DE10218689A1 - ADH aus Rhodococcus erythropolis - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung befasst sich mit einer Alkoholdehydrogenase aus Rhodococcus erythropolis. DOLLAR A Mittels solcher cofaktorabhängigen ADHs lassen sich mit einem cofaktorregenerierenden Enzym in einem gekoppelten enzymatischen System vorteilhaft chirale Alkohole gewinnen, die für den Einsatz in der organischen Synthese von Nutzen sein können. DOLLAR A Eine Nukleotidsequenz, Vehikel diese aufweisend, eine Polypeptidsequenz und Verfahren zur Mutation sowie die Verwendung der Sequenzen sind beansprucht.

Description

• Die vorliegende Erfindung beschäftigt sich mit einer Alkoholdehydrogenase (ADH, RE-ADH) des Organismus Rhodococcus erythropolis. Gerichtet ist die Erfindung u. a. ebenfalls auf ein Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden mit Alkoholdehydrogenaseaktivität sowie deren Verwendung. Auch beansprucht wird ein spezieller Ganzzellkatalysator bzw. ein gekoppeltes enzymatisches Reaktionssystem.
• Die Gewinnung optisch aktiver organischer Verbindungen, z. B. Alkohole und α-Aminosäuren, auf biokatalytischem Wege gewinnt zunehmend an Bedeutung. Als ein Weg zur großtechnischen Synthese dieser Verbindungen hat sich der gekoppelte Einsatz zweier Dehydrogenasen unter Cofaktorregenerierung gezeigt (DE 197 53 350). Schema 1
  
  
• In situ Regeneration von NADH mit der NAD-abhängigen Formiatdehydrogenase bei der reduktiven Aminierung von Trimethylpyruvat zu L-tert-Leucin (Bommarius et al. Tetrahedron: Asymmetry 1995, 6, 2851-2888).
• Alkoholdehydrogenasen (ADHs) sind in diesem Zusammenhang ähnlich interessant, erlauben sie doch in einem gleichgelagerten gekoppelten enzymatischen System u. a. die Herstellung von enantiomer angereicherten Alkoholen ausgehend von Ketonen oder racemischen Alkoholen (DE 100 37 101; als aktuelle, umfassende Übersicht zum Stand der Technik, siehe: W. Hummel, Adv. Biochem. Engineering/Biotechnology 1997, 58, 145-184.)).
  
  
• ADHs werden in die Klasse E.C. 1.1.1.1 eingeteilt und gehören damit zu den sogenannten Oxidoreduktasen. Sie finden sich in einer Reihe von Organismen (Enzyme Catalysis in Organic Synthesis, Ed.: K. Drauz and H. Waldmann, 1995, VCH, Vol. II, 595ff). Interessant sind sogenannte "Breitband"-Enzyme, die stereoselektiv ein breites Spektrum an Substraten umsetzen.
• Kommerziell erhältlich für präparative Anwendungen im Labormaßstab sind bereits 3 verschiedene ADHs aus Hefe (YADH), aus Pferdeleber (HLADH) und aus Thermoanaerobium brockii (TBADH), die zur Herstellung von Alkoholen verwendet werden. Daneben gibt es noch weitere ADHs zu kaufen, die aber eher, wie der Name auch schon sagt, spezielle Substrate umsetzen, wie z. B. einige Steroid- Dehydrogenasen, die bevorzugt Alkohol-Gruppen an Steroid- Strukturen umsetzen oder Glycerol-Dehydrogenase, die Glycerin umsetzt oder letztlich auch mehrere Zuckerumsetzende Enzyme wie Glucose-DH.
• Die meisten der bislang bekannten literatur-bekannten ADHs sind "S-spezifisch" (wobei sich die Bezeichnung S und R aus formellen Gründen der Nomenklatur manchmal auch umkehren kann). Unseres Wissens nach sind dagegen die ADHs aus den Lactobacillus-Stämmen R-spezifisch (siehe C. W. Bradshaw, W. Hummel, C.-H. Wong, J. Org. Chem. 1992, 57, 1532.) sowie eine weitere literaturbekannte aus Pseudomonas (P. Hildebrandt, T. Riermeier, J. Altenbuchner, U. T. Bornscheuer, Tetrahedron: Asymmetry 2001, 12, 1207.), die von der Arbeitsgruppe Altenbuchner und Bornscheuer kürzlich beschrieben wurde. Der Arbeitskreis um Keinan und Lamed berichtete zudem über eine ADH aus Thermoanaerobium brockii (E. Keinan, E. K. Hafeli, K. K. Seth, R. Lamed, J. Am. Chem. Soc. 1986, 108, 162.) die für kleine Substrate eine(R)-Spezifität zeigt, für größere Substrate dagegen (S)-spezifisch ist.
• Bei den (S)-spezifischen Alkoholdehydrogenasen sind zwar eine Reihe von Vetretern bekannt, wobei deren technische Eignung zumeist sehr beschränkt ist. Dies dokumentieren nicht zuletzt die kaum vorhandenen industriellen Verfahren mit solchen Enzymen im Gegensatz zu der Vielzahl an bekannten ADHs. Die (S)-ADH aus Hefe ist ein NAD-abhängiges Enzym. Sie ist sehr preiswert, setzt aber im wesentlichen nur primäre Alkohole um (bzw. Aldehyde), so dass dieses Enzym für die Herstellung chiraler Alkohole wenig Bedeutung hat. Zudem ist dieses Enzym äußerst empfindlich und von hoher Instabilität gekennzeichnet, insb. im Hinblick auf organische Solventien. Die NAD-abhängige (S)-ADH aus Pferdeleber (HLADH) stellt zweifelsohne die bislang gerade im akademischen Bereich am häufigsten angewendete Alkoholdehydrogenase dar, wie die Vielzahl an Publikationen mit diesem Enzym verdeutlichen (siehe z. B. Übersicht in: K. Faber, Biotransformations in Organic Chemistry, 4. Ausgabe, Springer-Verlag, 2000, p. 184f.). Leider kommt dieses Enzym für eine technische Nutzung aufgrund der mangelnden Verfügbarkeit kaum in Frage. Zudem ist die (S)-ADH aus Pferdeleber sehr teuer (1 U ca. 0,5 Euro), und bisher nicht rekombinant verfügbar. Das Substratspektrum umfaßt zudem bevorzugt cyclische Ketone, sie setzt keine Ketone mit aromatischen Seitenketten um (Typ Acetophenon). Diese Substanzklasse der aromatischen Ketone besitzt aber gerade aus industrieller Sicht hohe Bedeutung aufgrund deren Vielzahl an Anwendungen als Schlüsselintermediate im pharmazeutischen Bereich (Für ausgewählte Beispiele, siehe: a) R. A. Holdt, S. R. Rigby (Zeneca Limited), US 5580764, 1996; b) T. J. Blacklock, P. Sohar, J. W. Butcher, T. Lamanec, E. J. J. Grabowski, J. Org. Chem. 1993, 58, 1672-1679; c) R. A. Holdt, Chimica Oggi - Chemistry Today 1996, 9, 17-20; d) F. Bracher, T. Litz, Arch. Pharm. 1994, 327, 591-593; e) S. Y. Sit, R. A. Parker, I. motoc, W. Han, N. Balasubramanian, J. Med. Chem. 1990, 33, 2982-2999; f) A. zaks, D. R. Dodds, Drug Discovery Today 1997, 2, 513-530). Die NADP-abhängige (NADP ist 5-10-fach teurer als NAD) ADH aus Bakterium Thermoanaerobium brockii (TBADH) ist hingegen rekombinant verfügbar. Ihr Substratspektrum beschränkt sich jedoch auf aliphatische Ketone. Es werden beispielsweise keine Ketone mit aromatischen Seitenketten (Typ Acetophenon) umgesetzt.
• Neben der Anwendung von isolierten Enzymen ist auch der Einsatz von Ganzzellkatalysatoren bekannt, die Alkoholdehydrogenasen beinhalten, wobei hier im Vergleich zur Anwendung mit isolierten Enzymen prinzipielle Nachteile auftreten. Diese Nachteile, die u. a. in K. Faber, Biotransformations in Organic Chemistry, 4. Ausgabe, Springer-Verlag, 2000, p. 193f beschrieben sind, umfassen niedrige Produktivitäten und Ausbeuten bei Mikroorganismenkatalysierten Umsetzungen im Vergleich mit isolierten Enzymen. Beispielsweise liegen die Reaktionszeiten beim Einsatz von Bäckerhefe, dem wohl populärsten eingesetzten Ganzzellbiokatalysator bei der Reaktion nicht selten im Bereich mehrerer Tage. Ein weiterer Nachteil liegt in der schwierigen Produktaufarbeitung (Abtrennung von der zugesetzten C-Quelle, Zellmasse und Nebenprodukten) sowie in der Problematik, dass in Zellen gewöhnlicherweise mehrere ADHs vorkommen, die zeitgleich wirken, oftmals mit dem Effekt unerwünschter Nebenreaktionen sowie verminderter Ausbeuten und Enantioselektivitäten des gewünschten Produkts. Dennoch sind einige Literaturbeispiele mit nativen Ganzzellkatalysatoren auch im größeren Maßstab bekannt, ohne dass jedoch solche Verfahren im Allgemeinen einen industriellen großen Maßstab (= Tonnenmaßstab) erreicht hätten. Beispielsweise beschreibt die Fa. Zeneca Life-Science (R. A. Holdt, S. R. Rigby (Zeneca Ltd.), US 5580764, 1996) die Umsetzung von Dihydro-6-methyl-4- thieno-thiopyran-4-on-7,7-dioxide zur entsprechenden 4- Hydroxy-Verbindung mit einer ADH aus Neurospora crassa (filamentöser Pilz), wobei das Enzym nicht isoliert wird, sondern - wie obig erwähnt - ganze Zellen eingesetzt werden.
• Bristol-Myers-Squib setzen 6-Benzyloxy-3,5-dioxo-hexanoatethylester zur entsprechenden 3,5-Dihydroxy-Verbindung um mit einem im Zellextrakt von Acinetobacter calcoaceticus (Bakterium) enthaltenen Enzym (R. N. Patel, C. G. McNamee, A. Banerjee, L. J. Szarka (E. R. Squibb & Sons), EP 569998, 1993). Weiterhin wurde die Umsetzung von 4-Chlor- 3-oxo-buttersäure-methylester zur entsprechenden 3-Hydroxy- Verbindung mit einer ADH aus Geotrichum candidum (Hefe) beschrieben (Patel, R. N., McNamee, C. G., Banerjee, A., Howell, J. M., Robinson, R. S., Szarka, L. J., Enzyme Microb. Technol. 1992, 14, 731).
• Eli Lilly veröffentlichten die Transformation von 3,4- Methylendioxyacetophenone zum entsprechenden Alkohol mit einer ADH aus Zygosaccharomyces rouxii (Hefe) (J. T. Vicenzi, M. J. Zmijewski, M. R. Reinhard, B. E. Landen, W. L. Muth, P. G. Marler, Enzyme Microb. Technol. 1997, 20, 494).
• Merck setzen ein Pyridin-Derivat mit Candida sorbophila (Hefe) um (Chartrain, M., Chung, J., Roberge, C. (Merck & Co., Inc.), US 5846791, 1998).
• In einer japanische Publikation wird die Reduktion von 4- Chlor-3-oxo-buttersäure-methylester mit ADH in einem rekombinanten Ganzzell-Katalysator beschrieben. In E. coli- Zellen sind eine geeignete ADH (nichtkommerzielle "Ketoreduktase") und ein Coenzym-regenerierendes Enzym zusammen kloniert (Kataoka, M., et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997, 48, 699; Kataoka, M., et al., Biosci., Biotechnol., Biochem. 1998, 62, 167).
• Bezüglich der (S)-spezifischen Enzyme ist aus der Anmeldung DE 42 09 022 eine (S)-ADH aus dem Organismus Rhodococcus erythropolis schon bekannt. Hierbei handelt es sich jedoch offensichtlich um ein enzymatisches System, welches wenig Hitzestabilität aufweist und nach Inkubation für 10 min bei 45°C ein Temperaturoptimum besitzt. Da die Hitzestabilität direkt gekoppelt ist mit der Operationsstabilität bzw. Lösungsmittelstabilität (Suzuki, Y., K. Oishi, H. Nakano and T. Nagayama. Appl. Microbiol. Biotechnol. 26: 546), kann für das dort dargestellte mesophile Enzym nur eine durchschnittliche Eignung für technische Prozesse erwartet werden.
• Offensichtlich besteht daher immer noch ein Bedarf an weiteren ggf. verbesserten ADHs, die in industriellen Synthesen einsetzbar sind. Aufgabe der vorliegenden Erfindung war daher die Angabe weiterer Alkoholdehydrogenasen (ADHs) bzw. die sie codierenden Nukleinsäuren mit ggf. gegenüber bekannten Enzymen verbesserten Eigenschaften. Insbesondere sollten die ADHs gut im technischen Maßstab zur Herstellung von enantiomer angereicherten Alkoholen eingesetzt werden können, so dass derartige Produktionsprozesse unter ökonomischen wie ökologischen Gesichtspunkten im kommerziellen Maßstab vorteilhaft durchgeführt werden können, was eine im Hinblick auf Selektivität, Stabilität und/oder Aktivität überdurchschnittliche ADH erforderlich macht.
• Diese Aufgabe wird anspruchsgemäß gelöst. Anspruch 1 bezieht sich auf spezielle Nukleinsäuren, Anspruch 2 auf die zugehörigen Polypeptide. Anspruch 3 und 4 richtet sich auf Primer und Vehikel für die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren. Anspruch 5 schützt ein Mutageneseverfahren mit dessen Hilfe verbesserte Polypeptide gewonnen werden können. Anspruch 6 betrifft die hieraus ableitbaren Polypeptide und Nukleinsäuresequenzen selbst. Ansprüche 7 und 8 richten sich auf die Verwendung der so hergestellten bzw. angegebenen Polypeptide und Nukleinsäuren, wohingegen Ansprüche 9 bis 11 auf spezielle Ganzzellkatalysatoren gerichtet sind. Schließlich umfassen Ansprüche 12 und 13 noch mit erfindungsgemäßen Enzymen modifizierte Reaktionssysteme. Anspruch 14 betrifft die Verwendung des erfindungsgemäßen Ganzzellkatalysators, wohingegen Anspruch 15 einen erfindungsgemäßen Vektor schützt. Ansprüche 16 und 17 richten sich dann wieder auf die Verwendung von bestimmten Vektoren.
• Dadurch, dass man eine isolierte Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid mit Alkoholdehydrogenaseaktivität codiert, ausgewählt aus der Gruppe:
  
