NL8004080A - Methode voor het bepalen van transaminases, alsmede een daarmee verband houdende diagnostische uitrusting. - Google Patents

Description

*· 49 723/Bs/AS - 1 - BIODATA S.p.A., te Rome, Italië.

Methode voor het bepalen van traisaninases, alsmede een daarmee verband houdende diagnostische uitrusting.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het bepalen van transaminases voor toepassing op-het gebied van klinische diagnoses.

Transaminatie betekent het proces van het over-5 brengen van een aminogroep van een aminozuur naar een ketonzuur. Enzymen, die dit type reactie katalyseren worden transaminases genoemd, en de bepaling ervan is van belang geworden in de klinische chemie, sinds in 1954 LaDue, Wroblewski en Karmen meedeelden, dat GOT (gluta-10 minezuur oxaalazijnzuur transaminase, of asparaginezuur aminozuur transferase ofwel EC 2,6.1.1. volgens I.U.B. klassificatie) toeneemt na myocardiale infarctie. Variaties zijn opgemerkt hoofdzakelijk van zowel GOT en GPT (glutaminezuur pyrodruiverzuur transaminase, of alino 15 amino transferase ofwel EC 2.6.1.2. volgens I.U.B. klassificatie) onder andere pathologische vormen, in het bijzonder bij epathopatieën.

GOT katalyseert de volgende reactie:

COOH COOH COOH COOH

20 ja2 + | 2 _, |H2 |H2 CHNH0 CH„ * C=0 CH0 I T I - COOH CO CCOH CHNH2

COOH COOH

asparagine- cc -ketoglutaar- oxaalazijn- glutamine- 25 zuur zuur zuur zuur terwijl GTP de volgende reactie katalyseert: 800 4 0 80 m f~ - 2 -

CH0 COOH CH, COOH

l3 I J i I 2 I 2<-- I I 2 COOH CH., COOH CH0 I 2 I 2 CO CHNH- , I 1 2

5 COOH COOH

alanine a-ketoglutaar- pyrodruive- glutamine- zuur zuur zuur

In het geval van GOT is het niet gemakkelijk om het asparagine en het <*-ketoglutaarzuur te bepalen; 10 daarom zijn alle daadwerkelijk in gebruik zijnde methodes gebaseerd op de bepaling van oxaalazijnzuur, hetzij direct hetzij indirect.

Over de gehele wereld worden twee methodes gebruikt: 15 1) De colorimetrische methode, gebaseerd op de reactie van oxaalazijnzuur met 2,4-dinitrofenylhydrazine, deze reactie is niet kinetisch, maar na een vastgestelde incubatieperiode wordt de hoeveelheid gevormd ketonzuur gedoseerd door bij 536 nm de uitdoving van het gevormde fenylhydra-20 zon te meten. Deze methode, hoewel gemodificeerd in de loop der jaren, vertoont toch nog bezwaren in het geval van monsters van icterische mensen..

2) De kinetische ü.V. methode, welke algemeen beschouwd wordt als de referentiemethode als gevolg van de hoge 25 nauwkeurigheid en specificiteit daarvan.

Het oxaalazijnziiur, geproduceerd in de transa-minatiereactie, wordt bepaald door een enzymatische reactie gekoppeld met appelzuurdehydrogenase (MDH) door bij 340 nm de oxidatie te meten van MADH (nicotin-30 amide adenine dinucleotide in de gereduceerde vorm).

COOH COOH

CH0 MDH Aho + NAD+ | 2 _ψ | 2

C = O + NADH + H+ «- H-C-OH

I I

COOH COOH

3 5 oxaalazi jnzuur appelzuur 800 4 0 80 'Kt - 3 -

De modificaties, gemaakt in deze methode, die voor het eerst werd ingevoerd door Karmen, maakten het mogelijk, dat de reactie werd geoptimaliseerd als functie van de concentratie van.substraat en van de bepalings-5 temperaturen, en de moeilijkheden als gevolg van de te overwinnen niet lineaire kinetische fases.

Ook voor GTP kunnen overeenkomstige overwegingen worden gemaakt in het geval van de colorimetrische test, omdat de kinetische U.V. methode, geïntroduceerd door 10 Henley en Pollard, is gebaseerd op de bepaling van pyro-druivezuur, gevormd in de reactie van alaninetransami-natie door een enzymatisch reactiekoppel met melkzuurde-hydrogenase (LDH), waarbij de re-oxidatie van het NADH .wordt gemeten bij 340 nm.

