DE3123975A1 - Verfahren zur enzymatischen herstellung von l-carnitin - Google Patents

Verfahren zur enzymatischen herstellung von l-carnitin

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Description

Dr. Walter Nielsch
Patentanwalt
Slrlusweg 43,2000 Hamburg 65
Fernruf: 504165
Verfahren zur enzymatisehen Herstellung von L-Carnitin
Industrie Farmaceutiche Riunite S.p.A. 47, Viale Shakespeare, 1-00144 Rom (Italien)
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von !-Carnitin und genauer angegeben auf ein Verfahren zur enzymatischen Herstellung von L-Carnitin durch Umsetzen von 7" -Butyrobetain mit einem Hydroxylase-Enzym.
Es ist bekannt, daß Carnitin (ß-Hydroxy-^-trimethylaminobuttersäure) ein Asymmetriezentrum enthält und so zwei Stereoisomere, nämlich die D- und die L-Form von Carnitin existent sind.
!-Carnitin ist normalerweise im Körper anwesend, wo es die Puiiktion eines Trägers von aktivierten, langkettigen freien Fettsäuren, durch die mitochondriale Membran ausübt. Da die mitochondriale Membran undurchdringlich für Acyl-CoA-derivate ist, können langkettige freie Fettsäuren diese nur durchdringen, wenn eine Veresterung mit L-Carnitin stattgefunden hat. Die Trägerfunktion von L-Carnitin wird sowohl durch den Transport aktiver langkettiger Fettsäuren aus den Gebieten ihrer Biosynthese bewirkt, beispielsweise aus den MiIa?οsomen zu den Mitochondrien, wo sie oxidiert werden als auch durch Abtransport von Acetyl-CoA aus den I-iitochondrien, wo es gebildet wird, zu den extramitochondrialen Gebieten, v/o die Synthese der langkettigen Fettsäuren erfolgt, beispielsweise in den Mikrosomen, worin Acetyl-CoA für die Synthese von Cholesterin und Fettsäure verwendet werden kann.
Da das laevodrehende Isomere (L-Carnitin) ausschließlich die biologische Form darstellt (tatsächlich ist D-Carnitin niemals in Säugetiergeweben nachgewiesen v/orden), ist trotzdem bisher nur das DjL-Carnitin-Pvacemat seit einigen Jahren für verschiedene Indikationen verwendet worden. Beispielsweise wird D,L-Carnitin in Europa als ein Appetitstimulans verkauft. Ss ist berichtet worden.
daß dieses I-Iaterial einen Effekt auf die V/achstumsrate von Kindern ausübt (vgl. Borniche et al«, Clinic Chemica Acta 5, 171-176, 1960 und Alexander et al., "Protides in the Biological Fluids», 6th Colloquium, Brügges, 1958, 306-310). In der US-PS 3 830 931 werden Verbesserungen in der myocardialen Kontraktili- j tat und im systolischen Rhythmus bei Kongestion erzeugendem Herz- j versagen beschrieben, die häufig durch Verabreichung von D,L- ; Carnitin erhalten v/erden können. In der US-PS 3 810 994 ist die [ Verwendung von D,!-Carnitin zur Behandlung der Korpulenz be- j
schrieben.
Kürzlich wurde eine ansteigende Bedeutung bezüglich der Wichtigkeit in der exklusiven Verwendung des Carnitin-laevodrehenden-Isomeren für mindestens einige therapeutische Anwendungen weit verbreitet. Es wurde hierbei gezeigt, daß D-Carnitin ein konkurrierender Inhibitor der Carnitin-haltigen Enzyme, wie Carnitinacetyltransferase (CAT) und Carnitinpalmityltransferase (PTC) ist. In kürzlichem Beweismaterial wird festgestellt, daß D-Carnitin den L-Carnitinspiegel im Herzgewebe absenkt. Daraus ergibt sich, daß es notwendig ist, daß !-Carnitin ausschließlich an Patienten zur therapeutischen Behandlung von Herzerkrankungen oder zum Absenken der Blutlipide verabreicht wird.
