JP2002355028A - 死菌化方法 - Google Patents
死菌化方法Info
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- JP2002355028A JP2002355028A JP2001347082A JP2001347082A JP2002355028A JP 2002355028 A JP2002355028 A JP 2002355028A JP 2001347082 A JP2001347082 A JP 2001347082A JP 2001347082 A JP2001347082 A JP 2001347082A JP 2002355028 A JP2002355028 A JP 2002355028A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】ある種の形質転換微生物を用いた有機合成反応
を特殊な設備を用いることなく行うために、形質転換微
生物が産生した酵素の活性を失活させることなく、形質
転換微生物を死菌化させる方法を提供することを課題と
する。 【解決手段】熱変性温度が５０℃以上である酵素のアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡをエシェ
リヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属の微生物に導入し
た形質転換微生物を含む液と、該微生物含有液に対し、
１０重量％以上３５重量％以下の量の炭素数１〜３の１
価のアルコール及び／又はアセトンとを２５℃以上３５
℃未満で混合することを特徴とする形質転換微生物の死
菌化方法を解決手段として提供する。
を特殊な設備を用いることなく行うために、形質転換微
生物が産生した酵素の活性を失活させることなく、形質
転換微生物を死菌化させる方法を提供することを課題と
する。 【解決手段】熱変性温度が５０℃以上である酵素のアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡをエシェ
リヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属の微生物に導入し
た形質転換微生物を含む液と、該微生物含有液に対し、
１０重量％以上３５重量％以下の量の炭素数１〜３の１
価のアルコール及び／又はアセトンとを２５℃以上３５
℃未満で混合することを特徴とする形質転換微生物の死
菌化方法を解決手段として提供する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、形質転換微生物の
死菌化方法、より詳しくは、形質転換微生物が産生した
有用酵素の活性を失活させることなく、形質転換微生物
を死菌化する方法に関する。
死菌化方法、より詳しくは、形質転換微生物が産生した
有用酵素の活性を失活させることなく、形質転換微生物
を死菌化する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年の遺伝子組換え技術の進歩により、
酵素を用いた有機合成反応に形質転換微生物の産生する
酵素が用いられるようになってきている。一方、形質転
換微生物は自然界に存在しない微生物であるため、安全
を確保する観点から、環境への伝播、拡散を防止するこ
とが求められており、この方法として、形質転換微生物
を物理的に封じ込める方法及び形質転換微生物を殺菌す
る方法が行われている。
酵素を用いた有機合成反応に形質転換微生物の産生する
酵素が用いられるようになってきている。一方、形質転
換微生物は自然界に存在しない微生物であるため、安全
を確保する観点から、環境への伝播、拡散を防止するこ
とが求められており、この方法として、形質転換微生物
を物理的に封じ込める方法及び形質転換微生物を殺菌す
る方法が行われている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、形質転
換微生物の産生する酵素を有機合成反応に利用する場
合、形質転換微生物を物理的に封じ込める方法は、大規
模な設備が必要となるため、製造設備の点からは必ずし
も有利な方法とは言えず、また、形質転換微生物を死菌
化する方法は、一般に形質転換微生物を死菌化する条件
下で有用物質生産に利用される酵素が失活する場合が多
かった。そこで、本発明はある種の形質転換微生物を用
いた有機合成反応を特殊な設備を用いることなく行うた
めに、形質転換微生物が産生した酵素の活性を失活させ
ることなく、形質転換微生物を死菌化させる方法を提供
することを課題とする。
換微生物の産生する酵素を有機合成反応に利用する場
合、形質転換微生物を物理的に封じ込める方法は、大規
