの先在的高危険性の範囲を強調する、臨床的にずば抜けて大きいグループを表す。アレルギー試験は、生体内誘発試験として、または最も普通には主として末梢血中のＩｇＥ濃度に基づいた多数の試験管内アッセイによる皮膚接種試験として行うことができる。後者の領域での多大な努力にもかかわらず、最も信頼できるアレルギー診断方法はまだ生体内誘発試験（チャレンジ）であり、この方法は選んだ標的器官に応じて異なるレベルの感受性を有する。例えば、アレルゲンタンパク質を使った鼻内チャレンジは、特異的血清ＩｇＥについての皮膚試験やRAST（radioallergosorbent test）が陰性であっても、アレルギー応答を誘発し得る（Ivan Roitt，“Essential Immunology”，第５版， 152 頁と240 頁，1984年）。ポリペプチドのアレルゲン性の削減現在、工業用ポリペプチドに対するアレルギー応答の発生は、特に空気伝染物質の形成を避けるために、生成物を固定化し、造粒し、コーティングし、または溶解することによって回避されている。それらの方法はどうしても処理や加工の最中に粉塵またはエーロゾル形成の危険を有し、その後のアレルギー感作の危険を伴う。どうやってもポリペプチド微粉末またはエーロゾル形態の溶解ポリペプチドを有する危険がまだあるだろう。従って、感作やその後のアレルギー反応を引き起こす可能性のある何らかの酵素の放出が起こり得る。この問題点を軽減する別の方法は、ヒト起源のポリペプチドを例えば細菌、真菌、酵母または哺乳類細胞培養物中での生産に使うことであった。これは、ヒトに対する問題を軽減することができるが動物に対してはできない。更に、所望の性質を有するヒト起源のポリペプチドを見つけることは多くの場合不可能であろうから、他の起源を考えなくてはならない。これは、所望する性能を与える、分子中の１または複数の位置が変更されているヒトポリペプチドであることができる。他の種、例えば細菌、カビなどからの分子であってもよい。後者の生成物群は全て哺乳類における免疫感作能力を有するだろう。アレルゲン性を減少させるための他の提案は、タンパク質分子の大きさを縮小することであった（例えば日本国特許公開第4,112,753 号または調査報告第335, 102 号）。しかしながら、これはタンパク質の活性が重要性を持たない時、またはタンパク質の分解にもかかわらずタンパク質の活性が保持されるような稀な場合、にのみ利用できる解決策である。エピトープマッピングとその後のアレルゲン性エピトープの変更を通してタンパク質のアレルゲン性を減らすためにタンパク質工学の適用が提案されている〔 WO 92/10755(Novo Nordisk A/S)を参照のこと〕。この手法は一般に研究と開発に多大な投資を必要とする。医薬分野では、ポリペプチドへのポリマー分子の結合を通してポリペプチドの免疫原性を減らすという提案が行われている。これは一般にポリペプチドと他の高分子構造との相互作用を妨害する効果を有する。そのような結合体は新規性質を示すこともできる：例えばヨーロッパ特許第38 154号（Beecham Group Ltd.）は免疫抑制性を有するポリサルコシンとアレルゲンの結合体を開示している。米国特許第4,179,337 号（Davis他）は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコールに結合させた酵素およびペプチドホルモンといった非免疫原性ポリペプチドに関する。ポリペプチド１モルあたり10〜100 モルのポリマーが使われ、生理活性の少なくとも15％が維持される。加えて、問題のポリペプチドのＰＥＧ−結合体のサイズが増加したために、循環中のクリアランス時間が延長される。保護されたポリペプチドは水溶液中で哺乳類循環系にまたは筋肉内に注入される。経皮注射試験から免疫原性が評価される。米国特許第4,179,337 号は療法的適用と対応する生理活性の保持に関する。療法的適用の状況下では、アレルゲンの経皮、静脈内または皮下暴露によって引き起こされる免疫応答を与える危険性を制限することが重要である。しかしながら、吸入アレルゲンを抑制することは全く重要でない。更に、ポリペプチドに結合させるのに必要なポリマーの相対量は該方法を高価なものにする。 WO 93/15189（Veronese 他）は、タンパク質分解酵素を高分子阻害剤と結合することによるポリエチレングリコール改変タンパク質分解酵素の活性を維持する方法に関する。この結合体は医療用途のためのものである。一般にポリマーへのポリペプチドの結合は、該ポリペプチドの活性を減少させるかまたは該ポリペプチドとそれの基質との相互作用を妨害するという作用がある。ヨーロッパ特許第183 503 号（Beecham Group PLC）は、可逆性結合基によって少なくとも１つの水溶性ポリマーに連結された医薬上有用なタンパク質を含んで成る結合体を提供することによる上記概念の発展を開示している。英国特許第1,183,257 号（Crook 他）は、トリアジン環を経由した酵素と多糖の結合のための化学を記載している。ヨーロッパ特許第471 125 号（Kanebo，LTD）は、抗原性および皮膚過敏性に対して抑制効果をもたらす、トリアジン環経由で多糖に連結された改変プロテアーゼを記載している。使用した多糖は少なくとも10 kDaの平均分子量を有する。改変プロテアーゼ中の表面アミノ酸基の改変率は少なくとも30％である。一般に気管に入るアレルゲンは、原形質膜を透過しそしてアレルギー反応を引き起こすために約100 kDa より小さい分子量でなければならないと思われる。 Folkeson他，Acta Physiol．Scand，139，第437-354 頁，1990年は、点滴注入したタンパク質マーカーの分子量と気管から血流中への運搬量（生物学的利用能）との間に逆比例関係があることを示した。 WO 94/10191(Novo Nordisk A/S)は、低アレルゲン性タンパク質の製造方法であって、親の単量体タンパク質分子を一緒に連結してオリゴマーを形成させる方法を開示している。これは、例えばリンカーもしくはスペーサー分子を使うことによって、または第一の単量体のＣ末端と第二の単量体のＮ末端の間をペプチド結合によって両単量体分子を一緒に連結せしめることにより行われる。ヨーロッパ特許第215 662 号（Masda，Hiroshi）は、抗腫瘍剤のような薬剤に使われる、微生物由来の改変または未改変プロテアーゼに関する。プロテアーゼの改変は、例えば多糖とのカップリング、疎水性高分子基の導入、2 kDa 未満の分子量の低分子量抗腫瘍剤との結合により達成することができる。ポリマーの活性化ポリマーの活性化並びにタンパク質の結合のための方法および化学は文献中に広く記載されている。不溶性ポリマーの活性化に常用される方法としては、臭化シアン、過ヨウ素酸塩、グルタルアルデヒド、バイエポキシド、エピクロロヒドリン、ジビニルスルホン、カルボジイミド、ハロゲン化スルホニル、トリクロロトリアジンなどを使った官能基の活性化が挙げられる〔R.F．Taylor(1991)，“P rotein immobilisation．Fundamental and applications”，Marcel Dekker，N. Y．；S.S．Wong(1992)，“Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinkin g”，CRC Press，Boca Raton；G.T．Herm anson 他(1993),“Immobilized Affinity Ligand Techniques”，Academic Pres s，N.Y．を参照のこと〕。該方法の幾つかは不溶性ポリマーの活性化に関するが、可溶性ポリマーの活性化にも適用できる（例えば過ヨウ素酸塩、トリクロロトリアジン、ハロゲン化スルホニル、ジビニルスルホン、カルボジイミド等）。ｉ）ポリマーの活性化、ii）結合、およびiii）残余活性基のブロッキングから通常成る活性化および結合化学を選択する際には、アミノ、ヒドロキシル、チオール、カルボキシル、アルデヒドまたはスルフヒドリルであるポリマー上の官能基とタンパク質上の特定の結合基を考慮に入れなければならない。活性化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の合成に関して幾つかの概説および研究論文が発表されている〔Harris(1985)，JMS-REV．Macronol．Chem．Phys．C 25，325-373；Scouten(1987)，Methods in Enzymology，135，Mosbach，K.編，A cademic Press，Orland 30-65；Wong 他，(1992)，Enzyme Microb．Technol.，1 4，866-874；Delgado他，(1992)，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carr ier Systems，9，249-304；Zalipsky(1995)，Bioconjugate Chem.，6，150-165 〕。ポリマーの活性化方法はWO 94/17039 、米国特許第5,324,844 号、WO 94/1824 7 、WO 94/04193 、米国特許第5,219,564 号、米国特許第5,122,614 号、WO 90/ 13540（Enzon）および米国特許第5,281,698 号(Cetus)並びに更にWO 93/15189(V eronese)中にも見つけることができ、そして活性化ポリマーと酵素との結合、例えば第VIII凝固因子（WO 94/15625）、ヘモグロビン（WO 94/09027）、酸素運搬分子（米国特許第4,412,989 号）、リボヌクレアーゼおよびスーパーオキシドジスムターゼ（Veronese他，App．Biochem．Biotech．，11，p.141-45，1985）との結合方法も見つけることができる。従来技術の目的関連する従来技術は、療法目的での使用においてポリペプチド、タンパク質および／または酵素の免疫応答または過敏症（アレルギー）を減少させることに関し、これはアレルゲンを皮内、静脈内または皮下に提供する時に関連する。しかしながら、従来技術は、潜在的にアレルギーを引き起こし得る工業的用途での、または最終使用者がポリペプチドに暴露され得るような用途での、例えば洗剤、洗浄剤、洗面用化粧品および他の個人管理用品（パーソナルケア用品）の使用の際の、アレルゲンの提示には関係がない。従って、吸入した時に減少したアレルギー応答を有し、そしてポリペプチドがそれらの触媒活性を実質的に維持している非療法的工業的用途でのポリペプチド、タンパク質および／または酵素を提供できることは望ましいだろう。発明の要約驚くべきことに、本発明者らは触媒活性を実質的に維持しているアレルゲン性を減らした改変ポリペプチドをここに提供する。まず初めに、本発明は、1 kDa 〜60 kDaの範囲内の分子量を有するポリマーに結合された10 kDa〜100 kDa の分子量を有する親のポリペプチドを含んで成る、アレルゲン性を減らした改変ポリペプチドに関する。本発明の好ましい態様では、前記ポリペプチドがタンパク質または酵素である。本発明は、１分子の親のポリペプチドに１〜30分子のポリマー分子を結合させる段階を含んで成る、アレルゲン性を減らした前記改変ポリペプチドの製造方法にも向けられる。更に本発明は、前記ポリペプチドおよび／または他の酵素／ポリペプチドおよび／または例えば洗剤（食器洗い用洗剤と石鹸を含む）、家庭用品、農薬、個人管理用品（洗浄剤、例えばコンタクトレンズ用洗浄剤を含む）、化粧品、洗面用化粧品、口腔および皮膚用医薬品、織物加工用組成物、並びに食品および飼料を製造するのに使われる組成物（例えばベーキング用組成物）に一般に使われる成分、を含んで成る組成物を提供する。最後に、本発明は、アレルゲン性を減らしたポリペプチド、タンパク質または酵素の莫大な数の工業的用途への利用に関する。図面の簡単な説明図１は、酵素に気管内暴露する予定であるラットの断面図を示す。図２は、改変Subtilisin Novo と親のSubtilisin Novo に対するBrown Norway ラット血清の特異的ＩｇＥ応答を示す。するBrown Norwayラット血清の特異的ＩｇＥ応答を示す。図４は、改変ラッカーゼと親のラッカーゼに対するBrown Norwayラット血清の特異的ＩｇＥ応答を示す。するBrown Norwayラット血清の特異的ＩｇＥ応答を示す。発明の詳細な説明本発明者らは、驚くべきことに、触媒活性が少なくとも実質的に維持されているアレルゲン性を減らした改変ポリペプチドを提供することに成功した。本発明のそれらのアレルゲン性を減らした改変ポリペプチドは、様々な非療法的用途において吸入するとアレルゲンが与え得る上述の問題の幾つかを解決する。非療法的用途については、アレルギー応答の危険性を課し得るのは主としてアレルゲンの吸入であるということを強調しなければならない。従って、本発明の重要な利点の１つは、アレルゲン性という面でアレルゲンの吸入（気管内および鼻内授与を含む）が主問題である時、本発明者らが多数の工業的用途の中のポリペプチドの主問題の１つを解決したことであると理解すべきである。それとは異なり、従来技術の解決策は主としてアレルゲンの皮内、静脈内または皮下提供が主問題である療法的用途に関連する。更に、アレルゲンの吸入はずっと敏感な問題である。通常療法目的での生産を検討する時、キログラム規模での酵素の生産を考えるが、工業目的での生産は何千キログラムの生産を考える。療法目的に使われる技術はいつも工業目的に適するわけではない。「アレルゲン性を減らした」という用語は、本発明の改変ポリペプチドを吸入した時に、対応する親のポリペプチドに比べて、アレルギー状態を引き起こし得る産生ＩｇＥ（ヒトの場合；特殊動物では同等の効果を有する分子）の量が少なくなることを意味する。「免疫原」、「抗原」および「アレルゲン」という用語を下記に定義する。「免疫原」という用語はより広範な語であり、「抗原」と「アレルゲン」を包含する。「免疫原」は、ヒトを含む動物に導入した時に免疫応答を刺激することができる物質として定義することができる。「抗原」という語は、非自己分子として認識されると独力で抗体を産生することができる物質を指す。また、「アレルゲン」という語は、ＩｇＥ抗体（ヒトの場合；動物では同等の作用を有する分子）によりアレルギー感作またはアレルギー応答を生じ得る抗原として定義することができる。上述したように、工業的用途のポリペプチドを含む酵素の状況下では、例えば皮内的にアレルゲンが媒介するアレルギー応答と、気道において細胞固着型ＩｇＥとの接触により気管アレルゲンが引き起こすアレルギー応答とを区別することが重要である。これは、たとえ吸入試験がアレルギー応答を引き起こしても皮内試験は陰性となる場合があるという事実のためである。従って、アレルゲン性の評価は、本発明のアレルゲン性を減らした改変ポリペプチドと親のポリペプチドの気管内投与の結果を比較する、吸入試験により行うことができる。ポリペプチドのアレルゲン性の評価のための試験管内動物モデルは多数存在する。それらのモデルの幾つかはヒトに対する有害評価の適当な基礎を与える。適当なモデルとしてはモルモットモデルとラットモデルが挙げられる。それらのモデルは、予め感作された動物において誘発される惹起反応の機能として気管アレルゲンを同定しようとする。それらのモデルによれば、アレルゲンと言われるものは動物の気管内に導入される。モルモットの適当な株であるDunkin Hartley株は、ヒトが産生しないようなIg E 抗体をアレルギー応答と関連して産生する。しかしながら、それらは吸入したポリペプチド（酵素を含む）に対するアレルギー応答の原因である別の型の抗体 IgG1A とIgG1B を生産する（例えば Prentφ，ATRA，19，p.8-14，1991を参照のこと）。従って、Dunkin Hartley動物モデルを使う時、IgG1A とIgG1B の相対量がアレルゲン性レベルの尺度である。ポリペプチドおよび酵素への気管内暴露に適当なラット株はBrown Norway株である。このBrown Norway株はアレルギー応答としてIg E を産生する。実施例22において、例えばポリペプチド分子に多数のポリマーを結合させることによってポリペプチド（酵素）の重量を増やすことにより、ポリペプチド（特別な場合には酵素）のアレルゲン性を減らすことができるという本発明の驚くべき発見を開示する。同等の研究に他の動物、例えばウサギ等を使ってもよい。第一の観点では、本発明は、1 kDa 〜60 kDaの範囲の分子量を有するポリマーに結合された10 kDa〜100 kDa の分子量を有する親のポリペプチドを含んで成る、アレルゲン性を減らした改変ポリペプチドに向けられる。親のポリペプチド本発明によれば、親のポリペプチドは工業用の任意のポリペプチドであることができる。これはタンパク質、酵素、抗菌性ポリペプチド、リガンド、インヒビター、エンハンサーおよび補因子を包含する。本発明の好ましい態様では、親のポリペプチドが酵素であり、そして下記に言及される酵素の群より選択することができる。親のプロテアーゼ親のプロテアーゼ〔即ち、国際生化学・分子生物学連合(IUBMB)による酵素命名法(1992)に従って酵素分類番号E.C．3.4に分類される酵素〕はこの分類群のプロテアーゼを包含する。例としては、下記の酵素分類（E.C.）