Zahlreiche Verfahren sind zur Herstellung von Carnitin im industriellen Maßstab beschrieben worden. Die chemischen Synthesen von Carnitin führen unvermeidlich jedoch zu einem racemischen Gemisch der D- und !-Isomeren. Dementsprechend wurden entsprechende Auftrennungsmethoden entwickelt, um dadurch die separaten optischen Antipoden aus dem Racemat zu erhalten.
Eine typische Auftrennungsmethode, bei der D,L-Carnitinamid-Hydrochlorid als die Ausgangsverbindung für die Auftrennung verwendet wird, ist in der BE-PS 660 039 beschrieben. Bei diesem Verfahren wird D-Campfersäure zur Herstellung des D-Campforats des D,l-Carnitinamids eingesetzt. Eine alkoholische Lösung dieser Verbindung wird einer fraktionierten Kristallisation unterworfen, um das L-Isomere als die erste ausfallende Fraktion aus der Lösung
* * λ m mm* a*
|k » * β · Λ ii Λ Α«« Λ
- 5 abzuscheiden.
Um die Bildung des D-Campforates von D,L-Garnitinamid sicherzustellen, ist es zuerst erforderlich, mittels Ammoniak das Ammoniumsalz der D-Campfersäure herzustellen. Das so gebildete Ammonium-D-campforat wird dann durch Einwirkung von Silbernitrat in Silber-D-campforat überführt. Da das Carnitinamid sich in der Hydrochlorid-Salzform befindet, ist es zur Bildung dieses Silber salzes zwingend erforderlich, das Chloridion zu entfernen. Ein derartiges Verfahren ist daher sehr teuer (aufgrund der unerläßlichen Verwendung der Silberverbindung) und schwierig, im industriellen Maßstab ausgeführt zu werden, da die verschiedenen Verfahrens stufen unter Iiichtausschluß ausgeführt werden müssen, um eine deutliche Schwärzung der Reaktionsgefäße zu vermeiden, aufgrund der großen gebildeten Menge von Silberchlorid. Das D-Campf orat des D,Ii-Carnitinamids kann noch zusätzlich durch die Anwesenheit von Silberionen verunreinigt sein.
Ferner sind, nachdem das D-Campforat des L-Carnitinamids aus der alkoholischen Lösung auskristallisiert· wordeiV'istj; weitere Verarbeitungsstufen erforderliem^uanes gegebenenfalls' in Ir^Carnitin zu überführen.
Kürzlich-wurde ^a;;der .KE-QS 'ΨΤ 22. XQJ- ein enzymatasehes^^Verf ahren+ beschrieben:,:· bei .'demr I)-Garni;tin' exaiiMsiir-synthetisiert '-wird durch
mittels
Coenzym, welches bexider^ Dehydrogeiiäs'e- für die^HeSuktion, -wie eines Nicotinamid-adenindinucleotids (HADH) und eines chemischen oder .Emzymr-Reageriz.es,-.-verv/endeti.·wir"dy: welches zur Reduktion der /oxidierten .!Ρ.απη.-;#οϊΐ\ ΈΜΧ- in seine--refe^a^erte-form-1JTADH geeignet ist.-Die üaa?nitin-Dehydrog&nase; wird aus Bakterien aus dem Stamme Pseudpmonas, isoliert..-'". : ■■"-■-"' : ν v. :. -.■■ '
Ein derartiges .Verfahren, wie auch-einige'ändere Verfahren, die asymmetrische -:---'-~:~■■'■'■-' "■ - ■■ ■-■-■'-■-'■ - : ■" : -" "
in Hinsicht auf die Herstellung von Pharmazeutika auf der Verwendung von Bakterien beruhen, bringen zahlreiche Nachteile mit sich:
1. Die Enzymsysteme müssen mit entsprechenden aufwendigen Reinigungsverfahren unter hohen Kosten gereinigt v/erden, besonders wenn das Verfahren in einem industriellen Maßstab ausgeführt wird.
2. Ebenfalls würde für das hergestellte L-Carnitin eine sorgfältige Reinigung erforderlich sein, um es von bakteriellen Metaboliten und Verunreinigungen abzutrennen, die toxisch sein können und Gesundheitsschäden bewirken könnten.