模な設備が必要となるため、製造設備の点からは必ずし
も有利な方法とは言えず、また、形質転換微生物を死菌
化する方法は、一般に形質転換微生物を死菌化する条件
下で有用物質生産に利用される酵素が失活する場合が多
かった。そこで、本発明はある種の形質転換微生物を用
いた有機合成反応を特殊な設備を用いることなく行うた
めに、形質転換微生物が産生した酵素の活性を失活させ
ることなく、形質転換微生物を死菌化させる方法を提供
することを課題とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者は上記のような
状況に鑑み、有用物質生産に用いられる酵素をコードす
る遺伝子を組み込んだ形質転換微生物を、その形質転換
微生物が産生した有用物質生産に用いられる酵素の活性
を失活させることなく、死菌化する条件を種々検討した
結果、熱変性温度値が５０℃以上である酵素のアミノ酸
配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡをエシェリヒ
ア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属の微生物に導入した形
質転換微生物を含む液と、該微生物含有液に対し１０重
量％以上３５重量％以下の量の炭素数１〜３の１価のア
ルコール及び／またはアセトンとを２５℃以上３５℃未
満で混合することにより、該形質転換微生物が産生する
熱変性温度値が５０℃以上である酵素を失活させること
なく、形質転換微生物が死菌化できることを見出し、本
発明に至った。
状況に鑑み、有用物質生産に用いられる酵素をコードす
る遺伝子を組み込んだ形質転換微生物を、その形質転換
微生物が産生した有用物質生産に用いられる酵素の活性
を失活させることなく、死菌化する条件を種々検討した
結果、熱変性温度値が５０℃以上である酵素のアミノ酸
配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡをエシェリヒ
ア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属の微生物に導入した形
質転換微生物を含む液と、該微生物含有液に対し１０重
量％以上３５重量％以下の量の炭素数１〜３の１価のア
ルコール及び／またはアセトンとを２５℃以上３５℃未
満で混合することにより、該形質転換微生物が産生する
熱変性温度値が５０℃以上である酵素を失活させること
なく、形質転換微生物が死菌化できることを見出し、本
発明に至った。
【０００５】すなわち、本発明は、熱変性温度値が５０
℃以上である酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
を有するＤＮＡをエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ）属の微生物に導入した形質転換微生物を含む液と、
該微生物含有液に対し１０重量％以上３５重量％以下の
量の炭素数１〜３の１価のアルコール及び／またはアセ
トンとを２５℃以上３５℃未満で混合することを特徴と
する形質転換微生物の死菌化方法（以下、本発明死菌化
方法と記すこともある。）等を提供する。
℃以上である酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列
を有するＤＮＡをエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ）属の微生物に導入した形質転換微生物を含む液と、
該微生物含有液に対し１０重量％以上３５重量％以下の
量の炭素数１〜３の１価のアルコール及び／またはアセ
トンとを２５℃以上３５℃未満で混合することを特徴と
する形質転換微生物の死菌化方法（以下、本発明死菌化
方法と記すこともある。）等を提供する。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明死菌化方法に用いられる、
形質転換微生物の宿主微生物にはエシェリヒア（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ）属の微生物が用いられる。この中で
も、形質転換微生物の作製の容易さ等の点から好ましく
はエシェリヒア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉ）種の微生物が用いられ、より好ましくは、エシェ
リヒアコリ ＪＭ１０５（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉ ＪＭ１０５）株の微生物が用いられる。
形質転換微生物の宿主微生物にはエシェリヒア（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ）属の微生物が用いられる。この中で
