FR2796080A1

FR2796080A1 - Procede de production de la l-lysine par surexpression de l'enzyme malique

Info

Publication number: FR2796080A1
Application number: FR9907785A
Authority: FR
Inventors: Armel Guyonvarch; Marie France Baucher; Emmanuel Mailly; Karima Salim; Bernard Kudla
Original assignee: Orsan
Current assignee: Orsan
Priority date: 1999-06-18
Filing date: 1999-06-18
Publication date: 2001-01-12
Anticipated expiration: 2019-06-18
Also published as: FR2796080B1

Abstract

La présente invention concerne l'utilisation du gène malE pour améliorer la production de L-lysine par des bactéries cultivées en fermenteur et à un procédé de production de L-lysine par une souche bactérienne, notamment une souche de Corynebacterium, transformée avec un plasmide permettant la surexpression d'un gène codant pour une enzyme malique. L'invention porte également sur l'identification du gène codant pour l'enzyme malique de C. glutamicum.

Description

La biosynthèse de la L-lysine dans les microorganismes a été étudiée depuis 1950, deux voies de biosynthèse très différentes ont été décrites.

La première rencontrée chez les levures, champignons filamenteux, quelques phycomycètes et algues, permet la synthèse de L-lysine via l'alpha-aminoadipate à partir de l'alpha-cetoglutarate, intermédiaire du cycle de Krebs. Les étapes de cette voie ont été établies initialement chez la levure Saccharomyces cerevisiae puis chez

Nellrospora crassa.

La seconde voie de biosynthèse de la L-lysine se rencontre chez les procaryotes, quelques phycomycètes, les algues bleues, les protozoaires et les plantes supérieures.
Cette synthèse, via l'acide diaminopimélique, démarre de l'aspartyl semialdéhyde intermédiaire de synthèse des acides aminés branchés issus de l'aspartate Cette deuxième voie de biosynthèse a particulièrement été étudiée chez Brevibacterium flavum, Corynebacterium glutamicum et Escherichia coli, microorganismes de choix utilisés pour la production industrielle de L-lysine.

Trois variantes dans la partie spécifique de la voie de synthèse de la L-lysine ont été décrites chez les procaryotes où habituellement seulement l'une d'entre elles est présente comme chez E. coli. Par contre, chez Corynebacterium gllltamiclim deux voies de synthèse coexistent. L'une utilise une succinylase et l'autre une

diaminopimelate déhydrogénase (Schaimpf et al 1991)

Toutefois, dans tous les cas considérés empruntant la voie de l'acide diaminopimélique, deux contraintes à l'augmentation des flux de synthèse de la
L-lysine demeurent : @ - Premièrement, la disponibilité d'une molécule de pyruvate devant être incorporée à chaque aspartyl semi-aldéhyde par la dihydrodipicolinate synthase lors de la première étape de la synthèse, - deuxièmement, la consommation de deux NADPH2 par molécule de L-piperidine-2,6 dicarboxylate formée.

)
L'enzyme malique, par sa capacité à synthétiser une molécule de pyruvate et à régénérer un NADPH2 à partir d'une molécule de malate, peut participer au maintien des pools de ces deux éléments importants de la biosynthèse de la L-lysine chez les organismes utilisant la voie de synthèse par l'acide diaminopimelique.

L'enzyme malique fait également partie des enzymes anaplérotiques Ces enzymes permettent la connexion entre les molécules à trois carbones issues de la glycolyse (pyruvate, phosphoenolpyruvate) et les molécules à quatre carbones du cycle de Krebs (oxaloacétate, malate). En ceci elles jouent un rôle essentiel dans le métabolisme central des microorganismes, ainsi que dans leur aptitude à synthétiser des acides aminés comme la L-lysine ou le L-glutamate.

Différentes enzymes jouant ce rôle anaplérotique ont été décrites chez divers organismes. Chacun de ces organismes est caractérisé par la présence de certaines de ces enzymes et par leur implication quantitative respective dans le flux anaplérotique en fonction des conditions environnementales de culture.

Chez les bactéries du genre Corynebacterium, ont été décrites jusqu'à présent les enzymes anaplérotiques suivantes : - phospho(enol)pyruvate carboxylase (Eikmanns et al. 1989) - pyruvate carboxylase (Peters-Wendisch et al., 1997)) - phospho(enol)pyruvate carboxykinase (Jetten et Sinskey, 1993)

- isocitrate lyase (Reinscheid et al., 1994a) - malate synthase ((Reinscheid et al., 1994b) La voie de biosynthèse de la L-lysine est illustrée à la page 326 de Shaw-Reid et al.

(1999). Cette publication concerne l'effet de l'inactivation site-spécifique du gène dapE chez C. glutamicum sur la production de L-lysine Auncun des documents mentionnés ci-dessus ne décrit, ni ne suggère l'utilisation du gène malE pour la production de L-lysine.

Or, les auteurs ont trouvé que la surexpression de l'enzyme malique dans ces bactéries permet non seulement de maintenir la disponibilité en pyruvate (précurseur dans la voie de biosynthèse de la L-lysine), mais également de régénérer du NADPH2 (cofacteur essentiel dans la voie de biosynthèse de la L-lysine).

La présente invention a trait au clonage, à la caractérisation moléculaire du gène malE

codant l'enzyme malique (E.C 1.1.1.38) de C. gliiiamiciim ATCC 17965, à la surexpression de ce gène dans des souches de C. glutamicum, et à l'impact de cette surexpression sur la production de L-lysine.

Ainsi, un premier aspect de la présente invention concerne une séquence nucléotidique comprenant une séquence ayant au moins 50% d'identité avec le gène codant l'enzyme malique de Corynebacterium.

De préférence, cette séquence comporte la séquence SEQ ID n 1.

La séquence nucléotidique du gène malE (2260 bases) est également représentée à la figure 3 L'invention porte également sur un polypeptide caractérisé en ce qu'il comprend une séquence peptidique ayant au moins 75% d'identité avec l'enzyme malique de

Corynebactehum. De préférence , ce polypeptide comporte la séquence SEQ ID n 2 . Cette séquence protéique déduite de la phase ouverte de lecture du gène malE est également représentée à la figure 3

Un autre aspect de l'invention concerne un vecteur d'expression d'une enzyme malique comprenant une séquence nucléotidique codant une enzyme malique fusionnée à un promoteur efficace dans les cellules procaryotes et/ou eucaryotes, de préférence chez Corynebacterium. De préférence, ledit vecteur d'expression comprend une séquence nucléotidique, telle que définie ci-dessus, fusionnée à un promoteur efficace dans les cellules procaryotes et/ou eucaryotes, de préférence chez Corynebacterium. Ce vecteur permet de faire surexprimer un polypeptide, dont la séquence est mentionnée ci-dessus, dans les cellules procaryotes et/ou eucaryotes, de préférence chez Corynebacterium. Le vecteur selon l'invention peut-être un vecteur navette E. coli / Corynebacterium.

Avantageusement, ledit vecteur peut comprendre en outre un ou plusieurs marqueur(s) de sélection, et la séquence codante de l'enzyme malique peut être placée sous le contrôle du promoteur Ptrc (Delaunay et al , 1998, citée dans la description par référence) On peut citer par exemple le plasmide pMF22 (figure 5) possédant les caractéristiques évoquées précédemment La présente invention a également pour objet une cellule transformée par un vecteur selon l'invention. De préférence, cette cellule appartient au genre Corynebacterium, de préférence à l'espèce Corynebacterium glutamicum.

