JPS63502876A - 歯周疾患の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「歯周疾患の検出方法」 （発明の背景） 本発明は、＠乳動物における歯周疾患の存在を判定する方法に関し、より具体的 には。

口腔体液試料中に闇値を上回る酵素アスパラギン酸塩アミノトランフェラーゼが 存在するか否かを検定することによって活動性歯周疾患を判定する改善された方 法に関する。

歯周疾患は、歯の支持組織に影響を及ぼす微生物が病因となる炎症性疾患である 。これらの疾患は、大人の７０％以上に影響を及ぼし２年令が３５歳を過ぎた人 々に歯を失わせる主な原因である。歯周疾患に伴う費用は、治療費および生産性 の喪失による経済的費用を含めて、極めて高いものである。　１９７６年に、歯 周疾患を患う人々（［億Å以上）の効果的な処置に必要な費用は、当時実際に費 やされた１５億ドルの何倍にもなるものと推定された（　ｒＮＩＯＲの歯周疾患 研究活動の評価−Ａｄ　Ｈｏｃ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ 　Ｐａｎｅｌ報告Ｊ。

Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｄｅｎｔａｌ　Ｒｅ５ｅａｒ ｃｈ＋　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ＋　Ｄ、Ｃ，（１９７６年４氏jを参照のこ と〕。

ｒ歯周疾曇」という名称は、疾患の２つの主なサブクラスである歯肉炎および歯 根膜炎を含んでいる。「歯肉炎ｊは、歯槽骨および付着歯肉の破壊のない歯肉の 炎症を特徴とする。　Ｌｏｅ、　Ｒ，およびＰ、　５ｉｌｎｅｓｓ、　Ａｃｔａ 　０ｄｏｎｔ、　５ｃａｎｄ、　２１：５３３　（１９６３）を参照のことA「 歯 ｍ膜炎」は、一般に歯肉炎の進んだ段階とされており、歯肉組織と歯のあいだに 歯周ポケットが形成されることを特徴としており、その後は歯槽骨が破壊された り、付着歯肉部が弱ることによって、最終的には歯の破壊に至る＊　Ｒａｍｆｊ ｏｒｄ、　Ｓ、、　Ｊ、　Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ、　３８：６０２゜（１９６ ７）を参照のこと、歯根膜周炎はさらに１例えば、若年性歯根膜炎１局所歯根膜 炎。

急性壊死性歯根膜炎、慢性炎症性歯根膜炎（ＣＩＰＤ）に分類することができる 。　ＣＩＰＤは、アメリカの成人に最も一般的な歯根膜炎の形態であり、歯根膜 のセメント質への付着の喪失。

接合上皮の根尖移動、および歯槽骨の破壊を特徴とする。歯肉炎および歯根膜炎 はいずれも、−歯“ふ歯肉の結合部に歯肉溝液（漿液漏出液）が蓄積するという ！Ｉｙ徴を有する。

歯肉疾患は１文明世界において最も蔓延している細菌性疾患の１つではあるが、 その診断は最近まで主観的な観察指標に主に鯨っていた。歯肉炎については１例 えばＬｏｅおよびＳｉ　１ｎｅｓｓ＋　用、および歯根膜炎についてはＲａｍｆ ｊｏｒｄ、よ艮、これらの指標は、探針を用いて丁寧に行う検査時の出血、ポケ ットの深さ、付着歯肉のｆ＆壊ならびに歯槽骨破壊のＸ線撮影による証拠等の判 定基準に基づいている。残念なことに、これらの臨床的指標は、探針による検査 時の出血（プローブやキューレット等の硬質の器具を用いた歯の生え際あるいは ポケットの探針検査による歯肉組織の出血）を除き、活動性歯肉疾患ではなく、 過去の疾患による以前の傷害を反映するものであることが一般に認められている ・さらに・探針プローブ検査時の出血の診断価値にも問題があるとされているｅ 　Ｈａｆｆａｊｅｅ、　５ｏｃｒａｎｓｋｙおよびＧｏｏｄｓｏｎ、Ｊ、　Ｐｅ ｒｉｏ、　１０：２５７−２６５　（１９６３）　、さらに、この疾患の診断を 妨げる特徴があるが、それらは、疾患の初期段階ではこの疾患が無症候性である 可能性があり、また多くの場合は偶発的であり、破壊活動の周期的パターンは、 潜伏期間あるいは自発的な部分後退が操り返し発生することに基づくものである 。

最近、歯周疾患の新しい診断方法が幾つか開発された。その１方法は、歯肉炎お よび歯根膜炎は、歯と歯肉の結合部に歯肉溝液が蓄積することを特徴とすること を利用する。歯と歯肉の間に測定した歯肉溝液が大量であれば、歯周疾患の存在 を知ることができる。

Ｐｅｒｉｏｐａｐｅｒ　（カリフォルニア州、Ｔｕｓｔｉｎに所在するＭａｒｃ ｏ）として知られる多孔性材料の小さなストリップを歯と歯肉のあいだの隙間に 挿入し、このストリップに吸収された歯肉溝液の量をＰｅｒｊｏｔｒｏｎ　（カ ナダ、　ＷｉｎｎｉＰｅｇに所在するＨａｒｃｏ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ　Ｌ ｔｄ、）として知られる器具を用いて電気流Ｉ−測測定よって測定する。

ＭｃＮａｍａｒａの米国特許第３，６９１．０１８号は、初期疾患を早期に検出 する診断法を開示しており、その方法では、歯肉溝液にβ−Ｄ−ガラクトシダー ゼが存在するか否かを試験する。前記の特許は、ナイロンミリポアフィルタ−製 の１マイクロンの孔サイズのストリップを用いて歯肉溝液を採取することが出来 ることを開示している。その後にこの体液は、２つの異なるｐＨ（５，０および ７．５）において、β−Ｄ−ガラクトシダーゼが存在するか試験する。前記ｐＨ は、１つは哺乳類産生酵素を示し、他方は細菌産生酵素を示す、多孔性ストリッ プは。

通切な基質と共にｐＨ５ならびにｐ）１７．５の緩衝液中で３７℃で約２時間の あいだインキュベ（２）弱、（３）中、（４）強、に基づいて判定する。２つの ｐＨの各々においてインキュベートした試料の色強度を判定し、原色表軸ａｓｔ ｅｒ　ｔａｂｌｅ）と比較することによって、歯周疾患の存在と程度を判断する 。

しかしながら、最近、歯肉溝液中に高レベルの酵素アスパラギン酸塩アミノトラ ンフェラーゼ（ＡＳＴ）が存在することが、活動性歯周疾患の存在と高い相関が あることが開示された。　１９８５年８月１４日公開されたＣｈａｍｂｅｒｓ、 　ＥＰＯ特許出願公開第１５１，５３６号、さらにこの酵素が歯肉溝液中に高レ ベルで存在することは、非進行性ではない、進行性の歯周疾患ならびにそれに伴 う組織破壊の可能性が高いことを示すものであることが開示された。進行したレ ベルの血清ＡＳＴは、これまでに急性心筋梗塞、肺塞栓症、急性膵炎、ウィルス 性肝炎および中毒性肝炎、ならびに急性肝硬変を含む広範囲にわたる様々な状態 に相関があることが示されている。