• a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in Seq. ID NO: 1 dargestellten Sequenz,
• b) einer Nukleinsäuresequenz, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäuresequenz gemäß Seq. ID NO: 1 oder der dazu komplementären Sequenz hybridisiert,
• c) einer Nukleinsäuresequenz, die eine Homologie von mindestens 91% zur Seq. ID NO: 1 aufweist,
• d) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid codiert, welches mit der in Seq. ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenz mindestens 84% Homologie auf Aminosäureebene aufweist, ohne dass die Aktivität und/oder die Selektivität und/oder die Stabilität des Polypeptids verglichen mit dem Polypeptid der Seq. ID NO: 2 wesentlich reduziert ist,
• e) einer Nukleinsäuresequenz codierend für ein Polypeptid mit gegenüber dem Polypeptid der Seq. ID NO: 2 verbesserter Aktivität und/oder Selektivität und/oder Stabilität, hergestellt durch
  • a) Mutagenese der Seq. ID NO: 1,
  • b) Klonierung der aus i) erhältlichen Nukleinsäuresequenz in einen geeigneten Vektor mit anschließender Transformation in ein geeignetes Expressionsystem und
  • c) Detektion des massgeblichen Polypeptids mit verbesserter Aktivität und/oder Selektivität und/oder Stabilität,
zur Verfügung stellt, gelangt man in bevorzugter Art und Weise zu der Möglichkeit, die für einen enzymatischtechnischen Prozeß zur Erzeugung von enantiomerenangereicherten Verbindungen notwendigen Enzyme in ausreichender Menge über rekombinante Techniken herstellen zu können. Es ist mit den Nukleinsäuresequenzen möglich, die Polypeptide aus schnell wachsenden Wirtsorganismen in hohen Ausbeuten zu gewinnen. Neben einem ungewöhnlich breiten Substratspektrum sind die erfindungsgemäßen Polypeptide auch wider Erwarten hitzestabil.
• Sie setzen u. a. aliphatische und aromatische Ketone, Aldehyde und 2- bzw. 3-Ketoester um. Ungewöhnlich und unerwartet ist wie gesagt die Tatsache, dass die durch die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen codierten Polypeptide bei 65°C innerhalb von 15 min so gut wie keine Desaktivierung zeigen, obwohl sie ursprünglich einem Bakterium entstammen, dass selbst bei 37°C nicht mehr wächst, mithin also nicht thermophil ist. Neben dieser sehr hohen Hitzestabilität, mit der vorteilhafterweise eine hohe Operationsstabilität bzw. Lösungsmittelstabilität einhergeht (Suzuki, Y. et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. 26: 546 (s. o.)), unterscheidet sich das vorliegende Polypeptid und damit auch die dieses Enzym codierende Nukleinsäuresequenz von dem Enzym aus der DE 42 09 022 in Aufbau und Größe. Während die 4 Untereinheiten des gegenständlichen Polypeptids eine Molmasse von je 39 kDa (±2 kDa) aufweisen, besitzen die 2 Untereinheiten der DE 42 09 022 eine Molmasse von 72 kDa (±5).
• In der vorliegenden Erfindung werden neben den örginären Nukleinsäuresequenzen also auch solche beansprucht, die unter stringenten Bedingungen mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz oder deren Komplementär hybridisieren bzw. weitere, die durch geeignete Mutageneseverfahren verbessert wurden.
• Die Vorgehensweise zur Verbesserung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen bzw. der durch sie codierten Polypeptide durch Mutagenese-Methoden ist dem Fachmann hinlänglich bekannt. Als Mutagenese-Methoden kommen alle dem Fachmann für diesen Zweck zur Verfügung stehenden Methoden in Frage. Insbesondere sind dies die Sättigungsmutagenese, die Random-Mutagenesis, in vitro- Rekombinations-Methoden sowie Site-Directed-Mutagenesis (Eigen, M. und Gardiner, W., Evolutionary molecular engineering based on RNA replication, Pure Appl. Chem. 1984, 56, 967-978; Chen, K. und Arnold, F., Enzyme engineering for nonaqueous solvents: random mutagenesis to enhance activity of subtilisin E in polar organic media. Bio/Technology 1991, 9, 1073-1077; Horwitz, M. und Loeb, L., Promoters Selected From Random DNA-Sequences, Proc Natl Acad Sci USA 83, 1986, 7405-7409; Dube, D. und L. Loeb, Mutants Generated By The Insertion Of Random Oligonucleotides Into The Active-Site Of The Beta-Lactamase Gene, Biochemistry 1989, 28, 5703-5707; Stemmer, P. C., Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, Nature 1994, 370, 389-391 und Stemmer, P. C., DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution. Proc Natl Acad Sci USA 91, 1994, 10747-10751).
• Die erhaltenen neuen Nukleinsäuresequenzen werden nach den unten angegebenen Methoden in einen Wirtsorgansmus (Lit. s. u.) kloniert und die so exprimierten Polypeptide mit geeigneten Screening-Methoden detektiert und anschließend isoliert. Zur Detektion sind grundlegend alle möglichen Nachweisreaktionen für die mit diesem Polypeptid gebildeten Moleküle geeignet. Insbesondere dienen dazu photometrische Test über gebildetes oder verbrauchtes NADH, HPLC- oder GC- Methoden zum Nachweis der mit diesem Enzym gebildeten Alkohole. Zum Nachweis neuer durch gentechnische Methoden veränderter Polypeptide sind zudem auch gelelektrophoretische Nachweismethoden oder Nachweismethoden mittels Antikörpern geeignet.
• Wie gesagt sind von der Erfindung auch Nukleinsäuresequenzen mitumfasst, welche unter stringenten Bedingungen mit den erfindungsgemäßen einzelsträngigen Nukleinsäuresequenzen oder deren komplementären einzelsträngigen Nukleinsäuresequenzen hybridisieren. Als solche ist z. B. die Gensonde gemäß Seq. 13 oder die genannten Primer der Seq. 3-12 anzusehen.
• Der Ausdruck "unter stringenten Bedingungen" wird hierin wie bei Sambrook et al. (Sambrook, J.; Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) beschrieben, verstanden. Bevorzugt liegt eine stringente Hybridisierung gemäß der vorliegenden Erfindung vor, wenn nach Waschen für eine Stunde mit 1 × SSC (150 mM Natriumchlorid, 15 mM Natriumcitrat, pH 7.0) und 0,1% SDS (Natriumdodecylsulfat) bei 50°C, bevorzugt bei 55°C, mehr bevorzugt bei 62°C und am meisten bevorzugt bei 68°C und mehr bevorzugt für 1 Stunde mit 0,2 × SSC und 0,1% SDS bei 50°C, bevorzugter bei 55°C, mehr bevorzugt bei 62°C und am meisten bevorzugt bei 68°C noch ein positives Hybridisierungssignal beobachtet wird.
• Gegenstand der Anmeldung sind weiterhin die Polypeptide (Enzyme) ausgewählt aus der Gruppe
  