Außerdem würde NADH (ein teurer Reaktionsteilnehmer) die Reaktion nicht stimulieren, wenn intakte Bakterien verwendet werden, da es nicht die Bakterienzellwand durchdringen kann.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Herstellung von exklusivem L-Carnitin, welches nicht auf der Verwendung von Bakterien als Quelle für das Enzymsystem, welches in dem Verfahren Verwendung findet, beruht.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Peststellung, daß die Sporen von Neurospora crassa ein Hydroxylase-Enzym besitzen, welches im Kontakt mit ^-Butyrobetain in einem Hydroxylgruppen liefernden Lösungsmittel in Gegenwart von Natrium-2-oxoglutarat, l?erroionen und einem Reduktionsmittel, selektiv ft^-Butyrobetain exklusiv und selektiv in substantiell reines !-Carnitin überführt.
^•Butyrobetain (CHz)5N-CH2-CH2-CH2-COOH ist eine bekannte Verbindung und sie kann leicht durch chemische Synthese hergestellt v/erden. Ein Verfahren zur Herstellung vonT^Butyrobetain ist beispielsweise in Can. J. Chem. 54, (1976) 3510-3311 beschrieben. Die Angaben dieses Aufsatzes sollen als Referenz Bestandteil dieser Beschreibung sein.
Es ist bekannt, daß die Hydroxylierung vonT^Butyrobetain in !-Carnitin im lebenden Organismus erfolgt. Die Forschung der letzten Jahre hat definitiv sichergestellt, daß der biosynthe tische lieg für Carnitin in folgender Weise erfolgt:
ι ->
H5N+-Ch2-CH2-CH2-CH2-CH-COO"
jS-Adenosylmethioninlysinmethyl-Transferase Lysin
NHz (Proteinbindung)
(CH3)jN+-CH2-CH2-CH2-CH2-CH-C00~ 6-N-Trimethyllysin
i +
-CH2-CH2-Ch2-CH-CH-COO" Trimethyl-3-hydroxylysin
(CH5J5N+-CH2-CH2-CH2-COO" 4-Trimethylaminobutyrat
ψ ( o^-Butyrob etain)
(CH5J5N+-CH2-CH-CH2-COO" Carnitin
OH
Die Hydroxylierung von^^Butyrobetain in !-Carnitin durch eine partiell gereinigte lösliche Proteinfraktion, isoliert aus der Rattenleber, ist bereits in Biochemistry, YoI. 6, No. 5 May, 1967S 1271-1282 beschrieben worden.
Es ist jedoch bisher nicht beschrieben worden, daß ein ^-Butyrobetain-Hydroxylase-Enzym in den Sporen von Neurospora crassa an- ■ ■wesend ist und daß dieses Hydroxylase-Enzym gewonnen werden kann, (um so für die^-Butyrobetain-TJmwandlung zur Verfügung zu stehen) s durch eine Behandlung der Sporen, durch die eine Modifikation ihrer Struktur bewirkt wird.
Gemäß der Erfindung basiert das Verfahren zur Herstellung von L-Carnitin auf der Umsetzung von ^"'-Butyr ob etain mit einem Ilydroxylase-Snzym und es ist dadurch gekennzeichnet, daß eine Phase, die die abgegebenen Produkte der Sporen der Art Neurospora crassa enthält, mit einer Lösung in einem Hydroxylgruppen abgebenden Lösungsmittel atis
a)2^-Butyrobetain;
b) iTatrium-2-oxoglutaratj
c) einem Reduktionsmittel; und
d) einer Perroioneiiquelle als Hydroxylierungskatalysator in Kontakt gebracht wird.
Die aus den Sporen abgegebene Produkte-enthältende-Phase wird entweder durch chemisch-physikalische Behandlung der Sporen mit einem Detergenz oder durch Unterwerfen der Sporen mit einer mechanischen Behandlung, z.B. mit einem Ultraschall-Desintegrator, erhalten.
Um die L-Carnitin-Ausbeute zu optimieren, wird vorzugsweise eine Lösung verwendet, die als weitere Komponente e) Katalase enthält.
Lösungsmittel
Das Lösungsmittel, worin ^-Butyr ob etain, Natrium-2-oxoglutarat,. das Reduktionsmittel und der Hydroxylierungskatalysator aufgelöst werden, wird aus der Gruppe, bestehend aus Y/asser, Pufferlösungen, niederen Alkanolen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und ihren Gemischen ausgewählt. Eine Kaliumphosphat-Pufferlösung von pH 7 ist das bevorzugte Lösungsmittel.
