JPH02499A - 歯周疾患検査用組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は歯周疾患検査用組成物、さらに詳しくは、検体
中のある種の歯周疾患原因菌を特異的に、かつ、簡便、
迅速に検出し、歯周疾患の罹患や進行を診断、予測し、
あるいは治療の効果を診断することのできる検査用組成
物に関する。

従来の技術および問題点 近年、歯周疾患に関する細菌学的研究が進み、南周疾憬
病巣部に多くのスピロヘータが検出され、種々の臨床的
指標と高い相関性を示すことが判明している。また、嫌
気性のダラム陰性桿菌が主要な歯周疾患の原因菌である
ことも判明しており、その中でも特に、バタテロイデス
・ジンジバリス（Ｂ　ａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　　ｇｉｎ
ｇｉｖａｌ　ｉｓ）などの黒色色素産生バクテロイデス
（Ｂ　ｌａｃｋ−ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ　Ｂ　ａｃｔｅｒ
ｏｉｄｅｓ）が注目され、その病原性について多数の報
告がなされている。

そこで、口腔内におけるこれらの原因菌の存在を検知し
、歯周疾患の罹患や進行を診断あるいは予７則し、歯周
疾患の治療、予防に、臨床的に応用する試みがなされて
いる。

しかしながら、細菌学的方法によるこれらの原因菌の検
知には、暗視野顕微鏡の使用、嫌気性菌の取扱という高
度な技術、特殊な設備等を必要とし、操作が煩雑で、培
養や結果の判断にも長い時間や熟練を要するという欠点
があり、臨床的に実用化するには困難な点が多い。また
、免疫学的な面から、これらの原因菌に対する液性免疫
である血中の抗体価を測定したり、細胞性免疫であるリ
ンパ球幼若化反応を測定し、原因菌の存在を検知する試
みもなされているが、検体試料の調整に煩雑な操作を必
要とする問題があり、やはり、実用化はなかなか困難・
である。

このような事情にかんがみ、本発明者らは、臨床的に実
用化できる歯周疾患原因菌の検知を可能とすべく、鋭意
研究を重ねた。その結果、口腔内スピロヘータが非常に
特異的なペプチダーゼ様酵素活性を有し、また、バタテ
ロイデス・ジンジバリス、バタテロイデス・インターミ
ーディアスなど黒色色素産生バクテロイデスら同様な活
性を有し、ある種の基質を用いる発色反応により、この
酵素活性を特異的に、かつ、簡便、迅速に検出でき、し
かも、歯周疾患の症状が正確に反映されることを見出し
、すでに特許出願した（特願昭６１−１７９７１６号、
同６１−２３３８　＝Ｉ　１３号および同６２−１１３
１２２号）。

一方、ペプチダーゼ様酵素の発色反応による測定におい
て、発色反応を促進させるある種の化合物を用いること
により、きわめて容易に、短時間に測定することができ
ることを知り、すてに特許出願した（特願昭６２−２８
６５５９号）。

その後、さらに研究を重ねた結果、この発色反応を促進
させる化合物が前記の歯周疾患原因菌の検知に適用でき
ること、また、それにより、より容易に、短時間に検知
が行えることを見出し、本発明を完成するに至った。

問題点を解決するための手段 本発明は、検体中のペプチダーゼ様酵素活性を測定する
ことにより、歯周疾患の罹患や進行を診断、予測し、あ
るいは治療効果の診断をするための検査用組成物であっ
て、 （ａ）式：　　Ｘ−Ｔ−Ｐｒｏ−Ｙ　　　　　［１］［
式中、Ｐｒｏはプロリン残基、Ｘは水素またはアミノ基
保護基、Ｙはプロリン残基のＣ末端に結合する酸素の存
在下に酸化酵素によって色源体の酸化反応の反応速度を
増加させる化合物（以下エンハンサ−という）の残基、
ＴはそのＣ末端がプロリン残基のＮ末端と結合する０〜
４個のアミノ酸またはその保護誘導体からなるアミノ酸
またはペプチドの残基を意味する］ で示される化合物および （ｂ）式　：　　　Ｘ’−Ｚ−Ａｒｇ−Ｙ’　　　　　
　　［２コ［式中、Ａｒｇはアルギニン残基、Ｘｏは水
素またはアミノ基保護基、Ｙｏはアルギニン残基のＣ末
端に結合するエンハンサ−の残基、ＺはそのＣ末端がア
ルギニン残基のＮ末端と結合する０〜４ｇのアミノ酸ま
たはその保護誘導体からなるアミノ酸またはペプチドの
残基を意味する］ で示される化合物あるいはこれらの混合物、電源体およ
び酸化酵素を組み合わせてなることを特徴とする歯周疾
ル検査用組成物を提供するものである。