15 CH, CH,

I I

C = O + NADH-H* LDH H-C-OH + NAD+

ï I

COOH * COOH

pyrodruivezuur melkzuur

Ook voor de kinetische U.V. methode maakten de 20 modificaties, geïntroduceerd en beschreven in de literatuur, het mogelijk, dat de reactie werd geoptimaliseerd als functie van de concentraties van substraat en van de bepalingstemperaturen.

De bepaling van GOT en GPT activiteiten aanwezig 25 in het serum of in andere biologische monsters, wordt uitgevoerd door de bovengenoemde colorimetrische of U.V. kinetische methoden. Hierdoor is de analyst altijd verplicht om twee verschillende analyses uit te voeren voor de twee transaminases. Dit is het gevolg van de technische 30 onmogelijkheid om de twee U.V. kinetische enzymen, bovengenoemd, te koppelen in één bepaling wegens het kruis-inhibitiefenomeen.

Het doel van de uitvinding is nu een nieuwe methode, die het mogelijk maakt om spectrofotometrisch 35 in U.V. kinetica met slechts één proef de som te bepalen van de twee transaminase-activiteiten, en deze proef 800 4 0 80 * - 4 - τ vormt aldus de eerste selectieproef tussen normale en pathologische waarden van dergelijke enzymatische activiteiten. In toevoeging maakt de nieuwe methode het in overeenstemming met de vereisten van de analyst mogelijk 5 om door eenvoudig de volgorde van introductie van reactie-middelen en substraten in het reactiemengsel te modificeren, exact de activiteiten van de twee transaminases te bepalen in eenheden per liter in het zelfde monster van plasma of serum, waardoor tijd wordt bespaard in verge-10 lijking met de methodes, die traditioneel in de laboratoria worden gebruikt.

Het is bekend, dat GOT in staat is om transami-natie te katalyseren niet alleen van zijn natuurlijke substraten (glutaminezuur en asparaginezuur), maar even-15 eens van andere aminozuren . Onder deze wordt ook het cysteïnesulfininezuur actief getransamineerd in aanwezigheid van 0C-ketoglutaarzuur onder vorming van {^-sulfinyl-pyrodruivezuur, dat, gezien het in wateroplossing onstabiel is, snel hydrolyseert tot druivezuur en sulfiet 20 volgens het volgende reactieschema:

CH2-S02H (jOOH CH2-S02H COOH

CHNH0 + CH, GOT C = 0 + CHn I 2 12 I 12 COOH CH0 COOH CHn 12 . i2 C = O CHNH- 1 i

25 COOH COOH

cysteïnesul- cL-ketoglu- ^ -sulf inyl- glutamine- finezuur taarzuur pyrcdruivezuur zuur +Ho0 \ CH_ \l IC = O + HoS0o

30 COOH

pyrodruive z uur 800 4080 % - 5 -

Zelfs bij afwezigheid van d,-ketoglutaarzuur is GOT in staat om een reactie aan te gaan met cysteïnesul-finezuur en een ot— )¾ eliminatiereactie te katalyseren volgens het volgende reactieschema: 5 CHo-S0oH CH9 ,22 || 2 CHNH0 GOT C-NEL· + H^S0o I -» | 2 23 COOH COOH \+ Ho0 CH-.

C = 0 + nh3 COOH

10 cysteïnesul- aminoacryl- pyrodruive- finezuur zuur zuur

Ook in dit geval is het eindprodukt van de reactie druivezuur, en de activiteit van GOT kan worden bepaald in spectrometrische kinetica bij 340 nm door de 15 re-oxidatie te meten van NADH in aanwezigheid van melk-zuurdehydrogenase, hetzelfde enzym, dat wordt gebruikt voor de bepaling van de GPT activiteit.

Het gebruik van cysteïnesulfinezuur als substraat van GOT maakt het aldus mogelijk om slechts ëén aantonend 20 enzym te gebruiken, het melkzuurdehydrogenase (LDH), in de- gekoppelde bepaling van de twee transaminases volgens het volgende reactieschema: ch3

<!;hnh0 + a-KG

1 \

25 COOH NGPT

alanine *CH-, CH0

I I

C = O + NADH LDH H-C-OH + NAD+ I —» i

CH9S00H GOT COOH COOH

| 2 2 * ch-nh2

30 COOH + Ot-KG

cysteïnesul- pyrodruive- melkzuur finezuur zuur 800 4080 - 6 - Μ “De vermindering van uitdoving bij 340 nm geeft een maat voor de hoeveelheid geproduceerd druivezuur, en als gevolg van de activiteiten van beide transaminases. Het is belangrijk op te merken, dat de simultane bepaling 5 van transaminases onder deze omstandigheden mogelijk is dankzij de afwezigheid van kruisinhibitie tussen de gebruikte substraten. De bijzondere kinetische eigenschappen van de reactie tussen GOT en cysteïnesulfinezuur maken twee verschillende toepassingen van het systeem 10 mogelijk, die in de volgende voorbeelden worden toegelicht:

Voorbeeld I.