も、形質転換微生物の作製の容易さ等の点から好ましく
はエシェリヒア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉ）種の微生物が用いられ、より好ましくは、エシェ
リヒアコリ ＪＭ１０５（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉ ＪＭ１０５）株の微生物が用いられる。
【０００７】本発明死菌化方法に用いられる形質転換微
生物に導入されるＤＮＡは、熱変性温度が５０℃以上で
ある酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する
ＤＮＡである。ここで、酵素の熱変性温度とは、１０ｍ
Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５〜ｐＨ７．
５）中に約１μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ程度の割合
で精製酵素を含む溶液を試料として、かつ測定波長２２
２ｎｍで温度（例えば、４０℃以上７０℃以下の温度範
囲を含む温度）を変化（例えば、約１℃／１ｍｉｎ以下
の昇温勾配）させながら円二色性スペクトルを円二色性
分散計を用いて測定する場合において、測定値の変化率
が最も大きい温度をいう。
生物に導入されるＤＮＡは、熱変性温度が５０℃以上で
ある酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する
ＤＮＡである。ここで、酵素の熱変性温度とは、１０ｍ
Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５〜ｐＨ７．
５）中に約１μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ程度の割合
で精製酵素を含む溶液を試料として、かつ測定波長２２
２ｎｍで温度（例えば、４０℃以上７０℃以下の温度範
囲を含む温度）を変化（例えば、約１℃／１ｍｉｎ以下
の昇温勾配）させながら円二色性スペクトルを円二色性
分散計を用いて測定する場合において、測定値の変化率
が最も大きい温度をいう。
【０００８】熱変性温度が５０℃以上である酵素とは、
通常、５０℃以上８０℃以下の熱変性温度を有する酵素
であって、例えば、熱変性温度が５０℃以上である酸化
還元酵素、熱変性温度が５０℃以上である転移酵素、熱
変性温度が５０℃以上である加水分解酵素、熱変性温度
が５０℃以上である脱離酵素、熱変性温度が５０℃以上
である異性化酵素、熱変性温度が５０℃以上である合成
酵素等が挙げられ、好ましくはアスペルギルス属由来の
エステラーゼ、アルスロバクター属由来のエステラー
ゼ、クロモバクテリウム属由来のエステラーゼ等が挙げ
られる。これら熱変性温度が５０℃以上である酵素のア
ミノ酸配列をコードする塩基配列は、例えば、当該酵素
に耐熱性を付与する等のために特異的変異を有するアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列でも特異的変異を持たな
いアミノ酸配列をコードする塩基配列でもどちらでも構
わない。
通常、５０℃以上８０℃以下の熱変性温度を有する酵素
であって、例えば、熱変性温度が５０℃以上である酸化
還元酵素、熱変性温度が５０℃以上である転移酵素、熱
変性温度が５０℃以上である加水分解酵素、熱変性温度
が５０℃以上である脱離酵素、熱変性温度が５０℃以上
である異性化酵素、熱変性温度が５０℃以上である合成
酵素等が挙げられ、好ましくはアスペルギルス属由来の
エステラーゼ、アルスロバクター属由来のエステラー
ゼ、クロモバクテリウム属由来のエステラーゼ等が挙げ
られる。これら熱変性温度が５０℃以上である酵素のア
ミノ酸配列をコードする塩基配列は、例えば、当該酵素
に耐熱性を付与する等のために特異的変異を有するアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列でも特異的変異を持たな
いアミノ酸配列をコードする塩基配列でもどちらでも構
わない。
【０００９】熱変性温度が５０℃以上である酵素のアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列の具体例としては、例え
ば、以下のものが挙げられる。 （ａ）配列番号１で示される塩基配列。 （ｂ）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡと
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
の塩基配列であって、かつラセミ体のＮ−ベンジルアゼ