• a) der Polypeptide, codiert durch eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz,
• b) der Polypeptide aufweisend eine Sequenz gemäß Seq. ID NO: 2,
• c) der Polypeptide mit einer Homologie von mind. > 82% zum Polypeptid der Seq. ID NO: 2, ohne dass die Aktivität und/oder die Selektivität und/oder die Stabilität des Polypeptids verglichen mit dem Polypeptid der Seq. ID NO: 2 wesentlich reduziert ist.
• Die erfindungsgemäßen Polypeptide sind in technischen Prozessen aufgrund der schon angedeuteten Stabilität und dem breiten Substratspektrum sehr gut einzusetzen.
• In einer nächsten Ausgestaltung bezieht sich die Erfindung auf Plasmide oder Vektoren aufweisend eine oder mehrere der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen.
• Als Plasmide oder Vektoren kommen im Prinzip alle dem Fachmann für diesen Zweck zur Verfügung stehenden Ausführungsformen in Frage. Derartige Plasmide und Vektoren können z. B. von Studier und Mitarbeiter (Studier, W. F.; Rosenberg A. H.; Dunn J. J.; Dubendroff J. W.; , Use of the T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes, Methods Enzymol. 1990, 185, 61-89) oder den Broschüren der Firmen Novagen, Promega, New England Biolabs, Clontech oder Gibco BRL entnommen werden. Weiter bevorzugte Plasmide und Vektoren können gefunden werden in: Glover, D. M. (1985), DNA cloning: a practical approach, Vol. I-III, IRL Press Ltd., Oxford; Rodriguez, R. L. und Denhardt, D. T (eds) (1988), Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses, 179-204, Butterworth, Stoneham; Goeddel, D. V., Systems for heterologous gene expression, Methods Enzymol. 1990, 185, 3-7; Sambrook, J.; Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
• Plasmide, mit denen das die erfindungsgemäße Nukleinsäure aufweisende Genkonstrukt in ganz bevorzugter Weise in den Wirtsorganismus kloniert werden kann, sind: pUC18 (Roche Biochemicals), pKK-177-3H (Roche Biochemicals), pBTac2 (Roche Biochemicals), pKK223-3 (Amersham Pharmacia Biotech), pKK-233-3 (Stratagene) oder pET (Novagen), oder pKA1 (Fig. 1).
• Gleichfalls ist die Erfindung auf Mikroorganismen aufweisend eine oder mehrere erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen gerichtet.
• Der Mikroorganismus, in den die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen enthaltenen Plasmide kloniert werden, dient zur Vermehrung und Gewinnung einer ausreichenden Menge des rekombinanten Enzyms. Die Verfahren hierfür sind dem Fachmann wohlbekannt (Sambrook, J.; Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). Als Mikroorganismen können im Prinzip alle dem Fachmann für diesen Zweck in Frage kommenden Organismen wie z. B. Hefen wie Hansenula polymorpha, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Prokaryonten, wie E. coli, Bacillus subtilis oder Eukaryonten, wie Säugerzellen, Insektenzellen herangezogen werden. Vorzugsweise sind E. coli-Stämme für diesen Zweck zu benutzen. Ganz besonders bevorzugt sind: E. coli XL1 Blue, NM 522, JM101, JM109, JM105, RR1, DH5α, TOP 10^- oder HB101. Plasmide, mit denen das die erfindungsgemäße Nukleinsäure aufweisende Genkonstrukt vorzugsweise in den Wirtsorganismus kloniert wird, sind weiter oben angegeben.
• Ein folgender Aspekt der Erfindung richtet sich auf Primer zur Herstellung der erfindungsgemäßen Gensequenzen mittels aller Arten von PCR. Mitumfaßt sind die Sense- und Antisense-Primer codierend für die entsprechenden Aminosäuresequenzen, bzw. komplementären DNA-Sequenzen. Geeignete Primer können prinzipiell nach dem Fachmann bekannten Verfahren gewonnen werden. Das Auffinden der erfindungsgemäßen Primer erfolgt durch Vergleich mit bekannten DNA-Sequenzen oder durch Übersetzung der ins Auge gefaßten Aminosäuresequenzen in das bevorzugte Codon des betrachteten Organismus (z. B. für Streptomyces: Wright F. und Bibb M. J. (1992), Codon usage in the G + C-rich Streptomyces genome, Gene 113, 55-65). Gemeinsamkeiten in der Aminosäuresequenz von Proteinen von sogenannten Superfamilien sind hierfür ebenfalls von Nutzen (Firestine, S. M.; Nixon, A. E.; Benkovic, S. J. (1996), Threading your way to protein function, Chem. Biol. 3, 779-783). Weitere Informationen diesbezüglich können gefunden werden in Gait, M. J. (1984), Oligonucleotide synthesis: a practical approach, IRL Press Ltd., Oxford; Innis, M. A.; Gelfound, D. H.; Sninsky, J. J. und White, T. J. (1990), PCR Protocols: A guide to methods and applications, Academic Press Inc., San Diego. Äußerst bevorzugt sind folgende Primer:
  5'-Primer: ATG AAG GCG(C) ATC CAG TAG ACG(C) CGG(C) ATC (Seq. 3)
  3'-Primer: GCC GGT ACC AAT(C) GAC(G) AAC(G) CGC GTA (Seq. 4)
  5'-Primer: ATC CAG TAC ACG CGC ATC GGC GCG GAA (Seq. 5)
  3'-Primer: GCC TCC GCG AAG TTT CGG CAG AGA ACG (Seq. 6)
  5'-Primer: GCG GAA TTC ATG AAG GCA ATC CAG TAC ACG (Seq. 7)
  3'-Primer: CGC AAG CTT CTA CAG ACC AGG GAC CAC AAC (Seq. 8)
  5'-Primer: GAG GTC GGT CAT ATG AAG GCA ATC CAG TAC ACG CGT ATC GGC (Seq. 9)
  3'-Primer: CGC GGA TCC CTA CAG ACC AGG GAC CAC AAC (Seq. 10)
  5'-Primer: GGT GAA TTC ATG AAG GCA ATC CAG TAC ACG CGT ATC GGC (Seq. 11)
  3'-Primer: CGC AAG CTT CTA GTG GTG GTG GTG GTG GTG CAG ACC AGG GAC (Seq. 12)
• In einer weiteren Ausgestaltung bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung von verbesserten rec-Polypeptiden mit Alkoholdehydrogenaseaktivität ausgehend von erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen, wobei folgendes Protokoll angewandt wird:
  
• a) die Nukleinsäuresequenzen werden einer Mutagenese unterworfen,
• b) die aus a) erhältlichen Nukleinsäuresequenzen werden in einen geeigneten Vektor kloniert und dieser dann in ein geeignetes Expressionsystem transferiert und
• c) die gebildeten Polypeptide mit verbesserter Aktivität und/oder Selektivität und/oder Stabilität werden detektiert und isoliert.
• Ebenfalls einen Gegenstand der Erfindung bilden rec- Polypeptide oder diese codierende Nukleinsäuresequenzen, welche nach einem wie eben beschriebenen Verfahren erhältlich sind.
• Die Herstellung der zur Erzeugung der verbesserten rec- Polypeptide benötigten Nukleinsäuresequenzen und deren Expression in Wirten ist weiter unten angesprochen und gilt hier entsprechend.
• Die erfindungsgemäßen Polypeptide und rec-Polypeptide werden vorzugsweise zur Herstellung von chiralen enantiomerenangereicherten organischen Verbindungen, wie z. B. sec-Alkoholen mit einem stereogenen Zentrum verwendet.
• Überraschenderweise zeigen sich dabei neuartige und von bisherig bekannten Alkoholdehydrogenasen, z. B. ADHs aus R. erythropolis, deutlich abweichende biochemische Eigenschaften, insbesondere im Hinblick auch auf das Substratmuster, als auch auf die erzielte Enantioselektivität. Die neue ADH zeigt sich als besonders geeignet zur Herstellung aromatischer sekundärer Alkohole, was gerade angesichts der kommerziellen Bedeutung dieser Substanzklasse zu einer hohen industriellen Attraktivität der neuen ADH führt.
• Im nachfolgenden seien insbesondere die Unterschiede und Vorteile im Vergleich mit den bisherigen ADHs aus R. erythropolis beschrieben.
• Die nun beanspruchte Alkoholdehydrogenase aus R. erythropolis weist dabei signifikante Unterschiede im Vergleich zu den früheren ADHs (beschrieben beispielsweise in DE 42 09 022, 1991, J. Peters et al., J. Biotechnol. 1994, 33, 283 und J. Peters, Dissertation, Univ. Düsseldorf, 1993), die entweder direkt aus dem Rohextrakt oder partiell aufgereinigt verwendet wurden, auf. Diese Unterschiede betreffen - wie obig erwähnt - sowohl physikalische Eigenschaften, wie Struktur, Thermostabilität und Stabilität in organischen Medien, als auch biochemische Eigenschaften, insb. bezüglich der Substratakzeptanz.
• Die signifikantesten Unterschiede der "neuen" ADH aus R. erythropolis im Vergleich zu den obig erwähnten, bereits bekannten ADHs (= Stand der Technik) sind bezüglich der biochemischen Charakteristika (Substratakzeptanz) nachfolgend beschrieben. In den folgenden Tabellen ist dies anhand einiger exemplarischer Beispiele zudem graphisch verdeutlicht. Dazu wurde - wie üblich - jeweils die gemessene Aktivität für eine Verbindung als 100% gesetzt und die Aktivität(en) der anderen Verbindung(en) in Relation dazu ermittelt. Aus den relativen Aktivitäten im Vergleich mit anderen Substraten lässt sich dann erkennen, ob ein solches anderes Substrat dann für die jeweilige Alkoholdehydrogenase besser oder schlechter akzeptiert wird.
• Ein erstes signifikantes Beispiel ist anbei in Tabelle 1 gezeigt. Dabei wurde die jeweils gemessene Aktivität für p- Methylacetophenon als 100% gesetzt. Überraschenderweise zeigt sich dabei, dass die neue ADH für das Substrat p- Chloracetophenon zu einer deutlich verbesserten Akzeptanz führt mit einer relativen Aktivität von 189%. Im Gegensatz dazu wurde für die frühere ADH (beschrieben in DE 42 09 022, 1991) eine verminderte Aktivität im Vergleich zu p- Methylacetophenon von lediglich 81% ermittelt. Tab. 1
  
  
• Ein weiterer interessanter Vergleich ist in Tabelle 2 gezeigt. Hier sind die relativen Aktivitäten auf p- Fluoracetophenon bezogen. Dabei zeigt sich, dass die neue ADH das Substrat p-Methoxyacetophenon bevorzugt akzeptiert (rel. Aktivität: 195%), während der gegenläufige Effekt für die bereits bekannte ADH (gemäß DE 42 09 022, 1991) beobachtet wird (rel. Aktivität von nur 90% für p- Methoxyacetophenon verglichen mit 100% für p- Fluoracetophenon). Tab. 2
  
  
• Signifikante Unterschiede sind aber nicht nur auf den Bereich unterschiedlich substituierter aromatischer Ketone beschränkt, sondern finden sich auch gerade im generellen Vergleich zu alipatischen β-Ketoestern wieder (Tabelle 3). So werden aliphatische β-Ketoethylester von der bereits bekannten Form der ADH (aus J. Peters, Dissertation, 1993) weitaus besser akzeptiert als p-Chloracetophenon als Verteter der aromatischen Ketone (250% vs. 100%). Selbst das deutlich schlechter akzeptierte Ketoestersubstrat Acetessigsäuremethylester weist eine gleiche Aktivität wie p-Chloracetophenon auf. Der gegenläufige Trend zeigt sich für die neue Form der ADH: Hier besitzt im Vergleich zum Methylester das p-Chloracetophenon eine mehr als 9-fache Aktivität (909% vs. 100%). Selbst im Vergleich mit dem β- Ketoethylester weist p-Chloracetophenon beim Einsatz der neuen ADH eine höhere Aktivität auf (909% vs. 773%). Somit belegen auch diese Beispiele die signifikante qualitative Änderung der Substratakzeptanz beim Vergleich der neuen ADH mit den bereits bekannten ADHs gemäß J. Peters, Dissertation, Universität Düsseldorf, 1993. Tab. 3
  
  
• Abschließend sei erwähnt, dass signifikante qualitative Unterschiede bezüglich der Substratakzeptanz auch gefunden werden bei anders funktionalisierten Ketonen. Dies zeigt beispielsweise der Vergleich von reinen langkettigen Alkylketonen mit Phenoxyaceton als Vertreter eines heteroatomsubstituierten Dialkylketons (Tabelle 4). Tab. 4
  