Reduktionsmittel
Das Reduktionsmittel zur Verwendung in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ist jeder Reduktor, der zum Reduzieren von Perriionen (Pe ) in Perroionen (Pe ) geeignet ist. Das Perroion wirkt als der Katalysator der Hydroxylierungsreaktion desT'-Butyrobetains durch das Bydroxylase-Enzym, welches in den Sporen von l'Teurospora crassa enthalten ist. Dementsprechend sollte jedes Perriion, welches gebildet werden kann, sofort wieder in den Oxidationszustand +2 zurückgebildet werden.
ITicht beschränkende Beispiele für geeignete Reduktionsmittel sind die Alkalimetalldithionite, Ascorbinsäure und deren Alkalimetallsalze .
Perro-Ionen-Quelle
Als eine Quelle für Perro-Ionen kann jedes wasserlösliche Perrosalz, dessen Anionenteil nicht die Hydroxylase-Enzymaktivität inaktiviert, verwendet werden.
Geeignete Perrosalze sind FeSO^9 (NH, ^Fe(SO, )2 und F
wobei die zuerst genannte Verbindung besonders bevorzugt wirdo
Sporen
Es können die Sporen jeden Stammes von Neurospora crassa vorteilhaft in dem Verfahren dieser Erfindung verwendet werden, hierbei werden die Stämme ATCC 9279, ATCC 13837 s ATCC 15514 und ATCC 24924 besonders bevorzugt.
Die Verfahren zum Züchten, Isolieren und Reinigen der Sporen von Neurospora crassa sind dem Fachmann auf dem mikrobiologischen Gebiet als geläufige Methoden bekannt.
Jedoch ist eines der bevorzugten Verfahren dasjenige,, welches von M. Cortat et al. in "Conidiation of Neurospora crassa in Submerged Culture without Mycelial Phase", Arch, Microbiol«, 95p 305-309 (1974) beschrieben worden ist.
Die so gezüchteten und isolierten Sporen können unbeschränkt gelagert werden ohne Verlust oder substantielle Herabsetzung ihrer Enzymaktivität.
Sporenbehandlung
Die Sporen werden entweder mit -einem Detergenz,, wie. TRITON X-100 oder mit mechanischen Vorrichtungen, vorzugsweise Ultraschall-Desintegratoren, behandelt. Diese Behandlungen trennen das Hydroxylierungs-Enzym ab und stellen eine Hydroxylierungs-Ensym-enthaltende-Phase zur Verfügung,, die die Reste der behan= delten Sporen enthält oder nicht mehr enthält und in dem Verfahren dieser Erfindung eingesetzt wird«,
Messung der ^-Butyrobetain-Hydroxylase-Aktivität Die ^-Butyrobetain-Hydroxylase-Aktivität wird in einem Reaktionsgefäß gemessen, das eine ausreichende Menge der Phase aufweist, die die abgegebenen Sporen-Modifikationsprodulcte enthält, damit eine Enzymkonzentration von etwa 5-30 ρ Mol/ml ^-Butyrobetain (2-14 mi-Ιοί), (NH, J2Pe(SO^)2 (0,6-2 mMol), Eatriumascorbinat (10-14 xnMol), Natrium~2-oxoglutarat (1,4-3 mMol), Katalase (1-1,4 g/l) in Kairumphosphatpuffer (14mMol) bei pH 7 vorliegt.
Fach 30-60 Minuten Inkubationszeit bei 37° C wird das Reaktionsgeraisch durch 0,7 MILLIPORE-Filter filtriert, um die Abtrennung der Sporen zu bewirken. Das Eiltrat wird zur Bestimmung von L-Carnitin analysiert nach dem Verfahren von David J. Pearson et al., "Methods of Enzymatic Analysis", YoI. 4, (2nd Edition), 1974, pag. 1758, Academic Press, Inc.
Die zu prüfende Probe wird gegen eine Eontrollprobe getestet, die die gleichen Komponenten mit der Ausnahme enthält, daß kein y'-Butyrobetain hinzugefügt wird.