本発明の組成物を用いる検査は次の２つの反応系より成
り立っている。第１は検体中のペプチダーゼ様酵素と、
式［１］および式［２］の基質とを反応させエンハンサ
−を遊離させる反応である。第２は、遊離したエンハン
サ−の存在下、酸素の存在下に電源体を酸化する酵素の
作用によって電源体を酸化して色素を生成させる反応で
ある。第１の反応においてはエンハンサ−の生成は検体
中のペプチダーゼ様酵素活性に比例する。第２の反応に
おいては、エンハンサ−の１と色素の生成速度とが比例
する。すなわち、酸化酵素の作用によって電源体が酸化
され、時間に比例して色素が生成し、エンハンサ−が存
在すると色素の生成速度が増幅される。また、一定時間
後の色素の生成量はエンハンサ−の１に比例することに
基づく。

従って、第１および第２の反応を組み合わせ、生成する
色素を定量することによってエンハンサ−の奄を定量し
、その結果、検体中のペプチダーゼ活性を測定すること
ができる。

本発明の検査用組成物を用いれば、唾液、歯垢、歯肉溝
浸出液などのような検体を、好ましくは、至適条件下（
ｐＨ５〜９）、式［１］および式［２］の基質と反応さ
仕、その後電源体および酸化酵素と反応させることによ
り、あるいは検体を電源体および酸化酵素の存在下、式
［１］および式［２］の基質と反応させることにより、
生成する色素の量を測定し、簡便かつ迅速に、歯周疾患
の罹患や進行を診断、予測あるいは治療の効果を診断す
ることができる。

基質として用いる式［１］および［２］の化合物は公知
であるか、少なくとも、公知のペプチド合成法によって
容易に製造できるものであり、式［１コおよび式［２］
のＸおよびＸ°基で示されるアミノ梧保護基はペプチド
合成に用いられる公知のアミノ基保護基のいずれのもの
でもよく、例えば、ホルミル基、アセチル基、スクシニ
ル基、ｔ−ブトキソカルボニル基、ベンゾイル基、カル
ボヘンゾキン基、ρ−トルエンスルホニル基などが挙げ
られろ。

Ｔ基はそのＣ末端がプロリン残基のＮ末端と結合する０
〜４側のアミノ酸またはその保護誘導体からなるアミノ
酸またはペプチドであればいずれでもよいが、Ｔ基中の
Ｃ末端アミノ酸残基がグリノン、アラニン、リジン、フ
ェニルアラニンまたはこれらの保護誘導体残基であるこ
とが好ましい。

該保護誘導体には、セリンのＯＨ基、システィンのＳｌ
ｌ基、アスパラギン酸やグルタミン酸のβあるいはγ−
ＣＯＯＩ−１基が保護基、例えば、ヘンノル基などで保
護されたちのが包含されろ。

Ｚ基はそのＣ末端がアルギニン残基のＮ末端と結合する
０〜４個のアミノ酸またはその保護誘導体からなるアミ
ノ酸またはペプチドであればいずれでもよいが、Ｚ基中
のＣ末端アミノ酸残基がグリシン、リジン、アルギニン
、フェニルアラニンまたはこれらの保護誘導体残基であ
ることが好ましい。該保護誘導体には、セリンのＯＨ基
、システィンのＳＨ基、アスパラギン酸やグルタミン酸
のβ−あるいはγ−ＣＯＯＨ基が保護基、例えば、ベン
ノル基などで保護されたものが包含される。

ＹおよびＹｏで示されているエンハンサ−残基は電源体
を酸化する反応速度を増加させる化合物の残基であれば
いずれでしよく、かかるエンハンサ−の具体例としては
式： ［式中、Ｒ１−Ｒ４は、同一もしくは異なって、水素、
ハロゲン、アルキル、スルホンまたはヒドロキシルを示
しＲ６はヒドロキンル、アミノまた置換アミノ（該置換
基はアルキル、スルホアルキルまたはヒドロキンアルキ
ル）をα味するコで示されるアニリン誘導体があげられ
ろ。