番号に分類されるものから選ばれたプロテアーゼが挙げられる： 3.4.11（即ち、いわゆるアミノペプチダーゼ）、例えば3.4.11.5（プロリルアミノペプチダーゼ）、3.4.11.9（Ｘ−pro アミノペプチダーゼ）、3.4.11.10（細菌ロイシルアミノペプチダーゼ）、3.4.11.12（好熱性アミノペプチダーゼ）、3.4.11.15（リジルアミノペプチダーゼ）、3.4.11.17（トリプトファニルアミノペプチダーゼ）、3.4.1 1.18（メチオニルアミノペプチダーゼ）； 3.4.21（即ち、いわゆるセリンエンドペプチダーゼ）、例えば3.4.21.1（キモトリプシン）、3.4.21.4（トリプシン）、3.4.21.25（ククミシン）、3.4.21.32 （ブラキユリン）、3.4.21.48（セレビシン）および3.4.21.62（サブチリシン）； 3.4.22（即ち、いわゆるシステインエンドペプチダーゼ）、例えば3.4.22.2（パパイン）、3.4.22.3（フィカイン）、3.4.22.6（キモパパイン）、3.4.22.7（アスクレパイン）、3.4.22.14（アクチニダイン）、3.4.22.30（カリカイン）および3.4.22.31（アナナイン）； 3.4.23（即ち、いわゆるアスパラギン酸エンドペプチダーゼ）、例えば3.4.23 .1（ペプシンＡ）、3.4.23.18（アスペルギロペプシンＩ）、3.4.23.20（ペニシロペプシン）および3.4.23.25（サッカロペプシン）；および 3.4.24（即ち、いわゆるメタロエンドペプチダーゼ）、例えば3.4.24.28（バシロリシン）。関連するサブチリシンの例は、サブチリシン BPN′、サブチリシンアミロサッカリチクス、サブチリシン168、サブチリシンメセントエリコペプチダーゼ、サブチリシンカールスバーグ、サブチリシンＤＹ、サブチリシン309、サブチリシン147、サーミターゼ、アクアリシン、バシラスPB92プロテアーゼ、プロテイナーゼＫ、プロテアーゼ TW7およびプロテアーゼ TW3を包含する。そのような容易に入手可能な市販のプロテアーゼの特定例として ens Pro（いずれの酵素もNovo Nordisk A/Sから入手可能である）が挙げられる。他の市販のプロテアーゼの例としては、Gist-Brocades N.V.によプロテアーゼ変異体も親のプロテアーゼとして見なされると理解すべきである。そのようなプロテアーゼ変異体の例はEP 130.756(Genentech)，EP 214.435(He nkel)，WO 87/04461(Amgen)，WO 87/05050(Genex)，EP 251.446(Genencor)，EP 260.105(Genencor)，Thomas 他(1985)，Nature，318，p.375-376，Thomas他(198 7)，J．Mol．Biol.，193，p.803-813，Russel 他(1987),Nature，328，p.496-50 0，WO 88/08028(Genex)，WO 88/08033(Amgen)，WO 89/06279(Novo Nordisk A/S) ，WO 91/00345(Novo NordisK A/S)，EP 525 610（Solvay）およびWO 94/02618(G ist-Brocades N.V.)中に開示されている。プロテアーゼの活性は“Methods of Enzymatic Analysis”,第３版，1984，Ve rlag Chemie，Weinheim,第５巻に記載されたようにして測定することができる。親のリパーゼ親のリパーゼ〔即ち、国際生化学・分子生物学連合(IUBMB)による酵素命名法( 1992)に従って酵素分類番号E.C．3.1.1（カルボン酸エステルヒドロラーゼ）に分類される酵素〕はこの分類群のリパーゼを包含する。例としては、下記の酵素分類（E.C.）番号に分類されるものから選ばれたリパーゼが挙げられる： 3.1.1（即ち、いわゆるカルボン酸エステルヒドロラーゼ）、例えば3.1.1.3（トリアシルグリセロールリパーゼ）、3.1.1.4（ホスホルリパーゼＡ₂）。リパーゼの例としては、次の微生物に由来するリパーゼが挙げられる。指摘の特許刊行物は参考として本明細書中に組み込まれる：フミコーラ（Humicola）、例えばＨ．ブレビスポラ（H ．brevispora）、Ｈ．ランギノーサ（H ．lanuginosa）、Ｈ．ブレビス変種テルモイデ（H ．brevis va r ．thermoidea ）およびＨ．インソレンス（H ．insolens）（米国特許第4,810,41 4 号）。シュードモナス（Pseudomonas）、例えばPs．フラギ（Ps ．fragi）、Ps．スタッツェリ（Ps ．stutzeri）、Ps．セパシア（Ps ．cepacia）およびps．フルオレッセンス（Ps ．fluorescens）、またはPs．プランタリイ（Ps ．plantarii）およびPs．グラジオリ（Ps ．gladioli）〔米国特許第4,950,417 号(Solvay Enzymes) 〕、またはPs．アルカリゲネス（Ps ．alcaligenes）およびPs．シュードアルカリゲネス（Ps ．pseudoalcaligenes）（ヨーロッパ特許第218272 号）、またはPs ．メンドシナ（Ps ．mendocina）（WO 88/09367 ；米国特許第5,389,536 号）。フザリウム（Fusarium）、例えばＦ．オキシスポラム（F ．oxysporum）（ヨーロッパ特許第130,064 号）またはＦ．ソラニ・ピシ（F ．solani pisi）（WO 90/ 09446）。ムーコル（Mucor ）〔リゾムーコル（Phizomucor）とも呼ばれる〕、例えばＭ．ミーヘイ（M ．miehei）（ヨーロッパ特許第238 023 号）。クロモバクテリウム（Chromobacterium）、特にＣ．ビスコサム（C ．viscosum ）。アスペルギルス（Aspergillus）、特にＡ．ニガー（A ．niger）。カンジダ（Candida ）、例えばＣ．シリンドラサ（C ．cylindracea）〔Ｃ．ルゴサ（C ．rugosa）とも呼ばれる〕もしくはＣ．アンタークティカ（C ．antarctica）（WO 88/02775）またはＣ．アンタークティカ（C ．antarctica ）リパーゼＡもしくはＢ（WO 94/01541 とWO 89/02916）。ゲオトリクム（Geotricum）、例えばＧ．カンジダム（G ．candidum）〔Schima da他(1989)，J．Biochem.，106，383-388〕。ペニシリウム（Penicillium）、例えばＰ．カメンベルティ（P. camembertii ）〔Yamaguchi 他(1991),Gene 103，61-67〕。リゾプス（Rhizopus）、例えばＲ．デレマー（R ．delemar）〔Hass他(1991)， Gene 109，107-113〕またはＲ．ニベウス（R ．niveus）〔Kugimiya他(1992)，Bi osci．Biotech．Biochem．56，716-719〕またはＲ．オリゼ（R ．oryzae）。バシラス（Bacillus）、例えばＢ．サチリス（B ．subtilis）〔Dartois 他(19 93)，Biochemica et Biophysica Acta 1131，253-260〕またはＢ．ステアロサーモフィラス（B ．stearothermophilus）（特公昭64−7744992 号）またはＢ，ピュミルス（B ．pumilus）（WO 91/16422）。る。他のリパーゼの例は、Genencor Int．Inc.からのPs．メンドシアン（Ps ．mend ocian ）リパーゼであるLumafast^TM；Gist Brocades/Genendor Int．Inc.からのP s．シュードアルカリゲネス（Ps ．pseudoalcaligenes）リパーゼであるLipomax ^TM ；Unileverからのフザリウム・ソラニ（Fusarium solani）リパーゼ（クチナーゼ）；Solvay Enzyme からのバシラス種（Bacillus sp.）リパーゼである。他のリパーゼも別の会社から入手可能である。リパーゼ変異体も親酵素として考えられると解釈すべきである。そのような変異体の例は例えばWO 93/01285 とW0 95/22615 の中に記載されている。リパーゼの活性は、“Methods of Enzymatic Analysis”,第３版，1984，Verl ag Chemie，Weinhein,第４巻に記載されたようにして、またはAF 95/5 GB（請求すればNovo Nordiskから入手可能）に記載されたようにして測定することができる。親のオキシドレダクターゼ親のオキシドレダクターゼ〔即ち、国際生化学・分子生物学連合(IUBMB)による酵素命名法(1992)に従って酵素分類番号E.C. 1（オキシドレダクターゼ）に分類される酵素〕はこの群のオキシドレダクターゼを包含する。例としては、下記の酵素分類（E.C.）番号に分類されるものから選ばれたリパーゼが挙げられる：グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ〔NAD+〕（1.1.1.8）、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ〔NAD(P)⁺〕（1.1.1.94）、グリセロール− ３−リン酸１−デヒドロゲナーゼ〔NADP〕（1.1.1.94）、グルコースオキシダーゼ(1.1.3.4)、ヘキソースオキシダーゼ(1.1.3.5)、カテコールオキシダーゼ（1. 1.3.14）、ビリルビンオキシダーゼ(1.3.3.5)、アラニンデヒドロゲナーゼ(1.4. 1.1)、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ(1.4.1.2)、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ〔NAD(P)⁺〕（1.4.1.3）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ〔NADP⁺〕（1.4.1.4 ）、Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ(1.4.1.5)、セリンデヒドロゲナーゼ(1.4.1. 7)、バリンデヒドロゲナーゼ〔NADP⁺〕（1.4.1.8）、ロイシンデヒドロゲナーゼ (1.4.1.9)、グリシンデヒドロゲナーゼ（1.4.1.10）、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ(1.4.3.2)、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ(1.4.3.3)、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ（1.4.3.11）、プロテイン−リジン６−オキシダーゼ（ 1.4.3.13）、Ｌ−リジンオキシダーゼ（1.4.3.14）、Ｌ−アスパラギン酸オキシダーゼ（1.4.3.16）、Ｄ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ（1.4.99.1）、プロテインジスルフィドレダクターゼ（1.6.4.4）、チオレドキシンレダクターゼ(1.6.4.5) 、プロテインジスルフィドレダクターゼ（グルタチオン）(1.8.4.2)、ラッカーゼ（1.10.3.2）、カタラーゼ（1.11.1.6）、ペルオキシダーゼ（1.11.1.7）、リポキシゲナーゼ（1.13.11.12）、スーパーオキシドジスムターゼ（1.15.1.1）。前記グルコースオキシダーゼはアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger ）由来であってもよい。前記ラッカーゼはポリポラス・ピンシタス（Polyporus pinsitus）、ミセリオフトラ・テルモフィラ（Myceliophtora thermophila）、コプリナス・シネレウス（Coprinus cinereus）、リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）、リゾクトニア・プラチコラ（Rhizoctonia praticola）、シタリジウム・テルモフィルム（Scytalidium thermophilum）およびルス・ベルニシフェラ（Rhus verni cifera ）由来であってもよい。前記ビリルビンオキシダーゼはミロセケシウム・ベルカリア（Mytothechecium verrucaria ）由来であってもよい。ペルオキシダーゼは例えば大豆、西洋ワサビまたはコプリナス・シネレウス（Coprinus cinereus ）由来であってもよい。プロテインジスルフィドレダクターゼは、デンマーク国特許出願第768/93号、同第265/94号および同第264/94号（Novo Nordisk A/S）（これらは参考として本明細書中に組み込まれる）のいずれかに言及された任意のものであることができ、例えばウシ起源のプロテインジスルフィドレダクターゼ、アスペルギルス・オリゼ（Asperg illus oryzae ）またはアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）由来のプロテインジスルフィドレダクターゼ、およびエシェリキア・コリ（Escherichia coli ）由来のDsbAまたはDsbCが挙げられる。容易に入手可能な市販のオキシドレダクターゼの具体例としてはGluzyme ^TM（ Novo Nordisk A/Sから入手可能な酵素）が挙げられる。しかし、他のオキシドレダクターゼも別の所から入手可能である。オキシドレダクターゼの変異体も親酵素として考えられると理解すべきである。オキシドレダクターゼの活性は“Methods of Enzymatic Analysis”,第３版， 1984，Verlag Chemie，Weinheim,第３巻に記載された通りに測定することができる。親のカルボヒドラーゼ親のカルボヒドラーゼは、特に５員環と６員環構造の糖鎖（例えばデンプン）を分解することのできるあらゆる酵素として定義することができる〔即ち、国際生化学・分子生物学連合(IUBMB)による酵素命名法(1992)に従って酵素分類番号E .C．3.2（グリコシダーゼ）に分類される酵素〕。本発明のカルボヒドラーゼの群には、糖類、例えば６員環構造、例えばＤ−グルコースを、Ｄ−フルクトースのような５員環構造に異性化することのできる酵素も含まれる。例としては、次の酵素分類（E.C.）番号のもとに分類される酵素から選ばれたカルボヒドラーゼが挙げられる： α−アミラーゼ(3.2.1.1)、β−アミラーゼ(3.2.1.2)、グルカン１，４−α− グルコシダーゼ(3.2.1.3)、セルラーゼ(3.2.1.4)、エンド−１，３（４）−β− グルカナーゼ(3.2.1.6)、エンド−１，４−β−キシラナーゼ(3.2.1.8)、デキストラナーゼ（3.2.1. 11）、キチナーゼ（3.2.1.14）、ポリガラクツロナーゼ（3.2.1.15）、リゾチーム（3.2.1.17）、β−グルコシダーゼ（3.2.1.21）、α−ガラクトシダーゼ（3. 2.1.22）、β−ガラクトシダーゼ（3.2.1.23）、アミロ−１，６−グルコシダーゼ（3.2.1.33）、キシラン−１，４−β−キシロシダーゼ（3.2.1.37）、グルカンエンド−１，３−β−Ｄ−グルコシダーゼ（3.2.1.39）、α−デキストリンエンド−１，６−グルコシダーゼ（3.2.1.41）、スクロースα−グルコシダーゼ（ 3.2.1.48）、グルカンエンド−１，３−α−グルコシダーゼ（3.2.1.59）、グルカン１，４−β−グルコシダーゼ（3.2.1.74）、グルカンエンド−１，６−β− グルコシダーゼ（3.2.1.75）、アラビナンエンド−１，５−α−アラビノシダーゼ（3.2.1.99）、ラクターゼ(3.2.1.108)、キトナナーゼ(3.2.1.132)およびキシロースイソメラーゼ(5.3.1.5)。関連するカルボヒドラーゼの例としては、トリコデルマ・ハージアナム（Tric hoderma harzianum ）由来のα−１，３−グルカナーゼ；ペシロマイセス（Paec ilomyces ）の株由来のα−１，６−グルカナーゼ；バシラス・サチリス（Bacill us subtilis ）由来のβ−グルカナーゼ；フミコーラ・インソレンス（Humicola insolens ）由来のβ−グルカナーゼ；アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger ）由来のβ−グルカナーゼ；トリコデルマ（Trichoderma）の株由来のβ− グルカナーゼ；エルスコビア・サンシネオリティカ（Oerskovia xanthineolyti ca ）株由来のβ−グルカナーゼ；アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger ）由来のエキソ−１，４−α−Ｄ−グルコシダーゼ（グルコアミラーゼ）；バシラス・サチリス（Bacillus subtilis）由来のα−アミラーゼ；バシラス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）由来のα−アミラーゼ；バシラス・ステアロサーモフィルス（Bacillus st earothermophilus ）由来のα−アミラーゼ；アスペルギルス・オリゼ（Aspergi1 lus oryzae ）由来のα−アミラーゼ；非病原性微生物由来のα−アミラーゼ；アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）由来のα−ガラクトシダーゼ；フミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）由来のペントサナーゼ、キシラナーゼ、セロビアーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ；トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）由来のセルラーゼ；非病原性かび由来のセルラーゼ；アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）由来のペクチナーゼ、セルラーゼ、アラビナーゼ、ヘミセルラーゼ；ペニシリウム・リラシナム（Penicillium l ilacinum ）由来のデキストラナーゼ；非病原性かび由来のエンドグルカナーゼ；バシラス・アシドプリチカス（Bacillus acidopullyticus）由来のプルラナーゼ；クルイベロミセス・フラギリス（Kluyveromyces fragilis）由来のβ−ガラクトシダーゼ；トリコデルマ・リーセイ（Trichodermareesei）由来のキシラナーゼが挙げられる。