酵素アスパラギン酸塩アミノトランフェラーゼ［ＥＣ２，６，１，１ｉ　Ｌ−ア スパラギン酸、２−オキソグルタル酸アミノトランフェラーゼ］　（グルタミン 酸アスパラギン酸トランスアミナーゼ、グルタミン酸アスパラギン酸アミノトラ ンスフェラーゼ、グルタミン酸アスパラギン酸アミノフェラーゼ、グルタミン酸 オキサロ酢酸トランスアミナーゼ、　ＧＯＴ、　Ｇ、Ｏ，？、、あるいはＧＯ− Ｔとして以前から知られているもの）（これより以後はＡＳＴと称する）は、下 記の反応を触媒する。

アスパラ　α−ケトグル　オキサ口　グルタミンギン酸塩　タル酸塩　酢酸塩　 酸塩 補欠分子族としてピリドキサールリン酸塩が必要である。さらにこの酵素はその 他の反＾ＳＴは、真核生物細胞のミトコンドリアおよび細胞質の双方に見られる 。いずれの形態も９分子量が約９０，０００ダルトンで、２個のほぼ等しいサイ ズのサブユニットから成るが。

その物理的および化学的特性、ならびにアミノ酸組成は異なる。　ＡＳＴは、ア ミノ酸の様々な異化作用および同化作用経路に関与するａ　Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ ＋　Ａ、Ｌ、＋　Ｂｉｏｃｈｅｍ旦狂Ｌ　第２版。

（Ｗｏｒｔｈ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ＋　１９７５）を参 照のこと。

Ｃｈａｌｌｂｅｒｓの方法によると、歯肉溝液は、微量注射器１毛細管チューブ 、あるいは吸収材ストリップ等の手段によって、歯肉と歯の界面から採取する。

前記物質の容量を測定し。

採取した歯肉溝液試料中にＡＳＴが存在するか否かは、比色定量法あるいは免疫 学的定量法のいずれかによって判定する。

漿液中のＡＳＴを判定するためには、多種の比色定量法が知られている。これら の定量法は、実際には、アスパラギン酸塩およびα−ケトグルタル酸塩のＡＳＴ 触媒反応によって生成するオキサロ酢酸塩の存在を分析する。１つの手順におい ては９反応！、」、によるオキサロ酢酸塩の生成は、２．４−ジニトロフェニル −ヒドラゾン誘導体の形成と連結する。

この誘導体は、赤みを帯びた茶色で、　５２０　ｎｍで吸光する。

オキサ口　２．４−ジニトロフェニル−オキサロ酢酸塩−２．４−ジニトロ酢酸 塩　ヒドラジン　フェニル−ヒドラゾンこれらの手順では、漿液試料は、過剰の し一アスパラギン酸およびα−オキソグルタル酸を用いてインキュベートシ、さ らに過剰の２．４−ジニトロフェニルヒドラゾンを添加する。