Un autre aspect de l'invention a trait à un procédé de production de L-lysine caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) Transformation d'une cellule avec un vecteur permettant une surexpression d'une enzyme malique, b) mise en culture de la cellule transformée dans un milieu favorisant sa croissance et comprenant une ou plusieurs substance (s) favorisantla biosynthèse de la L-lysine, c) extraction de la L-lysine du milieu et purification
L'étape c) de ce procédé peut consister en

i) la séparation du milieu de culture et des cellules, notamment par centrifugation et/ou par filtration, ii) et en l'extraction et/ou la purification de la L-lysine du milieu, notamment par chromatographie sur résine échangeuse d'ions, par concentration, adsorption, précipitation au point isoélectrique, et/ou par dialyse.

Dans un mode particulier de réalisation de ce procédé, le vecteur est un plasmide dans lequel a été insérée une séquence codant une enzyme malique sous le contrôle d'un promoteur permettant l'expression de ladite enzyme dans une cellule procaryote ou eucaryote. Avantageusement, on peut transformer la cellule avec un vecteur selon l'invention. Ladite cellule peut appartenir au genre Corytiebacteriiim, de préférence à l'espèce Corynebacterium glutamicum.

On entend par Corynebacterium dans le cadre de l'invention le genre Corynebacterium au sens large, qui comprend toute souche y appartenant ou s'y rapprochant, notamment le genre Brevibacterium. On peut citer par exemple les souches Brevibaterium divaricatum ATCC 14020, Brevibacterium flavum ATCC

14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, Brevibacterium roseum ATCC 13825, Corynebacterium acetoacidophillim ATCC 13870, Corynebacterium lilium ATCC 15990, et Corynebacterium glutamicum ATCC 13032.

Ces souches peuvent être isolées de la nature ou modifiées. On entend par souche modifiée toute souche ayant subi une ou plusieurs mutation (s), en particulier des mutations conférant une résistance à des analogues de la L-lysine ou des précurseurs métaboliques de la L-lysine et/ou toute souche qui a été transformée.

Parmi les souches mutantes et/ou transformées, on peut notamment citer les souches suivantes : Les souches décrites dans WO 95/23224, les souches exprimant un variant du gène de l'aspartokinase (WO 94/25605, US 5,688,671 et JP 6062866), la souche DSM 6870 (FR 2687167), les souches résistantes à la rétro-inhibition par la 2-azido-epsilon caprolactam obtenues par le procédé décrit dans US 5,770,412 ,

la souche DSM 5715 (US 5,770,409), les souches transformées avec un gène codant une homosérine déshydrogénase mutante (US 5,766,925) ;

les souches de Brevibacterium résistantes au 4-N-(D-alanyl)-2,4-diamino-2,4-dideoxyL-arabinose ou à ses dérivés (US 5,650,304), notamment les souches Brevibacterium lactofermentum AJ 12529, FERM-P 11579, FERM-BP-4074, Corynebacterium acetoacidophilum AJ 12530, FERM-P 11580, FERM-BP-4073 (US 5,650,304) ; les souches possédant une résistance à la sélénalysine (US 5,362,636), notamment les

souches Brevibacterium lactofermentum AJ 12564, AJ 12566, Corynebacterium acetoacidophilum AJ 12565, Brevibacterillm t7aviim AJ 12568 et Corynebacterium gllllamiclim AJ 12579 ; les souches possédant une résistance pour l'iodothyronine, notamment Corynebacterium glutamicum FERM BP-3594 (US 5,302,521 et JP 5111386) ; les souches résistantes à l'acide alpha-amino-béta-hydroxyvalérique, à la S-(béta aminoéthyl) L-cystéine, à la méthyl lysine et autres analogues (EP 510319 et FR 2668496 souches AJ 12564, AJ 12566, et FERM BP-3554), aux analogues de l'arginine, de l'uridine, du tryptophane, de la phénylalanine (EP 387527) , et de

l'alanine, notamment les souches Corynebacterium glutamicrrm KFCC 10672, et FERM BP-2763 (US 5,268,293) ; les souches mutantes appartenant à l'espèce Corynebacterium thermoammogenes capables de pousser à des température supérieures à 40 C et qui sont résistantes à la S- (2 aminoéthyl)-L-cystéine, notamment les souches Corynebacterium thermoaminogenes AJ 12521, AJ 12522, AJ 12523, FERM BP-3304, FERM BP-3305 et FERM BP-3307 (US 5,250,423) ; les souches mutantes avec une activité superoxide

dismutase intensifiée (FR 2583061), notamment Brevrbacterium flavum AJ 12221 et FERM BP-2329 (US 5,179010) ; les souches résistantes à l'acyllysine et ses dérivés (JP 6007182) ; les souches résistantes à l'AME (L-asparagine methyl ester) soumises à des mutations induites par MNNG (N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine) (EP 551614) ; les souches mutantes [homosérine]' résistantes à la 4-azaleucine et la rifampicine (KR 9401307 et KR 9401306) ;

les souches transformées avec un plasmide contenant le gène codant pour la dihydrodipicolinate réductase (JO 5284970), la phosphoenolpyruvate carboxylase (EP 358940 et EP 143195), l'aspartate semi-aldéhyde déshydrogénase (DE 3823451) ; l'aspartate amino transférase (EP 219027), la dihydropicolinic acid synthase et/ou la tetrahydropicolinic acid succinylase (EP 197335), les souches capables d'assimiler le lactose (EP 271838) ; les souches résistantes à la béta-naphtho quinoline (FR 2601035), et les souches qui ont peu ou pas d'activité pyruvate kinase (J62205782) ; les souches transformées avec un plasmide contenant le gène codant la phosphoenolpyruvate carboxylase (EP 358940) ; et les souches transformées par des gènes autres que le gène malE qui favorisent la production de L-lysine, par exemple un gène conférant une résistance aux tensioactifs (WO 95/23224), un gène qui améliore l'activité de sécrétion desdites bactéries (WO 97/23597 et DE 4203320).

Les documents mentionnés ci-dessus sont cités dans la description par référence. Bien entendu, il est possible d'obtenir des souches possédant une combinaison des propriétés évoquées ci-dessus par fusion de protoplastes.

Des bactéries différentes des Corynebactéries peuvent également être transformées conformément à la présente invention et produire de la L-lysine. On peut citer par exemple E. coli, qui peut exprimer le gène codant la dihydrodipicolinate réductase et/ou le gène codant la diaminopimelate transaminase (WO 95/16042 citée dans la description par référence).

Les techniques de transformation sont documentées et sont à la portée de l'homme du métier. On peut notamment citer la publication Schafer et al. (1990) Dans un autre mode particulier de réalisation, la séquence codant une enzyme malique est une séquence selon l'invention telle que définie ci-dessus

L'étape b) du procédé consiste en une étape de fermentation. A cet effet, le milieu comprend au moins un carbohydrate assimilable, tel que par exemple du glucose. Ledit milieu peut comporter en outre une ou plusieurs substance (s) favorisantla biosynthèse de la L-lysine sélectionnée(s) parmi les métabolites impliqués dans le cycle de Krebs, les co-facteurs tels que la biotine et la thiamine, les acides aminés, notamment la thréonine, la leucine et la méthionine, les sels minéraux notamment les sels de calcium, de magnésium, et de potassium. Le milieu peut également contenir des dérivés de polyglycérol (JP 5284984), il peut avoir un faible ratio phosphate sur carbone (EP 796916) et/ou peut contenir de l'amidon comme source de carbone (J58152485) , ces documents sont incorporés dans la description par référence.