  
• So zeigt das Substratmuster für die bekannte Form der ADH aus J. Peters, Dissertation, 1993 eindeutig eine Präferenz für die langkettigen Alkylketone. Sowohl für 2-Heptanon (100%) als auch 2-Decanon (79%) wurden höhere Aktivitäten ermittelt verglichen mit Phenoxyaceton (71%). Ein völlig konträres Substratmuster zeigt dagegen die neue ADH. Hier wird für Phenoxyaceton die mit Abstand höchste Aktivität von 126% ermittelt, wohingegen die Alkylketone deutlich niedrigere Aktivitäten besitzen (100% und 76%). Der Trend innerhalb der 2-Alkylketone mit einer Präferenz für C7- Ketone verglichen mit C10-Ketonen ist allerdings bei sämtlichen ADHs wiederum ähnlich, wie die generell höheren Aktivitäten von 2-Heptanon im Vergleich mit 2-Decanon dokumentieren.
• Zusammenfassend konnte somit interessanterweise mit dieser neuen ADH ein Biokatalysator gefunden werden, der veränderte, teilweise sogar komplementäre Eigenschaften aufzeigt verglichen mit den früheren ADHs, z. B. aus R. erythropolis, die entweder direkt aus dem Rohextrakt oder partiell aufgereinigt verwendet wurden. Diese signifikanten Unterschiede eröffnen neue interessante Anwendungsfelder und dokumentieren zugleich die Neuartigkeit dieses neuen Biokatalysators. Somit weisen die ADHs der früheren, aus Rohextrakt stammenden bzw. partiell gereinigten ADHs aus R. erythropolis deutlich andere Eigenschaften bezüglich ihrer biochemischen Eigenschaften auf, als die "neue" ADH, die einen sowohl neuen, als auch verbesserten Bio-Katalysator darstellt. Insbesondere sind deutliche Vorteile erkennbar für die Herstellung der industriell hochinteressanten Substanzklasse der optisch aktiven aromatischen Alkohole.
• Weiterhin eigenen sich die erfindungsgemäßen und darüber hinaus weiter verbesserten Nukleinsäuresequenzen, die für die betrachteten Polypeptide codieren, bevorzugt zur Herstellung von Ganzzellkatalysatoren. Die prinzipielle Herstellung solcher Biokatalysatoren ist weiter unten angesprochen und dem Fachmann hinlänglich geläufig.
• Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ein Ganzzellkatalysator aufweisend ein kloniertes Gen für eine NADH- abhängige Alkoholdehydrogenase und ein kloniertes Gen für ein Enzym, das zur Regenerierung von NADH geeignet ist, insbesondere eine Formiatdehydrogenase oder ein NAD- regenerierendes Enzym wie die NADH-Oxidase.
• Der weiter bevorzugte Ganzzellkatalysator zeichnet sich dahingehend aus, dass es sich bei der Alkoholdehydrogenase um eine aus R. erythropolis, insbesondere die erfindungsgemäße aus DSM 43297 handelt.
• Im Falle des Vorliegens einer Formiatdehydrogenase im Ganzellkatalysator sollte diese sich von der Formiatdehydrogenase aus Candida boidinii und bei Vorliegen einer NADH-Oxidase von der NADH-Oxidase aus Lactobacillus brevis ableiten. Vorzugsweise wird ein Organismus wie in der DE 101 55 928 genannt als Wirtsorganismus eingesetzt. Der Vorteil eines derartigen Organismus ist die gleichzeitige Expression beider Polypeptidsysteme, womit nur noch ein rec-Organismus für die Reaktion angezogen werden muß. Um die Expression der Polypeptide im Hinblick auf ihre Umsetzungsgeschwindigkeiten abzustimmen, können die entsprechend codierenden Nukleinsäuresequenzen auf unterschiedlichen Plasmiden mit unterschiedlichen Kopienzahlen untergebracht werden und/oder unterschiedlich starke Promotoren für eine unterschiedlich starke Expression der Nukleinsäuresequenzen verwendet werden. Bei derart abgestimmten Enzymsystemen tritt vorteilhafterweise eine Akkumulation einer ggf. inhibierend wirkenden Zwischenverbindung nicht auf und die betrachtete Reaktion kann in einer optimalen Gesamtgeschwindigkeit ablaufen. Dies ist dem Fachmann jedoch hinlänglich bekannt (Gellissen, G.; Piontek, M.; Dahlems, U.; Jenzelewski, V.; Gavagan, J. W.; DiCosimo, R.; Anton, D. L.; Janowicz, Z. A. (1996), Recombinant Hansenula polymorpha as a biocatalyst. Coexpression of the spinach glycolate oxidase (GO) and the S. cerevisiae catalase T (CTT1) gene, Appl. Microbiol. Biotechnol. 46, 46-54; Farwick, M.; London, M.; Dohmen, J.; Dahlems, U.; Gellissen, G.; Strasser, A. W.; DE 199 20 712).
• Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung in einem nächsten Aspekt ein gekoppeltes enzymatisches Reaktionssystem aufweisend eine cofaktorabhängige enzymatische Transformation einer organischen Verbindung mit einem erfindungsgemäßen Polypeptid und eine enzymatische Regeneration des Cofaktors.
• Die enzymatische Regeneration des Cofaktors sollte vorteilhafterweise mit der von der Formiatdehydrogenase aus Candida boidinii abgeleiteten Formiatdehydrogenase oder einer von der NADH-Oxidase aus Lactobacillus brevis abgeleiteten NADH-Oxidase durchgeführt werden. Als Reaktionssystem kann jedes Gefäß verstanden werden, in dem die erfindungsgemäße Reaktion durchgeführt werden kann, also Reaktoren jeder Art (Schlaufenreaktor, Rührkessel, Enzymmembranreaktor etc.), oder Diagnosekits in jedweder Form.
• Bei Verwendung einer Formiatdehydrogenase erfolgt die Cofaktor-Regenerierung unter Einsatz von Ameisensäure bzw. deren Salze als Reduktionsmittel. Alternativ können aber auch andere enzymatische oder substrat-basierende cofaktoregenerierenden Systeme eingesetzt werden.
• Ein abschließende Verwendung der erfindungsgemäßen Alkoholdehydrogenase bzw. des erfindungsgemäßen Ganzellkatalysators betrifft deren Einsatz in einem Verfahren zur asymmetrischen Reduktion von Ketonen. Für die Umsetzung der Ketone eignen sich wäßrige, gepufferte Lösungen.
• Die Reaktionen werden im typisch für enzymatische Reaktionen liegenden pH-Bereich durchgeführt, wobei pH- Werte zwischen 4 und 9, insbesondere zwischen 5.5. und 7.5 sich als besonders geeignet erwiesen haben.
• Die Reaktionstemperaturen für die reduktiven Umsetzungen liegen vorzugsweise im Bereich zwischen 15 und 65°C, insbesondere zwischen 20 und 40°C.
• Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen lassen sich also vorzugsweise zur Herstellung von rec-Polypeptiden einsetzen. Durch rekombinante Techniken, die dem Fachmann hinlänglich bekannt sind, gelangt man zu Organismen, welche in der Lage sind, das betrachtete Polypeptid in für einen technischen Prozeß ausreichender Menge zur Verfügung zu stellen. Die Herstellung der erfindungsgemäßen rec- Polypeptide erfolgt nach dem Fachmann bekannten gentechnologischen Verfahren (Sambrook, J.; Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; Balbas, P. und Bolivar, F. (1990), Design and construction of expression plasmid vectors in E. coli, Methods Enzymol. 185, 14-37; Rodriguez, R. L. und Denhardt, D. T (eds) (1988), Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses, 205-225, Butterworth, Stoneham). Bezüglich der allgemeinen Vorgehensweise (PCR, Klonierung, Expression etc.) sei auch auf folgende Literatur und das dort zitierte verwiesen: Universal GenomeWalker™ Kit User Manual, Clontech, 3/2000 und dort zitierte Literatur; Triglia T.; Peterson, M. G. und Kemp, D. J. (1988), A procedure for in vitro amplification of DNA segments that lie outside the boundaries of known sequences, Nucleic Acids Res. 16, 8186; Sambrook, J.; Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; Rodriguez, R. L. und Denhardt, D. T (eds) (1988), Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses, Butterworth, Stoneham.
• Für die Anwendung kann das betrachtete Polypeptid in freier Form als homogen aufgereinigte Verbindungen oder als rekombinant hergestelltes Enzym verwendet werden. Weiterhin kann das Polypeptid auch als Bestandteil eines intakten Gastorganismus eingesetzt werden oder in Verbindung mit der aufgeschlossenen und beliebig hoch aufgereinigten Zellmasse des Wirtsorganismus.
• Möglich ist ebenfalls die Verwendung der Enzyme in immobilisierter Form (Sharma B. P.; Bailey L. F. und Messing R. A. (1982), Immobilisierte Biomaterialien - Techniken und Anwendungen, Angew. Chem. 94, 836-852). Vorteilhafterweise erfolgt die Immobilisierung durch Lyophilisation (Paradkar, V. M.; Dordick, J. S. (1994), Aqueous-Like Activity of α-Chymotrypsin Dissolved in Nearly Anhydrous Organic Solvents, J. Am. Chem. Soc. 116, 5009-5010; Mori, T.; Okahata, Y. (1997), A variety of lipicoated glycoside hydrolases as effective glycosyl transfer catalysts in homogeneous organic solvents, Tetrahedron Lett. 38, 1971-1974; Otamiri, M.; Adlercreutz, P.,; Matthiasson, B. (1992), Complex formation between chymotrypsin and ethyl cellulose as a means to solubilize the enzyme in active form in toluene, Biocatalysis 6, 291-305). Ganz besonders bevorzugt ist die Lyophilisation in Gegenwart von oberflächenaktiven Substanzen, wie Aerosol OT oder Polyvinylpyrrolidon oder Polyethylenglycol (PEG) oder Brij 52 (Diethylenglycol-mono-cetylether) (Kamiya, N.; Okazaki, S.-Y.; Goto, M. (1997), Surfactant-horseradish peroxidase complex catalytically active in anhydrous benzene, Biotechnol. Tech. 11, 375-378).
• Äußerst bevorzugt ist die Immobilisierung an Eupergit® insbesondere Eupergit C® und Eupergit 250L® (Röhm) (als Übersicht, siehe: E. Katchalski-Katzir, D. M. Kraemer, J. Mol. Catal. B: Enzym. 2000, 10, 157). Gleichfalls bevorzugt ist die Immobilisierung an Ni-NTA in Kombination mit dem durch Anhängen eines His-Tags (Hexa-Histidin) veränderten Polypeptid (Petty, K. J. (1996), Metal-chelate affinity chromatography In: Ausubel, F. M. et al. eds. Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, New York: John Wiley and Sons).
• Die Verwendung als CLECs ist ebenfalls denkbar (St. Clair, N.; Wang, Y.-F.; Margolin, A. L. (2000), Cofactor-bound cross-linked enzyme crystals (CLEC) of alcohol dehydrogenase, Angew. Chem. Int. Ed. 39, 380-383).
• Durch diese Maßnahmen kann es gelingen, aus Polypeptiden, welche durch organische Solventien instabil werden, solche zu generieren, die in Gemischen von wässrigen und organischen Lösungsmitteln bzw. ganz in Organik arbeiten können.
• In einer abschließenden Ausgestaltung beschäftigt sich die vorliegende Erfindung mit der Verwendung von Vektoren hergestellt aus "high copy number"-Vektoren (A) und "moderate copy number"-Vektoren (B) zur Herstellung von zur Bildung von Inclusionbodies neigenden rekombinanten Proteinen, wobei zumindest der Replikation Origin vom Vektor (B) und zumindest die Klonierungs- und Expressionselemente vom Vektor (A) genommen werden.
• Vorzugsweise wird als Vektor (A) der pET11a und als Vektor (B) der pACYC184 herangezogen. Der Vektor pAK1 ist ein solcher Prototyp. Dieser Vektor setzt sich wie gesagt zusammen aus einem Segment des "high copy number"-Vektors pET11a der Firma Novogen mit dem Replikations Origin ColE1 und dem "moderate copy number"-Vektor pACYC184 mit Replikations-Origin p15A. pET11a enthält das Ampicillin (AMP)-Gen als Selektionsmarker, pACYC184 enthält zwei Selektionsmarker, Chloramphenicol (CAM) und Tetracyclin (TET). Durch die Ligation des pET11a-Fragments in den pACYC184 wurde neben den Selektionsmarkern auch dessen T7- Promotor, lacI-Gen und die MCS (Multiple Cloning Side; Polylinker) in pACYC184 eingeführt.
• Bei Verwendung des erfindungsgemäß hergestellten Vektors pKA1 zur rekombinanten Herstellung der erfindungsgemäßen ADH aus E. coli erhält man eine ADH-Aktivität von ca. 70 U/mg im Rohextrakt, wohingegen man mit dem "high copy number"-Plasmid pKK223-3 von Amersham nur ca. 6 U/mg Aktivität und einen großen Anteil an unlöslichen Inclusionbodies erhält.
• Zur Herstellung der erfindungsgemäßen nativen Polypetide werden geerntete Zellen von R, erythropolis durch Vermahlen in einer Glasperlenmühle aufgeschlossen und die festen Bestandteile per Zentrifugation abgetrennt. Nach Aufreinigung des zellfreien Überstands der Zentrifugation über Anionenaustauschchromatographie und an Phenylsepharose, bei der die Aktivität der Fraktionen stetig getestet wird, erhält man eine Polypeptidfraktion, welche eine Aminosäuresequenzierung zuläßt. Die ermittelte Anfangssequenz sowie die durch Vergleich der bekannten ADHs gewonnenen konservativen Motive dienen zur Konstruktion von degenierten Primern (Seq. 3 und 4), mit deren Hilfe per PCR ein 500 bp großes Fragment erhalten werden kann. Mit diesem Fragment wird eine Gensonde (Seq. 13) mit den homologen Primern (Seq. 5 und 6) hergestellt.
• Nukleotidsequenz der Sonde (Seq. 13)
  
