DE3026854C2 - Kinetische UV-Methode zur Bestimmung von Glutamat-Oxalacetat-Transaminase und Glutamat-Pyruvat-Transaminase - Google Patents

Kinetische UV-Methode zur Bestimmung von Glutamat-Oxalacetat-Transaminase und Glutamat-Pyruvat-Transaminase

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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Transaminasen zur Verwendung für klinische Diagnosen.
Als Transamininjerung wird der Prozeß der Übertragung einer Aminogruppe von einer Aminosäure zu einer Ketosäure bezeichnet Enzyme, die diesen Reaktionstyp katalysieren, werden als Transaminasen bezeichnet. Ihre Bestimmung ist in der klinischen Chemie seit 1954 wichtig geworden, wo LaDue, Wroblewski und Karmen beschrieben haben, daß die Werte für GOT (Glutamat-Oxalacetat-Transaminase oder Aspartat-Amino-Transferase oder EC 2.6.1.1. nach der I.U.B.-KIassifikation) nach Myocardinfarkten zunehmen. Sowohl bei den Werten von GOT als auch von GPT (Glutamat-Pyruvat-Transaminase oder Alanin-Amino-Transf erase oder EC Z6.1.2. nach der I.U.B.-KIassifikation) sind bei pathologischen Formen, insbesondere bei Epathopathien, abweichende Werte festgestellt worden.
GOT katalysiert die folgende Reaktion:
COOH
CH2 I CHNH2
COOH
Asparaginsäure
COOH
CH2
i CH2
CO
COOH
σ-Ketoglutarsäure
COOH
CH2
I
C = O
COOH
COOH
CH2
I
CH2
CHNH2
COOH
Oxalessigsäure Glutaminsäure
GPT katalysiert die folgende Reaktion: CH3 COOH
CHNH2
COOH
Alanin
CH2 CH2 CO
COOH
cr-Ketoglutarsäure
CH3
C = O
COOH
Brenztraubensäure
COOH
CH2
CH2 CHNH2
COOH Glutaminsäure
Im Falle von GOT ist es nicht einfach, die Asparaginsäure:.und,;die:^rKetöglütarsäüYe'zü;bestimrnen. Daher bauen sich alle tatsächlich angewendeten Methoden entweder-direkt oder indirekt auf der Bestimmung von Oxalessigsäure auf.
Auf der ganzen Welt werden zwei Methoden angewendet:
1. Die kolorimetrische Methode, die sich auf der Reaktion von Oxalessigsäure mit 2,4-Dinitrophenyldrazin aufbaut. Diese Reaktion ist zwar nicht kinetisch, doch wird nach einer zuvor festgelegten inkubationsperiode die Menge der gebildeten Ketosäure bestimmt, indem die Extinktion des gebildeten Phenylhydrazons bei
536 nm gemessen wird. Diese Methode ist, obgleich sie im Verlauf der Jahre modifiziert worden ist, im Falle von Proben von Patienten mit Ikterus immer noch mit Nachteilen behaftet.
2. Die kinetische UV-Methode wird im allgemeinen aufgrund ihrer hohen Genauigkeit und Spezifität als die Referenzmethode angesehen.
Die bei der Transaminierungsreaktion gebildete Oxalessigsäure wird durch eine enzymatische Reaktion gekoppelt mit Malat-Dehydrogenase (MDH) bestimmt, indem bei 340 nm die Oxidation von NADH (Nikotinamid-Adenin-DinucIeotid in reduzierter Form) bestimmt wird.
COOH COOH ]0
CH2 CH2 + NAD+
I MDH I
C = O + NADH + H+ H-C—OH
I
COOH COOH
Oxalessigsäure Äpfelsäure
Modifikationen dieser Methode, die zuerst von Karmen eingeführt worden sind, gestatten es, daß die Reaktion als Funktion der Konzentration des Substrats und der Bestimmungstemperaturen optimiert werden und daß die Schwierigkeiten, die auf die nichtlinearen kinetischen Phasen zurückzuführen sind, überwunden werden.
Auch für GPT sind im Falle des kolorimetrischen Tests ähnliche Erwägungen angestellt worden, während die kinetische UV-Methode, die von Henley und Pollard eingeführt worden ist, sich auf der Bestimmung von Brenztraubensäure aufbaut, welche bei der Reaktion der Alanin-Transaminierung durch ein enzymatisches Reaktionspaar mit Lactat-Dehydrogenase (LDH) gebildet wird, wobei die Reoxidation des NaDH bei 340 nm
^ gemessen wird.
CHj CH3
I LDH I
C = 0+N\DH — H+ H —C-OH + NAD +
COOH COOH
Brenztraubensäure Milchsäure
Auch für die kinetische UV-Methode haben es die eingeführten und in der Literatur beschriebenen Modifikationen gestattet, daß die Reaktion als Funktion der Konzentration des Substrats und der Bestifrimungstemperaturen optimiert wird.
Die Bestimmung der GOT- und GPT-Aktivitäten im Serum oder in anderen biologischen Proben v/ird nach der oben beschriebenen kolorimetrischen oder UV-kinetischen Methode durchgeführt. Dies bedeutet für den analytischen Chemiker, daß er immer zwei verschiedene Analysen für die zwei Transaminasen durchführen muß, was auf die technische Unmöglichkeit zurückzuführen ist, die zwei oben beschriebenen UV-kinetischen Enzyme bei nur einer Bestimmung zu koppeln, was auf eine Kreuz-Hemm-Erscheinung zurückzuführen ist.
Gegenstand der Erfindung ist eine kinetische UV-Methode zur Bestimmung von Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (GOT) und Glutamat-Pyruvat-Transaminase (GPT) in nur einem Probenansatz von Serum oder Plasma, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als spezifische Aminosäuresubstrate der obengenannten Transaminasen L-Cysteinsulfinsäure bzw. L-Alanin verwendet und daß man als anzeigendes Enzym für beide Transaminaseaktivitäten Lactat-Dehydrogenase verwendet.