Le milieu peut également contenir au moins un antibiotique, en particulier un antibiotique permettant la croissance sélective des cellules transformées.

La publication Shaw-Reid et al (1999) et les références qui y sont contenues, sont citées dans la description en ce qui concerne l'arrière plan technologique de l'invention Un autre mode de réalisation du procédé consiste à mettre directement en #uvre l'étape b) avec une cellule transformée avec un vecteur selon l'invention, de préférence avec un vecteur possédant le gène malE défini ci-dessus.

Un aspect complémentaire de la présente invention concerne l'utilisation d'une séquence codant l'enzyme malique dans un procédé de bio-production de L-lysine. De préférence, ladite séquence est une séquence décrite précédemment L'invention se rapporte aussi à l'utilisation d'un vecteur comprenant une séquence codant l'enzyme malique pour faire surexprimer ladite enzyme dans une cellule adaptée à la production de L-lysine en fermenteur, de préférence, ledit vecteur correspond à un vecteur défini ci-dessus, et à l'utilisation d'une cellule transformée par un vecteur surexprimant l'enzyme malique pour la bio-production de L-lysine, de préférence surexprimant l'enzyme malique de Corynebacterium

L'approche utilisée pour le clonage du gène malE a été l'hybridation ADN/ADN, avec une sonde résultant d'une amplification en chaîne par polymérase (PCR) de l'ADN

chromosomique de C. glitiamiciim. La surexpression du gène malE a résulté de la fusion entre un promoteur s'exprimant

de manière constitutive et optimale chez C. gllllam/cllm avec la phase ouverte de lecture du gène malE.

Pour la suite de la description, on se référera à la légende des figures présentées ciaprès Légendes: Figure 1A : Séquence nucléotidique de la sonde de 231 bp Figure 1B : Carte de restriction des inserts portés par les plasmides pMFll, pMF12, pMF13 Figure 2 : Contrôle de l'origine des fragments clonés dans pMF11, pMF 12 et pMF 13 par la méthode de Southern.

Figure 3 : Séquence nucléotidique du gène malE de C. glutamicum et séquence en acides aminés déduite.

Les zones promotrices et terminatrices sont soulignées.

Figure 4 : Carte de restriction du plasmide pMF21.

Figure 5 Carte de restriction du plasmide pMF22.

Figure 6 : Cinétique de croissance en fermenteur Conditions de culture, voir exemple 3 (teneur normale en glucose).

Figure 7 : Cinétique de croissance en fermenteur.

Conditions de culture, voir exemple 4 (faible teneur en glucose).

Exemplel : Clonage et caractérisation du gène malE 1.1-Obtention de la sonde malE

Les séquences nucléotidiques et les séquences déduites en acides aminés des gènes

malE de Bacillits slearothermophillis (Kobayashi et al., 1989) et de Streptococcies bovis (Kawai, 1996) ont été comparées.

A partir des zones les plus conservées (nucléotides et amino acides), les oligonucléotides dégénérés EM3 et EM4 ont été définis en tenant compte du biais

d'utilisation des codons propre au genre Corynebactehum (Malumbres et al , 1993).

Amorces PCR: oligonucléotide EM3: 5'-GCGATGCC(A/T)GTCATGGAAGG(G/A)AA(A/G)GT(G/T)-3' (SEQ ID n 3) oligonucléotide EM4.

5' -GC(T/C)GT(G/A)CC(G/A)TG(T/C)TG(A/G)TCATC(A/G)TG-3' (SEQ ID n 4) Conditions de PCR.

Réaction: <SEP> Taq <SEP> Polymérase <SEP> (Eurobio) <SEP> 2,5 <SEP> u
<tb>

ADN génomique de C. glulamicum 450ng

<tb>
<tb> Oligonucléotides <SEP> 30 <SEP> pM <SEP> chacun
<tb> MgC12 <SEP> 1,5 <SEP> mM
<tb> dNTPs <SEP> 100 <SEP> mM <SEP> chacun
<tb> qsp <SEP> tampon <SEP> x <SEP> 1 <SEP> 50 <SEP> l
<tb> Programme <SEP> dénaturation <SEP> 1 <SEP> min <SEP> à <SEP> 95 C <SEP>
<tb> hybridation <SEP> 1 <SEP> min <SEP> à <SEP> 50 C <SEP>
<tb>

élongation 1 min à 72 C

<tb>
<tb> 30 <SEP> cycles
<tb>

L'ADN chromosomique de la souche de Corynebacterium gllllamiclim ATCC 17965 a été utilisé comme matrice pour la PCR, les oligonucléotides EM3 et EM4 comme amorces

Un fragment amplifié de 231 paires de bases a été obtenu. Ce fragment a été cloné dans le vecteur pGEM-T (Promega) et la séquence nucléotidique de ce fragment a été déterminée par la méthode de Sanger et al. (1977) La séquence nucléotidique obtenue (fig 1 A) ainsi que la séquence en acides aminés déduite ont été comparées à celles de B. stearothermophilus et de S. bovis.

La séquence en acides aminés déduite de la séquence nucléotidique du fragment de 231pb montre une identité de 82% avec la partie correspondante de l'enzyme malique de S. bovis et de 78% avec celle de B. stearothermophilus si l'on tient compte des remplacements conservatifs.

De cette comparaison, il ressort que le fragment amplifié appartient bien à un gène de type malE.

1.2-Clonage et analyse du gène malE Clonage du gène malE

La construction de la banque d'ADN de C. glutamicum ATCC 17965 a été réalisée comme suit: L'ADN total de la souche ATCC17965 a été digéré par l'enzyme de restriction MboI. Les fragments de restriction de 6 à 12kb ont été isolés par centrifugation en gradient de saccharose puis ligaturés dans le plasmide pUN121 (Nilsson et al., 1983) préalablement ouvert par l'enzyme BclI. Le mélange de ligature a été utilisé pour transformer par électroporation la souche ED.coli DH5a. Environ 10 000 clones indépendants ont été obtenus, ce qui permet d'affirmer que n'importe quel fragment d'intérêt a plus de 99,9% de chances d'être représenté au moins une fois dans cette banque (Ausubel et al , 1987).

L'ensemble des plasmides recombinants correspondant à la banque d'ADN de C.

glulaf1llCUnl ATCC 17965 a été ensuite transféré dans la souche de F'. coh

XH11(Mountain et al., 1984). La banque a été ordonnée par repiquage individuel des clones en plaques de microtitration, puis transférée sur membranes d'hybridation. Les membranes ont été traitées pour obtenir la lyse des cellules puis sont soumises à hybridation en présence de la sonde décrite précédemment marquée radioactivement.

Tous les clones positifs ont été réisolés et soumis à une deuxième hybridation de contrôle. Les clones répondant positivement deux fois ont été retenus.

Une carte de restriction sommaire (par les enzymes EcoRV et PSII) a été réalisée pour tous les plasmides extraits des clones retenus.