  
  
• Genomische DNA aus R. erythropolis wird dann mit EcoRI geschnitten und nach Auftrennung der Fragmente mittels Gelelektrophorese und Blotten mit der Sonde hybridisiert. Der Nachweis der Hybridisierung zeigte ein sehr spezifisches Signal bei 5,2 kb. Dies deutete darauf hin, daß das gesuchte Gen auf einem 5,2 kb großen EcoRI Fragment liegt.
• Um die komplette Gensequenz zu bekommen, wurde genomische DNA von R. erythropolis erneut mit EcoRT verdaut, DNA Fragmente mit einer Größe zwischen 5 und 6 kb isoliert und in den pUC18 Klonierungsvektor kloniert. Das entstandene Plasmid pRE-ADH wurde in E. coli XL1 Blue transformiert und die Klone mit Hilfe der homologen Primer über PCR gescreent.
• Die Gesamtsequenz des Gens für die ADH kann anschließend mithilfe homologer Primer ermittelt werden.
• Das native Polypeptid aus R. erythropolis ist von tetrameren Aufbau und hat ein Molekulargewicht von 36,206 kDa pro Untereinheit. Aufgrund der ermittelten Aminosäurensequenz gehört die Alkohol-Dehydrogenase aus R. erythropolis (RE-ADH) offensichtlich zur Gruppe der mediumchain Dehydrogenasen. Dafür sprechen die hohen Homologien zu Enzymen dieser Gruppe und das Vorhandensein einer typischen Zink-Bindungsstelle ("Zinkfinger"). Die Vertreter dieser Dehydrogenasen-Klasse sind in ihren Eigenschaften in Bezug auf die am besten untersuchte ADH aus Pferdeleber definiert worden. Innerhalb dieser Gruppe sind inzwischen eine Vielzahl von Enzymen unterschiedlicher katalytischer Eigenschaften bekannt.
• Eine Suche in der Datenbank "Genbank" mit dem Suchalgorithmen BlastNT und EMBL über das Internet ergab eine starke Homologie der RE-ADH mit anderen Zink-haltigen Alkoholdehydrogenasen, sowohl long- als auch medium-chain ADHs. Die höchste Homologie ergab sich zu einer Phenylacetaldehyd-Reduktase aus Corynebacterium sp. ST-10. Ein Vergleich beider Gene ergab die in Fig. 3 dargestellten Übereinstimmungen.
  
  
• Der Vergleich der Gen-Sequenz der Alkohol-Dehydrogenase aus R. erythropolis mit dem stark homologen Gen der Phenylacetaldehyd-Reduktase aus Corynebacterium sp. ST-10 (Fig. 3) zeigt in der oberen Reihe jeweils die Basensequenz der RE-ADH, in der unteren diejeinge aus Corynebacterium. Übereinstimmende Basen sind mit einem Strich gekennzeichnet.
• Die beiden Polypeptide zeigen in ihrer Proteinsequenz eine Übereinstimmung über das gesamte Gen über 316 Aminosäuren (82%). Die Übereinstimmung ist sogar noch höher, wenn man bestimmte Bereiche vergleicht. N-terminal findet man in der Aminosäure-Sequenz 100% Übereinstimmung bis zu der Aminosäure, die durch das Codon 946-948 determiniert wird. Danach findet man, ausgehend von der Corynebacterium- Sequenz, bei Rhodococcus eine Deletion, die ab dieser Position zu einem Frameshift und damit zu einer anderen Aminosäure-Sequenz führt. Übersetzt man die Gensequenz in die entsprechende Aminosäure-Sequenz, findet man, vom N- Terminus beginnend, daß Aminosäuren 1-316 in beiden Polypeptide absolut identisch sind, danach durch den Gen- Frameshift bedingt, vollkommen unterschiedlich. Es sei diesbezüglich auch auf Beispiel 4 dieser Schrift verwiesen.
• Die Transformation und Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz in E. coli erfolgte durch Klonierung des ADH-Gens in den Vektor pKK223-3 von Amersham Pharmacia Biotech. Für eine bessere Expressionsrate wurde das Codon AGA für die Aminosäure Arginin in Position 8 in das ebenfalls für Arginin codierende CGT geändert. Gleichzeitig wurde ein neuer Vektor (pKA1 - Fig. 1) generiert, welcher nach Ligation des ADH-Gens in den Vektor in E. coli BL21 (DE3)transformiert wurde. Im zellfreien Rohextrakt zeigte sich eine Aktivität in Bezug auf die Umsetzung mit p-Cl- Acetophenon von 70 U/mg. Im Vergleich dazu beträgt die Aktivität im Rohextrakt von R. erythropolis mit p-Cl- Acetophenon ca. 2,5 U/mg.
• Der schon angesprochene vorteilhafte Aspekt bzw. Unterschied in Bezug auf die Verbesserung der Stabilität im Vergleich zu den bisherigen bekannten Alkoholdehydrogenasen aus R. erythropolis ist in Tabelle 5 und nachfolgender Fig. 4 zusammengefasst. Zum besseren Vergleich wurde die jeweilige bei 45°C gemessene Enzymaktivität als 100% gesetzt.
• Hierbei wurden für die hochreine, neue Alkoholdehydrogenase hohe Hitzestabilitäten erzielt in einem breiten Temperaturbereich von bis zu 65°C. Die Stabilitätswerte liegen hier bei 100 bis 105°C. Dagegen wurde mit den bislang bekannten Alkoholdehydrogenasen aus R. erythropolis eine signifikante Temperaturempfindlichkeit beobachtet mit einer merklichen Abnahme im Temperaturbereich von 45 bis 60°C von einer relativen Aktivität von 100% auf lediglich 38°C. Tabelle 5
  