ることを開示している。

しかしながら、２，４−ジニトロフェニルヒドラゾンを用いる手順には幾つかの 欠点がある。

インキュベート時間が長く．且つオキサロ酢酸塩が酵素反応の経過とともに蓄積 し，双方ノ同位酵素を阻害する．さらに，ミトコンドリアのＡＳＴは，生成物に よる阻害に対する惑受性が強く，この手順では過小評価される傾向がある．漿液 中のＡＳＴの検出に用いるものとして周知であり，且つＣｈａ＋ｍｂｅｒｓ，上 ＆により歯肉溝液中のＡＳＴを検出ずるものとして開示された別の手順では．反 応Ｉによって生成されたオキサロ酢酸塩は．ピルビル酸塩に変化され，続いてこ のピルビル酸塩はビルビル酸塩−２，４−ジニトロフエニルヒドラゾン誘導体に 変換される．基質とともに試料をインキユベートした後，２．４−ジニトロフェ ニルヒドラゾン試薬を添加する前に．過剰のアユリンクエン酸塩を添加する。２ ．４−ジニトロフエニルヒドラゾンを添加した後，反応混合物をインキュベート し，過剰アルカリの添加によって誘導されるピルビル酸塩のジニトロフエニルヒ ドラゾン誘導体への転換を行う． この手順を用いるＡＳＴ定量法キットとして市販されているものの例としては， 　Ａ−ｇｅｎｔ”アスパラギン酸アミノトランスフエラーゼアンセイ　（Ａｂｂ ｏｔｔ　Ｃａｔ−　Ｎｏ．　ＡＢＡ−５０，　ＡＢＡ−１００．Ａｂｂｏｔｔ− ＶＰ，イリノイ州シカゴに所在するＡｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ） およびＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎＳｔａｔｚｙｓｅ　ＧＯＴ　（Ｗｏｒｔｈｉｎｇ ｔｏｎ　Ｃａｔ．　Ｎｏ．　ＣＧＯＴ，ニュージャージー州，　Ｆｒｅｅｈｏｌ ｄに所在す■ Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍｓ＋　Ｉｎｃ． ）があるΦ２．４−ジニトロフェニル　（ｍ） ０００　ピルビル酸塩　ビルビル酸塩−２．４−ジニトロオキサ口酢酸塩　フエ ニルヒドラゾン さらにＡＳＴを検出ずるための方法として，オキサロ酢酸塩と反応させるのにア ゾ色素を用いる方法が知られている．これらの方法は，２．４−ジニトロフエニ ルヒドラゾンを用いる方法よりもかなり迅速であり．反応生成物によるＡＳＴの 阻害が起きず．さらに呈色反応を起こすのにアルカリを用いない，　Ｆｏｒｇｉ ｏｎｅの米国特許第３，８７５．０１４は．下記の一組の反応を用いて漿液中の ＡＳＴ　濃度を測定するための試験指示薬を開示している．ＡＳＴ （ａ）　Ｌ−アスパラギン酸　＋　α−ケトグルタル酸　一オキサロ酢酸　＋し −グノレタミン酸 （ｂ）オキサロ酢酸　＋　ジアゾニウム塩（無色）　一ジアゾニウムカップリン グ生成物（有色）Ｆｏｒｇｉｏｎｅの試験指示薬は，オキサロ酢酸に選択的な透 過性がある接着剤で互いに接着された一組の吸水性の物質から成り，第１の吸水 性物質は．基質し−アスパラギン酸およびαーケトグルタル酸から成る．第２の 物質は乾燥ジアゾニウム塩から成る．この指示薬は．漿液に暴露する．漿液がＡ ＳＴを含有する場合には．オキサロ酢酸に対する基質の反応の触媒となる．その 後，オキサロ酢酸は第２ストリップに拡散し，ジアゾニウム塩により呈色反応を 引き起こす． ジアゾニウム塩を用いてＡＳＴを検出する手法ならびに様々な物質が＋　Ｒｅｊ ＋　’アミノトランスフェラーゼの測定，バート１，　アスパラギン酸塩アミノ トランスフエラーゼＪ　，　ＣＲＣＣｒｉｔｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　ｉｎ　 Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第２１巻，　Ｎ ｏ．　２，　ｐ吹D　９８−１８６ （１９Ｂ４）に開示されている．この文献は適切なジアゾニウム塩を開示してお り．それらには下記のものが含まれる．ファストバイオレットＢ，｛４−アミノ ー２．５−ジエトキシベンズアニリド（６−ペンズアミド−４〜メトキシ−５− トルイジン）ジ７ゾニウム塩化物１；フ７ストレンドＰＤＣ／ボンソウＬ，　｛ Ｎ’−ブチルー４−メトキシメタニルアミドジアゾニウム塩｝：ファストレッド ＫＬ，　＜２−アミ八４−メトキシベンズアミドジアゾニウム塩》：ファストス カーレットＧＧ，　（２．５−ジクロロアニリンジアゾニウム塩｝：ファストレ ンドＲＣ，　＋５−クロロー２＝トキシベンズアニリジンジアゾニウム塩化Ｔｈ ）　＊　ＦｏｒｇｉｏｎｅおよびＲｅｊに開示されるように．ＡＳＴの検出にジ アゾニウム塩を使用するには，カラーチャートとの比較による呈色強度の主観的 な訂価．あるいは半定責的に過ぎず且つ較正に様々な難しさがある自動化手順の いずれかが必要である． ２．４−ジニトロヒドラゾンあるいはジアゾニウム染料を用いる手法に伴う問題 があることから，望ましい代替手順が知られている．この手順においては，し− アスパラギン酸塩とα−ケトグルタル酸塩のＡＳＴ触媒反応によって生成したオ キサロ酢酸塩を，リンゴ酸脱水Ｓ酵素と補因子であるニコチン了デニンジヌクレ オチド（ＮＡＤ）を用いた第２反応によって，ＮＡＤの還元された形態であるニ コチンアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）が存在するもとでリンゴ酸塩に転換 するｅ　Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒの米国特許第４，０５９，４０７号を参照の こと。ＮＡＤＩ｛は３４０　ｎ一で紫外光線を吸収するので，オキサロ酢酸がリ ンゴ酸塩に転換する率は，　３４０　ｎｓにおけるＮＡＤＨの消失率をモニタリ ングすることによって追跡することができる，　ＮＡＤＨシステふは，　（ＮＡ ＤＨが紫外スペクトルの光を吸収するために）分光光度計を必要とする欠点があ るが，反応生成物による阻害を防止するために反応過程の最中に反応混合物から オキサロ酢酸塩を除去するので．再現性ならびに定量性の利点がある．その多く の利点から，このシステムは最も耐久性があるものと考えられ，現在ではＡＳＴ の測定の標準化のための国内および国外における活動の基礎となっている，　Ｒ ｅｉ．　．ｈ垣．ジ了ゾニウム塩ＡＳＴ検出システムは，特別な（非定量的）電 気泳動用途を例外として，あらゆる分野において大方ＮＡＤＨシステムによって とって代わられている．　Ｒｅｊ，　１７！４，　ｐｐ．　１３９−１４１　− 当技術に要求されるものは，予め設定した濃度を上回る化合物の存在を．カラー チャートを必要としない単純なイエスーノー試験によって検出することができる 技術である．Ｏｆ１１１の米国特許第４，４７１，０５５号は，予め設定した濃 度を上回る試料中のアルデヒド濃度を検出するプロセスおよびキットを開示して いる．これには２つの反応系が使われている．第４の反応系は、予め設定した濃 度に等しいアルデヒド量を第１の反応生成物に定！的に転換するように働く．次 に，第２の反応系は，残りの全てのアルデヒドを目で検出することが可能な第２ の反応生成物に転換するように働く．Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒ＋　，ｊＪｌ＋ 　は．ケトン．タンパク質およびＡＳＴ等の生物体液中の多様な物質等の必要性 は無くなる．試験する物質の特定の濃度に暴露されると目視可能な指示をする試 薬を用いる．前記の特許は，一定量の滴定基準液から成る試薬システムを開示し ている．前記滴定基準液は，分析する物質が関与し且つ反応が完了すると１つあ るいはそれ以上の生成物を形成する還元反応における生成物のうちの１つと反応 する．前記の生成物の１つは滴定基準液と定量的に反応するため．全滴定基準液 が消費されるまでは蓄積されることがなく（そして呈色を発生することがない） ．全滴定基準液が費消された時点において，生成物の蓄積は目視可能となるか， あるいは分光光度計によって測定可能となる．１｛ｏｃｈｓ　ｔｒａｓｓｅｒは ．下記の開示された指示薬システムを用いたＡＳＴの検出用のＮＡＤＨ／リンゴ 酸反応系を使用している． （ａ）　ＡＳＴ十試薬十還元指示薬　一　酸化指示薬（有色）（ｂ）酸化指示薬 十滴定基準液　一　還元指示薬（無色）Ｈｏｃｈｓ　ｔｒａｓｓｅｒは．アスパ ラギン酸．α−ケトグルタル酸，リンゴ酸デヒドロゲナーゼおよびＮＡＤＩＩを ｆ試薬Ｊとしている．適切な指示薬として，Ｏ−ジアニシジン，ｐ一トルイジン ，２．２゜−アジノージー（３−エチルーベンゾチアジンン一〇−スルフオンＦ 　（ＡＢＴＳ），　ｐ−ジフエニルアミンスルフォン酸、〇一トリジン、ナチュ ラルレッド（ｃｅｒｔ．）ｔヤーヌスｄＢ（ｃｅｒｔ．）．　２．６−ジブロモ インドフェノールナトリウム塩（ｐｒａｃ．）およびＮＮ〜ジメチルインドアニ リン（ｐｒａｃｔ．）が開示されている．適切な滴定基準液としては，ゲンチジ ン酸，アスコルビン酸，ヒドロキノン．ビロガロール．ヒドロキシルアミン．亜 硝酸ナトリウム．亜硫酸水素ナトリウム．チオ硫酸ナトリウム，システイン，ヒ ドラジン．第一鉄イオンおよびその錯体，ならびに第一銅イオンならびにその錯 体が開示されている．当技術においては歯周疾患を検出するための試験は存在す るが，迅速，低価格，且つ歯科医あるいは自宅において素人が容易に使用出来る ほど十分に簡単な改良された試験法が必要である．このような試験は．分光光度 計よりもむしろ肉眼で読みとることが可能であるべきであり，色強度の主観的判 断の必要性を最小限に抑えて，疾患状態の存在を客観的に示す必要がある．さら にこのような試験は，水酸化ナトリウム等の腐食性の化学物質を添加す゛る必要 性を避けるべきである．（要約） 本発明は，　ｍｌ液あるいは歯肉溝液等の口内体液中にアスパラギン酸塩アミノ トランフエラーゼが存在することを検出するための方法の改良をもたらすもので あり、試料との第１酵素反応混合物中の基質のインキュベートによって反応生成 物を形成し、前記反応生成物を第２の呈呈色反応において指示物質との反応によ って検出するものである。さらに具体的に述べると１本発明は１口内体液試料中 のアスパラギン酸塩アミノトランスフェラーゼの閾値を上回る濃度を検出するこ とによって、＠乳類の活動性歯周疾患の存在を検出する方法に関する０本発明は 、新規の迅速且つ安価な歯周疾患検出法を提供する。この試験は。