De cette analyse, trois plasmides pMF11, pMF12 et pMF13 ont étés obtenus et portent respectivement les inserts d'environ 2,9kb, 4,35kb et 4,4kb comme indiqué dans la FiglB.

Sachant que la sonde de 231 paires de bases utilisée pour l'hybridation devait être localisée approximativement à 500 paires de bases des extrémités 5' et 3' probables du gène malE, nous avons cherché parmi pMFll, pMF12 et pMF13 le plasmide susceptible de porter le gène malE entier.

Pour cela, une hybridation par la méthode de Southem (1975) des trois plasmides coupés par les enzymes Eco RV et Pst I, et la sonde de 231 paires de bases, a été réalisée. La zone d'hybridation a été déterminée, permettant de localiser la position de la phase ouverte de lecture de malE dans les différents inserts. Le plasmide pMF12, portant un insert (4,3 5kb) débordant largement de part et d'autre de la zone d'hybridation (FiglB) a été choisi comme clone de travail.

La vérification que le fragment d'ADN inséré dans le plasmide pMF12 provenait bien

de C. glutamicum ATCC 17965 a été effectuée Ceci a été démontré par hybridation ADN/ADN (Southern, 1975) entre l'ADN chromosomique de l'organisme donneur et l'ADN de pMF12 utilisé comme sonde (Fig.2).

Il est à noter qu'un polymorphisme de restriction existe au niveau du gène malE entre les deux souches de C. glutamicum testées

Séquence du gène et analyse

Le fragment d'ADN de C. glrrtamicum porté par pMF 12 a été partiellement séquence par la méthode de Sanger et al. (1977). La séquence a été déterminée sur les deux brins sur une longueur de 2260 paires de bases (Fig 3) L'analyse de cette séquence conduit aux conclusions suivantes : - Une séquence de type promoteur (-35: TTTGCAAAT, -10: TACAGAT) a été

détectée par comparaison avec des promoteurs connus de C. glutamicrrm (Patek et al., 1996)) - Une séquence de type terminateur (AGGCCCACAGAAGCAATTCTGTGGGCCT SEQ ID n 7) a été détectée par comparaison avec des terminateurs connus (Rosenberg et Court, 1979).

- Entre ces séquences, une phase ouverte de lecture majeure a été identifiée Elle mesure 1179 paires de bases, ce qui correspond à 393 codons (Fig 3) et code une protéine d'une masse moléculaire déduite de 40950 Daltons, ce qui est similaire à la masse moléculaire des enzymes maliques bactériennes connues.

Le biais d'utilisation des codons dans la phase ouverte de lecture putative est conforme

à celui rencontré chez les gènes analysés de C. glrrtamicrrm (Malumbres et al., 1993), tout comme le pourcentage en G+C de la séquence analysée.

Les similarités entre les séquences selon l'invention et les séquences provenant d'autres microorganismes sont représentées dans le tableauci-dessous

Tableau 1

<tb>
<tb> Espèce <SEP> % <SEP> similarités <SEP> % <SEP> similarités
<tb> acides <SEP> aminés <SEP> nucléotides
<tb> MAIE <SEP> de <SEP> ATCC <SEP> 17965 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb>

Bacillius stearothermophiltis (Kobayayashi et al, 1989) 69 46

<tb>
<tb> Synechocystis <SEP> sp. <SEP> (Kaneko <SEP> et <SEP> al, <SEP> 1996) <SEP> 65 <SEP> 42
<tb>

Streptococcits bovis (Kawai et al, 1996) 68 41,8

<tb>
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> (Lapidus <SEP> et <SEP> al, <SEP> 1997) <SEP> 63 <SEP> 41,2
<tb>

Sinorhizobium meliloti 65 43,7

<tb>
<tb> Leptospira <SEP> interrogans <SEP> 59 <SEP> 36
<tb> E. <SEP> coli <SEP> (Blattner <SEP> et <SEP> al, <SEP> 1997) <SEP> 64 <SEP> 42
<tb>

Haemophilus influernae (Fleischmann et al, 1995) 63 38 Archaeoglobiisfiilgidiis (Klenk et al, 1997) 59 39,4

<tb>
<tb> Pyrococcus <SEP> horikoshii <SEP> (Kawarabayasi <SEP> et <SEP> al, <SEP> 1998) <SEP> 56 <SEP> 36
<tb>

Rickeilsia prowasekii (Andersson et al, 1998) 60 33,8 Leuconostoc mesenteroides (Bekal et al, 1998) 61 35,6 Au mieux, la séquence nucléotidique de la phase ouverte de lecture présente des similitudes avec les séquences des gènes malE de B. stearothermophilus (46% de similarité) et de S. bovis (41,8% de similarité). La séquence protéique déduite de la phase ouverte de lecture présente des similitudes fortes avec les enzymes

correspondantes de B. stearothermophilus (69% de similarité) et de S. bovis (68% de similarité).

Fonctionnalité chez Ecole du gène malE cloné Conditions de culture: Les bactéries sont cultivées une nuit à 37 C en milieu LB (Luria broth) contenant de l'ampicilline à 100 g/ml dans le cas de pMF12 Le culot bactérien de 2ml de culture est lavé deux fois en KCI 0,2%, repris par 1ml de tampon TrisTricarballylate 100mM pH7,8

Les extraits protéiques sont obtenus par cassage des bactéries pendant 5min avec Ig de billes de verre (50 m de diamètre) traitées à l'HCI Les protéines cytosolubles sont récupérées dans le surnageant par centrifugation pendant 15min à 13000rpm.

Le dosage des protéines est effectué par la méthode de Lowry et al. (1951) en utilisant l'albumine de sérum bovin comme standard. Le dosage de l'activité enzymatique de l'enzyme malique est réalisé par la méthode de Mori et Shiio (1987) Le dosage de l'activité enzymatique de la glutamate deshydrogénase est réalisé par la méthode de

Meers et al .(1970).

-Afin de s'assurer que le fragment porté par pMF12 porte bien le gène malle dans son intégralité, un dosage de l'activité de l'enzyme malique a été réalisé dans les extraits

protéiques issus de cultures des clones de E. coli XH11 (pif12) comme décrit plus haut, ainsi qu'avec de l'enzyme malique purifiée de foie de poulet qui a servi de témoin positif (Tableau Il) Le dosage de la glutamate deshydrogénase a servi de standard interne d'intégrité des extraits enzymatiques (non reporté) Tableau II : spécifiques en nmol/min/mg protéines chez E.coli

<tb>
<tb> Souches <SEP> Activité <SEP> spécifique
<tb> enzyme <SEP> malique
<tb>

E.coli XHll 0,86 E.coli XH11 (pMFl2) 126,9

<tb>
<tb> Enzyme <SEP> malique
<tb> de <SEP> poulet <SEP> 23 <SEP> 166 <SEP>
<tb>
II ressort de ces dosages que le fragment porté par pMF12 contient bien le gène fonctionnel malE de C. glutamicum ATCC17965 et que celui-ci s'exprime chez E. coli XH11sous contrôle de son propre promoteur.

Exemple 2 : Expression du gène malE chez C gllltamicum 2.1 -Construction d'un vecteur d'expression du gène malE.