チジン−２−カルボン酸エチルエステルを不斉加水分解
し、（Ｓ）体のＮ−ベンジルアゼチジン−２−カルボン
酸を優先的に生産する能力を有する酵素のアミノ酸配列
をコードする塩基配列。 （ｃ）配列番号２で示される塩基配列。 （ｄ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡと
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
の塩基配列であって、かつ菊酸または菊酸誘導体のエス
テルを不斉加水分解する酵素のアミノ酸配列をコードす
る塩基配列。 （ｅ）配列番号３で示される塩基配列。 （ｆ）配列番号３で示される塩基配列に併記されるアミ
ノ酸配列において１６０番目のアミノ酸が下記のＡ群か
ら選ばれるアミノ酸に置換され、かつ１８９番目のアミ
ノ酸が下記のアミノ酸からなるＢ群から選ばれるアミノ
酸に置換されてなるアミノ酸配列をコードする塩基配
列。 （ｇ）前記（ｆ）からなるＤＮＡとストリンジェントな
条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列であっ
て、かつ前記（ｆ）によりコードされるアミノ酸配列か
らなる酵素と同等な触媒機能を有する酵素のアミノ酸配
列をコードする塩基配列。 （Ａ群） アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン （Ｂ群） アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、
スレオニン、フェニルアラニン、ヒスチジン、チロシ
ン、アルギニン
ノ酸配列をコードする塩基配列の具体例としては、例え
ば、以下のものが挙げられる。 （ａ）配列番号１で示される塩基配列。 （ｂ）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡと
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
の塩基配列であって、かつラセミ体のＮ−ベンジルアゼ
チジン−２−カルボン酸エチルエステルを不斉加水分解
し、（Ｓ）体のＮ−ベンジルアゼチジン−２−カルボン
酸を優先的に生産する能力を有する酵素のアミノ酸配列
をコードする塩基配列。 （ｃ）配列番号２で示される塩基配列。 （ｄ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡと
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
の塩基配列であって、かつ菊酸または菊酸誘導体のエス
テルを不斉加水分解する酵素のアミノ酸配列をコードす
る塩基配列。 （ｅ）配列番号３で示される塩基配列。 （ｆ）配列番号３で示される塩基配列に併記されるアミ
ノ酸配列において１６０番目のアミノ酸が下記のＡ群か
ら選ばれるアミノ酸に置換され、かつ１８９番目のアミ
ノ酸が下記のアミノ酸からなるＢ群から選ばれるアミノ
酸に置換されてなるアミノ酸配列をコードする塩基配
列。 （ｇ）前記（ｆ）からなるＤＮＡとストリンジェントな
条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列であっ
て、かつ前記（ｆ）によりコードされるアミノ酸配列か
らなる酵素と同等な触媒機能を有する酵素のアミノ酸配
列をコードする塩基配列。 （Ａ群） アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン （Ｂ群） アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、
スレオニン、フェニルアラニン、ヒスチジン、チロシ
ン、アルギニン
【００１０】配列番号１で示される塩基配列を有するＤ
ＮＡは、例えば、アスペルギルス・フラバス（Ａａｐｅ
ｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）ＡＴＣＣ１１４９２株
等の微生物から通常の方法でｃＤＮＡライブラリーを作
製し、このｃＤＮＡライブラリーを鋳型に用いてＰＣＲ
を行うことによって得ることができる。
ＮＡは、例えば、アスペルギルス・フラバス（Ａａｐｅ
ｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）ＡＴＣＣ１１４９２株
等の微生物から通常の方法でｃＤＮＡライブラリーを作
製し、このｃＤＮＡライブラリーを鋳型に用いてＰＣＲ
を行うことによって得ることができる。
【００１１】配列番号２で示される塩基配列を有するＤ
ＮＡは、例えば、アルスロバクターＳＣ−６−９８−２
８（工業技術院 生命工学技術研究所 寄託番号 ＦＥ
ＲＭＢＰ−３６５８）等の微生物から通常の方法でｃＤ