分光光度計を用いることなく、肉眼で読みとること力呵能であり、＃Ｊ周疾色が 存在するが否かを客観的に定性的に示す指標をもたらす、この指標は、環境レベ ルのＡＳＴが存在することによる誤った陽性結果を指示することが無く、さらに 色強度による主観的判断の必要は最小限である。この試験は１口内体液中に歯周 疾患の存在を示唆する閾値量のＡＳＴが存在すると、明確な見紛がうことのない 呈色を呈する。この方法は、（ａ）少量の口内体液を固体保持体に吸収し、（ｂ ）閾値を下回る量のＡＳＴが存在する反応混合物中では検出可能な量の酵素触媒 反応生成物が形成されず、闇値を上回る濃度のＡＳＴが存在する反応混合物中で は検出可能な量の酵素触媒反応生成物が形成されるという状態において、基質の 存在のもとて固体保持体のインキュベートによって第１反応混合物を形成し、さ らに（ｃ）検出可能量の（ｂ）の酵素触媒反応生成物と接触すると色の変化を呈 することが可能なジアゾニウム染料が存在するもとて（ｂ）の混合反応物をイン キュベートする過程から成る。

（詳細な説明） 本発明の実施方法に従って１口内体液を口から採取する。この体液は唾液でもよ く、あるいは望ましくは歯肉溝液とする。歯肉溝液は、歯と歯肉のあいだの歯肉 溝から採取することができる。唾液は、歯と口組織の表面がら採取することがで きる。つぎに、ある量の口内体液を固体保持体上に置き、固体保持体を試料チャ ンバーに入れ、指定の条件の下で基質と共にインキュベートする。これらの条件 とは、試料中のＡＳＴレベルが予め定めた闇値を下回る場合は、目視によって検 出可能な量の酵素触媒基質反応生成物が形成されない媒反応生成物に触れると呈 色変化を示すことが可能であり、呈色の発生は閾値を上回る量のＡＳＴが存在す ることを示唆し、また逆にこのような信号が発生しない場合にはＡＳＴＯ量が闇 値を下回ることを示唆する。これらの反応条件は、臨床上有意であると考えられ るＡＳＴのレベルに従い、検出閾値を上げるが下げるために調節すること力呵能 である。

口内体液試料は、唾液あるいは歯肉溝液であってもよい、唾液試料は、濾紙等の 多孔性の固体保持体材料への吸着のように様々の手段によって１口から採取する ことができる。

歯肉溝液は１本発明に従い、細い針（望ましくは先の尖っていない針）付の装置 注射器。

あるいは毛細管チューブ（望ましくは目盛付のもの）等の様々な手段により、歯 肉と歯のあいだの界面から採取することができる。さらに試料は、外科用綿撤糸 、綿棒、あるいはデンタルフロス等の糸状の材料により採集することができる。

望ましくは、このような体液は、祇または織物の吸収性のあるストリップを用い て、さらに最も望ましくはＰｅｒｉｏ−ｐａｐｅｒ　（カリフォルニア州、　Ｔ ｕｓｔｉｎに所在するＨａｒｃｏ）として知られている歯内治療用紙点によって 採取する。試料は、歯と歯肉の界面の歯肉溝液に採取手段を直接接触させて採取 する。試料の量は、採取手段の目盛りによって測定するが、あるいは採取後の測 定によって判断する。濾紙ストリンブ上の体液量は＋　Ｐｅｒｉｏｔｒｏｎ等の 検流計を用いて測定することができる。さらにこのような濾紙ストリップ上に採 取される体液の最大量は、ストリップの吸収性部分を適切な大きさにすることに よって大まかに限定することができる。＠収された体液量の微小な変動（例えば 、１０％の変動）は、試験法の精度を著しく変えるとは考えられない、しかしな がら、歯肉導液試料についての記録結果は、特に試験を行った位置における歯肉 の状態を反映するものであるが、一方、唾液試料についての記録結果は、試料を 採取した何本もの歯が存在する区域における歯肉の平均的な状態を反映する。

何らかの手段によって採取された口内体液試料は、つぎに、多孔性の固体保持体 に吸収される０本発明に有用な多孔性の固体保持体は、祇ならびに織布および不 織布等の繊維状の材料を含む、保持体の化学的な性質については、保持体は（ａ ）天然の炭化水素高分子。

ならびにそれらの合成修飾、架橋あるいは置換された誘導体で、セルロースおよ びセル口の高分子材料の１つの中で充填剤として使用することができる無機材料 、あるいは（ｆ）上記の種類の混合物あるいは共重合体であってもよい、望まし い材料の一つは、　Ｐｅｒｉｏｐａｐｅｒ（カルフォルニア州、　Ｔｕｓｔｉｎ に所在するＨａｒｃｏ）として市販されているセルロース繊維から製造された山 内治療用の濾紙である。この材料は、採取手段および試料保持体のいずれにも適 している。

本発明に従う適切な基質剤としては、　ＡＳＴ触媒反応によって定量的に転換さ れ、染料との反応によって検出することができる反応生成物となる物質がある。

このような基質剤には、Ｌ−アスパラギン酸塩、Ｌ−グルタミン酸塩、オキサロ 酢酸塩、α−ケトグルタル酸塩１ならびにアラニン、アラノシン、アミノアジピ ン酸塩、β−ヒドロキシアスパラギン酸塩。

システィン、システィンスルホン酸塩、５−ヒドロキシトリプトファン、ヒドロ キシフェニルピルビン酸塩、キヌレニン、ドーパ、チロシン、フェニルアラニン 、フェニルピルビン酸塩、ピルビン酸塩およびトリプトファンがある。これらの 基質のＡＳＴ触媒転換反応生成物は、さらに化学反応を行うことにより、それ自 体が染料と反応して検出可能な呈色を発生する生成物に転換することができる０ 本発明に有用な基質溶液は、リン酸塩、ホウ酸塩およびバルビトールを含む様々 なｐＨの緩衝剤から成ることができるが、望ましくはｐＨが７゜０から８．０の トリス塩酸を含む、さらにウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等の安定剤をこの組成 に加えてもよい、望ましい基質溶液の一つは、　ｐＨ８，０（ｌｅｔ衝液に基質 を添加した後のｐＨは７．９６である）の０．１Ｍ）リス塩酸緩衝液中に＋５ｍ Ｍのα−ケトグルタル酸ナトリウムおよび２０ＩＩＭのＬ−アスパラギン酸ナト リウムを加えたものである。

本発明に従う適切な染料としては、基質のＡＳＴ　Ｍ媒転換により形成される反 応生成物と反応することができる染料がある。望ましい染料材としてはジアゾニ ウム塩があり、たとえば、ファストバイオレットＢ、　ファストレッドＰＤＣ／ ポンソーＬ、　ファストレンドＫＬ。

ファストスカーレットＧＧ、ファストレンドＲＣ，ファストブルーＢおよびファ ストブルーＲＲである。最も望ましいものは、ジアゾニウム塩ファストブルーＢ Ｂである。適切なカンプリング荊は、約１〜２０＋＋ｇ　、望ましくは約２〜１ ０　ｗａＨのファストブルーＢＢ塩を脱イオン水ｌの乾燥を防ぐには、固体保持 体をインキュベートするウェルあるいはチューブに、少量の緩衝液および血清ア ルブミン等の安定剤ないしは担体タンパク質を添加することがしばしば有効であ ることがわかった０次に、液体試料を吸収させた固体保持体をウェルあるいはチ ューブ内に置き、基質剤を添加する。そして歯肉導液試料および基質を指定条件 のもとてインキュベートする。これらの条件とは、歯肉溝液試料中のＡＳＴが闇 値を下回る場合には、検出可能な量の酵素触媒反応生成物が形成されないもので ある。しかしながら、前記の条件はさらに、閾値を越える量のＡＳＴが存在する 場合には、適切な染料が存在するもとて色の変化を引き出すことができる検出可 能な量の酵素触媒反応生成物が形成されるものである。　ＡＳＴの存在量が特定 の反応が進む速度を決定する。したがって、　ＡＳＴが触媒としてはたらく反応 系においては、基質のＡＳＴ触媒反応に適切な時間制限を課し、それによって個 々の時間における触媒反応の程度を決定する必要がある。この制限時間の終わり には。