Afin de surexprimer le gène malE de C. glutamicum de manière constitutive, la phase ouverte de lecture du gène malE, déduite de la séquence nucléotidique, a été placée sous le contrôle du promoteur hybride Ptrc. Il a été montré que ce promoteur s'exprime

de manière constitutive chez C. glutamicum (Delaunay et al., 1998). Cette fusion a été ensuite placée sur le vecteur navette E. colilcoryliebacteriiim pCGL243 (Reyes et al , 1991).

Dans un premier temps une amplification par PCR, selon les conditions décrites plus

haut (exemplel), a été réalisée avec l'ADN de C. gliitamiciim ATCC 17965 servant de matrice et les oligonucléotides EM5 et EM6 servant d'amorces. oligonucléotide EM5 5' GGCTAAATGTCATGACCATCGACC 3' (SEQ ID n 5) oligonucléotide EM6 : 5' GTTTGATTTAAAGGTCTGGTCTCG 3' (SEQ ID n 6) L'oligonucléotide EM5 correspond à la séquence chevauchant le codon ATG d'initiation de la traduction de malE, il est modifié de sorte à créer un site de restriction Rca I (TCATGA) au niveau du codon ATG L'oligonucléotide EM6 correspond à la séquence en aval du terminateur probable du gène malE et contient un site de restriction DraI (TTTAAA)

Le fragment d'ADN obtenu, coupé par les enzymes Réal et DraI, a été ligaturé dans le vecteur pKK388-1 (Clontech) préalablement coupé par les enzymes de restriction NcoI et SmaI. Cette construction donne naissance au plasmide pMF 21(Fig 4) dans lequel la phase ouverte de lecture du gène malE est placée sous le contrôle du promoteur Ptrc Enfin, le fragment d'ADN Sali, comprenant l'intégralité de la fusion Ptrc-malE, a été isolé de pMF21 et introduit au site Sali du vecteur navette pCGL243, donnant ainsi naissance à pMF22 (Fig 5).

2-2 Surexpression du gène malE chez C. glutamicum 2262

Le plasmide pMF22 a été introduit dans la souche de C. glutamicum 2262 par électroporation (Bonamy et al., 1990).

Pour effectuer les dosages enzymatiques, les cellules sont récoltées en phase stationnaire de croissance en milieu BMCG (Liebl et al., 1989), additionné de lactate de sodium 2%w/v comme source de carbone.

Le culot bactérien de 25ml de culture (D0570 13,5) est lavé deux fois en KCl 0,2%, repris par 1ml de tampon TrisTricarballylate 100mM pH7,8.

Les extraits protéiques sont obtenus par cassage des bactéries pendant 2x5min (1800 vibrations/min avec Ig de billes de verre (106 um de diamètre) traitées à l'HCI. Les protéines cytosolubles sont récupérées dans le surnageant par centrifugation pendant 15mnà 13000rpm.

Le dosage des protéines est effectué par la méthode de Lowry et al. (1951) en utilisant l'albumine de sérum bovin comme standard. Le dosage de l'activité enzymatique de l'enzyme malique est réalisé par la méthode de Mori et Shiio (1987) Le dosage de l'activité enzymatique de la glutamate deshydrogénase est réalisé par la méthode de Meers et al (1970).

Les dosages enzymatiques effectués sur une préparation protéique de la souche 2262 transformée par pMF22 prouvent que l'enzyme malique y est bien surexprimé (Tableau III) Tableau III: activités spécifiques en nmol/min/mg protéines

<tb>
<tb> Souches <SEP> Activité <SEP> spécifique
<tb> enzyme <SEP> malique
<tb> ATCC <SEP> 17965 <SEP> 27,7 <SEP>
<tb> C <SEP> glutamicum2262 <SEP> 6,3
<tb> C <SEP> glutamicum2262
<tb> (pMF22) <SEP> 300
<tb>

Le gène malE cloné codant l'enzyme malique de C. glutamicum ATCC 17965, mis sous contrôle du promoteur Ptrc et porté par le plasmide pMF22 est surexprimé d'un facteur 50 chez C. glutamicum 2262.

Exemple 3 : Impact de l'amplification du gène malE sur la production de la L-lysine en fermenteur Dans le but d'étudier l'influence de la surexpression de l'enzyme malique sur la production de la L-lysine, la souche ATCC 21253 a été transformée par électroporation avec le plasmide pMF22 (Ptrc-malE) et le plasmide témoin pCGL243 La souche de C. glutamicum ATCC21253 a été utilisée par Vallino et Stephanopoulos (1993) pour produire de la L-lysine.

Les souches ATCC21253 (pMF22) et ATCC21253 (pCGL243) ont été étudiées en fermenteur en suivant le protocole de fermentation décrit par Vallino et Stephanopoulos (1993) 3.1-Préculture Les souches sont maintenues sur boîte de Pétri sur milieu BHI (Brain Heart Infusion, Bouillon coeur cervelle) gélosé en présence de 25 mg/l d'antibiotique pour garantir le maintien des plasmides Le milieu de préculture est le milieu PMB Il est autoclavé à 121 C en trois parties: Une solution A contenant 20 g de glucose, 1, 14g de citrate trisodique dihydrate, 55 mg de CaCl2, 200 mg de MgS04-7H20, 20 mg de FeS04-7H20, Ig de NaCl, 10 ml de la solution de sels 100x, le tout porté à 800 ml avec de l'eau distillée et ajusté à pH 5,0 avec HCl.

Une solution B contenant 8 g de K2HP04, 1g de KH2P04, 150 mg de thréonine, 100 mg de leucine, 40 mg de méthionine, 0,5 mg de biotine, 1 mg de thiamine-HCI, dans 100 ml d'eau distillée.

Une solution C contenant 5 g de (NH4) 2S04 dans 100 ml d'eau distillée.

La solution de sels 100x contient : 200 mg/1 de FeCl--6H20, 200 mg/1 MnS04-H20, 50 mg/1 ZnS04-7 H20, 20 mgil CuC12-2H20, 20 mgll Na2B407-10H20, 10 mg/1 (NH4) 6MO7024-4H20, ajusté à pH 1,5 avec HCI.

Pour maintenir le plasmide, 25 mg/1 de kanamycine sont ajoutés à la préculture.

Les fioles de préculture sont inoculées à partir d'un tube gélosé de chacune des souches ATCC21253 (pMF22) et ATCC21253 (pCGL243). Les précultures sont incubées 16H à 32 C sous agitation à 200 t/min.

3.2-Culture Les cultures sont inoculées à 10% v/v par les précultures Le milieu utilisé est le PMB Les conditions de culture sont les mêmes que celles de la préculture Les cultures sont arrêtées après 16H d'âge La densité optique obtenue est de 20 à 660 nm.

3. 3-Fermentation Les fermentations sont effectuées dans des fermenteurs de laboratoire de 31 (ADI Biotech) à 30 C avec une aération de 60 1/H sous une pression relative de 0,2 bars Le pH est contrôlé à 7,00 par l'ajout d'ammoniac gazeux. L'agitation est fixée à 800 t/min en début de fermentation puis augmentée jusqu'à 1200 t/min pour éviter la limitation en oxygène.

Le milieu de fermentation est le milieu FM4 préparé en deux solutions La solution A contient 1500g de glucose, 10g d'acide citrique, 6g de MgS04-7H20, 500 mg de FeS04-7H20, 20g de NaCl, 1g de CaCl2, 200 ml de la solution de sels

minéraux 100x, 10 ml de polypropylène glycol 2000, dans 7 1 d'eau distillée ajustée à pH4,0.