  
• Ein weiterer bemerkenswerter Unterschied zu bekannten Alkoholdehydrogenasen aus R. erythropolis, einhergehend mit einer erheblichen Verbesserung der Enantioselektivität, ist dem Vergleich zum Verlauf der Enantioselektivität während einer Reaktion unter Einsatz von R. erythropolis-Zellen, dem literaturbekannten Rohextrakt, sowie der neuen ADH aus R. erythropolis zu entnehmen.
• Unsere Ergebnisse mit ganzen Zellen von R. erythropolis weisen darauf hin, dass dieser Stamm mehrere ADHs enthält, zumindest eine weitere mit entgegengesetzter Enantioselektivität. Setzt man ganze Zellen, die mit Alginat immobilisiert worden sind, in einer Säule (5 cm gepackte Höhe, 1,2 cm Durchmesser; 5,7 ml Füllvolumen) kontinuierlich mit p-Chloracetophenon (1,5 mM; 2 ml pro h) um, erhält man im Auslauf anfänglich bei nahezu vollständigem Umsatz enantiomerenreines (S)-p-Chlor-2- phenylethanol. Dieser hohe ee-Wert bleibt aber nur für ca. 10 h (ca. 3 Volumenwechsel) erhalten, danach sinkt bei gleichbleibend hohem Umsatz der ee-Wert drastisch ab. Nach 25 h (ca. 9 Volumenwechseln) erhält man (S)-p-Chlor-2- phenylethanol mit 70% ee, nach 50 h (ca. 18 Volumenwechseln) zeigt der Alkohol nur noch ca. 5% ee.
• Die hier beschriebene "neue" Alkohol-Dehydrogenase setzt p- Chloracetophenon vollkommen enantiomerenrein um. Auch bei mehrfacher Verwendung oder höheren Konzentrationen ist nie die Bildung von (R)-p-Chlor-2-phenylethanol beobachtet worden. So wurde das Enzym in immobilisierter Form (s. Beispiel 8) 11-mal wiederholt eingesetzt, wobei das Produkt immer der enantiomerenreine (S)-Alkohol war.
• Unter optisch angereicherten (enantiomerenangereicherten, enantiomer angereicherten) Verbindungen wird im Rahmen der Erfindung das Vorliegen einer optischen Antipode im Gemisch mit der anderen in > 50 mol-% verstanden.
• Unter dem Begriff Nukleinsäuresequenzen werden alle Arten von einzelsträngiger oder doppelsträngiger DNA als auch RNA oder Gemische derselben subsumiert.
• Die Verbesserung der Aktivität und/oder Selektivität und/oder Stabilität bedeutet erfindungsgemäß, dass die Polypeptide aktiver und/oder selektiver bzw. unter den verwendeten Reaktionsbedingungen stabiler sind. Während die Aktivität und die Stabilität der Enzyme für die technische Anwendung naturgemäß möglichst hoch sein sollte, ist in Bezug auf die Selektivität dann von einer Verbesserung die Rede, wenn entweder die Substratselektivität abnimmt, die Enantioselektivität der Enzyme jedoch gesteigert ist. Für den in diesem Zusammenhang gebrauchten Ausdruck nicht wesentlich reduziert gilt mutatis mutandis das Selbe.
• Von den beanspruchten Proteinsequenzen und den Nukleinsäuresequenzen werden erfindungsgemäß auch solche Sequenzen umfaßt, die eine Homologie (exclusive der natürlichen Degeneration) größer als 91%, bevorzugt größer als 92%, 93% oder 94%, mehr bevorzugt größer als 95% oder 96% und besonders bevorzugt größer als 97%, 98% oder 99% zu einer dieser Sequenzen aufweisen, sofern die Wirkungsweise bzw. Zweck einer solchen Sequenz erhalten bleibt. Der Ausdruck "Homologie" (oder Identität) wie hierin verwendet, kann durch die Gleichung H (%) = [1 - V/X] × 100 definiert werden, worin H Homologie bedeutet, X die Gesamtzahl an Nukleobasen/Aminosäuren der Vergleichssequenz ist und V die Anzahl an unterschiedlichen Nukleobasen/Aminosäuren der zu betrachtenden Sequenz bezogen auf die Vergleichssequenz ist. Dies gilt auch für den Teilbereich der Gensequenz mit den Basen 1-948 aus Abb. 3. Auf jeden Fall sind mit dem Begriff Nukleinsäuresequnezen, welche für Polypeptide codieren, alle Sequenzen umfaßt, die nach Maßgabe der Degeneration des genetischen Codes möglich erscheinen.
• Die in dieser Schrift genannten Literaturstellen gelten als von der Offenbarung mitumfaßt. SEQUENZPROTOKOLL
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
Beispiel 1 Reinigung der Alkohol-Dehydrogenase und Gewinnung von partiellen Sequenzdaten
• R. erythropolis wurde in Medium DSM 65 (pro 1 L: 4 g Glucose, 4 g Hefeextrakt, 10 g Malzextrakt; pH 7,2) für 3 Tage bei 30°C unter aeroben Bedingungen angezogen. Nach Ernten der Zellen wurde diese mit Puffer resuspendiert (Zusatz von 1,5 ml Tris-HCl-Puffer, pH 7,4 pro 1 g Zellen) und durch Vermahlen mit Glasperlen aufgeschlossen. Die festen Bestandteile und Zellbruchstücke wurden durch Zentrifugation entfernt und der zellfreie Überstand als Rohextrakt für die weitere Reinigung eingesetzt.
• Eine erste Reinigung konnte durch Anionenaustausch- Chromatographie (MonoQ-Material, Fa. Pharmacia) erreicht werden (Laufpuffer: 50 mM TEA-Puffer, pH 7,0; Elution mit einem NACl-Gradienten von 0-1 M). Ein photometrischer Test (Messung bei 340 nm) mit p-Cl-Acetophenon (1,5 mM p- Cl-Acetophenon, 0,25 mM NADH 0,1 M Kpi-Puffer, pH 6,0) zeigt, dass das gewünschte Enzym bei ca. 0,8 M NaCl eluiert wird. Die Fraktion mit der höchsten Aktivität wird mit Ammoniumsulfat versetzt (1,8 M Endkonzentration) und auf eine Phenylsepharose CL-4B-Säule (Fa. Pharmacia) aufgetragen. Für die Elution wurde ein fallender Ammoniumsulfat-Gradient (1-0 M) eingesetzt, das gewünschte Enzym eluierte dabei bei nahezu 0 M Ammoniumsulfat. Auch hier wurde wieder die aktivste Fraktion mit Ammoniumsulfat versetzt (1 M Endkonzentration) und auf eine weitere Säule, gefüllt mit Butylsepharose FF aufgetragen. Das gewünschte Protein eluierte bei Anlegen eines fallenden Ammoniumsulfat-Gradienten (1-0 M) bei ca. 0,1 M Ammonimsulfat.
• Das mit diesen Schritten erhaltene Proteinmaterial erwies sich als ausreichend sauber, um eine Aminosäure- Sequenzierung durchzuführen (automatisierter Edman-Abbau mit einem Automated Sequencer 4774 (Applied Biosystems) mit online HPLC 120 A). Die Sequenz lautet: MKAIQYTRI.
Beispiel 2 Bestimmung der Gensequenz
• Datenbank-Recherchen zeigen, daß Enzyme, die zur Gruppe der Alkohol-Dehydrogenasen gehören, charakteristische, konservierte Bereiche aufweisen. Solche Bereiche sind z. B.:
  Gensequenz 1: EPELTEIPKPEPGPGEVLLEVTAAGVCHSDDF (Seq. 14)
  Gensequenz 2: PLTLGHEGAGKVAAVGEGVEGLDIGT (Seq. 15)
  Gensequenz 3: CGNCWHCSQGLENYC (Seq. 16)
  Gensequenz 4: HLVPIGDLDPVKTVPLTDAGLTPYHAIKRSLPKLRGGSYAWIGTGGL (Seq. 17).
• Durch Unterstreichung hervorgehoben sind Motive, die funktionell zugeordnet werden können: in Sequenz 1, 2 und 3 diejenigen Motive, die für die Zink-Bindung verantwortlich sind ("Zinkfinger"), in Sequenz 4 Teile der für die Bindung von NAD verantwortlichen Aminosäuren.
• Sequenzen aus diesen konservierten Bereichen können gemeinsam mit der N-terminalen Sequenz für die Isolierung des Gens für die Alkohol-Dehydrogenase verwendet werden. Für die Isolierung des gewünschten Enzyms aus R. erythropolis werden degenerierte Primer aus der N- terminalen Sequenz MKAIQYTRI (5'-Primer) und der aus den Datenbank-Informationen erhaltenen Sequenz YAVVIGTG (3'- Primer) eingesetzt.
• Als 5'-Primer wurde eingesetzt:
  5'ATG AAG GCG(C) ATC CAG TAC ACG(C) CGG(C) ATC 3' (Seq. 3)
  und als 3'-Primer:
  5'-GCC GGT ACC AAT(C) GAC(G) AAC(G) CGC GTA-3' (Seq. 4)
• Mit diesen Primern wurde eine PCR Reaktion durchgeführt, durch die ein ca. 500 bp großes Fragment amplifiziert werden konnte. Die Sequenzierung und Datenbank-Recherche zeigten große Homologie zu der Phenylacetaldehyd-Redukatse aus Corynebacterium sp. und zu anderen Zink-enthaltenden Alkoholdehydrogenasen (s. o.).
• Zur Isolierung des vollständigen Gens wurde aus dem 500 bp großen Fragment eine Sonde hergestellt, welche für die Durchführung einer Southern-Blot-Hybridisierung verwendet wurde. Um die Spezifität der Hybridisierungsreaktion zu gewährleisten, wurden für die Herstellung der Sonde homologe Primer aus internen Sequenzen des 500 bp Fragments konstruiert.
• Als homologe Primer wurden verwendet:
  5'-PrimerH: 5'-ATC CAG TAC ACG CGC ATC GGC GCG GAA-3' (Seq. 5)
  3'-PrimerH: 5'-GCC TCC GCG AAG TTT CGG CAG AGA ACG-3' (Seq. 6)
• Durch Verdau der genomischen DNA mit verschiedenen Restriktions-Endonucleasen wurde eine Genbank angelegt, und durch nachfolgende Southern-Blot-Hybridisierung wurde ein spezifisches Signal bei 5,2 kb erhalten. Dies zeigte, daß das gesuchte Gen auf einem 5,2 kb großen EcoRI-Fragment liegt.
• Mit spezifischen Primern, abgeleitet aus den Schnittstellen von Restristionsenzymen und Sequenzen aus dem 500 bp- Teilstück, werden dann mittels PCR weitere Sequenzstücke erhalten, wobei mit Hilfe überlappender DNA-Sequenzen und dem Stop-Codon die Gesamtsequenz definiert werden kann.
• Aus der Primärstruktur kann das Molekulargewicht der RE-ADH mit einer Größe von 36,206 kD ermittelt werden. Da mittels Gelfiltration (Superdex G-200, Pharmacia) ein Molekulargewicht von ca. 150.000 Da ermittelt wurde, handelt es sich bei der RE-ADH in nativer Form um ein Enzym mit tetramerem Aufbau.
Beispiel 3 Klonierung und heterologe Expression der RE-ADH a) Klonierung des RE-ADH-Gens (Wildtyp) in Vektor pKK223-3
• Für die Expression des RE-ADH Gens wurde zuerst das Plasmid pKK223-3 (Amersham Pharmacia Biotech) ausgewählt.
• Das Gen der ADH wurde mittels PCR unter folgenden Bedingungen amplifiziert:
  Zur Denaturierung der DNA wurde diese für 3 min bei 94°C inkubiert. Danach folgten 30 Zyklen bestehend aus:
  Denaturierung: 45 sec; 94°C
  Annealing: 30 sec; 64°C
  Extension: 110 sec; 68°C
  Abschließender Schritt: 10 min.; 68°C
  Kühlung: 6°C
• Das Reaktionsvolumen beträgt 50 µl.
• Als Polymerase für die Reaktion wurde die AdvanTaq DNA Polymerase (Fa. CLONTECH) verwendet.
• Da die genomische DNA von R. erythropolis GC reich ist (63%), wurde dem Ansatz 5% DMSO zugegeben, um die Effizienz der PCR-Reaktion zu erhöhen. Folgende Oligonukleotid-Primer mit den Restriktionsschnittstellen für die Restriktions- Endonucleasen EcoRI und HindIII wurden verwendet (Fa. Metablon):
  5'- Primer:
  5'-GCG GAA TTC ATG AAG GCA ATC CAG TAC ACG-3' (Seq. 7)
  3'- Primer:
  5'-CGC AAG CTT CTA CAG ACC AGG GAC CAC AAC-3' (Seq. 8)
• Zur Klonierung des Gens wurden das PCR-Produkt und der Plasmid-DNA-Vektor pKK223-3 (1-2 µg) mit den Restriktionsendonucleasen EcoRI und HindIII (10 U) verdaut (37°C, 2 h). Die Endonucleasen wurden am Ende der Reaktion durch Erhitzen bei 65°C für 20 min inaktiviert.
• Die Restriktionsansätze wurden auf Agarosegel nach Molekulargewicht aufgetrennt und die DNA aus dem Gel isoliert (QIAquick Gel Extraction Kits, Qiagen). Der Vektor pKK223-3 wurde dephosphoryliert (6 U Shrimp alkalische Phosphatase), um eine Religation der linearisierten Vektor- DNA zu vermeiden. Diese Reaktion erfolgte bei 37°C für 1 Stunde, das Enzym wurde anschließend durch Erhitzen bei 65°C für 15 min inaktiviert.
• Das PCR Produkt (Insert) wurde mit dem Vektor ligiert (äquimolare Menge). Der Ligationsansatz enthält 5 U T₄- Ligase und erfolgte bei 25°C.
• Zur Expression des RE-ADH Gens wurde das entstandene Plasmid pRE-ADH 1 in kompetente E. coli JM 105-Zellen transformiert. Das Wachstum der rekombinanten E. coli Zellen erfolgte auf Agarplatten mit LB_amp Medium (LB-Medium mit Ampicillin 100 µg/ml als Selektionsmarker) bei 37°C für 16 h.
• Kolonien auf der Agarplatte wurden für die Expression in 5 ml LB_amp Flüssig-Medium für 16 h bei 30°C kultiviert. Diese Kultur diente als Vorkultur einer Hauptkultur (1 : 100 angeimpft). Die Genexpression wurde bei einer optischen Dichte (OD_600nm) von 0,3 durch Zugabe von 1 mM IPTG induziert, die induzierten Zellen wuchsen dann noch 16 h bei 30°C auf der Rundschüttelmaschine (120 rpm) weiter.
• Zum Aktivitätstest wurden die Zellen geerntet (15 min zentrifugiert bei 14000 rpm, 4°C) und nach Resuspendierung mit 100 mM KPi-Puffer, pH 6.0 aufgeschlossen (1,5 ml Puffer pro 1 g Zellen). Zum Aufschluss wurde die Suspension mit Ultraschall behandelt (2 × 30 sec. Power 100%, Puls 50), dann wurde der Zellbrei zentrifugiert. Der Überstand ist die lösliche Rohextrakt-Fraktion, das Sediment die unlösliche Fraktion. Beide Fraktionen wurden auf Aktivität der Alkohol-Dehydrogenase photometrisch getestet (Standardtest mit p-Cl-Acetophenon und NADH). In der löslichen Faktion konnte eine spezifische Enzymaktivität von 6 U/mg gemessen werden (1 U = Abnahme von 1 µMol NADH pro Minute).
b) Klonierung des RE-ADH-Gens (Mutante) in Vektor pKA1
• Um eine bessere Expressionsrate in E. coli zu erreichen, wurde eine Mutation eingeführt, mit der das Codon AGA für die Aminosäure Arginin in Position 8 in das Codon in das ebenfalls für Arginin codierende CGT geändert wurde (Austausch von "minor codons" (Chen, G. T., Inouye, M., Nucleic Acids Res. Vol. 18 (1990), 1465; Chen, G. T., Inouye, M., Genes Dev. Vol. 8 (1994), 2641).
Erzeugung der Mutante mit geändertem Codon
• Das Gen wurde über PCR amplifiziert, wobei folgende PCR Bedingungen verwendet wurden:
  Zur Denaturierung der DNA wurde diese für 3 min bei 94°C inkubiert. Danach folgten 30 Zyklen aus:
  Denaturierung: 45 sec; 94°C
  Annealing: 30 sec; 64°C
  Extension: 110 sec; 68°C
  Abschließender Schritt: 10 min.; 68°C
  Kühlung: 6°C
• Das Reaktionsvolumen beträgt 50 µl.
• Als Polymerase für die Reaktion wurde die AdvanTaq DNA Polymerase (CLONTECH) verwendet. Folgende Nukleotid-Primer mit den Restriktionsschnittstellen NdeI und BamHI fanden Verwendung:
  5'-Primer
  5'-GAG GTC GGT CAT ATG AAG GCA ATC CAG TAC ACG CGT ATC GGC-3' (Seq. 9)
  Der 5'-Primer enthält den Austausch AGA gegen CGT
  3'-Primer
  5'-CGC GGA TCC CTA CAG ACC AGG GAC CAC AAC-3' (Seq. 10)
Konstruktion des Plasmids pKA1
• Dieses Plasmid wurde aus dem Plasmid Vektor pET11a, Replikation origin ColE1 (Novagen) und dem moderate copy number Plasmid Vektor pACYC184, Replikation origin p15A (Biolabs) konstruiert. pET11a enthält das Ampicillin (Amp)- Resistenzgen als Selektionsmarker, pACYC184 enthält zwei Selektionsmarker, die Gene für Chloramphenicol (Cam)- und Tetracyclin (Tet)-Resistenz.
• Das Plasmid pET11a wurde mit den Restriktionsendonucleasen HindIII und NruI verdaut. Das 2500 bp groß Fragment enthält die Expressionselementen lac I, T 7 Promotor, T 7 Terminator. Dieses Fragment wurde an das Plasmid pACYC184 ligiert über die Schnittstellen Hindill und NruI. Dabei wurde das Plasmid pACYC184 mit den beiden Restriktions- Endonukleasen HindIII und NruI geschnitten. Dadurch wurde das Tetracyclin-ResistenzgGen (Tet) inaktiviert. Das entstandene Plasmid pKA1 (5559 bp groß) wurde in E. coli XL1 Blue transformiert und auf LB-Agarplatten mit Chloramphenicol, 40 µg/ml ausplattiert.
• Um die Größe des Plasmids experimentell zu überprüfen, wurden zwei Kolonien aus der LB_cam, Agarplatte gepickt und in 5 ml LB_cam, für 16 h kultiviert. Die Plasmide wurden isoliert und für eine Restriktionsanalyse verwendet: die Plasmide wurden mit EcoRI geschnitten und die Größe auf einem Agarosegel (0,8%) bestimmt. Dabei konnte eine Größe von 5559 bp nachgewiesen werden. Dieses Plasmid wurde für die Klonierung und Expression der RE-ADH verwendet.
• Für die Klonierung und Expression der RE-Adh in den pKA1- Vektor wurden das die Mutation enthaltende Gen-Fragment (s. o.) und der Vektor pKA1 mit den Restriktions-Endonucleasen NdeI und BamHI verdaut, die Fragmente auf Agarosegel 0,8% aufgetragen und aus dem Gel aufgereinigt (QIAquick Gel Extraction Kits, Qiagen). Vektor und Insert wurden ligiert, (äguimolare Menge). Die Ligation erfolgte bei 25°C mit 5 U T₄-Ligase. Das Konstrukt pRE-ADH4 wurde zuerst in E. coli XL1 Blue Zellen transformiert und auf LB_cam, Agarplatten für 16 h bei 37°C inkubiert. Der Erfolg der Klonierung wurden über Restriktionsanalyse überprüft. Dabei wurden fünf Kolonien von der Agarplatte gepickt, die Plasmide isoliert (QIAprep Spin Miniprep Kit, Qiagen) und sequenziert.
• Für die Expression wurde E. coli BL21 (DE3) als Wirt eingesetzt. Rekombinante Zellen wurden in dem Medium LB_cam bei 37°C vermehrt. Bei einer OD₆₀₀ von 0,5 wurde die Expression mit 25 µM IPTG induziert, dann wurden die Zellen für 12 h bei bei 30°C vermehrt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation 15 min bei 5000 rpm geerntet, das Sediment in 100 mM Kpi-Puffer resuspendiert (1,5 ml pro 1 g Zellen) und mittels Ultraschall aufgeschloßen. Der zellfreie Rohextrakt zeigte eine Enzymaktivität von 70 U/mg (gemessen mit p-Cl-Acetophenon und NADH).
Beispiel 4 Biochemischer Vergleich der Alkohol-Dehydrogenase aus R. erythropolis mit der Aldehyd-Reduktase aus Corynebacterium sp
• Beim Vergleich der Gen-Sequenz für die ADH aus R. erythropolis mit Sequenzen in Datenbanken hat sich gezeigt, daß die RE-ADH hohe Homologie zu einer Aldehyd-Reduktase aus Coyrnebacterium sp. aufweist. In der Publikation zur Aldehyd-Reduktase sind eine Reihe biochemischer Eigenschaften dieses Enzyms beschrieben (Itoh, N., R. Morihama, J. Wang, K. Okada and N. Mizuguchi (1997), Purification and characterization of phenylacetaldehyde reductase from a styrene-assimilating Corynebacterium strain, ST-10, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3783-378). Einige der in dieser Veröffentlichung beschriebenen (Aldehyd-)Substrate wurden daher auch mit der RE-ADH umgesetzt und mit den relativen Aktivitäten der Reduktase verglichen. Die Tab. 6 faßt diese Ergebnisse mit den Aldehyden zusammen, zudem sind die Aktivitäten der beiden Enzyme bezogen auf die Umsetzung mit Acetophenon zusammengestellt. Weitere Vergleiche beider Enzyme sind mit dem publizierten Datenmaterial nicht sinnvoll, da das Enzym aus Corynebacterium durchweg mit Phenylacetaldehyd als Substrat getestet wurde, die RE-ADH aber bislang mit p-Cl- Acetophenon charakterisiert worden ist.
Tab. 6
• Vergleich der RE-ADH mit der Aldehyd-Reduktase aus Corynebacterium sp. bezüglich der Aktivitäten für die Acetophenon-Reduktion und und einiger Aldehyde. Daten zum Enzym aus Corynebacterium wurden der Publikation von Itoh et al. (s. o.) entnommen, Daten zur RE-ADH sind eigene Messungen (homogen = hochgereinigtes homogenes Enzym). Für den Vergleich mit relativen Aktivitätswerten wurde die Aktivität beider Enzyme auf Phenylacetaldehyd = 100% bezogen.
  