＾ＳＴ触媒反応は、酵素阻害物質の導入１反応溶液のｐＨを反応が不活性となる ｐＨに変化させること、　ＡＳＴ酵素反応を阻害する働きをするジアゾニウム塩 染料の添加、あるいはその他の手法によって中止させることができる。ジアゾニ ウム塩染料であるファストブルーＢＢを。

ＡＳＴ／基質溶液１ｂｔあたり約２ｍｇの濃度となるように添加した場合には、 このジアゾニウム塩染料は、１４あたりＡＳＴの濃度が約４０００シグア単位を 下回る際には、酵素反応をほぼ完全に阻害することが分かったが、ｌ−あたり１ ００００シグマ単位以上のＡＳＴｆｉ度では、この染料塩は酵素反応を完全に阻 害することが出来ない０本発明に従う方法は、検定値の読み取る正確な時間３あ るいは反応を阻害した正確な時間等が検定の精度に決定的に重要ではないので１ 時間に関してはがなりの融通性がある。

第１の酵素反応の速度は、酵素阻害物質の導入、基質濃度の変化２反応ｐｉ＋の 変更、緩衝液濃度の変更、温度の多様化、あるいは当業者に明らかなその他の方 法によって変えることが可能である。第２の呈色反応の速度は、緩衝液濃度およ びｐｌ＋の変化、ならびに染料濃度の変化によって変更することができる。

適切な反応条件は、当技術分野において周知の技術に従って、特定の基質および ジアゾは、様々な緩衝液モル濃度、酵素反応時間および呈色反応時間において検 定を行うシステムについて説明する。実施例３は、様々な緩衝液ｐＦｌ値におい て検定を行い、且つ緩衝液を染料混合物に添加するシステムについて説明する。

実施例４は、様々な基質濃度を用いて検定を行うシステムについて説明する。実 施例５は、様々な濃度のファストブルーＢＢ染料を用いて検定を行うシステムに ついて説明する。実施例６は、ファストブルーＢＢ塩染料を塩酸に様々の濃度で 混合したものを用いて検定を行うシステムについて説明する。実施例７および８ は、様々な濃度のＡＳＴ反応阻害物質を用いて検定を行うシステムについて説明 する。

（実施例１） この実施例では、＠内溝液中の酵素ＡＳＴの検定を、キットの形で供給される試 薬を用いて行う、約１μｌの歯肉溝液を＋　Ｐｅｒｉｏｐａｐｅｒストリップに 採取し、これを容量が約１００μｌの反応容器中に置く。

基質溶液は、Ｌ−アスパラギン酸ナトリウム３１．０　＋＋ｇおよびα−ケトグ ルタル酸ナトリウム８．４　ｍｇから成る乾燥粉末を、０．１Ｍ）リス−塩酸緩 衝液（ｐＨ８，０）１０−と混合することによって調製する。これらの成分は、 約２分間のあいだ激しく振って混合し、この時間のあいだに固体成分は緩衝液中 に溶解する。つぎに、　５０μ７！（約１滴）の基１を溶液をこの反応容器中の Ｐｅｒｉｏｐａｐｅｒストリップを覆うように滴下する。この基質溶液および歯 肉溝液は。

続いて室温で１５分間のあいだインキュベートする。

ファストブルーＢＢジアゾニウム塩から成るカンプリング溶液を、使用直前に粉 末状のファストブルーＢＢ塩１０　ｍｇを蒸留水１　に溶かして調製する。最初 の１５分インキュベートの後に、カンプリング溶液１０μｌを、カップリング溶 液と基質溶液が十分に混合されるように注意しながら反応容器に加える。ファス トブルーＢＢ塩溶液は黄色であるので、混合が完全か否かは容品に判断できる。

つぎに、呈色を５分間待つ、ファストブルーＢＢ塩は、第１反応混合によって形 成されたオキサロ酢酸塩と反応し、沈澱物を生ずる。この沈澱物は青するオキ５ ．サロ酢酸塩が多いほど、沈澱物の量は増加し、さらに濃い緑の色合いとなる。

（実施例２） この実施例では、実施例１の方法ならびに材料を用いて、酵素ＡＳＴの検定を行 った。様々なモル濃度のトリス塩酸緩衝液を使用し１反応時間１５分および３０ 分、およびジアゾ染料カンプリング時間５分および１０分で検定を行った。酵素 反応混合物のｐｌ＋は、８．０に保持した。第１Ａ表および第１Ｂ表に示す結果 は１本発明によるシステムが、酵素反応時間または呈色反応時間のいずれについ ても、比較的に時間の影響を受けないことを示している。これは、試験結果を読 み取る際の融通性をもたらし、また試験の実施と読み取りにおける操作者の比較 的に小さな誤りが試験の精度に影響を及ぼさないようにする。さらにこの結果は 。

指示薬の画点、すなわち色が黄色から緑色に変化する点が、一定ｐＨの緩衝液の モル濃度の変化によって変化する可能性があることを明らかにしている０反応時 間条件のあらゆる組合せについても、緩衝液モル濃度が上昇すると、　ＡＳＴを 検出する呈色反応闇値は低下することが分る（すなわち、より低いＡＳＴ濃度に おいて呈色が観察される）。