La solution B contient : de K2HP04, 20g de KH2PO4, 7,33g de thréonine, 15g de leucine, 6g de méthionine, 10 mg de biotine, 20 mg de thiamine-HCI, 400 g de (NH4) 2S04, dans 2 1 d'eau distillée.

Les deux solutions sont autoclavées séparément pendant 30 min à 121 C.

Dans chaque fermenteur on ajoute aseptiquement 700 ml de la solution A, 200 ml de la solution B et 100 ml de la culture obtenue à l'étape précédente comme inoculum.

Une dose équivalente à 25 mg/1 de kanamycine stérilisée par filtration est ajoutée avant inoculation.

La fermentation est effectuée en mode semi-continu (fed-batch) Une alimentation en glucose à 500 g/1 est effectuée entre 12H et 42H d'âge La densité optique du milieu évolue comme indiqué à la figure 6.

Après 72H de fermentation, les milieux de fermentation sont récoltés et analysés Les résultats sont indiqués au tableau IV ci-dessous.

Tableau IV : Production de L-lysine en fermenteur ( résultats à 72H)

<tb>
<tb> Souche <SEP> D.O. <SEP> 660nm <SEP> Lys <SEP> HCI <SEP> g/1 <SEP> Lys <SEP> HCl, <SEP> g <SEP> Rendement <SEP> g/g
<tb> ATCC21253
<tb> (pCGL243) <SEP> 40,3 <SEP> 27,1 <SEP> 31,2 <SEP> 16,2%
<tb> (Témoin)
<tb> ATCC21253
<tb> (pMF22) <SEP> 40,2 <SEP> 29,2 <SEP> 34,2 <SEP> 18,0%
<tb>

(Ptrc-/77</E)~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~

La souche transformée par le plasmide portant l'enzyme malique voit sa production de L-lysine augmentée de 9,6% en masse par rapport au témoin. Le rendement obtenu est majoré de 2,2 points, ce qui correspond à une amélioration relative de Il %.

Exemple 4 : Impact de l'amplification du gène mal E sur la production de L-lysine en fermenteur, lors de fermentations à teneur initiale en glucose réduite.

Les conditions générales de fermentation sont les mêmes que pour l'exemple 3 hormis la teneur initiale en glucose dans le milieu FM4 qui est réduite à 75 g/1 de manière à permettre une croissance plus rapide.

L'évolution de la densité optique est indiquée à la figure 7. On constate que dans ces conditions la croissance est plus rapide que précédemment Après 69H les fermenteurs sont arrêtés et analysés Les résultats des expériences en doublon sont les suivants (tableau V): Tableau V : Production de L-lysine en fermentations à teneur réduite en glucose (résultats à 69H).

Souche <SEP> D.O. <SEP> 660nm <SEP> Lys <SEP> HCl <SEP> g/l <SEP> Lys <SEP> HCl <SEP> g <SEP> Rendement <SEP> g/g
<tb> ATCC21253 <SEP> (pCGL
<tb> 243) <SEP> 42,6 <SEP> +/-1,7 <SEP> 28,3 <SEP> +/-0,8 <SEP> 33,6 <SEP> +/-0,8 <SEP> 18,5% <SEP> +/-0,5 <SEP>
<tb> (Témoin)
<tb> ATCC21253
<tb>

(pMF22) 43,0+/-1,7 30,2+/-0,8 36,0+/-0,8 19,5% +/-0,5

<tb>
<tb> (Ptrc-malE)
<tb>
La souche ATCC21253 (pMF22) permet une production de L-lysine majorée de 7% Le rendement est augmenté de 1 point ce qui correspond à une amélioration relative de 5%

La stabilité plasmidique dans les souches transformées a été vérifiée. A l'issue de la fermentation, un prélèvement a été effectué, étalé sur milieu non sélectif (BHI) puis repiqué sur milieu sélectif (BHI contenant 25mg /l de kanamycine) et non sélectif (BHI). Un nombre équivalent de clones a poussé à la fois sur les deux milieux.

Les plasmides pCGL243 et pMF22 sont maintenus de manière stable dans les souches étudiées.

Mesure de l'activité enzyme malique.

.Des prélèvements ont été effectués à 24 H lors des fermentations réalisées ci-dessus pour la mesure de d'activité de l'enzyme malique.

Préparation des extraits Un prélèvement de 20 ml est effectué après 24H d'incubation, la DO étant alors voisine de 80. La suspension cellulaire est centrifugée 15 min à 3500 g et à 4 C. Le culot est lavé 2 fois dans du tampon Tris,HCl 100 mM pH 7,5, contenant 100 mM de KCI, 10 mM de MgCl2.

Les culots sont repris dans 5 ml de ce même tampon, puis soumis à sonication dans la glace à raison de 6 cycles de 30s espacés de lmin30s à 40 Watts Après centrifugation de 15mn à 14 OOOrpm et à 4 C, les activités enzymatiques sont dosées sur le surnageant (extrait brut cytosoluble) Dosage enzymatique L'activité enzyme malique est dosée dans le sens malate # pyruvate. Le mélange réactionnel est composé de 250 l de tampon phosphate 400 mM pH 7,8, 100 (il de MgCl2 à 50 mM, 100 ni de NADP à 6mM, 100 l de malate 400mM.

Le volume nécessaire d'extrait brut est ajouté et l'ensemble est ajusté à 1 ml avec de l'eau déminéralisée L'évolution de la réaction est suivie à 340nm La vitesse de la

réaction est calculée à partir de la pente en tenant compte du coefficient d'absorption du NADPH2 (6,2 1.mmol-1.cm-1).

Dosage des protéines Les protéines de l'extrait brut sont quantifiées suivant la méthode de Lowry et al (1951) à l'aide du kit Bio-Rad DC protein assay.

L'activité spécifique obtenue en divisant l'activité enzymatique par la quantité de protéines présentes s'exprime en nmol min .mg .

Les résultats sont indiqués tableau VI ci-dessous Tableau VI : Activités spécifiques en nmol/min/mg protéines.

Souches <SEP> Activité <SEP> spécifique
<tb> Enzyme <SEP> malique <SEP> à <SEP> 24H
<tb> ATCC21253 <SEP> (pCGL
<tb> 243) <SEP> il+/-4
<tb> (Témoin)
<tb>

ATCC212S3 (p'22) trc-mal 1 SO +l- 9 L'activité enzyme malique de la souche transformée par pMF22 est amplifiée d'un facteur 14 par rapport à la souche témoin.

En conclusion, la construction Ptrc-malE effectuée conduit bien à une surexpression de l'activité enzyme malique chez C. glutamicum et à une amélioration de la production de L-lysine en fermenteur.