Um jegliches, nicht umgesetzte ^Butyrobetain von L-Oarnitin abzutrennen, wird es bevorzugt, nach den Angaben von G-öran Lindstedt in Biochemistry, Vol. 6, Ho. 5, Hay 1967, pag. 1271-1282 zu arbeiten ■.
Aus den vorstehenden Ausführungen ist es ersichtlich, daß das ensymatische Verfahren der vorliegenden Erfindung gleichzeitig mehrere Vorteile aufweist im Vergleich zu den bisher bekannten Verfahren.
Einige dieser Vorteile werden nachstehend angegeben:
(1) Gegenüber den chemischen Verfahren der bekannten Art, (die wie schon vorstehend nachgewiesen worden ist, alle racemische Gemische von D- und L-Carnitin liefern), besitzt das Verfahren der vorliegenden Erfindung den Vorteil zur Herstellung
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von exklusiv substantiell reinem !-Carnitin in hoher Ausbeute (etwa 80%). Die Auftrennung des Racemats in die laevo« . drehende und dextrodrehende Form und die anschließende Umwandlung durch letzteren in D,!-Carnitin, die erneut eine Auftrennung erfordert, wird so total vermieden,,
(2) Bezüglich der bekannten enzymatisehen Verfahren., die auf der Verwendung von Bakterien als Quelle für das in dem Verfahren benutzte Enzym beruhen, besitzt das Verfahren der vorliegenden Erfindung den Vorteil, daß keine aufwendigen und teuren Reinigungsverfahren ausgeführt werden müssen, weder für das zu verwendende Enzym noch für das hergestellte. !-Carnitin,, Das Hydroxylase-Enzym benötigt keine Isolierung aus der Sporenpräparation, die sicher als solche benutzt werden kann und auch das hergestellte !-Carnitin wird in substantiell reinem, kristallisiertem Zustand erhalten» Umgekehrt wurden die enzymatischen Methoden, die auf der Verwendung von Bakterien beruhen, eine aufwendige Reinigung sowohl für das Enzym, als auch für das !-Carnitin erfordern, um eine Verunreinigung durch Bakterien und bakterielle Hetaboliten zu vermeideb.
(3) Die Heurospora crassa-Sporen können in großen Mengen hergestellt werden und in trockener Form aufbewahrt werden«, Sie können zu jedem gewünschten Zeitpunkt verwendet werden ohne einen signifikanten Verlust an Enzymalctivitäto

Claims (9)

  1. Dr. Walter Nielseh
    Patentanwalt
    Siriusweg 43,2000 Hamburg 65
    Fernruf: 504165 Patentanspruche:
    (Ί ./ Verfahren zur Herstellung von L-Carnitin durch Umsetzen von ^-Butyrobetain mit einem Hydroxyläse-Enzym, dadurch gekennzeichnet, daß eine Phase, die die abgegebenen Produkte der Sporen der Art Neurospora crassa enthält, mit einer Lösung in einem Hydroxylgruppen abgebenden lösungsmittel aus
    a) ^-Butyrobetain;
    b) Natrium-2-oxoglutarat;
    c) einem Reduktionsmittel; und
    d) einer Perroionenquelle als Hydroxylierungskatalysator in Kontakt gebracht wird.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,, daß die eingesetzte Lösung noch (e) Katalase enthält.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Lösungsmittel, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus V/asser, Pufferlösungen, niederen Alkanolen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder deren Gemischen eingesetzt wird.
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Reduktionsmittel, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Alkaliraetalldithionit, Ascorbinsäi;re und ihren Alkalimetallsalzen eingesetzt wird.
  5. 5. Verfahren nach.Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Perroionenquelle, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus ]?eSOA, (HH4)231e(SO4)2 und Fe(SCIi)2 eingesetzt wird.
  6. 6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Art ITeurospora crassa, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Stemmen ATCC 13837, ATCC 24914, ATCC 9279 und ATCC 155H eingesetzt wird.
  7. 7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die die abgegebenen Produkte der Sporen enthaltende Phase durch Behandlung der Sporen mit einem Detergenz erhalten wird.
  8. 8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß als
    Detergenz TRITON X-100 eingesetzt wird.
  9. 9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die die abgegebenen Produkte der Sporen enthaltende Phase durch mechanische Behandlung der Sporen mit einem Ultraschall-Desintegrator erhalten wird.
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