容易に入手可能な市販のカルボヒドラーゼの具体例としては、Alpha-Gal^TM，B io-Feed^TM Alpha，Bio-Feed^TM Beta，Bio-Feed^TM （どの酵素もNovoNordisk A/Sから入手可能である）。他のカルボヒドラーゼも別の会社から入手可能である。カルボヒドラーゼ変異体も親酵素として考えられると理解すべきである。カルボヒドラーゼの活性は、“Methods of Enzymatic Analysis”，第３版，1 984，Verlag Chemie，Weinhein，第４巻に記載されたようにして測定することができる。親のトランスフェラーゼ親のトランスフェラーゼ〔即ち、国際生化学・分子生物学連合(IUBMB)による酵素命名法(1992)に従って酵素分類番号E.C．2に分類される酵素〕はこの分類群の中のトランスフェラーゼを包含する。親のトランスフェラーゼは次のようなトランスフェラーゼの亜群の中の任意のトランスフェラーゼであることができる：１炭素基を転移するトランスフェラーゼ（E.C．2.1）；アルデヒドまたは残基を転移するトランスフェラーゼ（E.C．2 .2）；アシルトランスフェラーゼ（E.C．2.3）；グルコシルトランスフェラーゼ（E.C．2.4）；メチル基以外のアルキル基またはアリール基を転移するトランスフェラーゼ（E.C．2.5）；窒素含有基を転移するトランスフェラーゼ（E.C．2.6 ）。好ましい態様では、親のトランスフェラーゼはトランスグルタミナーゼ E.C． 2.3.2.13（プロテイン−グルタミン μ−グルタミルトランスフェラーゼ）である。トランスグルタミナーゼは、ペプチド結合したグルタミン残基のγ−カルボキシアミド基がアシル供与体であるアシル転移反応を触媒することのできる酵素である。様々な化合物中の第一級アミノ基がアシル受容体として働くことができ、その後にペプチド結合したグルタミン酸の単置換型γ−アミドが形成する。ペプチド鎖の中のリジン残基のε−アミノ基がアシル受容体として働く時、トランスフェラーゼは分子内または分子間γ−グルタミル−ε−リジル架橋を形成する。トランスグルタミナーゼの例は係属中のデンマーク国特許出願第 990/94号（Novo Nordisk A/S）中に記載されている。親のトランスグルタミナーゼはヒト、動物（例えばウシ）または微生物起源のものであることができる。そのような親のトランスグルタミナーゼの例は、動物由来のトランスグルタミナーゼ FXIIIa；フィザルム・ポリセファラム（Physarum polycephalum）由来の微生物トランスグルタミナーゼ（Klein 他，Journal of Bacteriology,第174 巻，2599〜2605頁）；ストレプトマイセス種、例えばストレプトマイセス・ラベンジュレ（Streptomyces lavendulae）、ストレプトマイセス・リディカス（St reptomyces lydicus ）〔かつてのストレプトマイセス・リバニ（Streptomyces Iibani ）〕、およびストレプトベルティシリウム（Streptoverticillium）種、例えばストレプトベルティシリウム・モバレンセ（Streptoverticillium mobara ense ）、ストレプトベルティシリウム・シンナモネウム（Streptoverticillium cinnamoneum ）およびストレプトベルティシリウム・グリセオカーネウム（Str eptoverticillium griseocarneum ）に由来するトランスグルタミナーゼが挙げられる（Motoki他，米国特許第5,156,956 号；Andou 他，米国特許第5,252,469 号；Kaempfer他，Journal of General Microbiology,第137巻，1831〜1892頁；O chi他，International Journal of Systematic Bacteriology，第44巻，285 〜2 92 頁；Andou他，米国特許第5,252,469 号；Williams他，Journal of General M icrobiology,第129 巻，1743〜1813頁）。トランスフェラーゼ変異体も親酵素として考えられると理解すべきである。トランスグルタミナーゼの活性は“Methods of Enzymatic Analysis”,第３版，1984，Verlag Chemie，Weinheim,第１〜10巻に記載された通りに測定することができる。親のフィターゼ親のフィターゼは国際生化学・分子生物学連合(IUBMB)による酵素命名法(1992 )に従って酵素分類番号E.C．3.1.3（リン酸モノエステルヒドロラーゼ）のもとに分類される酵素の群に含まれる。フィターゼは、フィチン酸からイノシトールと無機リン酸への変換を触媒する微生物により生産される酵素である。フィターゼ生産微生物は細菌、例えばバシラス・サチリス（Bacillus subtil is ）、バシラス・ナット（Bacillus natto）およびシュードモナス（Pseudomona s ）；酵母、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）；並びに真菌、例えばアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・フィカム（Aspergillus ficuum）、アスペルギルス・アワモリ（Aspe rgillus awamori ）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、および他の様々なアスペルギルス種を包含する。親のフィターゼの例としては、次の酵素分類（E.C.）番号のもとに分類されるものから選ばれたフィターゼが挙げられる：３−フィターゼ（3.1.3.8）および６−フィターゼ（3.1.3.26）。フィターゼの活性は、“Methods of Enzymatic Analysis”,第３版，1984，Ve rlag Chemie，Weinheim,第１〜10巻に記載された通りに測定することができ、またはヨーロッパ特許出願第A1-0 420 358号の実施例２Ａに記載された方法に従って測定することができる。親の抗菌性ポリペプチド親の抗菌性ポリペプチドは、抗菌活性、例えば抗真菌、抗細菌および／または殺虫活性を示す任意のポリペプチドであることができる。前記ポリペプチドは酵素活性のような別の活性を示してもよい。本発明に係る親の抗菌性ポリペプチドの例としては、WO 94/01459(Novo Nordi sk A/S)に記載されたクルブラリア（Curvularia）属のカビに由来する殺真菌活性ポリペプチド；ヨーロッパ特許第403.458 号（Kabigen AB）に記載された抗菌性ポリペプチド；WO 92/15691(Imperial Chem Ind．PLC)に記載された、ミラビリス（Mirabilis ）種子から単離された抗菌性タンパク質；WO 92/22578（Boman 他）に記載された、ブタ小腸の抽出物から単離された抗菌性ポリペプチド；特公昭60-130599 号に記載されたような、ハンゼヌラ（Hansenula ）種の酵母により蓄積される酵母致死活性を有するポリペプチド；米国特許第5,348,865 号(Jin R o LTD.)に記載された、抗菌剤として使うことができるフィトラッカ・インスラリス（Phytolacca insularis）抗ウイルスタンパク質；米国特許第5,354,681 号（Novo Industri A/S）に記載されたノカルジオプシス・ダッソンビレイ（Nocar diopsis dassonvillei ）由来の溶菌酵素調製物が挙げられる。他の抗菌性ポリペプチドの例はマガニニン、プロテグリン、デフェンシン、シュードマイシン、ムタノリシンおよびＮ−アセチルムラミダーゼである。本発明に係る関連の親のポリペプチド、タンパク質または酵素は、アレルギー反応を引き起こし得るポリペプチド、タンパク質または酵素である。それらのポリペプチド、タンパク質または酵素は10 kDa〜100 kDa、好ましくは15 kDa〜80 kDa、または20 kDa〜70 kDa、または25 kDa〜60 kDa、または28 kDa〜55 kDa、または30 kDa〜50 kDaの分子量を有すると思われる。親酵素に比べて追加の付属基、例えばアミノ基を有する変異体を使うことは本発明の範囲内に含まれる。そのような変異体は免疫系による認識に対して該酵素をより効果的に遮蔽するので、そのような変異体を使うことは有利である。ポリマー適当なポリマーの例としては、ポリアルキレンオキシド(PAO)、例えばポリアルキレングリコール(PAG)、例えばポリエチレングリコール(PEG)、メトキシポリエチレングリコール(mPEG)およびポリプロピレングリコール、PEG−グリシジルエーテル（Epox-PEG）、PEG−オキシカルボニルイミダゾール（CDI-PEG）、Star −PEG、Branced PEG、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリカルボキシレート、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ−Ｄ，Ｌ−アミノ酸、デキストラン、例えばカルボキシメチルデキストラン、セルロース、例えばメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシエチルセルロースおよびヒドロキシプロピルセルロース、キトサンの水解物、デンプン、例えばヒドロキシエチルデンプンおよびヒドロキシプロピルデンプン、グリコーゲン、アガロースおよびその誘導体、グアゴム、プルラン、イヌリン、キサンタンゴム、カラギーナン、ペクチン、アルギン酸水解物並びに生体高分子（バイオポリマー）が挙げられる。 Star PEGは、架橋ジビニルベンゼンコアからエチルオキシド分子の重合により製造される多アーム型PEG 分子である〔Gnanou他(1988),Makromol．Chem．198， 2885；Rein 他(1993),Acta Polymer，44，225〕。Star PEGとBranced PEG はShe arwater Inc.，USAから入手可能である。 Epox-PEG（またはPEG −グリシジルエーテル）は、末端に活性化カップリング基としてエポキシドを有するPEG である。それらはタンパク質のアミノ基、ヒドロキシル基およびチオール基と反応／結合を行うことができる〔EllingおよびKula(1991)，Biotech．Appl．Biochem.，1 3，354〕。Epox-PEGは例えばメトキシ−PEG −エポキシドおよびPEG−（エポキシド）₂としてShearwater Inc.，USAから入手可能である。 CDI-PEG（またはPEG オキシカルボニルイミダゾール）は、反応性末端基としてカルボニルイミダゾールを有するPEG である。前記反応性／活性結合基はウレタン結合によってタンパク質と結合する〔Beauchamp 他，(1993)，Anal．Bioche m.，131，125〕。CDI-PEGは例えばメトキシ−PEG-CDI およびPEG-(CDI)₂としてS hearwater Inc.，USAから入手可能である。そのような容易に入手可能な適当なポリマー製品の例（そのうちの幾つかは活性化ポリマーである）としては、約1 kDa〜35 kDaの平均分子量を有するポリエチレングリコール（例えばMerck より）、約5 kDa の平均分子量を有するメトキシポリエチレングリコール（例えばSigma から）、約1 kDa 〜60 kDaの平均分子量を有するデキストラン（例えばFluka から）およびもっと高分子量のものが挙げられる。上述したポリマーは全て本発明に従って使うことができるけれども、メトキシポリエチレングリコールを有利に使うことができる。これは、メトキシエチレングリコールだけがポリペプチドと結合することのできる１つの反応性末端を有するという事実から生じる。従って、架橋の危険があまり著しくない。更に、それは生成物をより均質にし、ポリマーとポリペプチドとの反応を制御しやくすくする。１〜60 kDaの分子量（Ｍ_r）を有するポリマーを本発明に従って使うことができる。好ましいのは2 kDa〜35 kDa、特に2 kDa〜25 kDa、例えば約5 kDa または約15 KDaの分子量（Ｍ_r）を有するポリマーである。本明細書中に言及するポリマー分子量は全て平均分子量であることに注意されたい。本発明の好ましい態様では、ポリマーはポリエチレングリコール(PEG)、例えばメトキシポリエチレングリコール(mPEG)である。ポリマーの活性化ポリペプチドを結合させるのに使うことになっているポリマーが活性でない場合、適当な方法でそれを活性化しなければならない。「発明の背景」の項目に記載された方法は本発明に従って使うことができる方法の例である。しかしながら、最適な方法は、例えばポリペプチド鎖上の利用可能な取付基によって、分子ごとに異なるであろう。下記の適当なポリマー活性化方法では、簡単に方法を記載する。しかし、他の方法も使用できると理解すべきである。酵素の遊離酸基へのポリマーのカップリングは、ジイミドと例えばアミノ−PE G またはヒドラジノ−PEG〔Pollak他(1976)，J．Amr．Chem．Soc.，98，289-291 〕またはジアゾアセテート／アミド〔Wong他(1992),前掲〕の助けを借りて実施することができる。ヒドロキシ基へのポリマーのカップリングは通常は非常に困難である。何故なら、それを水中で行わなければならないからである。通常、ヒドロキシル基との反応よりも加水分解が優先する。遊離スルフヒドリル基へのポリマーのカップリングは、マレイミドやオルト− ピリジルジスルフィドのような特殊の基を使って反応させることができる。スルフヒドリル基にはビニルスルホン〔米国特許第5,414,135 号（1995）Snow他〕も好ましいが、言及される他のものほど選択的ではない。ポリペプチド鎖の中の近づきやすいアルギニン残基は、２つの隣接カルボニル基を含んで成る基による結合に向けることができる。求電子的に活性化されたPEG をリジンのアミノ基にカップリングさせることを含む技術も有用であるに違いない。有用なアルコール脱離基の多くはアミン結合を形成する。例えば、アルキルスルホネート、例えばトレシレート〔Nilsson 他 (1984)，Methods in Enzymology，第104 巻，Jacoby，W.B.編，Academic Press ，Orlando，56 〜66頁；Nilsson 他(1987)，Methods in Enzymology，第135 巻，Mosbach，K．編，Academic Press，Orlando，65 〜79頁；Scouten 他(1987)， Methods in Enzymology，第135 巻，Mosbach，K．編，Academic Press，Orlando ，1987，79 〜84頁；Crossland 他(1971)，J．Amr．Chem．Soc.，1971，93，421 7-4219〕、メシレート〔Harris(1985),前掲；Harris他(1984)，J．Polym．Sci． Polym．Chem，Ed.，22，341-352〕、アリールスルホネート、例えばトシレートおよびｐ−ニトロベンゼンスルホネートを使うことができる。有機スルホニルクロリド（例えばトレシルクロリド）は、多数のポリマー（例えばＰＥＧ）中のヒドロキシル基を、ポリペプチド中のアミノ基のような求核試薬と反応するとポリマーとポリペプチドの間に安定な結合を形成させる優れた脱離基（スルホネート）に効率的に変換する。高い結合率に加えて、反応条件が一般に穏和であり（変性を回避し且つ活性を殆どまたは全く破壊しない、中性から弱アルカリ性のｐＨ）、ポリペプチドに対する非破壊要件を満たしている。トシレートはメシレートよりも反応性である上により一層不安定であり、PEG 、ジオキサンおよびスルホン酸に分解する〔Zalipsky（1995）前掲〕。アミン結合を形成させるのにエポキシドも使われているが、それは上述した基よりもずっと反応性が小さい。ホスゲンを使ってPEG をクロロホルメートに変換する方法はリジンへのカルバメート結合のもとになる。このテーマは、塩素をＮ−ヒドロキシスクシンイミドで〔米国特許第5,122,614 号（1992）Zalipsky；Zalipsky他(1992)，Biotechnol ．