REFERENCES
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LISTAGE DE SEQUENCE <110> ORSAN <120> Production de L-Lysine <130> D18135 <160> 7 <170> PatentIn Vers. 2.0 <210> 1 <211> 2260 <212> ADN <213> Corynebacterium <400> 1

tacacctacc ttqgcctcat catcgctqaa acaqcaqqqq acaqcttcqt, gtcoattggc 60 ttgttcgcct tcggtgcact cggactcatt ggcgtgacag tggcaacccg aactçtggat 120 cgccgtatgc tgcgtggaag tgttcacacc accactttgt ttgtcattgc tgcaattctc 180 ggacagatcg cattcggatt agagggcaca ctagccgtag tagctatctt ccttgcagtc 240 accgtgtttg gtggagcata cggcgctctc ccaaccctgg gaaccaccat cttcctccat 300

gcgggtocjcg aooacccag. tactgcatcc tccatttatg tggtcartta CaQt9ga bzz atcgcgtetg gcgcggcact tggcgcgatg gctgtggatg ccgattgggt tgct.çgcact 420 ttgtggatca tggctggact gtcattggct tccacgttgg tcttggcgct gtggtcccgc 480 ccgctactga agtagcagcc caaattcagc ccactgaatc aaccactgaa ccaaccccaa 540 aaccacccaa aagtcacact tagcaaacaa ttaaattcat cacaaaccac ccct.çtacaa 600

ddLLdycadL aaaggluayy yytgttttgc aaatgttaac attgcgaaat tttt:çttgag 660 ctacagattt agctagtgtt tttgttccag aaccctaaat gaggttctac cctt:eaGaga 720 9r.OA Aàaacaccga ttaacaaggc taaatgatat gaccatcgac ctgcggcgtt 780 ccacccaaaa cctcacccat gaggaaatct tcgaggcaca cgagggcgga aagctctcca B40 ttagttccac tcgtccgctc cgcgacatgc gcgatctttc ccttgottac nCoca99tg 900 ttgctcaggt ttgtgaagca atcaaggaag atccagaggt tgcacgcacc cacacgggca 960 ttggaaacac cgtcgcggtt atttccgacg gcaccgctgt tcttggcctt ggcgetatcg 1020

gocctcaggc ctcccttccc gtcatggagg gcaagçfctca gctgtttagc tctta cgctg 1080 gcctgaaggc tatccctatc gttttggatg ttcacgatgt tgacgctttg gttgagacca 1140 tCqCaaCCdt ccfcqccttct ttcqqtgcta tcaacttgga ggacatctcc gctcctcgtt 1200 gcttcgaggt ggagcgccgc ctcatcgagc gtcttgatat cccagttatg cacgatgacc 1260 agcacggcac cgctgtggtt atcctcgctg cgctgcgcaa ctccctgaag ctgctggatc 1320

gcaagatcga agacctcaag attgttatcz ccggcgcagg tgccgctggt gttgcagctg 1350 tggacatgct gaccaacgct ggagcaaccg atattgtggt tctcgattcc cgagçcatca 1440 tccacgacag ccgtgaggat c#ttrrr: g t-t-aa7cafiqc: t.caa.cJr.abac3 aac,mcaacc 1500 ctcgtggcat cagcggtggc atcaatgagg ctttcaccgg cgcggacctg ttcattggcg 1560 tgtccggcgg caacatcggc gaggacgccc tcaagctcat ggcaccacag ccaatcctgt 1620 tcaccctggc gaacccaacc ccagagatcg atcctgagct gtctcagaag tacggcgcca 1680

tcgtcgcgac cggccgc:tcl. Vacctgccta accagatcaa caacgtgctc gcgt:tGr~c:rg 1740 gaattttcgç cggcgctctc gcagec gg ccaagaagat cacccctgaa Qt9tgctc9 1800 ccgctgcaga ggcaatcgcc gacatcgcag ctgaggacct cgaggtcggc cgcatCgtgc 1860 ctaccgcctt agatccccgc gtcgccccag caqtcaaqqc aqctqtcraq qccctcqccq 1920 aagcgcaaaa cgcttaagaa tttgcttatc gacgcctccc tccccqtcga ggcgccaata 1980 ttttaagagc aaacttgagg eccacagaag caattctgtg ggccttcaaa ttcçrctgatc 2040

aagaactcac cacaaccccg agaccagacc tttaaatcaa acaaattttt gcaca,ttatc 2100 caattcgcaa aaatccacca cgaatcacag aatttctgcg tcttgtggta gatnttcgca 2160 tc9t9CtCQ actgcgataa gctagaccaa cttgag7tar arlrlrrrlt-ria aaa(;f#(-r 7?7t7 tqccttggag taatggtgtg caaagcgcgg ctgatgcgtc 2260 <210> 2

<211> 392 <212> PRT <213> Corynebacterium <400> 2

Met Thr Ile Asp Leu Gin Arg Ser Thr Gin Asn Leu Thr His Glu Glu 1 5 10 15
Ile Phe Glu Al.aHis Glu Gly Gly Lys Leu Ser Ile Ser Ser Thr Arg
20 25 30
Pro Leu Arg Asp Met Arg Asp Leu Ser Leu Ala Tyr Thr Pro Gly Val
35 40 45 Ala Gln Val Cys Glu Ala Ile Lys Glu Asp Pro Glu Val Ala Arg Thr
50 55 60
His Thr Gly Ile Gly Asn Thr Val Ala Val Ile Ser Asp Gly Thr Ala
65 70 75 80 Val Leu Gly Leu Gly Asp Ile Gly Pro Gln Ala Ser Leu Pro Val Met
85 90 95 Glu Gly Lys Ala Gln Leu Phe Ser Ser Phe Ala Gly Leu Lys Ala Ile
100 105 110 Pro Ile Val Leu Asp Val His Asp Val Asp Ala Leu Val Glu Thr Ile
115 120 125 Ala Ala Ile Ala Pro Ser Phe Gly Ala Ile Asn Leu Glu Asp Ile 3er
130 135 140 Ala Pro Arg Cys Phe Glu Val Glu Arg Arg Leu Ile Glu Arg Leu A$p 145 150 155 160 Ile Pro Val Met His Asp Asp Gln His Gly Thr Ala Val Val Ile Leu
165 170 175 Ala Ala Leu Arg Asn Ser Leu Lys Leu Leu Asp Arg Lys Ile Glu Asp
180 185 190 Leu Lys Ile Val Ile Ser Gly Ala Gly Ala Ala Gly Val Ala Ala Val
195 200 205 Asp Met Leu Thr Asn Ala Gly Ala Thr Asp Ile Val Val Leu Asp Ser
210 215 220 Arg Gly Ile Ile His Asp Ser Arg Glu Asp Leu Ser Pro Val Lys Asp 225 230 235 210 Ala Leu Ala Glu Lys Thr Asn Pro Arg Gly Ile Ser Gly Gly Tle Asn
245 250 255 Glu Ala Phe Thr Gly Ala Asp Leu Phe Ile Gly Val Ser Gly Gly Asn
260 200 270 Ile Gly Glu Asp Ala Leu Lys Leu Met Ala Pro Gln Pro Ile Leu Phe @

Thr Leu Ala Asn Pro Thr Pro Glu Ile Asp Pro Glu Leu Ser Gln Lys
290 295 300 Tyr Gly Ala Ile Val Ala Thr Gly Arg Ser Asp Leu Pro Asn Gln [le 305 310 315 320 Asn Asn Val Leu Ala Phe Pro Gly Ile Phe Ala Gly Ala Leu Ala Ala
325 330 335