第１Ａ表 ｐＨ・８．０（基質を加えた後、必要であれば８．０に調整する）１５分検定 ＡＳＴ活動度（＾ｃｔｉｖｉｔｙ） シグマ単位ハ又 緩衝液　呈色　８　１００　、　２００　５００　１０００　２０００　４００ ０　１００００モル濃度　反応 時間 （分） ０．０１　５　’ｌ　’ｔ　Ｙ　Ｙ　＋１＋２　＋３＋５１０ＹＹＹ　Ｙ或いは 十％＋１＋２　＋４＋５０．０２　５　Ｙ　Ｙ　Ｙ　＋％　＋２＋３　＋５＋７ １０　ＹＢｒ　ＹＢｒ　＋’Ａ　４％或いは１　＋’２　＋４　−１−６　＋８ ０．０５　５　ＹＢｒ　ＹＢｒ　ＹＢｒ或いは＋’Ａ　＋１　＋３＋４　＋５＋ ＄１０　ＹＢｒ　ＹＢｒ　ＹＢｒ　＋１　＋４　＋５　＋８　＋９０．１　５　 ＹＢｒＹＢｒ　＋’Ａ　＋１　＋３　＋４　＋５　＋３１０　８ｒ　Ｂｒ　Ｂｒ 　＋１（Ｂｒ）　＋３　＋５　＋３　＋１０略号 ８ｒ・茶色：　Ｇ−緑：０・オリーブＦ　Ｏｒ・オレンジ：　Ｙ・黄色説明 十〃−非常に薄い緑 ＋１から＋７・緑の反応生成物の濃さ ＋８から＋１０・　非常に濃い緑から非常に濃い青第１Ｂ表 ３０分検定 ＡＳ丁活動度 シグマ単位ＩＪ 緩衝液　呈色　Ｂ　１００　２００　５００　１０００　２０００４０００１０ ００Ｇモル濃度　反応 時間 （分） ０．０１　５　Ｙ　’ｔ　Ｙ或いは　＋Ｈ＋１　＋２　＋４　＋５＋〃 １０　Ｙ　Ｙ　ＹＢｒ　＋！４＋１或いは　＋３＋５　＋７０．０２　５　Ｙ　 ’ｌ　ｌ　＋２　４３　＋３　＋５＋７１０　Ｙ　ＹＢｒ　＋％（ＹＢｒ）　＋ ２　＋４　＋４　＋（ｉ　＋９０．０５　５　ＹＢｒ　ＹＢｒ　＋１（ＧＢｒ） 　＋３　＋４　＋５　＋７　＋１０１０　８ｒ　Ｂｒ　＋１（ＧＢｒ）’＋３　 ＋４　＋６　＋８　＋１００．１５ＹＹ或いは十％＋１　＋２　＋４　＋５　＋ ８＋１０１０　＋１ｒ　Ｂｒ　Ｂｒ　＋２（ＧＢｒ）　＋５　＋７　＋９　＋ｌ Ｏ（実施例３） この実施例では、実施例１の方法および材料を用いて、様々な緩衝液ｐＨ値で酵 素ＡＳＴの検定を行った。第２表は、緩衝液に溶解したファストブルーＢＢ塩に 対する様々なＡＳＴ量について、４つの異なるｐＨで３０分間の酵素反応を行っ た検定結果を示す、第３表は、脱イオン水に溶解した様々な量のＡＳＴおよびフ ァストブルーＢＢ塩に対して、４つの異なるｐＨで１５分と３６分の酵素反応を 行った検定結果を示す、これらの表から、酵素反応ｐＨが高くなると。

色の変化、に必要なＡＳＴ量が低減し、したがってＡＳＴの検出閾値が低減する ことが分る。さらに、第゛２表と、第３表の３６分間の検定を比較すると、ジア ゾニウム染料に緩ｉ液を添加することは、　ＡＳＴの検出闇値を低下させる傾向 があることが明らがである。

第２表 ３０分検定 ＡＳＴ活動度 シグマ単位／１−！ 酵素　呈色　呈色　Ｂ　Ｘ０ＣＩ　２００　５００　１０００　２０００　４０ ００　１００００反応　反応　反応 ｐＨｐｉ！　時間 （分） ７、（１６，７５５Ｙ　Ｙ　’／　＋１　＋ｌ　＋３　＋４　＋４１０　Ｙ　＋ ％（ＹＢｒ）＋ｖ１（ＹＢｒ）　＋１　＋２　＋３　＋５　＋５１．４　７．０ ５　５　Ｙ　＋’Ａ　＋’Ａ　＋２＋３＋４＋４＋５１０　’ｌＢｒ　＋’Ａ　 ＋％　＋３　＋３　＋５　＋５　＋５７．７　７．５０　５　Ｙ　＋１　＋１　 ＋ｌ　＋３　＋５　＋５　＋６１０　ＹＢｒ　↓１　＋１　＋１　＋３　＋６　 ＋８　＋ｌＱ８．０　７．８６　５　ＹＢｒ　＋’Ａ　＋２　＋４　＋４　＋４ 　＋５　＋９１０　ＹＢｒ　＋ｌ’ｆ　千２　＋４　＋４　＋５　＋３　＋１０ 第３表 １５分検定 ＡＳＴ活動度 シグマ単位／−え 酵素　呈色　呈色　Ｂ　１００　２００　５００　１０００　２０００　４００ ０　１００００反応　反応　反応 ｐｏ　ｐＨ時間 （分） ？、０　６．８２　８　Ｙ　Ｙ　Ｙ　Ｙ　＋Ｖ、　＋１　＋２＋３７．４　７． ２２　８　Ｙ　Ｙ　ｙ　＋％＋ｔ　＋２　＋４　＋６７．７　７．５４　８　Ｙ Ｂｒ　ＹＢｒ　ＹＢｒ　＋ｌ　＋２　＋４　＋５　＋８８．０　７．８６　８　 ＹＢｒ　ＹＢｒ　ＹＢｒ　＋１　＋３　＋５　＋３　＋ｔ。

３６分検定 ＡＳＴ活動度 シグマ単位頑 酵素　呈色　呈色　Ｂ　１００　２００　５００　１０００　２０００　４００ ０　１００００反応　反応　反応 ｐＨｐＨ時間 （分） ？、０　６．８２　５　Ｙ　Ｙ　Ｙ　＋！４＋１　＋２　＋３＋３１０　’Ｉ　 Ｙ　Ｙ　＋ｌ＋ｌ　＋３　＋４＋４７．４　７．２２　５　Ｙ　’ｔ　＋％＋１ 　＋３　＋４　＋５＋７１０　Ｙ　Ｙ　＋’７ｉ＋２＋４　＋５　＋３＋３１０ 　ＹＢｒ　ＹＢｒ　＋１　＋３　４４　＋７　＋８＋１０Ｂ、０　７．８６　５ 　Ｙ　＋２　＋２　＋３　＋４　＋７　＋９＋１０１０　ＹＢｒ　＋２　＋２　 ＋３　＋５　十Ｂ　＋１０　＋１２（実施例４） この実施例では、実施例１の方法および材料を用いて、実施例１とは異なる濃度 のし一アスパラギン酸ナトリウムおよびα−ケトグルタル酸ナトリウム基質溶液 において、酵素ＡＳＴの検定を行った。この検定は、　ｐＨ８，０で１５分間の 酵素反応と５分間の呈色反応を行った。第４表は、基！？Ｍ度が低下するとＡＳ Ｔ検出闇値が上昇することを示す。

第４表 １５分）★定 ｐＨ８，０ ＡＳＴ活動度 シグマ単位／Ｊ 基質　呈色　Ｂ　１００　２００　５００　１０００　２０００　４０００　１ ００００濃度　反応 時間 （分） ０．２５ｘ　５　ｙ　’ｌ　Ｙ　＋１　＋２　＋３＋４　＋６１１１２いは０． １２５ｘ　５　Ｙ　Ｙ　ｙ　＋４４＋１＋２＋３　＋３０．０６７ｘ　５　’ｌ 　Ｙ　Ｙ　Ｙ　Ｙ　＋に＋１　＋１（実施例５） ファストブルーＢＢ塩濃度がＡＳＴ検出闇値に及ぼす影響を実証したものである 。この結果は。

第５表 １５分検定 ＡＳＴ活動度 シグマ単位／鋼】 ＦＢＢＢ　呈色　Ｂ　１００　２００　５００　１０００　２０００　４０００ 　１０００濃度　反応 時間 （分） 或いは２　或いは４ ５ｍｇ　５　Ｙ　＋’Ａ　＋’Ａ　＋ｌ　＋２　＋３　＋５　＋８１０　ＹＢｒ 　ＹＢｒ　＋％　＋ｌ　・＋３　＋４　＋（ｉ　＋１０或いは２ １０５ｇ　５　Ｙ　＋’Ａ　＋１　＋２　＋３　＋４　＋７　＋１０１０　ＹＢ ｒ　ＹＢｒ　＋’Ａ　＋２　＋４　４５　＋９　４１０（実施例６） たが、ファストブルーＢＢ塩／塩酸溶液混合物を添加した後はｐＨが変化した。