Appl．Biochem.，15，100-114；Monfardini他(1995)，Bioconjugate Chem.，6 ，62-69〕、イミダゾールで〔Allen 他(1991)，Carbohydr．Res.，213，309-319 〕、ｐ−ニトロフェノール、DMAPで〔ヨーロッパ特許第632 082 A1号(1993)，Lo oze，Y.〕置換する様々な形態で実行することができる。一般にクロロホルメートを所望の脱離基と反応させることにより誘導体が作られる。それらの基は全てペプチドへのカルバメート結合を生じる。更に、それぞれ尿素とチオ尿素を生じるイソシアネートとイソチオシアネートを使ってもよい。上述したのと同じ脱離基と環状イミドトロンを使ってPEG 酸からアミドを得ることができる〔米国特許第5,349,001 号(1994)，Greenwald他〕。それらの化合物の反応性は非常に高いが、加水分解を加速することがある。コハク酸無水物との反応から製造したPEG スクシネートも使うことができる。これにより含まれるようになったエステル基は、接合体を加水分解に対して一層敏感にする〔米国特許第5,122,614 号(1992)，Zalipsky〕。この基はＮ−ヒドロキシスクシンイミドを使って活性化することができる。更に、特殊なリンカーを導入することもできる。最古のものはシアヌル酸クロリドである〔Abuchowski他(1977)，J．Biol．Chem.，252，3578-3581；米国特許第4,179,337 号(1979)，Davis他；Shafer他(1986)，J．Polym．Sci．Polym．Che m．Ed.，24，375-378〕。芳香族アミンへのPEG のカップリングに続くジアゾ化は非常に反応性のジアゾニウム塩を与え、これはその場でペプチドと反応させることができる。アミド結合はPEG のアズラクトン誘導体を反応させることにより得ることもでき〔米国特許第5,321,095 号(1994)，Greenwald，R.B,〕、それによって追加のアミド結合を導入してもよい。ある種のペプチドはリジンを多くは含まないので、同一リジンに複数のPEG を結合させることが有利かもしれない。これは例えば１，３−ジアミノ−２−プロパノールの使用により達成することができる。カルバメート結合を使ってポリペプチドのアミノ基にPEG を結合させることもできる（WO 95/11924，Greenwald他）。骨格としてリジン残基を使ってもよい。結合体本発明によれば、改変ポリペプチドの結合体は50 kDa〜500 kDa、好ましくは5 0 kDa〜400 kDa 、より好ましくは50 kDa〜250 kDa、特に100 kDa 〜250 kDa 、例えば80 kDa〜200 kDa の範囲の全分子量を有する。本発明の改変ポリペプチドは高度の安定性を示し得る。個人管理用途を含む大部分の用途では、有利には改変酵素がポリマーに可逆的に結合されることがあり、これは生成物がごく僅かだけ分解する性質を有することを必然的に伴い、この性質はアレルギー状態を引き起こし得る状態の回帰をもたらすだろう。しかしながら、他の場合には、酵素は製造および／またはバルク処理段階ではポリマーに結合された状態にとどまるが、ヒトまたは動物への暴露の危険がない時、該酵素は後で分解することが有利である。本発明の結合型改変ポリペプチドの分解は、例えば生理的条件、例えばｐＨ、イオン強度、温度、還元または酸化ポテンシャルなどにより活性化することができる。この一例は洗剤を溶解させることによる分解である。更に、特定の化合物の存在が、例えば結合されにくい分子および／または親の形態の分子への分解をもたらしてもよい。特にポリペプチド、タンパク質または酵素の活性が結合形態で減少する場合には、分解が有利かもしれない。本発明はまた、親のポリペプチドに１〜30、好ましくは１〜25、例えば１〜10 個のポリマー分子を結合させる段階を含んで成る、アレルゲン性を減らしたポリペプチドの製造方法にも関する。本発明に従って使うことができる前記ポリマーの例は上記に列挙したものである。好ましくは１〜25個のポリマー分子を各ポリペプチド分子に結合させる。これは、該当する従来技術よりも少ない。結果としてポリマーにかかる費用が削減される。ある程度までは、ポリペプチド、タンパク質または酵素の活性が実質的に維持されることを必要とする。何故なら、該活性はポリペプチド鎖に結合されるポリマーの数と大きさによって反比例的に変化することが予想されるからである。本発明によれば、ポリペプチドの活性の５％以上、大部分は約20〜50％、良くて50〜70％、更に良くて70％〜80％、80％〜90％まで、更には100 ％までも維持される。組成物本発明は、少なくとも１つの本発明のポリペプチド、タンパク質または酵素を含んで成る組成物にも関する。該組成物は、別のポリペプチド、タンパク質もしくは酵素、および／または、例えば洗剤、例えば石鹸、家庭用品、農薬、個人管理用品、例えば洗浄剤、例えばコンタクトレンズ用洗浄剤、化粧品、洗面用化粧品、口腔および皮膚用医薬品、織物加工用組成物、食品およびを製造するのに使われる組成物、例えばベーキング用組成物などに汎用される成分を更に含んで成ってもよい。前記ポリペプチド／タンパク質／酵素の例としては、プロテアーゼ、リパーゼ、オキシドレダクターゼ、カルボヒドラーゼ、トランスフェラーゼ、例えばトランスグルタミナーゼ、フィターゼおよび／または抗菌性ポリペプチド活性を示す酵素が挙げられる。それらの酵素は減少した活性を有する結合体として存在してもよい。洗剤組成物本発明のポリペプチドが酵素であるなら、それは典型的には洗剤組成物において使うことができる。それは無粉塵性顆粒、安定型液体または保護された酵素の形で洗剤組成物中に含めることができる。無粉塵性顆粒は、例えば米国特許第4, 106,991 号と同第4,661,452 号（共にNovo Nordisk A/S）に開示されたようにして製造することができ、そして場合により既知の方法でコーティングすることができる。蝋状コーティング材料の例は、1000〜20000 の平均分子量を有するポリ（エチレンオキシド）生成物（ポリエチレングリコール、PEG）；16〜50エチレンオキシド単位を有するエトキシル化ノニルフェノール；アルコールが12〜20個の炭素原子を含みそして15〜80エチレンオキシド単位が存在するエトキシル化脂肪アルコール；脂肪アルコール；脂肪酸；並びに脂肪酸のモノ−、ジ−およびトリグリセリドである。流動床技術による使用に適当な皮膜形成コーティング材料の例は英国特許第1483591 号に与えられている。液体酵素製剤は、例えば、確立された方法に従って、プロピレングリコールのようなポリオール、糖または糖アルコール、乳酸またはホウ酸を添加することにより安定化することができる。他の酵素安定剤は当業界で公知である。保護された酵素はヨーロッパ特許第238,216 号に開示された方法に従って調製することができる。洗剤組成物は任意の便利な形態、例えば粉末、顆粒、ペーストまたは液体であることができる。液体洗剤は、典型的には水70％までと有機溶剤０〜30％を含有する水性であってもよく、または非水性であってもよい。洗剤組成物は１または複数の界面活性剤を含んで成り、その各々がアニオン性、非イオン性、カチオン性または両イオン性であることができる。洗剤は一般に、０〜50％のアニオン性界面活性剤、例えば直鎖アルキルベンゼンスルホネート（LAS）、α−オレインスルホネート（AOS）、アルキルスルフェート（脂肪アルコールスルフェート）（AS）、アルコールエトキシスルフェート（AEOSまたはAE S）、第二級アルカンスルホネート（SAS）、α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル−もしくはアルケニル−コハク酸、または石鹸を含むだろう。それは０〜40％の非イオン性界面活性剤、例えばアルコールエトキシレート（AEO または AE）、カルボキシル化アルコールエトキシレート、ノニルフェニルエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、またはポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド（例えばWO 92/06154中に記載されたような）を含有してもよい。洗剤組成物は、１または複数の別の酵素、例えばプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、オキシダーゼ、および別の抗菌性ポリペプチドを更に含んでもよい。洗剤は１〜65％の洗剤ビルダーまたは錯生成剤、例えばゼオライト、ジホスフェート、トリホスフェート、ホスホネート、シトレート、ニトリロ三酢酸（NTA）、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、ジエチレントリアミン五酢酸（DTMPA）、アルキル−もしくはアルケニル−コハク酸、可溶性シリケートまたは積層シリケート（例えばHoechst からのSKS-6）を含んでもよい。洗剤はビルダー無添加（unbuilt）であってもよく、即ち洗剤ビルダーを本質的に含まなくてもよい。洗剤は１または複数のポリマーを含んでもよい。ポリマーの例はカルボキシメチルセルロース(CMC)、ポリ（ビニルピロリドン）(PVP)、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリ（ビニルアルコール）(PVA)、ポリカルボキシレート、例えばポリアクリレート、マレイン酸／アクリル酸コポリマー、およびラウリルメタクリレート／アクリル酸コポリマーである。洗剤は漂白系を含んでもよい。前記漂白系は、過酸を形成する漂白活性化剤〔例えばテトラアセチルエチレンジアミン（TAED）またはノナノイルオキシベンゼンスルホネート（NOBS）〕と組み合わせることができるH₂O₂源（例えば過ホウ酸塩または過炭酸塩）を含んで成ることができる。あるいは、漂白系が例えばアミド、イミドまたはスルホン型のペルオキシ酸を含んで成ってもよい。本発明のポリペプチドを含んで成る本発明の洗剤組成物は、常用の安定剤、例えばポリオール、例えばプロピレングリコールまたはグリセロール、糖または糖アルコール、乳酸、ホウ酸またはホウ酸誘導体、例えば芳香族ホウ酸エステルを使って安定化することができ、該組成物は例えばWO 92/19709 およびWO 92/1970 8 に記載されたようにして配合することができる。洗剤は他の常用の洗剤成分、例えば織物コンディショナー（クレーを含む）、起泡増進剤、泡止め剤、防錆剤、汚れ懸濁剤、汚れ再付着防止剤、色素、殺菌剤、蛍光漂白剤、または香料を含んでもよい。ｐＨ（使用濃度の水溶液中で測定した時の）は通常は中性またはアルカリ性、例えば７〜11の範囲であろう。本発明の範囲内の洗剤組成物の特定形態としては下記のものが挙げられる：１）下記の成分を含んで成る少なくとも600 g/ｌの嵩密度を有する顆粒として製剤化された洗剤組成物： − 直鎖アルキルベンゼンスルホネート（酸として計算）７〜12％ − アルコールエトキシスルフェート（例えばＣ_12-18アルコール、1-2 EO）またはアルキルスルフェート（例えばＣ_16-18）１〜４％ − アルコールエトキシレート（例えばＣ_14-15アルコール、7 EO）５〜９％ − 炭酸ナトリウム（Na₂CO₃として） 14〜20％ − 可溶性シリケート（Na₂O・2SiO₂として）２〜６％ − ゼオライト（NaAlSiO₄として） 15〜22％ − 硫酸ナトリウム（Na₂SO₄として）０〜６％ − クエン酸ナトリウム／クエン酸（C₆H₅Na₃O₇/C₆H₈O₇として）０〜15％ − 過ホウ酸ナトリウム（NaBO₃・H₂Oとして） 11〜18％ − TAED ２〜６％ − カルボキシメチルセルロース０〜２％ − ポリマー（例えばマレイン酸／アクリル酸コポリマー、ＰＶＰ、ＰＥＧ）０〜３％ − 酵素０〜５％ − 微量成分（例えば泡止め剤、香料、蛍光漂白剤、光漂白剤）０〜５％２）下記の成分を含んで成る少なくとも600 g/ｌの嵩密度を有する顆粒として製剤化された洗剤組成物： − 直鎖アルキルベンゼンスルホネート（酸として計算）６〜11％ − アルコールエトキシスルフェート（例えばＣ_12-18アルコール、1-2 EO）またはアルキルスルフェート（例えばＣ_16-18）１〜３％ − アルコールエトキシレート（例えばＣ_14-15アルコール、7 EO）５〜９％ − 炭酸ナトリウム（Na₂CO₃として） 15〜21％ − 可溶性シリケート（Na₂O・2SiO₂として）１〜４％ − ゼオライト（NaAlSiO₄として） 24〜34％ − 硫酸ナトリウム（Na₂SO₄として）４〜10％ − クエン酸ナトリウム／クエン酸（C₆H₅Na₃O₇/C₆H₈O₇として）０〜15％ − カルボキシメチルセルロース０〜２％ − ポリマー（例えばマレイン酸／アクリル酸コポリマー、ＰＶＰ、ＰＥＧ）１〜６％ − 酵素０〜５％ − 微量成分（例えば泡止め剤、香料）０〜５％３）下記の成分を含んで成る少なくとも600 g/ｌの嵩密度を有する顆粒として製剤化された洗剤組成物： − 直鎖アルキルベンゼンスルホネート（酸として計算）５〜９％ − アルコールエトキシレート（例えばＣ_12-15アルコール、7 EO）７〜14％ − 脂肪酸としての石鹸（例えばＣ_16-22脂肪酸として）１〜３％ − 炭酸ナトリウム（Na₂CO₃として） 10〜17％ − 可溶性シリケート（Na₂O・2SiO₂として）３〜９％ − ゼオライト（NaAlSiO₄として） 23〜33％ − 硫酸ナトリウム（Na₂SO₄として）０〜４％ − 過ホウ酸ナトリウム（NaBO₃・H₂O として）８〜16％ − TAED ２〜８％ − ホスホネート（例えばEDTMPA）０〜１％ − ポリマー（例えばマレイン酸／アクリル酸コポリマー、ＰＶＰ、ＰＥＧ）０〜３％ − 酵素０〜５％ − 微量成分（例えば泡止め剤、香料、蛍光漂白剤）０〜５％４）下記の成分を含んで成る少なくとも600 g/ｌの嵩密度を有する顆粒として製剤化された洗剤組成物： − 直鎖アルキルベンゼンスルホネート（酸として計算）８〜12％ − アルコールエトキシレート（例えばＣ_12-15アルコール、7 EO） 10〜15％ − 炭酸ナトリウム（Na₂CO₃として） 14〜22％ − 可溶性シリケート（Na₂O・2SiO₂として）１〜５％ − ゼオライト（NaAlSiO₄として） 25〜35％ − 硫酸ナトリウム（Na₂SO₄として）０〜10％ − カルボキシメチルセルロース０〜２％ − ポリマー（例えばマレイン酸／アクリル酸コポリマー、ＰＶＰ、ＰＥＧ）１〜３％ − 酵素０〜５％ − 微量成分（例えば泡止め剤、香料）０〜５％５）下記の成分を含んで成る水性液体洗剤： − 直鎖アルキルベンゼンスルホネート（酸として計算） 15〜21％ − アルコールエトキシレート（例えばＣ_12-15アルコール、7 EOまたはＣ_12-15アルコール、5 EO） 12〜18％ − 脂肪酸としての石鹸（例えばオレイン酸）３〜13％ − アルケニルコハク酸（Ｃ_12-14）０〜13％ − アミノエタノール８〜18％ − クエン酸２〜８％ − ホスホネート０〜３％ − ポリマー（例えばＰＶＰ、ＰＥＧ）０〜３％ − ホウ酸塩（B₄O₇として）０〜２％ − エタノール０〜３％ − プロピレングリコール８〜14％ − 酵素０〜５％ − 微量成分（例えば分散剤、泡止め剤、香料、蛍光漂白剤）０〜５％６）下記の成分を含んで成る水性液体洗剤： − 直鎖アルキルベンゼンスルホネート（酸として計算） 15〜21％ − アルコールエトキシレート（例えばＣ_12-15アルコール，7 EOまたはＣ_12-15アルコール，5 EO）３〜９％ − 脂肪酸としての石鹸（例えばオレイン酸）３〜10％ − ゼオライト（NaAlSiO₄として） 14〜22％ − クエン酸カリウム９〜18％ − ホウ酸塩（B₄O₇として）０〜２％ − カルボキシメチルセルロース０〜２％ − ポリマー（例えばＰＥＧ、ＰＶＰ）０〜３％ − 定着用ポリマー、例えばラウリルメタクリレート／アクリル酸コポリマー；モル比25：１；MW 3800 ０〜３％ − グリセロール０〜５％ − 酵素０〜５％ − 微量成分（例えば分散剤、泡止め剤、香料、蛍光漂白剤）０〜５％７）下記の成分を含んで成る少なくとも600 g/ｌの嵩密度を有する顆粒として製剤化された洗剤組成物： − 脂肪アルコールスルフェート５〜10％ − エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド３〜９％ − 脂肪酸としての石鹸０〜３％ − 炭酸ナトリウム（Na₂CO₃として）５〜10％ − 可溶性シリケート（Na₂O・2SiO₂として）１〜４％ − ゼオライト（NaAlSiO₄として） 20〜40％ − 硫酸ナトリウム（Na₂SO₄として）２〜８％ − 過ホウ酸ナトリウム（NaBO₃・H₂Oとして） 12〜18％ − TAED ２〜７％ − ポリマー（例えばマレイン酸／アクリル酸コポリマー、ＰＥＧ）１〜５％ − 酵素０〜５％ − 微量成分（例えば蛍光漂白剤、泡止め剤、香料）０〜５％８）下記の成分を含んで成る顆粒として製剤化された洗剤組成物： − 直鎖アルキルベンゼンスルホネート（酸として計算）８〜14％ − エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド５〜11％ − 脂肪酸としての石鹸０〜３％ − 炭酸ナトリウム（Na₂CO₃として）４〜10％ − 可溶性シリケート（Na₂O・2SiO₂として）１〜４％ − ゼオライト（NaAlSiO₄として） 30〜50％ − 硫酸ナトリウム（Na₂SO₄として）３〜11％ − クエン酸ナトリウム（C₆H₅Na₃O₇として）５〜12％ − ポリマー（例えばＰＶＰ、マレイン酸／アクリル酸コポリマー、ＰＥＧ）１〜５％ − 酵素０〜５％ − 微量成分（例えば泡止め剤、香料）０〜５％９）下記の成分を含んで成る顆粒として製剤化された洗剤組成物： − 直鎖アルキルベンゼンスルホネート（酸として計算）６〜12％ − 非イオン性界面活性剤１〜４％ − 脂肪酸としての石鹸２〜６％ − 炭酸ナトリウム（Na₂CO₃として） 14〜22％ − ゼオライト（NaAlSiO₄として） 18〜32％ − 硫酸ナトリウム（Na₂SO₄として）５〜20％ − クエン酸ナトリウム（C₆H₅Na₃O₇として）３〜８％ − 過ホウ酸ナトリウム（NaBO₃・H₂Oとして）４〜９％ − 漂白促進剤（例えはNOBSまたはTAED）１〜５％ − カルボキシメチルセルロース０〜２％ − ポリマー（例えばポリカルボキシレートまたはＰＥＧ）１〜５％ − 酵素０〜５％ − 微量成分（例えば蛍光漂白剤、香料）０〜５％ 10）下記の成分を含んで成る水性液体洗剤組成物： − 直鎖アルキルベンゼンスルホネート（酸として計算） 15〜23％ − アルコールエトキシスルフェート（例えばＣ_12-15アルコール、2-3 EO）８〜15％ − アルコールエトキシレート（例えばＣ_12-15アルコール、7 EOまたはＣ_12-15アルコール、5 EO）３〜９％ − 脂肪酸としての石鹸（例えばラウリル酸）０〜３％ − アミノエタノール１〜５％ − クエン酸ナトリウム５〜10％ − ヒドロトロープ（例えばトルエンスルホン酸ナトリウム）２〜６％ − ホウ酸塩（B₄O₇として）０〜２％ − カルボキシメチルセルロース０〜１％ − エタノール１〜３％ − プロピレングリコール２〜５％ − 酵素０〜５％ − 微量成分（例えばポリマー、分散剤香料、蛍光漂白剤）０〜５％ 11）下記の成分を含んで成る水性液体洗剤組成物： − 直鎖アルキルベンゼンスルホネート（酸として計算） 20〜32％ − アルコールエトキシレート（例えばＣ_12-15アルコール、7 EOまたはＣ_12-15アルコール、5 EO）６〜12％ − アミノエタノール２〜６％ − クエン酸８〜14％ − ホウ酸塩（B₄O₇として）１〜３％ − ポリマー（例えばマレイン酸／アクリル酸コポリマー、定着用ポリマー、例えばラウリルメタクリレート／アクリル酸コポリマー）０〜３％ − グリセロール３〜８％ − 酵素０〜５％ − 微量成分（例えばヒドロトロープ、分散剤、香料、蛍光漂白剤）０〜５％ 12）下記の成分を含んで成る少なくとも600 g/ｌの嵩密度を有する顆粒として製剤化された洗剤組成物： − アニオン性界面活性剤（直鎖アルキルベンゼンスルホネート、アルキルスルフェート、α− オレフィンスルホネート、α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルカンスルホネート、石鹸） 25〜40％ − 非イオン性界面活性剤（例えばアルコールエトキシレート）１〜10％ − 炭酸ナトリウム（Na₂CO₃として）８〜25％ − 可溶性シリケート（Na₂O・2SiO₂として）５〜15％ − ゼオライト（NaAlSiO₄として） 15〜28％ − 過ホウ酸ナトリウム（NaBO₃・4H₂Oとして）０〜20％ − 漂白促進剤（TAEDまたはNOBS）０〜５％ − 酵素０〜５％ − 微量成分（例えば香料、蛍光漂白剤）０〜３％ 13）直鎖アルキルベンゼンスルホネートの全部または一部が（Ｃ₁₂〜Ｃ₁₈）アルキルスルフェートにより置き換えられている、１）〜12）に記載の洗剤組成物。 14）下記の成分を含んで成る少なくとも600 g/ｌの嵩密度を有する顆粒として製剤化された洗剤組成物： − （Ｃ₁₂〜Ｃ₁₈）アルキルスルフェート９〜15％ − アルコールエトキシレート３〜６％ − ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド１〜５％ − ゼオライト（NaAlSiO₄として） 10〜20％ − 積層ジシリケート（例えばHoechst からのSK56） 10〜20％ − 炭酸ナトリウム（Na₂CO₃として）３〜12％ − 可溶性シリケート（Na₂O・2SiO₂として）０〜６％ − クエン酸ナトリウム４〜８％ − 過炭酸ナトリウム 13〜22％ − TAED ３〜８％ − ポリマー（例えばポリカルボキシレートおよびＰＶＰ）０〜５％ − 酵素０〜５％ − 微量成分（例えば蛍光漂白剤、光漂白剤、香料、泡止め剤）０〜５％ 15）下記の成分を含んで成る少なくとも600 g/ｌの嵩密度を有する顆粒として製剤化された洗剤組成物： − （Ｃ₁₂〜Ｃ₁₈）アルキルスルフェート４〜８％ − アルコールエトキシレート 11〜15％ − 石鹸１〜４％ − ゼオライトＭＡＰまたはゼオライトＡ 35〜45％ − 炭酸ナトリウム（Na₂CO₃として）２〜８％ − 可溶性シリケート（Na₂O・2SiO₂として）０〜４％ − 過炭酸ナトリウム 13〜22％ − TAED １〜８％ − カルボキシメチルセルロース０〜３％ − ポリマー（例えばポリカルボキシレートおよびＰＶＰ）０〜３％ − 酵素０〜５％ − 微量成分（例えば蛍光漂白剤、ホスホネート、香料）０〜３％ 16）追加の成分としてまたは明記してある漂白系の代替物として、安定化されたまたはカプセル化された過酸を含有する、１）〜15）に記載の洗剤組成物。 17）過ホウ酸塩が過炭酸塩に置き換えられている、１），３），７），９）および12）に記載の洗剤組成物。 18）マンガン触媒を更に含有する、１），３），７），９），12），14）および15）に記載の洗剤組成物。マンガン触媒は、例えば“Efficient manganese ca talyst for low-temperature bleaching”，Nature，369，637-639，1994に記載の化合物の１つであることができる。 19）液体非イオン性界面活性剤（例えば直鎖アルコキシル化第一級アルコール）、ビルダー系（例えばホスフェート）、酵素およびアルカリを含んで成る非水性液体洗剤として製剤化された洗剤組成物。この洗剤はアニオン性界面活性剤および／または漂白系を含んでもよい。本発明の酵素は、洗剤に常用される濃度で配合することができる。本発明の洗剤組成物では、アレルゲン性を減らした問題の酵素を0.001 〜100 mg酵素／ｌ洗浄液に相当する量で添加することができると現在のところ期待される。食器洗い用組成物更に、本発明の改変酵素は食器洗い洗剤にも使うことができる。食器洗い洗剤組成物は、アニオン性、非イオン性、カチオン性、両性またはそれらの型の混合物であることができる界面活性剤を含んで成る。該洗剤は０〜90 ％の非イオン性界面活性剤、例えば低〜無発泡性エトキシル化プロポキシル化直鎖アルコールを含有するだろう。この洗剤組成物は、無機型および／または有機型の洗剤ビルダー塩を含有してもよい。そのような洗剤ビルダーは、含リン型と無リン型に細分することができる。洗剤組成物は一般に洗剤ビルダーを１〜90％含有する。含リン無機アルカリ洗剤ビルダーの例としては、存在する場合、水溶性塩、特にアルカリ金属ピロリン酸塩、オルトリン酸塩およびポリリン酸塩が挙げられる。含リン有機アルカリ洗剤ビルダーの例としては、存在する場合、ホスホネートの水溶性塩が挙げられる。無リン無機ビルダーの例としては、存在する場合、水溶性アルカリ金属炭酸塩、ホウ酸塩および珪酸塩並びに様々な型の水不溶性結晶質または非晶質アルミノシリケートが挙げられる。その中でゼオライトが最もよく知られた代表例である。適当な有機ビルダーの例としては、クエン酸、コハク酸、マロン酸、脂肪酸スルホネート、カルボキシメトキシスクシネート、ポリ酢酸、カルボン酸、ポリカルボン酸、アミノポリカルボン酸、ポリアセチルカルボン酸およびポリヒドロキシスルホン酸、のアルカリ金属塩、アンモニウム塩および置換アンモニウム塩が挙げられる。別の適当な有機ビルダーとしては、ビルダー性質を有することが知られている高分子量ポリマーおよびコポリマー、例えば適当なポリアクリル酸、ポリマレイン酸およびポリアクリル酸／ポリマレイン酸コポリマー並びにそれらの塩が挙げられる。食器洗い洗剤組成物は、塩素／臭素型または酸素型の漂白剤を含んでもよい。無機塩素／臭素型漂白剤の例は、次亜塩素酸および次亜臭素酸リチウム、ナトリウムまたはカルシウム、並びに塩素化リン酸三ナトリウムである。有機塩素／臭素型漂白剤の例は、複素環式Ｎ−ブロモおよびＮ−クロロイミド、例えばトリクロロイソシアヌル酸、トリブロモイソシアヌル酸、ジブロモイソシアヌル酸およびジクロロイソシアヌル酸、並びに水溶解性カチオンとそれらの塩、例えばカリウムおよびナトリウム塩である。ヒダントイン化合物も適当である。酸素漂白剤、例えば無機過塩の形、好ましくは漂白剤前駆体との無機過塩の形またはペルオキシ酸化合物としての酸素漂白剤が好ましい。適当なペルオキシ漂白化合物の典型例は、過ホウ酸アルカリ金属（四水和物と一水和物の両方）、過炭酸アルカリ金属、過珪酸アルカリ金属および過リン酸アルカリ金属である。好ましい促進物質はTAEDとグリセロールトリアセテートである。本発明の食器洗い洗剤組成物は、常用の酵素安定剤、例えばポリオール、例えばプロピレングリコール、糖もしくは糖アルコール、乳酸、ホウ酸、またはホウ酸誘導体、例えば芳香族ホウ酸エステル、を使って安定化することができる。本発明の食器洗い洗剤組成物は、別の常用の洗剤成分、例えば解膠剤、充填剤、泡止め剤（foam depressor）、防錆剤、汚れ懸濁剤、金属イオン封鎖剤、汚れ再付着防止剤、脱水剤、色素、殺菌剤、蛍光剤、増粘剤および香料を含んでもよい。最後に、本発明の酵素は従来の食器洗い洗剤、例えば次の特許刊行物のいずれかに記載された洗剤のいずれにおいても使うことができる： EP 518719，EP 518720，EP 518721，EP 516553，EP 516554，EP 516555，GB 220 0132，DE 3741617，DE 3727911，DE 4212166，DE 4137470，DE 3833047，WO 93/ 17089，DE 4205071，WO 52/09680，WO 93/18129，WO 93/04153，WO 92/06157，W O 92/08777，EP 429124，WO 93/21299，US 5141664，EP 561452，EP 561446，GB 2234980，WO 93/03129，EP 481547，EP 530870，EP 533239，EP 554943，EP 34 6137，US 5112518，EP 318204，EP 318279，EP 271155，EP 271156，EP 346136 ，GB 2228945，CA 2006687，WO 93/25651，EP 530635，EP 414197，US 5240632 ．本発明の範囲内の食器洗い洗剤組成物の特定態様としては次のものが挙げられる：１）自動食器洗い機用粉末組成物２）自動食器洗い機用粉末組成物３）自動食器洗い機用粉末組成物４）自動食器洗い機用粉末組成物５）自動食器洗い機用粉末組成物６）洗浄界面活性剤系を有する食器洗い用粉末および液体組成物７）自動食器洗い機用非水性液体組成物８）非水性食器洗い用液体組成物９）自動食器洗い機用チキソトロープ液体組成物 10）自動食器洗い機用液体組成物 11）保護された漂白粒子を含有する自動食器洗い機用液体組成物 11）過ホウ酸塩が過炭酸塩に置き換えられている、１），２），３），４），６）および10）に記載の自動食器洗い機用組成物。 12）更にマンガン触媒を含有する１）〜６）に記載の自動食器洗い機用組成物。マンガン触媒は、“Efficient manganese catalyst for low-temperature bleac hing”，Nature，369，(1994)，637-639に記載された化合物の１つであることができる。容易に入手可能な洗剤用プロテアーゼ含有製品の例としてはAlca Nordisk A/Sから入手可能）；洗剤用リパーゼの例としてはLipola 個人管理用途本発明の結合型ポリペプチドは、個人管理用途に関連した関心もある。プロテアーゼプロテアーゼはコンタクトレンズの洗浄用の周知の活性成分である。それらはレンズ上のタンパク様の汚れを加水分解し、それによってそれを可溶性にする。タンパク質汚れの除去は着用快適性に重要である。プロテアーゼは皮膚洗浄用品中の有効成分でもあり、その場合それらは古くなった角質様皮膚細胞の上層を除去し、それにより皮膚が明るく且つより生き生きと見えるようにする。プロテアーゼはオーラルケア用商品、特に義歯の洗浄用に使われているだけでなく、歯磨き剤にも使われている。更に、プロテアーゼは洗面用化粧品、入浴およびシャワー用品、例えばシャンプー、コンディショナー、ローション、クリーム、石鹸、トイレ用石鹸および液体石鹸に使われている。リパーゼリパーゼは、過剰の皮脂の除去のため皮膚洗浄用品およびニキビ予防用品の活性成分として、またスキンケアのためクリームおよびローションのような入浴およびシャワー用品の活性成分として、化粧用途に使うことができる。リパーゼは、毛髪表面からのフケおよび他の脂肪質の効果的除去のために毛髪洗浄用品（例えばシャンプー）にも使うことができる。リパーゼはコンタクトレンズの洗浄用品の有効成分でもあり、その場合それらはレンズ表面から脂質付着物を除去する。オキシドレダクターゼ個人管理目的で最もよく使われるオキシドレダクターゼは、H₂O₂の生成を保証し、次いでそれが例えばペルオキシダーゼ（通常ラクトペルオキシダーゼ）によるＳＣＮ^-またはＩ^-から抗菌薬（ＳＣＮＯ^-またはＩ₂）への酸化を開始させるであろう基質（例えばグルコース）を使うオキシダーゼ（通常グルコースオキシダーゼ）である。この酵素複合体は例えば乳やサルビアからの天然物が知られている。それはオーラルケア用品（洗口液、歯磨き剤、チューイングガム）の抗菌システムとして商業的に使われている。その場合、この酵素はグルコースを生成するアミログルコシダーゼと組み合わせることもできる。それらの系は化粧品の保存についても知られている。オキシダーゼとペルオキシダーゼの組合せを含んで成る抗菌システムはコンタクトレンズの洗浄で知られている。オキシドレダクターゼの別の適用は、オキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよびラッカーゼを使った酸化的染髪である。皮膚（および毛髪）の表面上に形成された遊離基は皮膚の老化過程（毛髪の損傷）に関係があることが知られている。遊離基は脂肪質、コラーゲンおよび細胞の破壊に至る連鎖反応を活性化する。化粧品中への遊離基スカベンジャー、例えばスーパーオキシドジスムターゼの使用は周知である（R.L．Goldemberg，DCI，Nov．93，48 〜52頁）。プロテインジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）もオキシドレダクターゼである。それは髪のくせづけ（毛髪中のジスルフィド結合の還元と再酸化）および傷んだ髪の修復（この場合損傷は主として現存のジスルフィド結合の還元である）に用いることができる。カルボヒドラーゼ歯の表面にできたプラークは主に多糖から成る。それらは歯の表面と微生物にくっつく。多糖は主にα−１，６−結合グルコース（デキストラン）とα−１，３−結合グルコース（ムタン）である。ムタナーゼとデキストラナーゼのような異なる型のグルカナーゼを使うことは、プラークの粘着性基質を加水分解するのに役立ち、それを機械的作用により取れやすくする。他の種類のバイオフィルム、例えばレンズケースの中にできるバイオフィルムも、グルカナーゼの作用により除去することができる。抗菌性ポリペプチド抗菌性ポリペプチドは、化粧品の保存、ニキビ予防用品、消臭剤およびシャンプーといった広範な用途を有する。更にそのようなポリペプチドはコンタクトレンズ用品にも利用することができる。食品および飼料本発明のアレルゲン性を減らした結合型酵素またはポリペプチドは、更に食品および飼料の製造において有益に使うことができる。プロテアーゼ小麦粉中のグルテンは、小麦粉がベイクド食品に利用できることの原因である必須成分である。パン生地（ドウ）のグルテン相を改質するには時々タンパク質分解酵素が必要であり、例えばプロテアーゼを使って硬い小麦粉を柔らかくすることができる。めおよび風味を良くするために使うことができる市販の中性金属プロテアーゼである。グルテンタンパク質は中程度にまたはより広範囲にペプチドに分解されるので、パン生地が柔らかくなり過ぎるのを避けるために厳密な制御が必要である。プロテアーゼは乳タンパク質を改質するのにも使われる。チーズを製造する時、乳中のカゼインを凝集させるためにレネットまたはキモシンのようなプロテアーゼを使うことができる。醸造工業では、プロテアーゼは未モルトの穀物を醸造しそして窒素含量を制御するために使われている。動物飼料では、プロテアーゼは言わば動物消化系を拡張させるのに使われている。リパーゼベーキング産業におけるリパーゼの応用はむしろ新しい。リパーゼの添加は、より大きな容積、改善されたすだち構造およびより白い色のために、改良されたパン生地性質と改良された製パン品質をもたらす。観察される効果は、リパーゼがパン生地の混合の間のグルテンと或る脂質断片との相互作用を変えるというメカニズムにより説明することができる。これは改良されたグルテン網状構造をもたらす。ブルーローンチーズ（例えばDanablue）、ある種のイタリアンチーズおよび他のバター脂含有乳製品の風味の発生は、乳脂肪から遊離脂肪酸への分解に依存する。