Lys Ala Lys Lys lia Thr Pro rl M* 1- T,ya Leu Ala Ala Ala Glu .i\l
340 345 350 Ile Ala Asp Ile Ala Ala Glu Asp Leu Glu Val Gly Arg Ile Val Pro
355 360 365 Thr Ala Leu Asp rro Arg Val Ala Pro Ala Val Lys Ala Ala Val Gln
370 375 380 Ala Val Ala Glu Ala Gln Asn Ala 385 390 <210 3 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial Séquence <220> <223> Amorce <220> <223> En position 9, n représente les nucléotides A ou T <220>

<223> En position 21, n représente les nucléotidmn r nu A <220> <223> Eu position 24, n représente les nucléotides A ou G <220> <223> En position 27, n représente les nucléotides G ou T <400> 3 gcgatgccng tcatggaagg naangtn 27 <210> 4 <211> 23 <212> ADN <213> Artificial Sequence <220> <223> Amorce <220> <223> En position 3, n représente les nucléotides T ou C <220>

<223> En position 6, n représente les nucléotides G ou A <220> <223> En position 9, n représente les nucléotides G ou A <220> <223> En position 12, n représente les nucléotides T ou c <220> <223> En position 15, n représente les nucléotides A ou G <220> <223> En position 21, n représente les nucléotides A ou G <400> 4 gcngtnccnt gntgntcatc ntg 23 <210> 5 <211> 24 <212> ADN <213> Artificial Séquence <220> <223> Amorce <400> 5 ggctaaatgt catgaccatc gacc 24 <210> 6 <211> 24 <212>ADN <213> Artificial Sequence <220> <223> Amorce <400> 6 gtttgattta aaggtctggt ctcg 24 <210> 7 <211> 28 <212> ADN <213> Corynebacterium <400> 7 aggcccacag aagcaattct gtgggcct 28

Claims

REVENDICATIONS 1. Séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence ayant au moins 50% d'identité avec le gène codant l'enzyme malique de Corynebacterium glutamicum.

2. Séquence nucléotidiquc selon la revendication 1 caractérisée en ce qu'elle comporte la séquence SEQ ID n 1.

3 Polypeptide caractérisé en ce qu'il comprend une séquence peptidique ayant au

moins 75% d'identité avec l'enzyme malique de Cn1')ll2'-har.t2rl'nn glutamicum. 4. Polypeptide selon la revendication 3 caractérisé en ce qu'il comporte la séquence SEQ ID n" 2.
5. Vecteur d'expression d'une enzyme malique caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique codant une enzyme malique fusionnée à un promoteur efficace dans les cellules procaryotcs et/ou cucaryotes, :le préférence chez les espèces du genre Corynebacterium ou Brevibacterium.
6. Vecteur d'expression selon la revendication 5 caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique selon l'une des revendication 1 à 2 fusionnée à un promoteur efficace dans les cellules procaryotes et/ou eucaryotes, de préférence

chez les espèces du genre Corynebacteriutn ou Brevibacterium. 7 Vecteur d'expression selon la revendication 5 caractérisé en ce qu'il permet de faire surexprimer un polypeptide selon l'une des revendications 3 et 4 dans les cellules procaryotes et/ou eucaryotes, de préférence chez les espèces du genre

Corynebacterium ou Brcvibacterium.

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8. Vecteur selon l'une des revendications 5 à 7 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un

vecteur navette F coli I Copynebacterium.

9, Vecteur selon l'une des icveaidiGation3 5 à 8 caractérisé en et qu'il comprend en outre un ou plusieurs marqueurs) de sélection.
10. Vecteur selon l'une des revendications 5 à 9 caractérisé en ce que la séquence codante du gène malE soit placée sous le contrôle du promoteur Ptrc.

11Vecteur selon la revendication 10 caractérisé en ce qu'il s'agit du plasmide pMF22.
12. Cellule transformée par un vecteur selon l'une des revendications Sali.
13. Cellule selon la revendication 12 caractérisée en ce qu'il s'agit de cellule du genre

Corytiebacterium ou BrcviBaterium, de préférence de cellule de Corynebacterium glutamicum.
14. Procédé de production de L-lysine caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes . a) Transformation d'une cellule avec un vecteur permettant une surexpression d'une enzyme malique, b) mise en culture de la cellule transformée dans un milieu favorisant sa croissance et comprenant une uu plusieurs substances) favorisant la biosyni hèse de la 1-lysine, c) extraction de la L-lysine du milieu et purification.
15. Procédé selon la revendication 14 caractérisé en ce que l'étape c) consiste en i) la séparation du milieu de culture et des cellules, notamment par centrifugation et/ou par filtration, ii) et en l'extraction et/ou la purification de la L-lysine du milieu, notamment par chromatographie sur résine échangeuse d'ions, par concentration, adsorption, précipitation au point isoélectrique, et/ou par dialyse.

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16. Procédé selon l'une des revendications 14 et 15 caractérisé en ce que le vecteur est un plasmide dans lequel a été inséré une séquence codant une enzyme malique sous le contrôle d'un promoteur permettant l'expression de ladite enzyme dans une cellule procaryote et/ou eucaryote.
17. Procédé selon l'une des revendications 14 à 16 caractérisé en ce que l'on transforme la cellule avec un vecteur selon l'une des revendications 5 à 11 18. Procédé selon l'une des revendications 14 à 17 caractérisé en ce que la cellule appartient au genre Corynebacterium ou Brevibacterium, de préférence à l'espèce

Corynobactertum lutamtcum.
19. Procédé selon l'une des revendications 14 à 18 caractérisé en ce que la séquence codant une enzyme malique est une séquence selon la revendication 1 ou 2.

20. Procédé selon l'une des revendications 14 à 19 caractérisé en ce que l'étape b) consiste en une étape de fermentation 21. Procédé selon la revendication 20 caractérisé en ce que le milieu comprend au moins un carbohydrate assimilable, de préférence du glucose.
22. Procédé selon l'une des revendications 20 et 21 caractérise en ce que le milieu comprend une ou plusieurs substances) favorisant la biosynthèse de la L-lysine sélectionnées parmi les métabolites impliqués dans le cycle de Krebs, les co- facteurs tels que la biotine et la thiamine, les acides aminés, notamment la thréonine, la leucine et la méthionine, les sels minéraux notamment les sels de calcium, de magnésium, et de potassium

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23. Procédé selon l'une des revendications 20 à 22 caractérisé en ce que le milieu contient un antibiotique, en particulien un antibiotique permettant la croissance sélective des cellules transformées.
24. Procédé selon l'une des revendications 14 à 23 caractérisé en ce que l'on met directement en oeuvre l'étape b) avec une cellule selon l'une des revendications 12 et 13 25. Utilisation d'une séquence codante pour l'enzyme malique dans un procédé de bio-production de L-lysine.
26. Utilisation selon la revendication 25 caractérisée en ce que ladite séquence est une séquence selon la revendication 1 ou 2.
27. Utilisation d'un vecteur comprenant une séquence codante pour l'enzyme malique pour faire surexprimer ladite enzyme dans une cellule adaptée à la production de L- lysine en fermenteur.

28 Utilisation selon la revendication 27 caractérisée en ce que le vecteur est un vecteur scion l'une des revendications 5 à 11 29 Utilisation d'une cellule transformée par un vecteur surexprimant l'enzyme malique pour la bio-production de L-lysine.
30. Utilisation selon la revendication 29 caractérisée en ce que la cellule est une cellule selon la revendication 12 ou 13.