Das erfindungsgemäße Verfahren gestattet es, mit nur einer einzigen Bestimmung spektrophotometrisch die Summe von zwei Transaminaseaktivitäten zu bestimmen. Dieses Verfahren stellt einen ersten Screening-Test zwischen normalen und pathologischen Werten von solchen ^nzymatischen Aktivitäten dar. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann man die Aktivitäten von zwei Transaminasen in Einheiten pro Liter in der gleichen Probe von Plasma oder Serum genau bestimmen, wodurch im Vergleich zu den traditionellen Verfahren Zeitersparnisse im Labor gewonnen werden.
Bekanntlich ist GOT dazu imstande, die Transaminierung nicht nur ihrer natürlichen Substrate (Glutaminsäure und Asparaginsäure), sondern auch von anderen Aminosäuren zu katalysieren. Unter diesen wird auch die Cysteinsulfinsäure aktiv in Gegenwart von «-Ketoglutarsäure transaminiert, wobei/f-Sulfinyl-Erenztraubensäure gebildet wird. Diese wird, da sie in wäßriger Lösung instabil ist, rasch zu Brenztraubensäure und Sulfid s hydrolisiert. Dies geschieht nach dem folgenden Reaktionsschema· eo
CH2—SO2H COOH
I I
CHNH2 + CH2
I I
COOH CH2
C=O
COOH Cysteinsuifin- c-Ketoglutar-
GOT
CH2—SO2H COOH
C=O + CH2
I I
COOH CH2
CHNH2 COOH Glutaminsäure
saure
säure
Brenztraubensäure
+ H2O
CH3
C=O + H2SO3
COOH
Brenztraubensäure
Selbst in Abwesenheit von «-Ketoglutarsäure ist die GOT dazu imstande, sich mit Cysteinsulfinsäure umzusetzen und eine «-^-Eliminierungsreaktion nach dem folgenden Schema zu katalysieren:
CH2-SO2K CH2
π		 + H2SO3 CH3
I
C ÜMU GOT , C MH s+ H2O C = O + NH3
I
C HIN ri2 —* K^ IN Xl2
I 		\ I
COOH
Brenztrauben
säure
COOH I \
COOH >		 \
Cysteinsulfin
säure		 ff-Aminoacrylsäure
Auch in diesem Falle ist das Endprodukt der Reaktion Brenztraubensäure. Die Aktivität von GOT kann in spektrofotometrischer Kinetik bei 340 nm bestimmt werden, indem die Reoxidation von NADH in Gegenwart von Lactat-Dehydrogenase gemessen wird, wobei das gleiche Enzym zur Bestimmung der GPT-Aktivität verwendet wird.
Die Verwendung von Cysteinsulfinsäure als Substrat von GOT gestattet es daher, nur ein einziges anzeigendes Enzym, nämlich die Lactat-Dehydrogenase (LDH), bei der gekoppelten Bestimmung der zwei Transaminasen nach folgendem Schema zu verwenden:
CH3
CHNH2 + or-KG
COOH
Alanine
CH2SO2H
CH-NH2
COOH + a-KG
Cysteinsulfinsäure
LDH
CH3
H-C — OH + NAD+ { COOH
Brenztraubensäure
Milchsäure
Die Verminderung der Extinktion bei 340 nm stellt ein Maß für die Menge der erzeugten Brenztraubensäure und daher das Ergebnis der Aktivitäten von beiden Transaminasen dar. Es ist zu beachten, daß die gleichzeitige Bestimmung der Transaminasen bei diesen Bedingungen aufgrund des Fehlens einer Kreuzhemmung zwischen den verwendeten Substraten möglich ist. Die besonderen kinetischen Eigenschaften der Reaktion zwischen GOT und der Cysteinsulfinsäure gestatten zwei verschiedene Anwendungen des Systems, wie in den folgenden Beispielen beschrieben wird.
Beispiel 1
Methode der Bestimmung der absoluten GOT- und GPT-Aktivitäten ι ο
Zu einem Reaktionsgemisch von 2,5 ml, das L-Alanin (200 mM), «-Ketoglutarsäure (2 mM), /?-NADH (0,24 mM) und 3,6 Einheiten Lactat-Dehydrogenase in Tris-HCl-Puffer (80 mM), pH 8,5, enthält, werden 0,5 ml Plasma oder Serum zugesetzt. Dann wird die Verminderung der Extinktion bei 340 nm (oder bei anderen Wellenlängen, z. B. 334 oder 365 nm, entsprechend den verwendeten Instrumenten) gemessen. Die Abnahme steht in direkter Beziehung zu dem Ausmaß der Transformation von Alanin zu Brenztraubensäure, die durch GPT bewirkt wird.
Nach wenigen Reaktionsminuten werden 0,1 ml einer Lösung von Cysteinsulfinsäure zugesetzt, so daß die Endkonzenträtion in dem Reaktionsgemisch 66 mM beträgt.
Die Erhöhung des /tff/min-Wertes ist in diesem Falle auf das Transformationsgemisch von Cysteinsulfinsäure zu Brenztraubensäure zurückzuführen, was durch GOT bewirkt wird.
Aus dem Transformationskoeffizienten können von dem ^£/min-Wert, der vor und nach der Zugabe von Cysteinsulfinsäure beobachtet wird, die exakten Werte der enzymatischen GOT- und GPT-Einheiten, die in dem Serum vorhanden sind, durch nur einen Bestimmungsprozeß errechnet werden.
Beispiel 2
Screening-Methode zur Bestimmung der normalen und pathologischen Werte der GOT- und GPT-Aktivitäten
in Plasma oder Serum
Zu einem Reaktionsgemisch von 2,5 ml, das L-Alanin (200 mM), «-Ketoglutarsäure (2 mM), /7-NADH (03 mM), Cysteinsulfinsäure (7 mM) und 3,6 Einheiten Lactat-Hydrogenase in Tris-HCI-Puffer (50 mM), pH 8,5 enthält, wird 0,5 ml Serum oder Plasma zugesetzt. Die Extinktionsverminderung wird bei 340 nm (oder bei anderen Wellenlängen, z. B. 334 oder 365 nm entsprechend dem verwendeten Instrument) gemessen. In diesem Falle steht die Verminderung der Extinktion in direkter Beziehung zu dem Ausmaß der Transformation sowohl von Alanin als auch von Cysteinsulfinsäure zu Brenztraubensäure, die durch GPT und GOT bewirkt wird. Somit stellt die Verminderung der Extinktion ein Maß für die Summe der zwei enZym-äusc-hen Aktivitäten dar.
Die kinetischen Eigenschaften des Tests gestatten es, einen Grenzwert für z/E/min zwischen normalen und pathologischen Werten aufzustellen.
Durch geeignete Transformationskoeffizienten ist es im Falle von normalen Proben möglich, exakt die tatsächlichen enzymatischen Einheiten sowohl von GOT als auch GPT zu errechnen, während im Falle der pathologischen Proben diese Methode einen Irrtum von etwa 10 bis 15% enthält.