  
• Die Ergebnisse zeigen, daß die C-terminalen Sequenzunterschiede beider Enzyme auch unterschiedliche biochemische Eigenschaften bedingen. Die Aktivitäten beider hochgereinigter Enzyme unterscheiden sich beträchtlich, die Rhodococcus-ADH ist gegenüber Acetophenon ca. 15-fach aktiver als das Corynebacterium-Enzym. Auch das relative Substratspektrum zeigt Unterschiede: Die hohe Aktivität des Corynebacterium-Enzyms gegenüber Capronaldehyd (12-fach gegenüber Acetophenon) findet sich beim RE-ADH-Enzym nicht, hier liegt die Aktivität gegenüber Capronaldehyd nur ca. 5- fach über Acetophenon. Auch das Verhältnis p-Cl-Acetophenon/Acetophenon ist unterschiedlich: Bei Corynebacterium liegt es bei ca. 10 : 1, bei der RE-ADH dagegen bei 3 : 1.
• Diese Beispiele zeigen, daß sich die beiden Enzyme signifikant voneinander unterscheiden und diese Unterschiede auf die Sequenzunterschiede im C-terminalen Bereich zurückzuführen sind.
Beispiel 5 Biochemische Charakterisierung der Alkohol-Dehydrogenase aus R. erythropolis a) Substratspektrum Tab. 7 Substratspezifität der neuen ADH aus R. erythropolis für Ketone und Ketoester.
• Die folgende Tabelle 7 zeigt, daß die Alkohol-Dehydrogenase aus R. erythropolis eine Vielzahl von Ketonen und Ketoestern akzeptiert, und dabei sowohl zur Herstellung aromatischer und aliphatischer sekundärer Alkohole geeignet ist. Die relative Aktivität ist hierbei bezogen auf die gemessene Aktivität von Acetophenon.
  
  
  
  
b) Km-Werte
• Für die Reduktionsreaktion zeigte die RE-ADH für das Substrat p-Cl-Acetophenon einen Km-Wert von 0,5 mM und für das Coenzym NADH von 0,025 mM. Für die Oxidationsreaktion liegen diese Werte für (S)-p-Cl-Phenylethanol bei 0,28 mM und für NAD bei 0,082 mM.
c) pH-Optimum der Aktivität und Stabilität
• Das pH-Optimum der RE-ADH liegt für die Reduktionsreaktion bei pH 6,0 (mit p-Cl-Acetophenon gemessen).
• Bei der Lagerung des Enzym bei 4°C und Raumtemperatur für 1 und 2 Tage zeigte sich im Bereich von 7,5-8,5 keine Desaktivierung (Tris-HCl-Puffer, 0,1 M).
Beispiel 6 Präparative Anwendungen der ADH aus R. erythropolis
• Durch Umsetzung einiger Ketoverbindungen soll das präparative Potential des Enzyms aufgezeigt werden.
a) Reduktions-Reaktionen
• Die Reduktion muss mit einer Regenerierungsreaktion für das Coenzym NADH gekoppelt werden, beispielsweise der Reaktion mit Formiat-Dehydrogenase und Formiat. Anwendbar sind aber auch alle anderen NADH-erzeugenden Reaktionen. Das Produkt wird mittels Gaschromatographie analysiert, wobei die stationäre Phase der GC-Säule in der Lage ist, enantiomere Alkohole zu trennen, so daß Informationen über den ee-Wert des enzymatisch hergestellten Produkts erhalten werden.
• Ein solcher Ansatz für die Reduktion enthält:
  10 mM Keto-Verbindung
  0,5 mM NAD
  100 mM Na-Formiat
  1 U/ml Formiat-Dehydrogenase
  0,5 U/ml Alkohol-Dehydrogenase (partiell gereinigt mittels Ionenaustausch-Chromatographie; Units photometrisch gemessen mit dem Standardtest mit p-Cl-Acetophenon und NADH)
• Zu den Zeitpunkten 0, 5 min und 10 min werden Proben entnommen (100 µl), mit 100 µl Chloroform extrahiert und die Chloroform-Phase mittels Gaschromatographie analysiert.
GC-Analytik
• Säule: CP-Chirasil-DEX CB Länge: 25 m, Durchmesser: 25 µm (Fa. Chrompack). Temperaturprogramm: 5 min bei 60°C, dann 5°C/min bis auf 190°C (Für Hexanon/Hexanol: 30 min bei 60°C, dann 10°C/min auf 195°C). Säulenfluß 1,3 ml/min. Gas: Helium
• Als Ketoverbindungen sind eingesetzt worden: p-Cl- Acetophenon, Acetophenon, 2-Oxobuttersäure-ethylester, 2- Hexanon und 2-Heptanon. Tab. 8 faßt die Daten zur Produktreinheit zusammen. Alle Verbindungen sind nach 10 min vollständig umgesetzt worden, die gaschromatographische Analyse zeigt, dass mit jedem Edukt nur ein Enantiomer gebildet worden ist. Das Enzym reduziert Keto-Verbindungen also hoch enantioselektiv. Tab. 8 Nachweis der Enantiomerenreinheit der durch enzymatische Reduktion gebildeten Produkte
  