そのような製品における風味の発生にリパーゼを使うことができる。油脂製造工業においては、リパーゼは例えば望ましくない副産物の量を少なくするため、エステル交換により脂肪を改質するため、およびエステルの合成に使われている。オキシドレダクターゼ更に本発明のアレルゲン性を減らしたオキシドレダクターゼは、食品および飼料の製造において有利に使うことができる。幾つかのオキシドレダクターゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼおよびそれらの組合せはベーキングに使われている。慣例的には、パン職人はアスコルビン酸と臭素酸カリウムを加えることによりグルテンを増強する。あるオキシダーゼは、グルテンタンパク質中の遊離スルフヒドリル単位の酸化により、パン生地中の臭素酸塩に代わるものとして使うことができる。これによりジスルフィド結合が作られ、より大きな抵抗性を持った、より強固でより弾力のあるパン生地が得られる。 Gluzyme ^TM（Novo Nordisk A/S）は、臭素酸塩に代用できるカタラーゼ活性を有するグルコースオキシダーゼ製剤である。パン生地の強化は、機械的衝撃に対する大きな抵抗性、より良好なオーブン膨張、およびより大きなローフ容積として判断される。カルボヒドラーゼ小麦粉は、ベーキング品質の差を引き起こす異なるアミラーゼ含量を有する。小麦粉を標準化するためにはアミラーゼの添加が必要となり得る。アミラーゼとペントサナーゼは通常酵母醗酵物に糖を供給し、パン容積を大きくし、劣化を遅らせ、ペントサンガムから生じる粘着性と古くなる速度を減らす。或る種の麦芽アミラーゼは、製品に粘着性を生じることなく２日間以上パンの保存寿命を延長させるのに利用することができる。デンプン分子の非還元性末端から低分子量糖類およびデキストリンを開裂させることにより、選択的に糊状デンプンを改質する。デンプンは劣化が起こりにくいような方法で改質される。生成する低分子量糖類は、最終製品に粘着性を引き起こす中間的な長さのデキストリンを生成することなく、焼きあがった製品の保水力を改善する。この酵素はパン焙焼の間に不活性化されるので、ラベル上に表示する必要がない加工助剤であると見なすことができる。ノバミル（Novamyl）の過剰摂取はほとんど排除することができる。真菌α−アミラーゼによりパン容積を大きくすることができ、これは更にきれいで且つ均一な構造のパン粉を提供する。前記アミラーゼはマルトース、デキストリンおよびグルコースを生成するエンド酵素である。穀物および或る種の細菌 α−アミラーゼは、デンプンの糊化温度よりも高い温度で不活性化されるので、小麦パン生地に添加すると、パン容積が小さく中がべっとりしたパンを生じる。フンガミル（Fungamyl）は、熱不安定性であるという利点を有し、糊化温度のすぐ下の温度で不活性化される。多数のペントサナーゼおよびヘミセルラーゼ活性を含む酵素調製物は、パン生地の取扱いと安定性を改善することができ、そしてパンの新鮮さ、すだち（crum b）構造およびパン容積を改善する。小麦粉中のペントサン画分を加水分解することにより、それはかなり多くの水分結合能を失い、次いでデンプンやグルテンにその水分が利用できるだろう。グルテンはより柔軟で伸展性になり、デンプンはより容易に糊化するようになる。ペントサナーゼは乳化剤と組み合わせてまたはそれの代替物として利用することができる。更にカルボヒドラーゼは、清涼飲料、菓子、肉製品、乳製品、パン製品、アイスクリーム、ベビーフード、ジャムなどに広く使われている、デンプンからのシロップの製造に使われている。デンプンの変換は通常３段階で実施される。第一にα−アミラーゼを使ってデンプンを液化する。主としてオリゴ糖とデキストリンから成る麦芽デキストリンを得る。次いで、オリゴ糖とデキストリンをグルコースに加水分解するために前記混合物をアミログルコシダーゼで処理する。こうしてより甘い製品が得られる。もしハイマルトースシロップが所望であれば、β−アミラーゼのみでまたはプルラナーゼ（枝切り酵素）と組み合わせて使ってもよい。グルコース混合物はフルクトースへの異性化により更に甘くすることができる。このために固定化グルコースイソメラーゼを使うことができる。糖工業では、サトウキビ汁中に存在するデンプンの分解を加速させることが慣例である。それによって原糖中のデンプン含量が減らされ、製糖所での濾過が促進される。更にデキストラナーゼは、原料の砂糖汁およびシロップ中のデキストランを分解するために使われている。アルコール産業では、α−アミラーゼはマッシュを蒸留する時のデンプンの希薄化に有益に使われている。醸造業では、α−アミラーゼは補助的な液化に使われている。乳製品工業では、乳糖吸収不良を有する人のための低乳糖乳を製造する時に、 β−ガラクトシダーゼ（ラクターゼ）が使われている。ラクターゼ処理乳から味付の乳飲料を製造する時、製品の甘さを減らさずに砂糖の添加量を減らすことができる。コンデンスミルクを製造する際、ラクターゼ処理により乳糖の晶出を避けることができ、かくして乳糖結晶中へのカゼイン凝集によって起こる濃縮の危険性が減らされる。ラクターゼ処理乳（またはホエー）からアイスクリームを製造する時、乳糖結晶が形成されず、砂質化という欠点が生じないだろう。更に、キシラナーゼはWO 94/21785(Novo Nordisk A/S)に記載されているように、多数の食品／飼料工業的用途の中で利用できることが知られている。 α−アミラーゼは、動物飼料工業においてデンプンの消化を良くするために穀物含有飼料に添加するのに使われている。抗菌性ポリペプチドある種の溶菌酵素は、例えば食肉包装業界において残骸を洗浄するのに使用することができる（例えばNovo Industri A/S からの米国特許第5,354,681 号を参照のこと）。トランスフェラーゼ本発明に係るアレルゲン性を減らしたトランスグルタミナーゼは、食品および飼料の製造において有利に使うことができる。トランスグルタミナーゼはタンパク質を架橋する能力を持つ。この性質は、タンパク質を含む水相をゲル化させるのに使うことができる。これはスプレッドの製造時に使うことができる（デンマーク国特許出願第1071/84 号、Novo Nordisk A/Sから）。トランスグルタミナーゼは、例えば改善された性質（例えば改善された味、密度、食感およびより大きな容積）を有するケーキの製造に使えるように小麦粉を改質することにより、小麦粉のベーキング品質の改善に使うことができる（特公平1-110147号参照）。更に、ペースト状の食材を製造する時に、例えばアイスクリーム、トッピング、フローズンデザート、マヨネーズおよび低脂肪スプレッドのような食品において脂肪代用物として使われる（Novo Nordisk A/SからのWO 93/22930 参照）。また、牛乳または乳状製品からのヨーグルト、ムース、チーズ、プリン、オレンジジュース用のゲルの調製、食用タンパク質の味および触感の改善に使われる（Novo Nordisk A/SからのWO 94/21120とWO 94/21129 参照）。フィターゼ本発明のフィターゼは食品、例えば朝食用シリアル食品、ケーキ、菓子、飲料、パンまたはスープ等、並びに動物飼料の製造において有利に使うことができる。フィターゼは、野菜タンパク源に存在するフィチン酸塩／フィチン酸に結合したリンを活用するため、またはフィチン酸錯体中に結合した栄養上重要な無機質を活用するためのいずれかで用いることができる。微生物フィターゼは、飼料への無機リンの補給を避けるために一腹動物の飼料に添加することができる（米国特許第3,297,548 号参照）。更にフィターゼは大豆加工に使うことができる。大豆ミールは高濃度の反栄養素因子フィテートを含み得る。フィテートは中に存在する必須無機質をキレート化するので、フィテートはこのタンパク源をベビーフードや魚、牛および他の非反芻動物用の飼料における使用に適さなくする（ヨーロッパ特許第0 420 358 号参照）。ベーキング目的でもフィターゼを使うことができる。小麦粉他とフィターゼを含むパン生地の分割片を焙焼することにより、優れた品質を有するパンを製造することができる。高フィターゼ活性コウジカビは清酒の製造に使われることが知られている（JP -0-6070749-A参照）。繊維用途プロテアーゼプロテアーゼは絹の精錬およびサンドウオッシュに使われている。リパーゼリパーゼは、織物の仕上げ時に疎水性エステル（例えばトリグリセリド）を含む脂肪質を除去するために使われる（Novo Nordisk A/SからのWO 93/13256 参照）。オキシドレダクターゼ繊維の漂白洗浄において、カタラーゼは過剰の過酸化水素を除去するために役立ち得る。カルボヒドラーゼデニム衣料品の仕上げにおいて生地の色濃度を局部的に変化させるためにセルロース分解酵素が広く使われている（酵素で促進される「ストーンウオッシュ」）。セルロース分解酵素はバイオポリッシュ工程においても利用される。バイオポリッシュは、布の湿潤性を損なうことなく取扱と外観の点で布品質を改善する糸表面の特殊処理である。バイオポリッシュは例えばWO 93/20278 に記載された方法を使うことにより得ることができる。繊維の製織中、糸は相当な機械応力にかけられる。切断を避けるために、それらは通常ゼラチン状物質（糊剤）でコーティングする（糊付けする）ことにより強化される。最も常用される糊付け剤は天然形または改質形のデンプンである。かくして生地から糊剤を除去した後、いわゆる糊抜きの後で、均一で且つ耐久性のある仕上げを得ることができる。デンプンまたは改質デンプンを含む糊剤で糊付けした生地の糊抜きは、好ましくはデンプン分解酵素の使用により促進される。口腔および皮膚用医薬品プロテアーゼ高度に精製されたプロテアーゼの様々な組合せ（例えばトリプシンとキモトリプシン）が、経口投与される医薬品に並びに例えば炎症、湿疹および外傷の治療用の皮膚医薬品に使われている。皮革製造トランスフェラーゼトランスグルタミナーゼが、硬化剤として作用することにより皮革のカゼイン仕上げに使われることは知られている（Novo NordiskからのWO 94/13839 参照）。硬質表面の洗浄例えば食品工業における硬質表面の洗浄は、乳製品、肉、魚介類食品、飲料等の製造に使われる装置が複雑な形を有するのでしばしば困難である。酵素を含んで成るゲルおよびフォーム形態の界面活性剤の使用は硬質表面の洗浄を容易にし且つ改善することが示されている。そのような界面活性剤組成物中に有利に添加することができる酵素は、特にプロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼおよびセルラーゼである。そのような酵素を含む硬質表面洗浄組成物は、輸送部門においても、例えば洗車や一般容器洗浄に有利に使うことができる。最後に、本発明は、ポリペプチドを含んで成る製品における本発明の結合体または本発明の組成物の利用に関する。まず第一に、本発明の結合体または組成物は、個人管理用品、例えばヘアケアまたはヘアトリートメント用品に有利に使うことができる。この例としては、シャンプー、バルサム、ヘアコンディショナー、ヘアウエーブ剤、染毛剤、ヘアトニック、ヘアリキッド、ヘアクリーム、ヘアシャンプー、ヘアリンス、ヘアスプレーのような製品が挙げられる。更に期待されるのは、歯磨き剤、洗口液、チューインガムのようなオーラルケア用品である。同じく期待されるのは、スキンケア用品および化粧品、例えばスキンクリーム、スキンミルク、クレンジングクリーム、クレンジングローション、クレンジングミルク、コールドクリーム、クリーム石鹸、美容エッセンス、スキンローション、ミルキーローション、カーマインローション、ハンドクリーム、粉末石鹸、透明石鹸、サンオイル、サンスクリーン（日焼け止め）、ひげ剃り用フォーム、ひげ剃り用クリーム、ベビーオイル、口紅、リップクリーム、クリーミーファンデーション、フェイスパウダー、パウダーアイシャドウ、パウダーファンデーション、メーキャップベース（化粧下地）、エッセンスパウダー、ホワイトニングパウダーである。コンタクトレンズ衛生用品にも、本発明の結合体を有利に使うことができる。そのような製品としては、コンタクトレンズ洗浄用および消毒用製品である。洗浄用粉末石鹸、固形石鹸、液体石鹸のような洗剤への利用も期待される。方法および材料材料酵素基質： suc-AAPF-pNA（スクシニル−アラニン−アラニン−プロリン−フェニルアラニン−ｐ−ニトロアニリド）。Sigma No．S-7388，M _w624.6 g/モルジメチルカゼイン（CM−カゼイン）（Sigma）グリセロールトリブチレート（Merck 1958）カルボキシメチルセルロース（Sigma）ポリマー：ポリエチレングリコール（PEG-35,000）（Fluka から）トレシルクロリド（２，２，２−トリフロロエタンスルホニルクロリド）により活性化されたポリエチレングリコール（PEG-5.000）（Sigma，St.Louis，USA ；M-3038）モノメトキシポリエチレングリコール（mPEG-5.000）（Shearwater Polymers Inc.，USAから）モノメトキシポリエチレングリコール（mPEG-15.000）（Shearwater Polymers Inc.，USAから） mPEG-NH₂-5.000（Shearwater Polymers Inc.，USAから）酵素：サブチリシンＡ（Novo Nordisk A/S）サブチリシン Novo（サブチリシンBNP′）（Novo Nordisk A/S）ヌギノーサ（Humicola lanuginosa）リパーゼ（Novo Nordisk A/Sから入手可能）リポラーゼ（請求すればNovo Nordisk A/Sから入手可能）カンジダ・アンタークティカ（Candida antaectica）リパーゼＢ（Novo Nordi sk A/Sから入手可能）ポリポラス・ピンシタス（Polyporus pinsitus）ラッカーゼ（Novo Nordisk B iotech Inc．からのPCT/US95/07536に記載）コプリナス・シネレウス（Coprinus cinereus）ペルオキシダーゼ（Novo Nor disk A/Sから入手可能）溶液：停止溶液（ＤＭＧ緩衝液）ホウ酸ナトリウム、Borax（Sigma）３，３−ジメチルグルタル酸（Sigma） CaCl₂（Sigma）トレシルクロリド（２，２，２−トリフルオロエタンスルホニルクロリド）（ Fluka） Tween-20：ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Merck カタログ番号822184）１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）（Fluka）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Fluka品番56480）ホスゲン（Fluka品番79380）トレーサー分子：ビオチン化マウス抗ラットＩｇＥ（Zymed 品番号03-9740）着色基質：ＯＰＤ：ｏ−フェニレンジアミン（Kementecカタログ番号4260）動物： Brown Norwayラット（Charles River，DE から）装置： XCELII（Novex） ELISA リーダー（UVmax，Molecular Devices） HPLC（Waters） PFLC（Pharmacia） Superdexカラム，Mono-Q，Mono-S（Pharmacia，SW から） Superdex-75 カラム（Pharmacia，SW から） SLT: SLT LabInstruments からの光度計サイズ排除クロマトグラフ（Spherogel TSK-G2000 SWG）サイズ排除クロマトグラフ（Superdex 200，Pharmacia，SW）方法基質としてカゼインを使ったプロテアーゼ活性分析：）活性は、AF 219/1-GB（Novo Nordisk A/Sから入手可能）中に記載されている。 Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA を使ったプロテアーゼ活性分析：プロテアーゼ特にキモトリプシンは、ペプチドとｐ−ニトロアニリンの間の結合を開裂させ、405 nmで吸収する可視の黄色を与える。緩衝液：例えばBritton & Robinson緩衝液，pH 8.3。基質：100 mgのsuc-AAPF-pNAを１mlのジメチルスルホキシド（DMSO）に溶かす。この溶液の100 μｌをBritton & Robinson緩衝液で10mlに希釈する。分析：基質とプロテアーゼ溶液を混合し、時間およびＡ_405nm／分の関数として405 nmで吸光度をモニタリングする。温度制御すべきである（プロテアーゼに応じて20〜50℃）。これは試料中のプロテアーゼ活性の測度である。リパーゼ活性：リパーゼ活性は"AF 95/5 GB（Novo Nordisk A/Sから入手可能）中に記載された通りに分析した。オキシドレダクターゼ活性：基質としてカゼインを使って測定するオキシドレダクターゼ活性は"AF 219/1- GB（Novo Nordisk A/Sから入手可能）中に記載されている。ラッカーゼ活性：ラッカーゼ活性は、好気条件下でシリンガルダジンの酸化から測定する。生成する紫色を530 nmで光度測定する。分析条件は19μMシリンガルダジン、23.2 mM 酢酸緩衝液、pH 5.5、30℃、反応時間１分である。１ラッカーゼ単位（LACU）は、それらの条件下で１分あたり1.0 μモルのシリンガルダジンの変換を触媒する酵素の量である。ラッカーゼのラッカーゼ活性はAF 239 GB（要求すればNovo Nordiskから入手可能）（これは参考として本明細書中に組み込まれる）中に記載されている。