式［３］の化合物の具体例としては、３．５−ジブロモ
−４−ヒドロキソアニリン（ＤＢＨＡ）、３５−ジクロ
ロ−４−ヒドロキンアニリン（ＤＣＨＡ）、ｐ−Ｎ、Ｎ
−ジスルホプロピルアミノアニリン（ＳＰＡ）、３．５
−ノヨードー４−ヒドロキンアニリン（ＤＩＨＡ）、３
．３−ジアミノスチルベン−４，４°−ジスルホン酸（
ＤＳＤＡ）、ｐ−フェニレンジアミン（ＰＰＤ）、４−
アミノアニリン３−スルホン酸（ＤＡＳ）、２−メチル
−３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシアニリン（ＭＤＩ
３ＨＡ）、２．６−シメチルー３．５−フクロロー４−
ヒドロキンアニリン（ＤＭＤＣＨＡ）、４−Ｎ、Ｎ−ジ
スルホプロピルアミノ−３，５−ノブロモアニリン（Ｓ
ＤＢＡ）、４−（Ｎ−エチル−Ｎ−ヒドロキソエチルア
ミノ）−３，５−ノブロモアニリン（ＥＨＤＢＡ）、４
−Ｎ、Ｎ−ジエチルアミノ−３，４ノヒドロキシアニリ
ン（Ｄ　Ｅ　Ｄ　ＩＩ　Ａ　）などがあげられる。

式［＋］および式［２コの化合物におけろ各アミノ酸残
基の立体配置は、ペプチダーゼ様酵素の基質となりつる
限り、特に限定するものではない。

本発明で用いられる酸化酵素としては酸素の存在下色原
体を酸化して色素を生成させる酵素いずれら使用でき、
例えば、ビリルビンオキシダーゼ（ＥＬＯＤ、ＥＣＩ、
３．３．５）、モノフェノール・オキシゲナーゼ（ＭＰ
ＯｌＥＣＩ、１４．１８．１）、アスコルビン酸オキシ
ダーゼ（ＡＯＤ、ＥＣＩ、１０．３．３、）カテコール
オキンダーゼ（ＥＣＩ、１０．３、■）、ラブカーゼ（
ＥＣＩ。

１０．３．２）、０−アミノフェノールオキノダーゼ（
ＰＣＩ、１０．３．４）、３−ヒドロキシアンスラニレ
イトオキノダーゼ（ＥＣＩ、１０．３．５）、フェノー
ル−２−モノオキノゲナーゼ（ＥＣ１、！４．１３．７
）などがあげられる。

電源体としては、酸化されて発色するものは何れら使用
でき、感度を向上させるには、分子吸光係数の高いもの
が好ましい。しかし、エンハンサ−の非存在下の反応に
おいて発色（試藁盲倹に相当）が少なく、一方、エンハ
ンサ−の存在により著しく強い発色を示す化合物が好ま
しい。このような電源体としては、例えば、つ５の化合
物があげられる。

Ｃ＝０ Ｃ＝Ｏ Ｈ ＣＨ２−ＣＯＯＨ Ｃ＝Ｏ Ｈ ＣＨ，−ＣＯＯＨ これらの化合物の吸収極大値はつぎの表のとおっである
。

７、＞ａ ３　ａ 本発明の検査用組成物は、式［１］および［２］の化合
物が検体由来のペプチダーゼ様酵素の基質として反応で
き、さらに遊離したエンハンサ−が酸化酵素による電源
体の酸化縮合反応を増強する反応を行うことができる形
態のものであればいずれでもよい。

もっとも基本的には式［１］あるいは式［２］の化合物
あるいは両者の混合物を含む水溶液と酸化酵素および電
源体が共存する水溶液の組み合わせであるか、あるいは
式［１］あるいは式［２］の化合物あるいは両者の混合
物および酸化酵素、電源体が共存する水溶液でよく、好
ましくは、測定時、ｐＨ５〜９となるよう緩衝剤を含有
させる。用いる緩衝剤は通常用いられるものいずれでも
よく、例えばグツドバッファー、トリス塩酸緩衝剤、リ
ン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、ベロナール緩
衝剤、ＨＥＰＥＳ６１衝剤などを用いることができる。

該水溶液は、式［＋］、式［２］の化合物、電源体、酸
化酵素および、所望により、緩衝剤を蒸留水に溶解する
ような公知の方法で製造することができ、要すればさら
に、界面活性剤、防腐剤、抗生物質などの他の添加物を
適宜配合することができる。