Claims (4)

Patentansprüche:
1. Kinetische UV-Methode zur Bestimmung von Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (GOT) und Glutamat-Pyruvat-Transaminase (GPT) in nur einem Probenansatz von Serum oder Plasma, dadurch g e kennzeichnet, daß man als spezifische Aminosäuresubstrate der obengenannten Transaminasen L-Cysteinsulfinsäure bzw. L-Alanin verwendet und daß man als anzeigendes Enzym für beide Transaminaseaktivitäten Lactat-Dehydrogenase verwendet
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die gesamten GOT- und GPT-Transaminaseaktivitäten dadurch bestimmt, daß man den Gesamt-^/ü/min-Wert bestimmt, wobei die zwei Aminosäuresubstrate seit dem Beginn in der Reaktionsumgebung vorhanden sind.
3. Verfahren nach Anspruch 1 zur Bestimmung der Einzelaktivitäten von GOT und GPT, dadurch gekennzeichnet, daß man den -dE/min-Wert zuerst in Gegenwart von L-Alanin als Substrat und hierauf die Erhöhung des 2/£7min-Werts nach der Zugabe von Cysteinsulfinsäure mißt
4. Dignostischer Satz zur Anzeige von normalen oder pathologischen Werten von GOT und GPT nach dem Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß er als Substratkomponenten Cysteinsulfinsäure und L-Alanin enthält
DE3026854A 1979-07-17 1980-07-16 Kinetische UV-Methode zur Bestimmung von Glutamat-Oxalacetat-Transaminase und Glutamat-Pyruvat-Transaminase Expired DE3026854C2 (de)

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