呈色反応は５第６表 ３０分検定 ５分間の色反応時間 ＾ＳＴ活動度 シグマ単位／−Ｍ１ 塩酸　酵素　呈色　Ｂ　１００　２００　５００　１０００　２０００　４００ ０　１００００濃度　反応　反応 ｐＨｐ）ｌ Ｏ，ＩＮ　８．０　７．１８　Ｙ　Ｙ　＋’、４　＋１　＋２＋’ｌ　＋５　＋ ５０．０６７Ｎ　８．０　７．４３　Ｙ　ＹＢｒ　４１　＋２　＋２　＋３　４ ５　＋８０．０５Ｎ　８．０　７．５６　Ｙ　＋ｙ、　十各　＋２　＋３　＋５ 　＋８　＋１００．０４Ｎ　８．０　７．６２　Ｙ　＋’／、　＋１　＋２＋３ 　＋５　＋８＋１０（実施例７） この実施例では、実施例１の方法および材料を用いてＡＳＴの検定を行い９反応 混合物に加えたβ−クロロ−し−アラニンの影響を測定した。酵素反応は、ｐ！ （値が７．３５あるいは７．０のいずれかにおいて３０分間にわたって行い、呈 色反応は５分あるいは１０分のいずれがで行った。第７Ａ表および第７Ｂ表は、 酵素阻害物質の添加量を増すと、　ＡＳＴの検出闇値の上昇が観察されたことを 実証している。この結果は１反応ｐＨが低下すると検出闇値は上昇する傾向があ ることを示唆している。呈色反応時間の差異は検定の結果に大きな影響を及ぼす ことは観察されていない。

第７Ａ表 ３０分検定 ｐＨ７，３５ ＡＳＴ活動度 シグマ単位− ＣＬＡ　呈色　Ｂ　１００　２００　５００　１０００　２０００　４０００　 １００００モル　反応 濃度　時間 （分） なし　５　Ｙ　Ｙ　Ｙ　＋］　＋２　＋３　＋４　＋５１ＯＹ　Ｙ　Ｙ　＋１　 ＋３　＋４　＋５　＋７或いは　或いは ＋’Ａ　２ ０．０１　５　Ｙ　’ｌ　Ｙ　＋１　＋１　＋３　＋４　＋６或いは　或いは ＋’Ａ　２ １０　Ｙ／ＹＢｒ　Ｙ／ＹＢｒ　ＹＢｒ　＋１　＋２　＋３　＋４　＋７或いは ＋２ ０．０５　５　Ｙ　Ｙ　Ｙ　Ｙ　＋１　＋２　＋４　＋５　。

或いは ＋２ １０　Ｙ／ＹＢｒ　Ｙ／ＹＢｒ　Ｙ／ＹＢｒ　＋’Ａ　＋１　＋２　＋４　＋６ ０．１　５　Ｙ　Ｙ　Ｙ　’ｌ　＋１（ＯＧ）＋２（ＯＧ）＋３（ＯＧ）＋４（ ＯＧ）１０　ＹＢｒ　ＹＢｒ　ＹＢｒ　ＹＢｒ　＋１（ＯＧ）　＋２（ＯＧ）　 ＋３（ＯＧ＞　＋４（ｏＧ）第７Ｂ表 ３０分検定 ｐｌ＋７．０ ＡＳＴ活動度 シグマ単位／祷Ｉ ＣＬＡ　呈色　Ｂ　１００　２００　５００　１０００　２０００　４０００　 １００００モル　反応 濃度　時間 （分） なし　５　Ｙ　Ｙ　Ｙ　Ｙ　＋１　＋１　＋２　＋３１０ＹＹＹ　Ｙ　＋２　＋ ２　＋３　＋４或いは　或いは ４％　５ ０．０１　５　Ｙ　Ｙ　Ｙ　Ｙ　４％　＋１　＋２　＋３１０　Ｙ　Ｙ　Ｙ　’ ｌ　４％　＋２　＋３　＋４或いは　或いは ４％　１ ０．０５　５ＹＹＹ　Ｙ　Ｙ　０４＋１　＋１１０　Ｙ　Ｙ　Ｙ　Ｙ　ｙ　＋１ 　＋１　＋１或いは ０．１　５　Ｙ　Ｙ　Ｙ　Ｙ　Ｙ　Ｙ　＋’Ａ　＋１１０　Ｙ　Ｙ　Ｙ　Ｙ　Ｙ 　Ｙ　＋ｌ　＋１或いは （実施例８） この実施例では、実施例１の方法および材料を用いてＡＳＴの検定を行い、碌々 な量の酵素阻害物′ｆｄ、１−ｃ−プロパルギルグリシンを添加した場合の影響 を測定した。酵素反応はｐ１＋値が７．３５あるいは７．０のいずれかで３０分 間にわたって行い、また呈色反応は５分、　１０分あるいは１５分間にわたって 行った。第８Ａ表および第８Ｂ表の結果は、酵素阻害物質の添加量を増すと、　 ＡＳＴの検出闇値が上昇する傾向があることを実証している。さらに酵素阻害物 質の濃度が高い場合には、検出閾値における黄色から緑色への移行がやや不明瞭 となり。

黄色と緑色信号のあいだに、中間のオレンジ色−緑色および黄色−茶色が表れる 。ｐＨ値が低くなるとＡＳＴの検出闇値が上昇することが観察され、また高いｐ Ｈまたは高い酵素阻害物１４度における呈色反応時間の差異は検定結果には影響 を及ぼさないことが観察された。