反応に際し、各試薬は式［１］および式［２コの化合物
１０　ｎＭ＝　ｌ　ＯｍＭ、配合する場合の配合比率１
．１０〜ｌＯ：１の範囲で、色原体０．０ｌ−ＩＱ　ｘ
ｑ／　ＲＱｓ酸化酵素０．００１〜１００ＯＵ／ｚ（！
、緩衝剤１ｍＭ＝ＩＭの範囲で使用することが好ましい
。

前記の水溶液は、これらのＩ５度の式［１］および式［
２］の化合物、色原体、酸化酵素、所望により緩衝剤を
含有し、そのまま直接、検査に供することのできる形態
にすることができ、あるいは、使用時、適宜蒸留水で所
望の濃度に希釈する濃厚液の形態とすることらできる。

本発明の検査用組成物には、これらの水溶液の形態のら
のを、さらに、公知の方法により乾燥粉末化、粒化した
もののごとき固形の形態のらの、粉末成分を混合した粉
末、その顆粒化物のごとき固形の形態のもの、あるいは
、液状の形態のものをろ紙、ペーパーディスク、シート
、フィルム、スティック、スボンノ、高分子物などの担
体に含浸させるものら包含される。また、キットの形態
とすることらできる。

本発明の検査用組成物を用いて検査を行なうには、まず
、検体を採取する。検体の採取は公知の方法で行なって
もよく、例えば、歯肉溝浸出液や唾液はろ紙、キャピラ
リー、ペーパーポイントなどで採取でき、歯垢は綿棒、
キュレット、スケラーなどで採取できる。

ついで、本発明の検査用組成物と検体を、例えば、試験
管、マイクロクイタープレート、セル、バイアル瓶、プ
ラスチック・キュベツトなどの中で接触さけ、好ましく
はｐＨ５〜９で反応を行わせる。この反応は、通常２０
〜４５℃で行なわれ、反応時間は検体や反応温度により
異なるが、５分〜２４時間程度の反応が好ましい。

反応終了後、発色の有無、強弱を肉眼あるいは分光光度
計で判定し、これにより、検体中のペプチダーゼ様酵素
活性の存無、強弱を判断し、歯周医用の罹患や進行を診
断、予測あるいは治療効果の診断を行なうことができる
。

実験および実施例 つぎに、実験および実施例を挙げて本発明をさらに詳し
く説明する。

実験ｌ 各種口腔内嫌気性細菌のペプチダーゼ様酵素活性 口腔内の様気性細菌であるトレボネーマ・デンテイコー
ラ（Ｔ　ｒｅｐｏｎｅｍａ　ｄｅｎＬｊｃｏｌａ）　４
　殊、バクテロイデス・ジンジバリス５株、アクチノバ
チルス・アクチノマイセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏ
ｂａｃｉｌｌｕｓａｃＬｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉ
Ｌａｎｓ）　４　ｐ、アクチノマイセス・イスラエリー
（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　１ｓｒａｅｌｌｉ）２株お
よびフシバクテリウム・ヌクレータム（Ｆ　ｕｓｏｂａ
ｃＬｅｒｉｕｍ　　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）　３　ｆ’Ｊ
ｇのペプチダーゼ様酵Ｘ堰質に対する水解活性をつぎの
とおり測定した。

トレボネーマ炙の細菌はＴＹＧＶＳ培地を用い、３７°
Ｃで７日間、池の細菌はプレイン・ハート・インフュー
ジョン・ブロスを用い、３７℃で４８〜７２時間嫌気的
に培痒し、培養液を希釈して、各々、６６０ｎ＋＋＋に
おける吸光度が０．５の細菌懸濁液本調製した。

エンハンサ−としてＤＢＨＡを有するペプチダーゼ様酵
素の基質化合物をＯ，１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐｌ−１
７、５）に０．２ｍＭの濃度で溶解し、基質溶液を調整
した。

一方、５１１９／和デイスパノ一ルＭ−３２Ａを含む０
．１ＭＤ［ＰＳＯ緩衝液（ｐｉ−ｒ　７　、５　）に化
合物Ｐ−２およびＡＯＤ８各々０　、２　ｕ／Ｒ１！、
５０Ｕ／ｍＱとなるよう混合調製したらのを試薬液Ａと
した。

基質溶液１０ｍＱに試薬液Ａ１．５ｍ（！および細菌Ｉ
！！濁液０．２スＱを加え、３７℃で３０分間反応させ
た。反応終了後、生成した色素による６３０ｎｍにおけ
ろ吸光度の変化を分光光度計にて測定した。