Methode voor het bepalen van de absolute GOT en GPT activiteiten.

Aan een reactiemengsel van 2,5 ml, dat L-alanine 15 (200 mM), ^--ketoglutaarzuur (2 mM), -NADH (0,24 mM) en 3,6 eenheden melkzuurdehydrogenase in tris-HCl buffer (80 mM), pH 8,5 bevatte, voegde men 0,5 ml plasma of serum toe, waarna de afname werd gemeten van de uitdoving bij 340 nm (of bij andere golflengtes, bijvoorbeeld 20 334 of 365 nm, al naar gelang het gebruikte instrument).

Deze afname staat in directe betrekking met de hoeveelheid transformatie van alanine in pyrodruivezuur, veroorzaakt door GPT.

Na een paar minuten reactie werd 0,1 ml van een 25 oplossingscysteïnesulfinezuur toegevoegd, zodat de eind- concentratie in het reactiemengsel 66 mM bedroeg.

De toename Δ E/min. is in dit geval het gevolg van de transformatie van cysteïnesulfinezuur in pyrodruivezuur, dat wordt veroorzaakt door GOT.

30 Door middel van transformatiecoëfficiënten is het mogelijk om uit de toename Δ E/min., waargenomen voor en na de toevoeging van het cysteïnesulfinezuur, de exacte waarden te berekenen van GOT en GPT enzymatische eenheden, aanwezig is het serum, door middel één 35 enkel bepalingsproces.

Voorbeeld II.

Methode voor het kritisch onderzoeken van normale en pathologische waarden van GOT en GPT activiteiten in plasma of serum.

8004080 - 7 -

Aan een reactiemengsel van 2,5 ml, dat L-alanine (200 mM) , ct'-ketoglutaarzuur (2 mM) , -NADH (0,24 mM) , cysteïnesulfinezuur (7 mM), en 3,6 eenheden melkzuurde-hydrogenase in tris-HCl buffer (50 mM), pH 8,5 bevatte, 5 voegde men 0,5 ml cerum of plasma toe, en de afname in uitdoving werd gemeten bij 340 nm (of bij andere golflengtes, bijvoorbeeld 334 of 365 nm, al naar gelang het gebruikte instrument). In dit geval staat de afname van uitdoving in direct verband met de hoeveelheid transfor-10 matie van zowel alanine als cysteïnesulfinezuur tot pyrodruivezuur, respectievelijk veroorzaakt door GPT en GOT, en dit vormt een maat van de som van de twee enzymatische activiteiten.

De kinetische eigenschappen van de proef maken 15 het mogelijk om een grenswaarde in te stellen voor Δ E/min. tussen normale en pathologische waarden.

Door middel van geschikte transformatiequotiënten is het mogelijk om in het geval van normale monsters exact de daadwerkelijke enzymatische eenheden te berekenen 20- van zowel GOT en GPT, terwijl in het geval van pathologische monsters de methode een fout heeft van ongeveer 10-15%.

Conclusies.

8004080

Claims (4)

1. Kinetische U.V. methode voor de simultane bepaling van glutaminezuur oxaalazijnzuur transaminase (GOT) en glutaminezuur druivezuur transaminase (GPT) in één enkel monster serum of plasma, met het k e n -5 merk, dat als specifieke aminozuursubstraten voor de bovengenoemde transaminases respectievelijk worden gebruikt L-cysteïnesulfinezuur en L-alanine, en dat als aantonend enzym van beide transaminase-activiteiten melkzuur dehydrogenase wordt genomen.

2. Methode volgens conclusie 1, m e t het kenmerk , dat de totale GOT en GPT transaminase-activiteiten worden bepaald door het meten van de totale waarde f\ E/min.. waarbij de twee aminozuursubstraten van het begin af in de reactieomgeving aanwezig zijn.

3. Methode volgens conclusie 1, m e t het kenmerk, dat Δ E/min. eerst wordt gemeten in aanwezigheid van L-alanine als substraat, en vervolgens de toename van Δ E/min. na de toevoeging van· cysteïnesul-finezuur wordt gemeten, waarbij de laatste/\E/min. toe-20 name de maat vormt van de GOT transaminase-activiteit.

4. Diagnostische uitrusting voor het aantonen· van normale of pathologische waarden van GOT en GPT onder toepassing van de methode van conclusie 1, 2 of 3, m et het kenmerk, dat deze uitrusting als component-25 substraten cystexnesulfinezuur en L-alanine heeft. 800 4 0 80