ペルオキシダーゼ活性：ペルオキシダーゼの酵素活性はPODU（ペルオキシダーゼ単位）として測定される。１PODUは、２，２′−アジノビス〔３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸〕（ABTS）が酸化される系において１分あたり１μモルのH₂O₂の変換を触媒する酵素の量である。セルラーゼ活性：。この反応は20 mM リン酸Na pH 7 中で40℃にて10分間実施した。ことによりモニタリングした。加えて、“EAL-SM-0373.01/01”（要求すればNov o Nordiskから入手可能）中に記載された通りにセルロース分解活性を測定した。 ELISA IgE 試験方法：３層サンドイッチELISA を使って特異抗体の相対濃度を決定する。被覆用抗原として、中性リン酸塩緩衝液中の10μg/mlおよび50μｌ／ウエルの免疫用分子を使って４℃で一晩インキュベーションする。ウエル表面上の残りの結合部位を全て、リン酸塩緩衝液中の200 μｌ／ウエルの２％脱脂粉乳を使って室温（RT）で少なくとも30分間ブロックする。この抗原を使って試験しようとする血清は全て、８チャンネルピペットを使って10倍希釈からの希釈系列に次いで３倍希釈において、このプレートに50μｌ／ウエルで添加する。希釈液は0.5 ％脱脂粉乳と0.05％Tween 20を有するリン酸塩緩衝液中に作製し、RTで攪拌台上で２時間インキュベートしたものである。「トレーサー」分子は、0.5 ％脱脂粉乳と0.05％Tween 20を有するリン酸塩緩衝液中で2000倍希釈し、RTで攪拌台上で２時間インキュベートした50μｌ／ウエルのビオチン化マウス抗ラットＩｇＥである。対照（ブランク）は同じ順序であったがラット血清を使わなかった。2000倍希釈した50μｌ／ウエルのストレプトアビジン接合西洋ワサビペルオキシダーゼを攪拌台上で１時間インキュベートした。50μｌ／ウエルの着色基質は、10mlのクエン酸塩緩衝液 pH 5.2中のＯＰＤ（６mg）とH₂O₂（30％溶液を４μｌ）である。100μｌ／ウエルの2 N H₂SO₄を使って反応を停止させる。ＳＬＴ上での読みは全て486 nmと比較参照としての620 nmである。データはロータス中で計算・表示する。ラットの気管内（IT）感作：分子のIT投与には、2.5 インチ（6.35cm）の長さの金属探査子の付いた使い捨て注射器を使う。この探査子を喉頭蓋（図１参照）の約１cm下の気管内に注入し（図１参照）、そして分子の溶液0.1 ml を付着させる。動物を４回感作し、最後の感作と瀉血の間に５日間あける。動物は４グループに分けたBrown Norwayラットである。開始時点での体重は250 グラム以上であり、終了時点での体重は約450 グラムである。分子量の測定：標準法により４〜20％勾配ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（novex）を使ってタンパク質の電気泳動分離を行った。銀染色により子量標準の移動度に比較して測定した。実施例実施例１トレシルクロリドを使ったPEG 35.000の活性化活性化方法はNilson，K.他(1984),前掲から改作した。使用する全ての溶媒はM erck 分析用である。 4.0 g のPEG 35.000を無水ジクロロメタン（10ml）に溶かした。ピリジン（0. 25ml）とトレシルクロリド（0.22ml）を加えた。周囲温度で90分間攪拌した後、得られた黄色混合物を蒸発乾固し、次いで熱エタノール（60ml）中に溶かし、HC l で酸性にした。混合物を冷凍庫中で−18℃に一晩放置しておくと、嵩張った白色沈澱が得られた。この沈澱を400 g での20分間の遠心により回収し、冷たい酸性エタノール（60mlエタノール、0.5 ml濃塩酸）で繰り返し（６回）洗浄した。一定重量が得られるまで溶媒を蒸発させることにより、77％の収率でオフホワイト色粉末の活性化PEG-35.000を回収した。この活性化PEG-35.000は融点59〜61℃ により特徴付けられ、ＮＭＲ分析は30〜35％のトレシル化を示した。上記方法に従ったスケールアップ合成において、96％の収率で59 〜60℃の融点を有する黄色フレークが得られた。ＮＭＲ分析は40％より高いトレシル化を示した。実施例２トレシルクロリドを使ったmPEG 15.000 の活性化 mPEG 15.000(10.0 g)を無水ジクロロメタン（35ml）に溶かし、その15mlを留去して微量の水を除去した。冷却した後、液体表面の下にトリエチルアミン（90 0 μｌ，10当量）とトレシルクロリド（350 μｌ，５当量）を加えた。溶液が明黄色に変わり、幾らかのトリエチルアミン塩酸塩が沈澱した。90分後、攪拌しながら太い注射器を使って溶液をエーテル（250 ml）中に注いだ。３分間攪拌した後、明黄色沈澱物を濾過し、エーテル（20ml）で洗浄し、乾燥させると、ＮＭＲで80〜90％の活性化とかなりの量のHNEt₃Cl を示す、11.3 gの生成物を得た。これを熱濾過を使って酢酸エチル（325 ml）から再結晶して大部分の塩を除去した。室温にゆっくり冷却した後、更に結晶化させるために懸濁液を冷蔵庫中に放置しておいた。収量9.3 g （93％）の白色結晶。¹H-NMR（CDCl₃）δ1.42 t（I= 6 .5 CH₃ i HNEt₃Cl），3.10 dq(I=4.6 CH₂ i HNEt₃Cl)，3.38 s(I=2.6 CH₃ i OMe )，3.40^*dd(I=4.5 ‰，¹³C 付随)，3.64 bs(I= 1364 主ピーク)，3.89^*dd(I=4.8 ‰，¹³C 付随)，4.24 q(J= 9.0 Hz，I= 1.8，トレシル中のCH₂)，4.53^*dd（I=1 .5 CH₂-O- トレシル）。80〜90％活性化とわずか６‰(w/w)のHNEt₃Cl.を示す。実施例３Ｎ−スクシンイミジルカーボネートを使ったmPEG 15.000 の活性化 mPEG 15.000 をトルエン中に懸濁し（４ml／g のmPEG）、その20％を常圧下で共沸蒸留して反応体を乾燥させた。溶液を30℃に冷却した後にジクロロメタン（乾燥１ml／g mPEG）を加え、トルエン中のホスゲン（1.93 M，５モル／モルmPEG ）を添加し、混合物を室温で一晩攪拌した。それを蒸発乾固せしめ、蝋状の塊として所望の生成物を得た。蒸発後、ジクロロメタンとトルエン（１：２，乾燥したもの３ml／g mPEG）を加えて白色固体を再溶解させた。固体としてのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（２モル／モルmPEG）と次いでトリエチルアミン（1.1 モル／モルmPEG）を加えた。混合物を３時間攪拌すると、最初は不透明であったが次いで透明になり、最後に少量の沈澱が生じた。この混合物を蒸発乾固せしめ、熱濾過により酢酸エチル（10ml）から再結晶して塩と不溶物を除去した。ブランク液をゆっくり冷やすために周囲温度に16時間放置しておき、次いで冷蔵庫の中に一晩置いておいた。白色沈澱を濾過し、少量の冷却酢酸エチルで洗浄し、乾燥すると98％(w/w)を得た。ＮＭＲは80〜90％の活性化と５‰(w/w)のHNEt₃Cl を示す。mPEG 15000についての¹H-NMR(CDCl₃)δ1.42 t(I= 4.8 CH₃ i HNEt₃Cl)，2.84 s(I=3.7 スクシンイミド)，3.10 dq(I= 3.4 CH₂ i HNEt₃Cl)，3.38 s(I= 2.7 CH₃ i OMe)，3.40^*d d(I= 4.5‰，¹³C 付随)，3.64 bs(I= 1364 主ピーク)，3.89^*dd(I=4.8 ‰，¹³C 付随)，4.47 dd(I= 1.8，PEG 中のCH₂)。デシケーター中で22℃で４か月間の貯蔵後も全く変化が見られなかった。実施例４Ｎ−スクシンイミジルカーボネートを使ったmPEG 5.000の活性化Ｎ−スクシンイミジルカーボネートを使ったmPEG 5.000の活性化は実施例３に記載したのと同様にして行った。実施例５トレシルクロリドで活性化したPEG 35.000とプロテアーゼとの結合従って調製した活性化PEG 35.000の混合物（7.5 ml）を、磁気攪拌器を使って0.1 Ｍホウ酸ナトリウム，pH 9.2の中で周囲温度で一晩インキュベートした。エタノールアミン（0.01ml）の添加により結合反応を終わらせた。ラムを使ったHPLCによるサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。親酵素と比べると、該結合体は基質としてsuc-AAPF-pNAを使ったペプチドアッセイでは68％の残余酵素活性を有し、基質としてカゼインを使ったアッセイでは 39％の残余酵素活性を有した。実施例６上記実施例１と５に記載したのと同じ手順と化学薬品を使って、ただし約10倍過剰の活性化PEG 35.000、例えば42mgのエスペラーゼ性は、suc-AAPF-pNA基質を使うと80％であり、基質としてカゼインを使うと46％であった。実施例７活性化mPEG 5.000とプロテアーゼとの結合 200 mgのサブチリシン Novo を50 mM ホウ酸ナトリウム，pH 10中でＮ−スクシンイミジルカーボネートで活性化したmPEG 5.000（実施例４に従って調製）1. 8 ｇと共に20mlの最終容積でインキュベートした。反応は周囲温度で磁気攪拌を使って行った。反応時間は１時間であった。最終濃度 5 mM グルタル酸ジメチル，1 mM CaCl₂および50 mM ホウ酸塩，pH 5.0へのＤＭＧ緩衝液の添加により反応を停止させた。得られた誘導体の分子量は約100 kDa であり、これはサブチリシン Novo １モルあたり結合したPEG 12モルに相当する。親酵素に比較して、残余活性はペプチド基質（スクシニル−Ala- Ala-Pro-Phe-ｐ−ニトロアニリド）に対しては100 ％に近く、CM−カゼインに対しては64％であった。実施例８活性化mPEG 15.000 とプロテアーゼとの結合 200 mgのサブチリシン Novo を50 mM ホウ酸ナトリウム，pH 10中でＮ−スクシンイミジルカーボネート活性化mPEG 15.000（実施例３に従って調製）5.5 g と共に20mlの最終容積でインキュベートした。反応は周囲温度で磁気攪拌を使って行った。反応時間は１時間であった。最終濃度 5 mM グルタル酸ジメチル，1 mM CaCl₂および50 mM ホウ酸塩，pH 5.0へのＤＭＧ緩衝液の添加により反応を停止させた。得られた誘導体の分子量は200 kDa より上であり、サブチリシン Novo １モルあたり結合したPEG 12モルに相当する。親酵素に比較して、残余活性はペプチド基質（スクシニル−Ala-Ala-Pro-Phe- ｐ−ニトロアニリド）に対しては100 ％に近く、CM−カゼインに対しては71％であった。実施例９トレシルクロリドで活性化したPEG 35.000とリパーゼとの結合って調製した活性化PEG 35.000の混合物（3.4 ml）を、磁気攪拌器を使って0.1 Ｍホウ酸ナトリウム，pH 9.2の中で周囲温度で一晩インキュベートした。エタノールアミン（0.01ml）の添加により結合反応を終わらせた。ムを使ったHPLCによるサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。親酵素と比べると、該結合体は基質としてグリセロールトリブチレートを使った時に56％の残余酵素活性を有していた。実施例10 トレシルクロリドで活性化したPEG 5.000 とリパーゼとの結合って調製したトレシルクロリド活性化PEG 5.000 の混合物（２ml）を、磁気攪拌器を使って0.1 Ｍホウ酸ナトリウム，pH 9.2の中で周囲温度で一晩インキュベートした。エタノールアミン（0.01ml）の添加により結合反応を終わらせた。ムを使ったHPLCによるサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。親酵素と比べると、該結合体は基質としてグリセロールトリブチレートを使った時に48％の残余酵素活性を有していた。実施例11 トレシルクロリドで活性化したmPEG 15.000 とリパーゼとの結合 25mgのカンジダ・アンタークティカ（Candida antarctica）リパーゼＢを25ml の0.1 M ホウ酸塩，1 M NaCl，pH 9.2中で実施例２に従ってトレシルクロリドで活性化したmPEG 15.000 2.82 gと共に周囲温度で３時間インキュベートした。1 mlの２Ｍグリシンの添加により反応を停止させ、次いで得られた誘導体をサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した（Spherogel TSK-G2000 SWG）。親のカンジダ・アンタークティカ（Candida antarctica）リパーゼＢと比べると、該誘導体は基質としてグリセロールトリブチレートを使った時に約83％の残余酵素活性を保持していた。実施例12 トレシルクロリドで活性化したmPEG 15.000 とリパーゼとの結合 6 mlの0.1 M ホウ酸塩，0.8 M NaCl，pH 9.2中の27mgのリポラー活性化したmPEG 15.000 417.4 mgと共に周囲温度で３時間インキュベートした。 139μｌの２Ｍグリシンの添加により反応を停止させ、次いで得られた誘導体をサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した（Spherogel TSK-G2000 SWG）。ルトリブチレートを使った時に約36％の残余酵素活性を保持していた。実施例13 トレシルクロリドで活性化したmPEG 15.000 とリパーゼとの結合 17mlの0.1 M ホウ酸塩，0.8 M NaCl，pH 9.2中の170 mgのリポラ 19 gと共に周囲温度で３時間インキュベートした。730μｌの２Ｍグリシンの添加により反応を停止させた後、誘導体をサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した（Spherogel TSK-G2000 SWG）。ルトリブチレートを使った時に約64％の残余酵素活性を保持していた。実施例14 Ｎ−スクシンイミジルカーボネートで活性化したmPEG 15.000 とリパーゼとの結合 9 mlの0.1 M ホウ酸塩，1 M NaCl，pH 9.2中の100 mgのリポラーネートで活性化したmPEG 15000 2.576 gと共に周囲温度で３時間インキュベートした。859 μｌの２Ｍグリシンの添加により反応を停止させ、次いで得られた誘導体をサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した（Spherogel TSK-G2000 SW G）。ルトリブチレートを使った時に約60％の残余酵素活性を保持していた。得られた結合体の分子量はSDS-PAGEを使って約150 kDa であると決定された。実施例15 mPEG-NH₂-5.000 とリパーゼとのカルボジイミド媒介結合 5 mlの50 mM MES 緩衝液，0.2 M NaCl，pH 5.0中の0.4 mgのリポエチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）と共に周囲温度で３時間インキュベートした。得られた誘導体をサイズ排除クロマトグラフィー（Superdex 200，Pharmacia）により精製した。レートを使った時に約１％の残余活性を保持していた。実施例16 Ｎ−スクシンイミジルカーボネートで活性化したmPEG 15.000 とラッカーゼとの結合 10mlの0.1 M ホウ酸塩，0.5 M NaCl，pH 9.2中の100 mgのポリポラス・ピンシタス（Polyporus pinsitus）ラッカーゼを、実施例３に従ってＮ−スクシンイミジルカーボネートで活性化したmPEG 15000 1.155 gと共に周囲温度で２時間インキュベートした。200 μｌの２Ｍグリシンの添加により反応を停止させ、次いで得られた誘導体をサイズ排除クロマトグラフィー（Superdex 200）により精製し、そして50 mM ホウ酸塩，pH 9.0に対して透析した。分子量はSDS-PAGEにより150 〜200 kDa であると決定された。親のラッカーゼと比べると、該誘導体は約55％の残余酵素活性を保持していた。実施例17 Ｎ−スクシンイミジルカーボネートで活性化したmPEG 15.000 とコプリナス・シネレウス（Coprinus cinereus）ペルオキシダーゼとの結合 7.5 mlの0.1 M ホウ酸塩，0.5 M NaCl，pH 9.2中の75mgのペルオキシダーゼを、実施例３に従ってＮ−スクシンイミジルカーボネートで活性化したmPEG 15.00 0 1.579 g と共に周囲温度で２時間インキュベートした。200 μｌの２Ｍグリシンの添加により反応を停止させ、次いで得られた誘導体をサイズ排除クロマトグラフィー（Superdex 200）により精製し、そして0.1 M リン酸ナトリウム，pH 7 .0に対して透析した。分子量はSDS-PAGEにより150 〜200 kDa であると決定された。親のペルオキシダーゼと比べると、該誘導体は約79％の残余酵素活性を保持していた。実施例18 トレシルクロリドで活性化した PEG 5.000とセルラーゼとの結合液 pH 8.5 中でトリシルクロリド活性化PEG 5.000 115.2 mgと共に周囲温度で２時間インキュベートした。反応は磁気攪拌を使って周囲温度で行った。