ＮＡライブラリーを作製し、このｃＤＮＡライブラリー
を鋳型に用いてＰＣＲを行うことによって得ることがで
きる。
ＮＡは、例えば、アルスロバクターＳＣ−６−９８−２
８（工業技術院 生命工学技術研究所 寄託番号 ＦＥ
ＲＭＢＰ−３６５８）等の微生物から通常の方法でｃＤ
ＮＡライブラリーを作製し、このｃＤＮＡライブラリー
を鋳型に用いてＰＣＲを行うことによって得ることがで
きる。
【００１２】配列番号３で示される塩基配列を有するＤ
ＮＡは、例えば、クロモバクテリウム（Chromobacteriu
m）SC-YM-1株（工業技術院 生命工学技術研究所 寄託
番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４００９）等の微生物から通常の
方法でｃＤＮＡライブラリーを作製し、このｃＤＮＡラ
イブラリーを鋳型に用いてＰＣＲを行うことによって得
ることができる。
ＮＡは、例えば、クロモバクテリウム（Chromobacteriu
m）SC-YM-1株（工業技術院 生命工学技術研究所 寄託
番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４００９）等の微生物から通常の
方法でｃＤＮＡライブラリーを作製し、このｃＤＮＡラ
イブラリーを鋳型に用いてＰＣＲを行うことによって得
ることができる。
【００１３】このようにして得られたＤＮＡに下記の部
位特異的変異を導入するには、原型のＤＮＡ（ここでは
野生型の遺伝子である）が組み込まれたプラスミドの１
本鎖ＤＮＡを鋳型にして、変異を導入する塩基配列を含
む合成オリゴヌクレオシドをプライマーとして変異型の
遺伝子を合成すればよい。例えば、Smithら（GeneticEn
gineering ３１ Setlow,J. and Hollaender,A Plenum:
New York）、Vlasukら（Experimental Manipulation of
Gene Expression, Inouye,M :Academic Press, New Yo
rk）、Hos.N.Hunt ら（Gene, 77,51,1989）の方法等を
あげることができる。本発明では、配列番号３で示され
る塩基配列に併記されるアミノ酸配列において１６０番
目および／１８９番目のアミノ酸がグリシン以外のアミ
ノ酸の置換されるように変異プライマーを調製し、ＰＣ
Ｒ法による増幅を行えばよい。好ましくは、１６０番目
のアミノ酸が下記のＡ群から選ばれるアミノ酸に置換さ
れ、かつ１８９番目のアミノ酸が下記のＢ群から選ばれ
るアミノ酸に置換されるような特異的変異を導入するこ
とが好ましい。 （Ａ群） アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン （Ｂ群） アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、
スレオニン、フェニルアラニン、ヒスチジン、チロシ
ン、アルギニン 尚、配列番号３で示される塩基配列に併記されるアミノ
酸配列において１６０番目および１８９番目のアミノ酸
に同時に部位特異的変異を導入してもよい。
位特異的変異を導入するには、原型のＤＮＡ（ここでは
野生型の遺伝子である）が組み込まれたプラスミドの１
本鎖ＤＮＡを鋳型にして、変異を導入する塩基配列を含
む合成オリゴヌクレオシドをプライマーとして変異型の
遺伝子を合成すればよい。例えば、Smithら（GeneticEn
gineering ３１ Setlow,J. and Hollaender,A Plenum:
New York）、Vlasukら（Experimental Manipulation of
Gene Expression, Inouye,M :Academic Press, New Yo
rk）、Hos.N.Hunt ら（Gene, 77,51,1989）の方法等を
あげることができる。本発明では、配列番号３で示され
る塩基配列に併記されるアミノ酸配列において１６０番
目および／１８９番目のアミノ酸がグリシン以外のアミ
ノ酸の置換されるように変異プライマーを調製し、ＰＣ
Ｒ法による増幅を行えばよい。好ましくは、１６０番目
のアミノ酸が下記のＡ群から選ばれるアミノ酸に置換さ
れ、かつ１８９番目のアミノ酸が下記のＢ群から選ばれ
るアミノ酸に置換されるような特異的変異を導入するこ
とが好ましい。 （Ａ群） アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン （Ｂ群） アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、
スレオニン、フェニルアラニン、ヒスチジン、チロシ
ン、アルギニン 尚、配列番号３で示される塩基配列に併記されるアミノ