各細菌懸濁液のペプチダーゼ様酵素活性は、各菌種の△
０Ｄ８３ｏ値の平均値を求め次のように表示した。

△ＯＤ８．。

＜０．０５ ±　：　　０．０５〜〈０．ｌ ＋　　　：　　０．１〜〈０．５ 十＋　　：　　０．５〜〈１．０ ＋＋４−　　：　　１．０〜＜２．０ ＋＋＋＋　　　：　　≧２．０ 結果を第１表に示す。第１表中、基質化合物の略号はつ
ぎのとおりである。

ＧＲ，グリシル−アルギニン−ＤＩ３ＨＡＢｚ−ＧＲ：
Ｎ−ベンゾイル−グリシル−アルギニン−Ｄ　Ｂ　ＨＡ Ｚ−ＶＧＲ：Ｎ−カルボベンゾキシ−バリルグリシル−
アルギニン−ＤＢＨＡ ＧＰニグリンループロリン−Ｄ１３ＨＡＺ−ＫＰ：Ｎ−
カルボベンゾキシ−リジル−プロリン−ＤＢＨＡ Ｂｚ−ＲＧＦＰ：Ｎ−ベンゾイル−アルギニルグリシル
−フェニルアラニル−プロ リン−ＤＢＨＡ 第１表に示すごとく、口腔内嫌気性細菌のうち、歯周疾
患原因菌であるスピロヘータ（トレボネーマ・デンティ
コーラ）およびバクテロイデス・ジンジバリスが特異的
なペプチダーゼ様酵素活性を示した。また、Ｃ末端にア
ルギニンをもつ基質とプロリンをもつ基質とを併用する
ことにより各々単独のものにくらべ２〜３倍の活性を示
した。

寒恍１ 本発明法と従来法との感度の比較 トレボネーマ・デンティコーラＡＴＣ０３５４０５株お
よびバクテロイデス・ジンジバリスＡＴＣＣ３３２７７
株のペプチダーゼ様分解活性を本発明法および従来法に
より測定し、本発明法と従来法との感度の比較を行った
。

細菌の培養は実験ｌの方法で行い、培養液を希釈して、
各々６６０ｎｍにおける吸光度が０．５および０．１の
細菌懸濁液を調整した。

基質としてＮ−ベンゾイル−アルギニル−グリシル−フ
ェニルアラニル−プロリン−ＤＢＨＡ（Ｂｚ−Ａｒｇ−
Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−ＤＢＨＡ）およびＮカルボベ
ンゾキン−グリシル−グリシル−アルギニン−ＤＢＨＡ
（Ｚ−１ｉｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＤＢＨＡ）を用い０
．１Ｍリン酸緩衝液（ｐｉ（７，０）に０゜２ｍＭ濃度
で溶解し、基質溶液を調整した。

本発明法による酵素活性の測定は実験ｌで行った方法に
より行った。なお色原体としてはＰ−２の代わりにＰ−
１を用いた。

一方、従来法としては、０．２ｍＭ基質溶液ｌ。

ＯＲρに細菌＠濁液０．２１ρ加え、３７℃、３００分
間反応後ｌ２ｗ９／酎Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフ
ェニル）−Ｎｏ−サクシニル・エチレンノアミン（ＥＭ
ＳＥ）を１．０籾、０　、５　ｙｓｇ／　ｚＱフｘリン
アン化カリウム０　、５　ｘ（ｌを加え、３７℃、５分
間反応後、生成した色素による７１０ｎｍにおける吸光
度の変化を分光光度計により測定した。

結果を第２表に示す。値は従来法および本発明法で測定
したＯＤ値を示す。

このように両店質と菌液のいずれの組み合わせにおいて
も従来法に比べ本発明法では１５倍〜２０倍程度のＯＤ
値が得られ、菌量（酵素量）が少な〈従来法では検出が
不可能であったものも検出可能である。

実験３ 実験２で、６６０ｎｍにおける吸光度が０．５になるよ
う調製したバクテロイデス・ジンジバリス菌液を用い、
実験２のＡＯＤの代わりに種々の酸化酵素を用い、色原
体として化合物Ｐ−２を用い実験２と同様の方法で本発
明法と従来法との感度を比較した。感度は本発明法にお
けるＯＤ、、。値と従来法における０Ｄ７１ｏ値の比で
表わした。