第８八表 ３０分検定 ｐＨ７，４ ＡＳＴ活動度 シグマ単位／−！ ＰＡＧ　呈色　Ｂ　１００　２００　５００　１０００　２０００　４０００　 １００００モル　反応 濃度　時間（分） なし　ＳＹＹ　十％　＋１’＋２　４３　＋４　４５或いは１ １０　Ｙ　Ｙ　＋ｊ４　＋２　＋３　＋４　＋５　＋８０．０１Ｍ　５　Ｙ　Ｙ 　Ｙ　＋’Ａ　＋１　＋３　＋４　＋６或いは２ １０　ＹＢｒ　ＹＢｒ　ＹＢｒ　＋ｌ　＋２　＋３　＋５　＋７或いは８ ０．０５Ｍ　５　’ｌ　Ｙ　Ｙ　−Ｎ４　＋１　４２　＋３　＋４１０　ＹＢｒ 　ＹＢｒ　ＹＢｒ　＋１４（ＹＢｒ）＋２　＋３　＋３　＋５（ＯＧ　１０００ 〜１００００．　５分および１０分）０．１Ｍ　５　Ｙ　Ｙ　ＹＢｒ　＋１　＋ １　＋２　＋３１０　０ｒ　Ｏｒ　０ｒＢｒ　＋１　＋２．　＋３　＋４（ＯＧ 　１０００−１００００．　５分および１０分）第８Ｂ表 ３０分検定 ｐＨ７，０ ＡＳＴ活動度 シグマ単位／ζ１ ＰＡＧ　呈色　Ｂ　１００　２００　５００　１０００　２０００　４０００　 １００００モル　反応 濃度　時間（分） なし　５　Ｙ　Ｙ　Ｙ　Ｙ　＋％　＋１　＋２　＋４或いは ＋２ １０　Ｙ　Ｙ＋’Ａ　＋１　＋２　＋２　＋４　＋７１５　Ｙ　Ｙ　＋％　＋１ 　＋２　＋３　→−５＋８０．０ＩＭ５ＹＹＹ　Ｙ　＋１　＋１　＋２　＋４１ ０　Ｙ　Ｙ　’ｔ　＋％　＋１　＋２　＋３　＋５或いは １５　Ｙ　Ｙ　Ｙ　＋％　＋１　−）３　＋４　＋７０．０５Ｍ５ＹＹＹ　Ｙ　 Ｙ　＋１　＋２　＋３１０ＹＹＹ　Ｙ　Ｙ　＋１　＋２　＋５或いは １５　ＹＢｒ　ＹＢｒ　ＹＢｒ　ＹＢｒ　ＹＢｒ　＋２　＋３　＋５（ＯＧ　２ ０００〜１００００．５分〜１５分）第８Ｂ表（Ｖｔき） ３０分検定　ｐＩ（７，０ ＡＳＴ活動度 シグマ単位／− ＰＡＧ　呈色　Ｂ　１００　２００　５００　１０００　２０００　４０００　 １００００モル　反応 濃度　時間（分） ０．１Ｍ　Ｓ　’Ｉ　Ｙ　Ｙ　Ｙ　Ｙ　Ｙ　４１（ＯＧ）　＋３（ＯＧ）１０　 ＹＢｒ　ＹＢｒ　ＹＢｒ　ＹＢｒ　ＹＢｒ　ＹＢｒ　４１（ＯＧ）　＋３（ＯＧ ）１５　ＹＢｒ　ＹＢｒ　ＹＢｒ　ＹＢｒ　ＹＢｒ　ＹＢｒ　＋２（ＯＧ）　＋ ４（ＯＧ）これまで述べた実施例に例示するように、特定レベルのＡＳＴを検出 する閾値点を調節することは十分に本発明の範囲内にある。歯周疾患は一般に、 約５６０から約４０００シグマ単位ｉｖｌあるいはそれ以上の量のＡＳＴ力噛肉 溝液に存在することによって診断されるものと考えられるが９本発明は、これら 特定のＡＳＴ　ｔｊａ度の闇値を検出することに限定されるものではない、実際 に、基質濃度、基質インキュベーシッンｐＨの調節、特定濃度の酵素阻害＠５質 の添加、あるいはその他の変更によって、約１００から約４０００シグマ単位ｔ ｓｌあるいはそれ以上の事実１全ての検出闇値を選択することが可能である。

例示のために、実施例４は、基質濃度の変化によって得られる反応闇値の劇的な 変化を実証している。同様に反応闇値の劇的な変化は、酵素阻害物質の量を変え てＡＳＴ反応混合物に混入することに関連する実施例７および８に例示されてい る。実施例２および３は。

様々なモル濃度およびｐＨ値の緩衝液を混入した場合の、閾値濃度に及ぼされる 微妙な影響について例示している。

を行って特定の濃度闇値を越えたＡＳＴの存在を検出するために、緩衝液ｐ）Ｉ およびモル濃度の調節を行うことが出来るようにする。

国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（１）アスパラギン酸塩アミノトランスフェラーゼ基質が含まれている試料 を第１反応混合物中にインキユベートして第１反応生成物を形成すること、およ び （２）指示物質と共に，第２の色のついた反応生成物がその中で形成される第２ 反応混合物中にインキュベートしてその中の反応生成物を検出することにより， 口腔体液試料中のアスパラギン酸塩アミノトランスフェラーゼを検出する方法に おける、以下の（ａ），（ｂ）から成る改良。 （ａ）第２反応混合物中の指示物質としてジアゾニウム化合物を用いること，お よび （ｂ）第１および第２反応混合物内の反応条件を変更して，前記第１反応混合物 中に、選定された閾値を下回るレベルのアスパラギン酸塩アミノトランスフェラ ーゼが存在する時には目視によって検出可能な着色した反応生成物が前記第２反 応混合物中に形成されず；第１反応混合物中に、選定された閾値を上回る濃度の アスパラギン酸塩アミノトランスフェラーゼが存在する時には目視によって検出 可能な呈色反応生成物が第２反応混合物中に形成されること ２．口腔体液の試料が歯肉溝液である請求の範囲第１項に記載の改良。 ３．口腔体液の試料が唾液である請求の範囲第１項に記載の改良。 ４．アスパラギン酸塩アミノトランスフェラーゼ基質がアスパラギン酸塩および α−ケトグルタル酸塩であり，第一反応生成物がオキサロ酢酸塩である請求の範 囲第１項に記載の改良。 ５．第一反応混合物の変更がｐＨの調整から成る請求の範囲第１項に記載の改良 。 ６．第一反応混合物の変更がアスパラギン酸塩およびα−ケトグルタル酸塩の濃 度の調整から成る請求の範囲第１項に記載の改良。 ７．第一反応混合物の変更が緩衝液濃度の調整から成る請求の範囲第１項に記載 の改良。 ８．第一反応混合物の変更が酵素阻害物質の添加から成る請求の範囲第１項に記 載の改良。 ９．酵素阻害物質がβ−クロロ−レアラニンてある請求の範囲第８項に記載の改 良。 １０．酵素阻害物質がｄ，１−ｃ−プロバルギルグリシンである請求の範囲第８ 項に記載の改良。 １１．第２反応混合物の変更が緩衝液濃度の調整から成る請求の範囲第１項に記 載の改良。 １２．第２反応混合物の変更がｐＨの調整から成る請求の範囲第１項に記載の改 良。 １３．第２反応混合物の変更が指示物質濃度の調整から成る請求の範囲第１項に 記載の改良。 １４．指示物質が：ファストバイオレットＢ；ファストレッドＰＤＣノポンソウ Ｌ，ファストレッドＫＬ；ファストスカーレフトＧＧ，ファストレッドＲＣ，フ ァストブルーＢＢ，ファストブルーＢおよびファストブルーＲＲを含むグループ から選定される請求の範囲第１項に記載の改良。 １５．指示物質がファストブルーＢＢである請求の範囲第１４項に記載の改良。 １６．（１）口腔体液を採取する手段，（２）アスパラギン酸塩アミノトランス フェラーゼによって触媒される反応により，第１反応生成物を形成する基質から 成る第１の試薬混合物，および （３）前記第１反応生成物と反応して第２の着呈色反応生成物を形放する指示物 質から成る第２の試薬混合物から成る、 口腔体液試料中のアスパラギン酸塩アミノトランスフエラーゼを検出するための キットにおいて，以下の（ａ），（ｂ）から成る改良。 （ａ）第２試薬混合物中の指示物質としてのジアゾニウム化合物，および（ｂ） 液体試料中に事前設定したアスパラギン酸塩アミノトランスフェラーゼの最小量 がない場合に前記第２の着呈色反応生成物の形成を防止する第１あるいは第２試 薬混合物中の試薬発明の詳細な説明