酸配列において１６０番目および１８９番目のアミノ酸
に同時に部位特異的変異を導入してもよい。
【００１４】本発明において、あるＤＮＡとストリンジ
ェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、例え
ば、「クローニングとシークエンス」（渡辺格監修、杉
浦昌弘編集、１９８９、農村文化社発行）等に記載され
るサザンハイブリダイゼーション方法において、（１）
高イオン条件下［例えば、６ＸＳＳＣ（９００ｍＭの塩
化ナトリウム、９０ｍＭのクエン酸ナトリウム）等が挙
げられる。］に６５℃の温度条件でハイブリダイズさせ
ることによりあるＤＮＡとＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド
を形成し、（２）低イオン濃度下［例えば、０．１Ｘ
ＳＳＣ（１５ｍＭの塩化ナトリウム、１．５ｍＭのクエ
ン酸ナトリウム）等が用いられる。］に６５℃の温度条
件で３０分保温した後でも該ハイブリッドが維持される
ようなＤＮＡをいう。
ェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、例え
ば、「クローニングとシークエンス」（渡辺格監修、杉
浦昌弘編集、１９８９、農村文化社発行）等に記載され
るサザンハイブリダイゼーション方法において、（１）
高イオン条件下［例えば、６ＸＳＳＣ（９００ｍＭの塩
化ナトリウム、９０ｍＭのクエン酸ナトリウム）等が挙
げられる。］に６５℃の温度条件でハイブリダイズさせ
ることによりあるＤＮＡとＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド
を形成し、（２）低イオン濃度下［例えば、０．１Ｘ
ＳＳＣ（１５ｍＭの塩化ナトリウム、１．５ｍＭのクエ
ン酸ナトリウム）等が用いられる。］に６５℃の温度条
件で３０分保温した後でも該ハイブリッドが維持される
ようなＤＮＡをいう。
【００１５】本発明死菌化方法に用いられる形質転換微
生物は、例えば、熱変性温度が５０℃以上である酵素の
アミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡと宿
主微生物とから「Molecular Cloning: A Laboratory Ma
nual 2nd edition」（1989）, Cold Spring Harbor Lab
oratory Press、「Current Protocols in MolecularBio
logy」(1987), John Wiley & Sons, Inc. ISBNO-471-50
338-X等に記載されている通常の方法に準じて作製する
ことができる。
生物は、例えば、熱変性温度が５０℃以上である酵素の
アミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡと宿
主微生物とから「Molecular Cloning: A Laboratory Ma
nual 2nd edition」（1989）, Cold Spring Harbor Lab
oratory Press、「Current Protocols in MolecularBio
logy」(1987), John Wiley & Sons, Inc. ISBNO-471-50
338-X等に記載されている通常の方法に準じて作製する
ことができる。
【００１６】上記の方法で作製した形質転換微生物は、
例えば、発酵工学の基礎（１９８９）学会出版センタ
ー，Ｐ．Ｆ．Ｓｔａｎｂｕｒｙ，Ａ．Ｗｈｉｔａｋｅｒ
著、石崎文彬訳に記載されている通常の方法で培養する
ことにより、導入したＤＮＡを発現させ、有用物質生産
に有用な酵素を産生させることができる。
例えば、発酵工学の基礎（１９８９）学会出版センタ
ー，Ｐ．Ｆ．Ｓｔａｎｂｕｒｙ，Ａ．Ｗｈｉｔａｋｅｒ
著、石崎文彬訳に記載されている通常の方法で培養する
ことにより、導入したＤＮＡを発現させ、有用物質生産
に有用な酵素を産生させることができる。
【００１７】本発明死菌化方法は、このようにして得ら
れる形質転換微生物を含む液と、該微生物含有液に対し
１０重量％以上３５重量％以下の量の炭素数１〜３の１
価のアルコール及び／またはアセトンとを２５℃以上３
５℃未満で混合することにより達成される。
れる形質転換微生物を含む液と、該微生物含有液に対し
１０重量％以上３５重量％以下の量の炭素数１〜３の１
価のアルコール及び／またはアセトンとを２５℃以上３
５℃未満で混合することにより達成される。
【００１８】本発明死菌化方法に用いられる炭素数１〜
３の１価のアルコールとは、メタノール、エタノール、
プロパノール又はイソプロパノールである。
３の１価のアルコールとは、メタノール、エタノール、