結果を第３表に示す。ＡＯＤの替わりに種々の酸化酵素
を用いた場合でも従来法に比へ高い感度アップがはかれ
た。

酸化酵素 ＰＯ ＡＯ ラッカーゼ ＰＯ Ａ　Ｏ ＭＯ 第３表 酸化酵素濃度（Ｕ／ｍＱ） ０．２ １．２ ０．０５ ０．０２ ２．５ 感度比（倍率） １６．５ ７８．１ ４．３ Ｉ！、６ 実験４ 実験３で、酸化酵素としてＡＯＤを用い、エンハンサ−
として、Ｄ　Ｂ　ＨＡの代わりに、５ＰＡＳＤＩＨＡ、
ＤＳＤＡ　％　　ＰＰＤ、　　　ＤＡＳ、　　　ＭＤＢ
ＨＡ、　　　ＤＭＤＣＨＡ。

５ＤＢＡ、ＥＨＤＢＡ、ＤＥＤＨＡを用い、本発明法と
従来法との感度を比較した。

その結果、第４表に示した感度比が得られた。

第　　４　　表 及Ｗ立 臨床所見との相関−１ 臨床所見上、健常であると認められる者５名、歯肉炎患
者６名および歯周炎患者６名から、各々、ペーパーポイ
ントにより歯肉溝浸出液検体を採取し、リンガ−液１　
、５　ｍ（ｌに分散後、位相差顕微鏡を用い、全菌数に
対するスピロヘータの相対量を測定した。また、このリ
ンガ−液０．２１１σを、実験ｌにおけると同様にして
調整した基質溶液を用い、同様にして氷解活性を測定し
た。基質としては、式［１］の化合物であるグリンルー
プロリンＤＢＨＡ（ＧＰ）、Ｎ−ベンゾイル−アルギニ
ルグリシル−フェニルアラニル−プロリン−ＤＢｌ−Ｉ
Ａ（Ｂｚ−ＲＧＦＰ）および式［１］の化合物であるＮ
−カルボベンゾキシ−バリル−グリシル−アルギニン−
ＤＢＨＡ（Ｚ−ＶＧＲ）、Ｎ−ベンゾイル−グリシル−
アルギニン−Ｄ１３ＨＡ（Ｂｚ−ＧＲ）を各々単独、併
用して用いた。

結果を第５表に示す。酸素活性の表示は実験ｌの表示に
従った。

第５表に示すごとく、酵素活性はスピロヘータ量および
臨床所見と相関し、基質を組み合わせることにより各々
単独で用いた場合より活性の増大が認められた。

友曾旦 臨床所見との相関−２ 健常者群（１０名）、成人性歯周炎患者群（１０名）、
限局性若年性歯周炎患者群（４名）の各群の混合全唾液
遠心上清を検体として用い、実験２の方法でペプチダー
ゼ様酵素活性を本発明法と従来法で比較した。なお、本
実験では反応時間は１５分間とした。基質として、Ｎ−
カルボベンゾキシ−グリシル−アルギニン−Ｄ　ＩＨＡ
（Ｚ−Ｃ；Ｒ）、Ｎ−ペンゾイルーアルギニルーグリシ
ルーフェニルアラニルーブロリン−Ｄ　Ｉ　ＨＡ（Ｂｚ
−ＲＧＦＰ）を各々単独および併用して用いた。

結果を第６表に示す。結果は実験２の如く、０ＤＳＳ。

、　ＯＤ　１．。値で示した。

第６表に示すごとく、成人性歯周炎患者群および限局性
若年性歯周炎患者群は、いずれの方法においても健常者
群に比べ高い活性を示し、統計的にも有意差が認められ
る。しかも本発明法では従来法に比べＯＤ値がｌθ倍程
度高く、患背群と健常群のＯＤ値の差が明確である。特
にＣ末端にアルギニンを６つ基質とプロリンを６つ基質
とを併用することにより、患晋群において約１５倍の高
い値を示した。従って本発明法による酵素活性測定によ
り短時間に歯周疾患の診断、予測および治療効果の判定
を客観的に行うことができる。

実施例１ Ｎ−カルボベンゾキンーバリルーグリンルーアルギニン
ーＤＢＨＡの２ｍＭ蒸留水溶液を基質溶液とした。Ｏ，
１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）を調製し、緩衝
液へとした。ディスパノールＭ−３２Ａ５ス９／Ｒ（ｌ
を含む０．１ＭＤＩＰＳＯ援衝液（ｐｌ（７，５）を緩
衝液Ｂとした。ＡＯＤを緩衝液Ｂに２００Ｕ／＋ａとな
るよう調製したものを酸化酵素溶液とした。化合物Ｐ−
３を緩衝液Ｂに０４：Ｊ９／＊（ｌとなるよう調製した
ちのを色源体溶液とした。