  
b) Oxidations-Reaktionen
• Durch enantioselektive Oxidation eines Alkohols kann beispielsweise aus einem Racemat ein enantiomerenangereicherter oder enantiomerenreiner Alkohol gewonnen werden. Beispielhaft wird das für die Gewinnung von (R)- Phenylethanol aufgezeigt:
  Eingesetzt wurden: 10 mM (R,S)-Phenylethanol, 0,5 mM NADH, 50 mM Tris-HCl-Puffer pH 7,5 mit 2 mM DTT, 1 U ADH aus R. erythropolis und 2 U NADH-Oxidase (aus Lactobacillus brevis DSM 20054 entsprechend (DE 101 40 088).
• Proben wurden nach 0, 1 und 2 h entnommen und gaschromatographisch aufgetrennt (Säule: CP-Chirasil-DEX CB Länge: 25 m, Durchmesser: 25 µm (Fa. Chrompack). Temperaturprogramm: 5 min bei 60°C, dann 5°C/min bis auf 190°C; Säulenfluß 1,3 ml/min. Gas: Helium. Dabei wurde sowohl der Acetophenonpeak (Produkt; Retentionszeit = 16,9 min), als auch die Enantiomeren des Phenylethanol (Edukte; Retentionszeiten R-Phenylethanol = 20,8 min und S- Phenylethanol = 21,1 min) aufgezeigt.
• Die Analyse zeigt, daß (S)-Phenylethanol nach 2 h vollständig oxidiert worden ist, gaschromatographisch ist eine entsprechende Menge des Oxidationsprodukts Acetophenon zu sehen. (R)-Phenylethanol ist vollständig erhalten geblieben, so daß sich für dieses Enantiomere ein ee-Wert von > 99% ergibt.
Beispiel 7 Immobilisierung des Enzyms
• Die RE-ADH kann mit verschiedenen Kopplungsmethoden und Trägermaterialien immobilisiert werden. Über eine kovalente Bindung beispielsweise kann das Enzym an Trägermaterialien wie Eupergit® gebunden werden.
a) Immobilisierung an Eupergit® (Handelname; Röhm/Degussa)
• Eingesetzt wurden in Parallelansätzen Eupergit C® und Eupergit C 250L®, die jeweils mit partiell gereinigter RE- ADH beladen wurden (Literatur zur Eupergit-Immobilisierung: E. Katchalski-Katzir, D. M. Kraemer, J. Mol. Catal. B: Enzym. 2000, 10, 157). Für den Test wurde eingesetzt:
  1,5 mM p-Cl-Acetophenon (gelöst in 0,1 M Na-formiat-Puffer, 0,05 M KPi-Puffer, pH 6,0)
  0,5 mM NAD
  30 mg Immobilisat
  1 U/ml Formiat-Dehydrogenase (FDH)
• Dieser Test wurden bei 30°C inkubiert, nach 0, 5, 10 und 15 min wurde jeweils eine Probe (100 µl) entnommen, diese mit 100 µl Chloroform extrahiert und die Chloroform-Phase mittels Gaschromatographie auf gebildetes Phenylethanol analysiert. Aus der Kinetik der Phenylethanol-Bildung kann die Aktivität des immobilisierten Enzyms berechnet werden, man erhielt so 11,8 U/g Träger für Eupergit C® und 8 U/g Träger für Eupergit C 250L®. Bezogen auf die Menge an eingesetztem Enzym entsprach dies einer Kopplungsausbeute von 1% (Eupergit C®) bzw. 0,8% (Eupergit C 250L®).
b) Immobilisierung an Ni-NTA
• Für die Immobilisierung an Ni-NTA wurde das Enzym gentechnisch am C-Terminus mit einem His-Tag (Hexa- Histidin) versehen.
Veränderung des RE-ADH-Gens
• Für die Anknüpfung eines Hexa-Histidinrests an den C- Terminus wurden folgende Nukleotid-Primer konstruiert:
  5'-Primer:
  5'-GGT GAA TTC ATG AAG GCA ATC CAG TAC ACG CGT ATC GGC- 3' (Seq. 11)
• Über den 5'-Primer wurde eine stille Mutation für die Aminosäure in Position 8 eingeführt (Austausch des Arginin- Codons AGA gegen CGT).
  3'-Primer:
  5'-CGC AAG CTT CTA GTG GTG GTG GTG GTG GTG CAG ACC AGG GAC -3' (Seq. 12)
• Dieser Primer mit 6 Codons für Histidin ermöglicht die Einführung von 6 Histidinresten am C-Terminus der RE-ADH.
• Mit diesen Primern wurde das Gen über PCR unter den vorab beschriebenen Bedingungen amplifiziert.
• Der pKK223-3 Plasmid Vektor und das PCR Produkt wurden mit EcoRI und HindIII verdaut. Nach der Ligation der beiden Fragmente (Reaktion bei 25°C mit 5 U T4-Ligase), wurde das entstandene Plasmid pRE-ADHs zuerst in E. coli XLI Blue transformiert und 16 h auf Agarplatten mit LB_amp-Medium bei 37°C inkubiert. Über Restriktionsanalyse konnte der Erfolg der Klonierung überprüft werden. Für die Expression wurde der Vektor pRE-ADHs in E. coli JM105 transformiert und für 16 h in LB_amp-Medium bei 37°C angezogen. Bei Erreichen einer OD₆₀₀ von 0,5 wurde die Genexpression durch Zugabe von 1 mM IPTG induziert. Nach weiterem 12-stündigem Wachstum konnten die Zellen geerntet werden und auf Aktivität der RE-ADH getestet werden.
• Es konnte eine Enzymaktivität von 7 U/mg gemessen werden. Dieser Aktivitätswert zeigte, dass die Veränderung des Gens durch Anknüpfung eines Hexa-Histidin-Restes am C-Terminus keinen Einfluss auf die Enzymaktivität hat.
• Durchführung der Immobilisierung
• Die rekombinanten E. coli JM105/pRE-ADHs-Zellen wurden in einem Imidazol-haltigen Puffer (50 mM NaH₂PO₄; 300 mM NaCl; 10 mM Imidazol, pH 8,0) aufgeschlossen und wie vorab beschrieben Rohextrakt präpariert. Für die Immobilisierung wurde 1 ml Enzymlösung (13 U/ml RE-ADH, Rohextrakt aus der Kultur E. coli JM105/pRE-ADHs; 8 mg/ml Protein) zu 300 mg Ni-NTA-Träger (Quiagen) gegeben und für 10 min bei 0°C (Eisbad) inkubiert. Nach Zentrigation der Suspension konnten noch 3 U/ml als Restaktivität im Überstand als nichtgebundenes Enzym nachgewiesen werden. Das Immobilisat wurde für den Nachweis der gebundenen Aktivität mit p-Cl- Acetophenon umgesetzt.
• Dazu wurden pro 1 ml Gesamtvolumen eingesetzt:
  30 mg Immobilisat
  3 mM p-Cl-Acetophenon (Substrat; gelöst in 100 mM Na- Formiat, 50 mM Kpi Puffer pH 6,0)
  0,5 mM NAD
  1 U Formiat-Dehydrogenase
• Der Testansatz wurde wie oben beschrieben (Immobilisierung an Eupergit®) inkubiert, Proben entnommen und mittels Gaschromatographie analysiert. Fig. 2 zeigt die Kinetik der Umsetzung, auf Grund der Bildungskinetik für p-Cl- Phenylethanol läßt sich daraus eine Aktivität von 0,21 U berechnen. Berücksichtigt man, dass dieser Versuch mit 30 mg Immobilisat durchgeführt wurde und dass 10 U RE-ADH an 300 mg Träger gebunden haben, wurden mit den 30 mg also 1 U in den Testansatz eingebracht. Wiedergefunden wurde eine Aktivität von 0,21 U, man erhält damit eine Immobilisierungsausbeute von 21%. Die Enantiomerenreinheit (ee-Wert) des mit dem Immobiliat gebildeten Alkohols beträgt > 99%.

Claims (17)

1. Isolierte Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid mit Alkoholdehydrogenaseaktivität codiert, ausgewählt aus der Gruppe:

a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in Seq. ID NO: 1 dargestellten Sequenz,

b) einer Nukleinsäuresequenz, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäuresequenz gemäß Seq. ID NO: 1 oder der dazu komplementären Sequenz hybridisiert,

c) einer Nukleinsäuresequenz, die eine Homologie von mindestens 91% zur Seq. ID NO: 1 aufweist,

d) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid codiert, welches mit der in Seq. ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenz mindestens 84% Homologie auf Aminosäureebene aufweist, ohne dass die Aktivität und/oder die Selektivität und/oder die Stabilität des Polypeptids verglichen mit dem Polypeptid der Seq. ID NO: 2 wesentlich reduziert ist,

e) einer Nukleinsäuresequenz codierend für ein Polypeptid mit gegenüber dem Polypeptid der Seq. ID NO: 2 verbesserter Aktivität und/oder Selektivität und/oder Stabilität, hergestellt durch

a) Mutagenese der Seq. ID NO: 1,

b) Klonierung der aus i) erhältlichen Nukleinsäuresequenz in einen geeigneten Vektor mit anschließender Transformation in ein geeignetes Expressionsystem und

c) Detektion des massgeblichen Polypeptids mit verbesserter Aktivität und/oder Selektivität und/oder Stabilität.

2. Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe

a) der Polypeptide, codiert durch eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1

b) Polypeptid aufweisend eine Sequenz gemäß Seq. ID NO: 2

c) Polypeptid mit einer Homologie von mind. 84% zum Polypeptid der Seq. ID NO: 2, ohne dass die Aktivität und/oder die Selektivität und/oder die Stabilität des Polypeptids verglichen mit dem Polypeptid der Seq. ID NO: 2 wesentlich reduziert ist.

3. Plasmide, Vektoren, Mikroorganismen aufweisend eine oder mehrere Nukleinsäuren nach einem der Ansprüche Anspruch 1.

4. Primer zur Herstellung der Nukleinsäuresequenzen nach Anspruch 1 mittels PCR.

5. Verfahren zur Herstellung von verbesserten rec- Polypeptiden mit Alkoholdehydrogenaseaktivität ausgehend von Nukleinsäuresequenzen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) die Nukleinsäuresequenzen einer Mutagenese unterwirft,

b) die aus a) erhältlichen Nukleinsäuresequenzen in einen geeigneten Vektor kloniert und diesen in ein geeignetes Expressionsystem transferiert und

c) die gebildeten Polypeptide mit verbesserter Aktivität und/oder Selektivität und/oder Stabilität detektiert und isoliert.

6. rec-Polypeptide oder diese codierende Nukleinsäuresequenzen erhältlich nach Anspruch 5.

7. Verwendung der Polypeptide gemäß Anspruch 2 oder 6 zur Herstellung von chiralen enantiomerenangereicherten organischen Verbindungen, wie z. B. Aminosäuren oder Alkoholen.

8. Verwendung der Nukleinsäuresequenzen gemäß Anspruch 1 oder 6 zur Herstellung von Ganzzellkatalysatoren.

9. Ganzzellkatalysatoren aufweisend ein kloniertes Gen für eine NADH-abhängige Alkoholdehydrogenase und ein kloniertes Gen für eine Formiatdehydrogenase oder NADH-Oxidase.

10. Ganzzellkatalysator gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine Alkoholdehydrogenase aus R. erythropolis, insbesondere DSM 43297 handelt.

11. Ganzzellkatalysator gemäß Anspruch 9 dadurch gekennzeichnet, daß sich die Formiatdehydrogenase von der Formiatdehydrogenase aus Candida boidinii und die NADH-Oxidase von der NADH-Oxidase aus Lactobacillus brevis abgeleitet.

12. Gekoppeltes enzymatisches Reaktionssystem aufweisend eine cofaktorabhängige enzymatische Transformation einer organischen Verbindung mit einem Polypeptid gemäß Anspruch 2 oder 6 und eine enzymatische Regeneration des Cofaktors.

13. Reaktionssystem nach Anspruch 12 dadurch gekennzeichnet, dass die enzymatische Regeneration mit einer von der Formiatdehydrogenase aus Candida boidinii abgeleiteten Formiatdehydrogenase oder einer von der NADH-Oxidase aus Lactobacillus brevis abgeleiteten NADH-Oxidase durchgeführt wird.

14. Verwendung des Ganzellkatalysators aus Anspruch 9 in einem Verfahren zur asymmetrischen Reduktion von Ketonen.

15. Vektor pKA1.

16. Verwendung von Vektoren hergestellt aus "high copy number"-Vektoren (A) und "moderate copy number"- Vektoren (B) zur Herstellung von zur Bildung von Inclusionbodies neigenden rekombinanten Proteinen, wobei zumindest der Replikation Origin vom Vektor (B) und zumindest die Klonierungs- und Expressionselemente vom Vektor (A) genommen werden.

17. Verwendung nach Anspruch 16 dadurch gekennzeichnet, dass als Vektor (A) der pET11a und als Vektor (B) der pACYC184 herangezogen wird.