プロパノール又はイソプロパノールである。
【００１９】形質転換されたエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ）属の微生物を含む液と、該微生物含有液
に対し１０重量％以上３５重量％以下の量の炭素数１〜
３の１価のアルコール及び／またはアセトンとを混合す
る方法としては、例えば、前記微生物の培養液、懸濁液
等の微生物含有液に炭素数１〜３の１価のアルコール及
び／又はアセトンを加えた後、攪拌又は振盪する方法、
同じ反応容器に前記微生物の培養液、懸濁液等の微生物
含有液と炭素数１〜３の１価のアルコール及び／又はア
セトンとを攪拌又は振盪しながら並行して加える方法等
があげられる。
ｒｉｃｈｉａ）属の微生物を含む液と、該微生物含有液
に対し１０重量％以上３５重量％以下の量の炭素数１〜
３の１価のアルコール及び／またはアセトンとを混合す
る方法としては、例えば、前記微生物の培養液、懸濁液
等の微生物含有液に炭素数１〜３の１価のアルコール及
び／又はアセトンを加えた後、攪拌又は振盪する方法、
同じ反応容器に前記微生物の培養液、懸濁液等の微生物
含有液と炭素数１〜３の１価のアルコール及び／又はア
セトンとを攪拌又は振盪しながら並行して加える方法等
があげられる。
【００２０】本発明死菌化方法を完結するために必要な
時間は、培養終了時における微生物含有液中の形質転換
微生物の密度、使用される酵素の熱変性温度、微生物含
有液に添加されるアルコールまたはアセトンの量等に応
じて変化し得るが、例えば、５分間〜４日間であり、好
ましくは１５分間〜２日間、より好ましくは３０分間〜
２日間、特に好ましくは６時間〜２日間である。
時間は、培養終了時における微生物含有液中の形質転換
微生物の密度、使用される酵素の熱変性温度、微生物含
有液に添加されるアルコールまたはアセトンの量等に応
じて変化し得るが、例えば、５分間〜４日間であり、好
ましくは１５分間〜２日間、より好ましくは３０分間〜
２日間、特に好ましくは６時間〜２日間である。
【００２１】本発明死菌化方法の終了、すなわち形質転
換微生物が死滅したことは、微生物含有液と炭素数１〜
３の１価のアルコール及び／またはアセトンとを混合し
た液の一部を、形質転換微生物が生育可能な寒天培地に
塗布し、コロニーを形成しなくなることによって判断で
きる。本発明では、酵素の熱変性温度が高いほど、添加
されるアルコール及び／またはアセトンの量を多くする
ことが可能となり、また添加されるアルコール及び／ま
たはアセトンの量が多いほど、死菌化完結時間を短くす
ることが可能である。
換微生物が死滅したことは、微生物含有液と炭素数１〜
３の１価のアルコール及び／またはアセトンとを混合し
た液の一部を、形質転換微生物が生育可能な寒天培地に
塗布し、コロニーを形成しなくなることによって判断で
きる。本発明では、酵素の熱変性温度が高いほど、添加
されるアルコール及び／またはアセトンの量を多くする
ことが可能となり、また添加されるアルコール及び／ま
たはアセトンの量が多いほど、死菌化完結時間を短くす
ることが可能である。
【００２２】本発明死菌化方法により得られる死菌化液
は、そのままの状態または当該死菌化液を処理した後、
有機合成反応に用いることができる。死菌化液を処理す
る方法としては、例えば、（１）死菌化液をダイノミル
等により菌体を破砕し、膜濾過、遠心分離等により菌体
破砕物を取り除く方法、（２）膜濾過、遠心分離等によ
り菌体を取り除いた後、限外濾過により低分子成分等を
取り除く方法、（３）死菌化液から目的とする酵素を粗
精製酵素、精製酵素の形態で単離する方法、（４）死菌
化液から単離した粗精製酵素、精製酵素を通常の方法で
固定化する方法等があげられる。
は、そのままの状態または当該死菌化液を処理した後、
有機合成反応に用いることができる。死菌化液を処理す
る方法としては、例えば、（１）死菌化液をダイノミル
等により菌体を破砕し、膜濾過、遠心分離等により菌体
破砕物を取り除く方法、（２）膜濾過、遠心分離等によ
り菌体を取り除いた後、限外濾過により低分子成分等を
取り除く方法、（３）死菌化液から目的とする酵素を粗
精製酵素、精製酵素の形態で単離する方法、（４）死菌
化液から単離した粗精製酵素、精製酵素を通常の方法で
固定化する方法等があげられる。
【００２３】
【実施例】以下、本発明を実施例等により、さらに詳し
く説明するが、本発明は以下の例に限定されるものでは
ない。
く説明するが、本発明は以下の例に限定されるものでは
ない。
【００２４】実施例１ 後述参考例１記載の方法により、エシェリヒア コリ
（Ｅ．ｃｏｌｉ） ＪＭ１０５／ｐＹＨＮＫ２株を培養
した培養液（１）４０ｍｌとエタノール１０ｍｌとを１
００ｍｌ容ガラス製ネジ口瓶に入れ、３０℃で２４時間