これらを組み合わせて、本発明の歯周疾弘検査用１ｎ成
物キットとした。

このキットは、つぎのようにして歯周疾患の診Ｉ析ある
いは予測に用いろことができる。

被験者の歯肉溝にペーパーポイントを３０秒間挿入して
検体を採取する。基質溶液０　、　ｌ　ｗＱおよび緩衝
液Ａ　Ｏ、９ｖＱを混合し、これに検体を加え、３７℃
で３０分間反応させろ。さらに、これに酸化酵素溶液０
．５πＱおよび色源体溶液０　、５　ｘＱ、を加え、３
７℃で３０分間反応させる。反応終了後、色調を肉眼観
察する。検体を添加しない対照と比較し、青色の強弱を
判定する。強い青色の呈色は゛歯周疾患の罹弘を示す。

実施例２ Ｎ−カルボベンゾキシ−グリシル−グリシル−アルギニ
ン−９ＰＡ５００ナノモルおよびＮ−ペンゾイループロ
リルーアラニルーグリンルーブロリン−５ＰＡ５００ナ
ノモルをペーパーディスク（１釜０　、６　ｃｍ）に含
浸させて基質試薬を調製した。

０　、　Ｉ　ｌｖｉリン酸緩衝液（ｐ１４７．０）にト
リトンＸ−１００を５１／屁となるよう調製したものを
緩衝液Ｃとした。ｒ３ＬＯＤ０．０２Ｕおよび化合物Ｐ
４　１巧をペーパーディスク（径０　、６　ｃｍ）に含
浸させて発色用試薬とした。これを組み合わけたらのを
本発明の歯周疾憶検査用組成物キットとした。

このキットは、つぎのようにして歯周疾患の検査あるい
は予測に用いることができる。

緩衝液Ｃ４００μＱをバイアル瓶に入れ、これに被験者
から採取した混合唾液１００μＱを加え、さらに基質試
薬のペーパーディスクを加え３７°Ｃで１５分間反応さ
せる。さらに発色用試薬のペーパーディスクを加え３７
°Ｃで１５分間反応させる。

反応終了後、実施例１と同様に肉眼観察して判定する。

実施例３ Ｎ−ベンゾイル−アルギニン−ＤＩＨＡ５００ナノモル
、Ｎ−ベンゾイル−アラニル−プロリンＤ　ｌ　ｌＩ　
Ａ２５０ナノモル、ＨＡＯ２，５Ｕ、化合物Ｐ−５を混
合し、アンプル（内径９　ｍｍ、長さ３Ｃ７）内で凍結
乾燥させたしのを反応用試薬とした。

トリトンＸ−１０ｏ　　５＊９／肩Ｑを含有するＯ１〜
（ＤＩＰＳＯ緩衝液（ｐＨ７，５）を調製し、緩衝液と
した。

これらを組み合わせて、本発明の歯周疾Φ検査用組成物
キットとした。

このキットは、つぎのようにして歯周疾患の検西あるい
は予測に用いることができる。

肢験各の歯肉溝にペーパーストリップスを３０秒間挿入
して検体を採取ずろ。緩衝液ｌ屑ぐを反応用試薬含有ア
ンプルに入れ試薬を溶解させる。これに検体を加え、３
７℃で３０分間反応さ仕る。

反応終了後、実施例１と同様に肉眼観察して判定する。

実施例・１ Ｎ−Ｌ−ブトキノカルボニル−バリル−ロイノル−グリ
ノル−アルギニン−Ｄ１３１−（Ａ、ＭＰＯ１化合物■
）−８を５ｍｖ／ｘＱディスパノールＭ３２Ａを含むＯ
，ＩＭ　ＤＩＰＳＯ緩衝液（ｐＨ７、５）にそれぞれ２
００ナノモル／：ａＱ、　０．２Ｕ／、ｖ９．０．２Ｔ
１ｇ／ｌｔＱとなるよう混合調製し、この１００μＣを
円径ろ祇（ｉｌ　Ｉ　ｃｉ）に含浸乾燥して試験紙を作
成した。

この試験紙は次のようにして歯周疾患の検龜あるいは予
測に用いることができる。

彼験者から採取した混合唾液１００μ夕を試験紙に滴下
し、室温で２０分間反応させる。反応終了後、試験紙の
色調を肉眼観察する。検体のかわりに水を滴下した対照
と比較し、青色の強弱をｒＪＩ定する。強い青色の呈色
は歯周疾弘の罹弘を示す。