反応温度は１時間であった。誘導体の分子量（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中での変性タ取り付けられたＰＥＧ２〜４モルに相当する、53〜63 kDaであった。内部標準（親酵素の高純度精製調製物）と比較すると、誘導体は63％の残余活性を保持していた。実施例19 活性化mPEG 5.000と基質保護セルラーゼとの結合 mPEG結合の最中、酵素の活性部位を遮蔽するために、酵素をカルボキシメチルセルロース溶液（0.5 ％ W/V）中で実施例３のものと同じ最終緩衝液およびタンパク質濃度に希釈した（４mlの炭酸ナトシンイミジルカーボネートで活性化したmPEG 5.000）。反応は４℃で１時間行った。実施例18と同様に、４〜20％勾配ポリアクリルアミドゲルを使ったＳＤＳ電気泳動とその後の銀染色により、誘導化率を評価した。ＰＥＧ２〜４モルに相当する、53〜63 kDaであった。誘導体の触媒活性は親酵素のそれの90％であった。実施例20 活性化mPEG 5.000と生成物安定化セルラーゼとの結合 C7292）を80 mM の最終濃度（5.000 倍のモル過剰に相当する）になるように添加した。セロビオースの存在下でのＮ−スクシンイミおよび生成物の特徴付けは上述したのと同様に実施した。誘導体の〜４モルに相当する、53〜63 kDaであった。誘導体は100 ％の残余活性を保持していた。実施例21 1 mlの0.1 M ホウ酸塩，1 mM CaCl₂，pH 10.0 中の20mgのカレザーボネートで活性化したmPEG 15000 54.3 mgと共に周囲温度で３時間インキュベートした。18μｌの２Ｍグリシンの添加により反応を停止させ、次いで得られた誘導体をサイズ排除クロマトグラフィー（Superdex 200）により精製した。活性を保持していた。実施例22 ラット気管内（ＩＴ）追跡試験ブラウンノルウェーラット（ＢＮ）を、いずれも上記実施例に記載したようなＮ−スクシンイミジルカーボネートで活性化したmPEG 15.000 との酵素結合体としての、改変型サブチリシン Novo 、Ri ぞれ気管内感作した。免疫動物からの血清を特異的IgE ELISA（前述）において試験し、該分子が肺上皮を透過しそして特異的IgE 応答を引き起こす免疫応答系を活性化したかどうかを調べた（図２，３，４および５参照）。図面から明らかなように、親酵素で気管内暴露したラットに比べて改変酵素で気管内暴露したラットの応答は削減される。上記開示を鑑みて、本発明の精神または範囲から逸脱することなく多数の変更や修正を本発明の実施に加えることが可能なことは当業者に明らかであろう。従って、本発明の範囲は次の請求の範囲により限定される内容に従って解釈されるべきである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年２月４日【補正内容】請求の範囲１．1 kDa 〜60 kDaの範囲の分子量を有するポリマーに結合された5 kDa 〜10 0 kDa の分子量を有する親のポリペプチドを含んで成る、呼吸アレルゲン性を減らした改変ポリペプチド。２．前記ポリペプチドがタンパク質、特に抗菌活性または触媒活性を有するタンパク質である、請求項１に記載の改変ポリペプチド。３．前記ポリペプチドが酵素である、請求項２に記載の改変ポリペプチド。４．前記酵素がプロテアーゼ、リパーゼ、オキシドレダクターゼ、カルボヒドラーゼ、トランスフェラーゼ、フィターゼを含む酵素の群より選ばれる、請求項３に記載の改変ポリペプチド。５．前記ポリマーがポリアルキレンオキシド(PAO)、例えばポリアルキレングリコール(PAG)、例えばポリエチレングリコール(PEG)、メトキシポリエチレングリコール(mPEG)およびポリプロピレングリコール、PEG−グリシジルエーテル（E pox-PEG）、PEG−オキシカルボニルイミダゾール（CDI-PEG）、Star−PEGs、Bra nced PEGs、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリカルボキシレート、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ−Ｄ，Ｌ−アミノ酸、デキストラン、例えばカルボキシメチルデキストラン、セルロース、例えばメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシエチルセルロースおよびヒドロキシプロピルセルロース、キトサンの水解物、デンプン、例えばヒドロキシエチルデンプンおよびヒドロキシプロピルデンプン、グリコーゲン、アガロースおよびその誘導体、グアゴム、プルラン、イヌリン、キサンタンゴム、カラギーナン、ペクチン、アルギン酸水解物並びに生体高分子を含んで成る群より選ばれる、請求項１に記載の改変ポリペプチド。６．前記ポリマーがポリエチレングリコール(PEG)、特にメトキシポリエチレングリコールである、請求項５に記載の改変プロテアーゼ。７．前記ポリマーが１〜60 kDa、好ましくは２kDa〜35 kDa、特に2 〜25 kDa の分子量（Ｍ_r）を有する、請求項５または６に記載の改変プロテアーゼ。８．前記結合体が50 kDa〜500 kDa、好ましくは50〜400 kDa、より好ましくは 50 kDa〜250 kDa、特に100 kDa 〜250 kDa、例えば80 kDa〜200 kDa の範囲の分子量を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の改変プロテアーゼ。９．請求項１〜８のいずれか一項に記載の呼吸アレルゲン性を減らしたポリペプチドの製造方法であって、親のプロテアーゼ１分子を１〜30分子、好ましくは１〜25分子、例えば１〜10分子のポリマーと結合させる段階を含んで成る方法。 10．前記親のプロテアーゼを２〜15分子のポリマーと結合させる、請求項９に記載の方法。 11．前記親のポリペプチドが10 kDa〜100 kDa の分子量を有する、請求項９または10に記載のポリペプチドの製造方法。 12．前記活性化ポリマーを1 kDa〜60 kDaの分子量を有する活性化ポリマーと反応させる、請求項10または11に記載のポリペプチドの製造方法。 13．前記親のポリペプチドを活性化ポリマーと反応させる、請求項９〜12のいずれか一項に記載のポリペプチドの製造方法。 14．請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリペプチドを含んで成る組成物であって、他のポリペプチド、タンパク質もしくは酵素、および／または、洗剤、例えば固形石鹸、家庭用品、農薬、個人管理用品、例えばコンタクトレンズ用洗浄剤並びに皮膚および毛髪用洗浄剤、化粧品、洗面用化粧品、口腔および皮膚用医薬品、織物加工用組成物、並びに食品および飼料を製造するのに使われる組成物、において常用される成分を更に含んで成る、前記組成物。 15．プロテアーゼ、リパーゼ、オキシドレダクターゼ、カルボヒドラーゼ、トランスフェラーゼ、例えばトランスグルタミナーゼ、抗菌性ポリペプチドおよびフィターゼを含んで成る群より選ばれた少なくとも１つのポリペプチドまたは酵素を含んで成る、請求項14に記載の組成物。 16．ポリペプチドを含む工業用品の呼吸アレルゲン性を減らすための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の呼吸アレルゲン性を減らしたポリペプチドまたは請求項14〜15のいずれか一項に記載の組成物の利用。 17．個人管理用品における請求項16に記載の利用。 18．ヘアケアまたはヘアトリートメント用品への請求項17の利用。 19．シャンプー、バルサム、ヘアコンディショナー、ヘアウエーブ剤、染毛料、ヘアトニック、ヘアリキッド、ヘアクリーム、シャンプー、ヘアリンス、ヘアスプレーへの請求項18の利用。 20．オーラルケア用品における請求項17に記載の利用。 21．歯磨き剤、洗口液、チューインガムへの請求項20に記載の利用。 22．スキンケア用品における請求項17に記載の利用。 23．スキンクリーム、スキンミルク、クレンジングクリーム、クレンジングローション、クレンジングミルク、コールドクリーム、クリーム石鹸、美容エッセンス、スキンローション、ミルキーローション、カーマインローション、ハンドクリーム、粉末石鹸、透明石鹸、サンオイル、サンスクリーン、ひげ剃り用フォーム、ひげ剃り用クリームおよびベビーオイルにおける請求項22に記載の利用。 24．化粧品における請求項17に記載の利用。 25．口紅、リップクリーム、クリーミーファンデーション、フェイスパウダー、パウダーアイシャドウ、パウダーファンデーション、メーキャップベース、エッセンスパウダー、ホワイトニングパウダーへの請求項24に記載の利用。 26．コンタクトレンズ衛生用品への請求項16に記載の利用。 27．コンタクトレンズ洗浄および殺菌用品への請求項26に記載の利用。 28．洗剤における請求項16に記載の利用。 29．粉末洗剤における請求項28に記載の利用。 30．液体洗剤における請求項28に記載の利用。 31．食器洗い洗剤における請求項28に記載の利用。 32．石鹸、固形石鹸、液体石鹸への請求項28に記載の利用。 33．口腔および皮膚用医薬品における請求項16に記載の利用。 34．農薬における請求項16に記載の利用。 35．食品および飼料における請求項16に記載の利用。 36．ベーキング製品における請求項35に記載の利用。 37．織物加工用品における請求項16に記載の利用。 38．硬質表面の洗浄用組成物における請求項16に記載の利用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 7/48 Ａ６１Ｋ 7/48 7/50 7/50 47/48 47/48 ＺＣ１１Ｄ 3/386 Ｃ１１Ｄ 3/386 Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｎ 9/10 9/18 9/18 9/20 9/20 9/42 9/42 9/48 9/48 11/08 11/08 Ｚ (31)優先権主張番号１３９７／９４ (32)優先日 1994年12月７日 (33)優先権主張国デンマーク（ＤＫ） (31)優先権主張番号１３９８／９４ (32)優先日 1994年12月７日 (33)優先権主張国デンマーク（ＤＫ） (31)優先権主張番号１３９９／９４ (32)優先日 1994年12月７日 (33)優先権主張国デンマーク（ＤＫ） (31)優先権主張番号１４００／９４ (32)優先日 1994年12月７日 (33)優先権主張国デンマーク（ＤＫ） (31)優先権主張番号１４０１／９４ (32)優先日 1994年12月７日 (33)優先権主張国デンマーク（ＤＫ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ベク，トーマスクリスチャンデンマーク国，デーコー−2880 バグスバエルト，ノボアレ，ノボノルディスクアクティーゼルスカブ

Claims

【特許請求の範囲】１．1 kDa 〜60 kDaの範囲の分子量を有するポリマーに結合された5 kDa 〜10 0 KDa の分子量を有する親のポリペプチドを含んで成る、アレルゲン性を減らした改変ポリペプチド。２．前記ポリペプチドがタンパク質、特に抗菌活性または触媒活性を有するタンパク質である、請求項１に記載の改変ポリペプチド。３．前記ポリペプチドが酵素である、請求項２に記載の改変ポリペプチド。４．前記酵素がプロテアーゼ、リパーゼ、オキシドレダクターゼ、カルボヒドラーゼ、トランスフェラーゼ、フィターゼを含んで成る酵素の群より選ばれる、請求項３に記載の改変ポリペプチド。５．前記ポリマーがポリアルキレンオキシド(PAO)、例えばポリアルキレングリコール(PAG)、例えばポリエチレングリコール(PEG)、メトキシポリエチレングリコール(mPEG)およびポリプロピレングリコール、PEG−グリシジルエーテル(Ep ox-PEG)、PEG−オキシカルボニルイミダゾール(CDI-PEG)、Star−PEGs、Branced PEGs、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリカルボキシレート、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ−Ｄ，Ｌ−アミノ酸、デキストラン、例えばカルボキシメチルデキストラン、セルロース、例えばメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシエチルセルロースおよびヒドロキシプロピルセルロース、キトサンの水解物、デンプン、例えばヒドロキシエチルデンプンおよびヒドロキシプロピルデンプン、グリコーゲン、アガロースおよびその誘導体、グアゴム、プルラン、イヌリン、キサンタンゴム、カラギーナン、ペクチン、アルギン酸水解物並びに生体高分子を含んで成る群より選ばれる、請求項１に記載の改変プロテアーゼ。６．前記ポリマーがポリエチレングリコール(PEG)、特にメトキシポリエチレングリコールである、請求項５に記載の改変プロテアーゼ。７．前記ポリマーが１〜60 kDa、好ましくは2 kDa 〜35 kDa、特に2 〜25 kDa の分子量（Ｍ_r）を有する、請求項５または６に記載の改変プロテアーゼ。８．前記結合体が50 kDa〜250 kDa、好ましくは50〜400 kDa、より好ましくは 50 kDa〜500 kDa、特に100 kDa〜250 kDa、例えば80 kDa〜200 kDaの範囲内の分子量を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の改変プロテアーゼ。９．請求項１〜８のいずれか一項に記載のアレルゲン性を減らしたポリペプチドの製造方法であって、親のプロテアーゼ１分子を１〜30分子、好ましくは１〜 25分子、例えば１〜10分子のポリマーと結合させる段階を含んで成る方法。 10．前記親のプロテアーゼを２〜15分子のポリマーと結合させる、請求項９に記載の方法。 11．前記親のポリペプチドが10 kDa〜100 kDa の分子量を有する、請求項９または10に記載のポリペプチドの製造方法。 12．前記活性化ポリマーを1 kDa 〜60 kDaの分子量を有する活性化ポリマーと反応させる、請求項10または11に記載のポリペプチドの製造方法。 13．前記親のポリペプチドを活性化ポリマーと反応させる、請求項９〜12のいずれか一項に記載のポリペプチドの製造方法。 14．請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリペプチドを含んで成る組成物であって、他のポリペプチド、タンパク質もしくは酵素、および／または、洗剤、例えば固形石鹸、家庭用品、農薬、個人管理用品、例えばコンタクトレンズ用の洗浄剤並びに皮膚および毛髪用洗浄剤、化粧品、洗面用化粧品、口腔および皮膚用医薬品、織物加工用組成物、並びに食品および飼料を製造するのに使われる組成物、において常用される成分を更に含んで成る、前記組成物。 15．プロテアーゼ、リパーゼ、オキシドレダクターゼ、カルボヒドラーゼ、トランスフェラーゼ、例えばトランスグルタミナーゼ、抗菌性ポリペプチドおよびフィターゼを含んで成る群より選ばれた少なくとも１つのポリペプチドまたは酵素を含んで成る、請求項14に記載の組成物。 16．ポリペプチドを含む工業用品のアレルゲン性を減らすための、請求項１〜８のいずれか一項に記載のアレルゲン性を減らしたポリペプチドまたは請求項14 〜15のいずれか一項に記載の組成物の利用。 17．個人管理用品における請求項16に記載の利用。 18．ヘアケアまたはヘアトリートメント用品への請求項17の利用。 19．シャンプー、バルサム、ヘアコンディショナー、ヘアウエーブ剤、染毛料、ヘアトニック、ヘアリキッド、ヘアクリーム、シャンプー、ヘアリンス、ヘアスプレーへの請求項18の利用。 20．オーラルケア用品における請求項17に記載の利用。 21．歯磨き剤、洗口液、チューインガムへの請求項20に記載の利用。 22．スキンケア用品における請求項17に記載の利用。 23．スキンクリーム、スキンミルク、クレンジングクリーム、クレンジングローション、クレンジングミルク、コールドクリーム、クリーム石鹸、美容エッセンス、スキンローション、ミルキーローション、カーマインローション、ハンドクリーム、粉末石鹸、透明石鹸、サンオイル、サンスクリーン、ひげ剃り用フォーム、ひげ剃り用クリームおよびベビーオイルにおける請求項22に記載の利用。 24．化粧品における請求項17に記載の利用。 25．口紅、リップクリーム、クリーミーファンデーション、フェイスパウダー、パウダーアイシャドウ、パウダーファンデーション、メーキャップベース、エッセンスパウダー、ホワイトニングパウダーへの請求項24に記載の利用。 26．コンタクトレンズ衛生用品への請求項16に記載の利用。 27．コンタクトレンズ洗浄および殺菌用品への請求項26に記載の利用。 28．洗剤における請求項16に記載の利用。 29．粉末洗剤における請求項28に記載の利用。 30．液体洗剤における請求項28に記載の利用。 31．食器洗い洗剤における請求項28に記載の利用。 32．石鹸、固形石鹸、液体石鹸への請求項28に記載の利用。 33．口腔および皮膚用医薬品における請求項16に記載の利用。 34．農薬における請求項16に記載の利用。 35．食品および飼料における請求項16に記載の利用。 36．ベーキング製品における請求項35に記載の利用。 37．織物加工用品における請求項16に記載の利用。 38．硬質表面の洗浄用組成物における請求項16に記載の利用。