実施例５ ＡＯＤ３０００Ｕをバイアル瓶（胴径３０Ｒｉ。

長さ５Ｑｉｚ）内で凍結乾燥させ、これを試薬Ａ１（３
０検体用）とした。

Ｎ−カルボベンゾキン−グリシル−グリシルアルギニン
−ＤＢＨＡ５０ナノモルおよび化合物Ｐ−７０，５ｘ９
を混合し、バイアル瓶（胴径１８１度、長さ３３■）内
で凍結乾燥させ、これを試薬Ａ２（ｌ検体用）とした。

１巧／Ｍ０．ディスパノールを含む０．１Ｍ　　ＰＩＰ
ＥＳ緩を衝液（ｐＨ７，０）３０すをペットボトル（７
５ｚｆ！容噴）に入れ、これを試薬Ｂ（３０検体用）と
した。

ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム５ｍ９／ａＱ、
ナノ化ナトリウム２Ｈ／ｒｔＱを含む水溶液（ｐｌ−１
９，５）を点眼瓶（５０仄Ｑ容が）に入れ、これを反応
停止り液とした。

これらを組み合わせて、本発明の南周疾患検龜Ｙ旧…成
物キットとした。

このキットは、つぎのようにして歯周疾ＩＭの診断ある
いは予測に用いることができる。

予め、試薬ＡＩ　　１本を試薬８１本の全量で溶解して
ＡＯＤ溶液を調製する。被験各の歯肉ｉＭにペーパーポ
イントを３０秒間挿入して検体を採取し、試薬Ａ２バイ
アルに投入する。これにＡＯＤ溶液１７りを加え、撹拌
後３７°Ｃで１５分間反応させる。１５分後に反応停止
り液を一滴滴下し、撹拌し反応を停止させる。反応停止
液添加後、４時間以内に実施例１と同様に肉眼観察して
判定する。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）検体中のペプチダーゼ様酵素活性を迅速に測定す
   ることにより、歯周疾患の罹患や進行を診断・予測し、
   あるいは治療の効果を診断するための検査用組成物であ
   って、 （ａ）式：Ｘ−Ｔ−Ｐｒｏ−Ｙ［１］ ［式中、Ｐｒｏはプロリン残基、Ｘは水素またはアミノ
   基保護基、Ｙはプロリン残基のＣ末端に結合する、酸素
   の存在下に酸化酵素によって色源体の酸化反応の反応速
   度を増加させる化合物（以下エンハンサーという）の残
   基、ＴはそのＣ末端がプロリン残基のＮ末端と結合する
   ０〜４個のアミノ酸またはその保護誘導体からなるアミ
   ノ酸またはペプチドの残基を意味する］ で示される化合物および （ｂ）式：Ｘ’−Ｚ−Ａｒｇ−Ｙ’［２］ ［式中、Ａｒｇはアルギニン残基、Ｘ’は水素またはア
   ミノ酸保護基、Ｙ’はアルギニン残基のＣ末端に結合す
   るエンハンサーの残基、ＺはそのＣ末端がアルギニン残
   基のＮ末端と結合する０〜４個のアミノ酸またはその保
   護誘導体からなるアミノ酸またはペプチドの残基を意味
   する］ で示される化合物あるいはこれらの混合物、色源体およ
   び酸化酵素を組み合わせてなることを特徴とする歯周疾
   患検査用組成物。
2. （２）エンハンサーが式： ▲数式、化学式、表等があります▼［３］ ［式中、Ｒ＿１〜Ｒ＿４は、同一もしくは異なって、水
   素、ハロゲン、アルキル、スルホンまたはヒドロキシル
   、Ｒ＿５はヒドロキシル、アミノまたは置換アミノ（置
   換基はアルキル、スルホアルキルまたはヒドロキシアル
   キル）を意味する］で示されるアニリン誘導体である前
   記第（１）項の歯周疾患検査用組成物。
3. （３）Ｔ基中のＣ末端アミノ酸残基がグリシン、アラニ
   ン、リジン、フェニルアラニンまたはこれらの保護誘導
   体残基である前記第（１）項または第（２）項の歯周疾
   患検査用組成物。
4. （４）Ｚ基中のＣ末端アミノ酸残基がグリシン、リジン
   、アルギニン、フェニルアラニンまたはこれらの保護誘
   導体残基である前記第（１）項または第（２）項または
   第（３）項の歯周疾患検査用組成物。