攪拌した。その後のこの混合液のエステラーゼ活性は培
養液（１）の９５％以上であり、生菌数は０cfu/mlであ
った。 実施例２ 後述参考例１記載の方法により、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１
０５／ｐＹＨＮＫ２株を培養した培養液（１）４０ｍｌ
とエタノール１０ｍｌとを１００ｍｌ容ガラス製ネジ口
瓶に入れ、３０℃で６時間攪拌した。その後のこの混合
液のエステラーゼ活性は培養液（１）の９５％以上であ
り、生菌数は０cfu/mlであった。
（Ｅ．ｃｏｌｉ） ＪＭ１０５／ｐＹＨＮＫ２株を培養
した培養液（１）４０ｍｌとエタノール１０ｍｌとを１
００ｍｌ容ガラス製ネジ口瓶に入れ、３０℃で２４時間
攪拌した。その後のこの混合液のエステラーゼ活性は培
養液（１）の９５％以上であり、生菌数は０cfu/mlであ
った。 実施例２ 後述参考例１記載の方法により、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１
０５／ｐＹＨＮＫ２株を培養した培養液（１）４０ｍｌ
とエタノール１０ｍｌとを１００ｍｌ容ガラス製ネジ口
瓶に入れ、３０℃で６時間攪拌した。その後のこの混合
液のエステラーゼ活性は培養液（１）の９５％以上であ
り、生菌数は０cfu/mlであった。
【００２５】実施例３ 後述参考例１記載の方法により、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１
０５／ｐＹＨＮＫ２株を培養した培養液（１）４０ｍｌ
とエタノール１０ｍｌとを１００ｍｌ容ガラス製ネジ口
瓶に入れ、３０℃で４８時間攪拌した。その後のこの混
合液のエステラーゼ活性は培養液（１）の９５％以上で
あり、生菌数は０cfu/mlであった。
０５／ｐＹＨＮＫ２株を培養した培養液（１）４０ｍｌ
とエタノール１０ｍｌとを１００ｍｌ容ガラス製ネジ口
瓶に入れ、３０℃で４８時間攪拌した。その後のこの混
合液のエステラーゼ活性は培養液（１）の９５％以上で
あり、生菌数は０cfu/mlであった。
【００２６】実施例４ 後述参考例１記載の方法により、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１
０５／ｐＹＨＮＫ２株を培養した培養液（１）４２．５
ｍｌとエタノール７．５ｍｌとを１００ｍｌ容ガラス製
ネジ口瓶に入れ、３０℃で２４時間攪拌した。その後の
この混合液のエステラーゼ活性は培養液（１）の９５％
以上であり、生菌数は０cfu/mlであった。
０５／ｐＹＨＮＫ２株を培養した培養液（１）４２．５
ｍｌとエタノール７．５ｍｌとを１００ｍｌ容ガラス製
ネジ口瓶に入れ、３０℃で２４時間攪拌した。その後の
この混合液のエステラーゼ活性は培養液（１）の９５％
以上であり、生菌数は０cfu/mlであった。
【００２７】実施例５ 後述参考例１記載の方法により、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１
０５／ｐＹＨＮＫ２株を培養した培養液（１）４０ｍｌ
とメタノール１０ｍｌとを１００ｍｌ容ガラス製ネジ口
瓶に入れ、３０℃で２４時間攪拌した。その後のこの混
合液のエステラーゼ活性は培養液（１）の９５％以上で
あり、生菌数は０cfu/mlであった。
０５／ｐＹＨＮＫ２株を培養した培養液（１）４０ｍｌ
とメタノール１０ｍｌとを１００ｍｌ容ガラス製ネジ口
瓶に入れ、３０℃で２４時間攪拌した。その後のこの混
合液のエステラーゼ活性は培養液（１）の９５％以上で
あり、生菌数は０cfu/mlであった。
【００２８】実施例６ 後述参考例１記載の方法により、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１
０５／ｐＹＨＮＫ２株を培養した培養液（１）４０ｍｌ
とメタノール１０ｍｌとを１００ｍｌ容ガラス製ネジ口
瓶に入れ、３０℃で６時間攪拌した。その後のこの混合
液のエステラーゼ活性は培養液（１）の９５％以上であ
り、生菌数は０cfu/mlであった。
０５／ｐＹＨＮＫ２株を培養した培養液（１）４０ｍｌ
とメタノール１０ｍｌとを１００ｍｌ容ガラス製ネジ口
瓶に入れ、３０℃で６時間攪拌した。その後のこの混合
液のエステラーゼ活性は培養液（１）の９５％以上であ
り、生菌数は０cfu/mlであった。
【００２９】実施例７ 後述参考例１記載の方法により、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１
０５／ｐＹＨＮＫ２株を培養した培養液（１）４０ｍｌ
とメタノール１０ｍｌとを１００ｍｌ容ガラス製ネジ口
瓶に入れ、３０℃で４８時間攪拌した。その後のこの混
合液のエステラーゼ活性は培養液（１）の９５％以上で
あり、生菌数は０cfu/mlであった。 実施例８ 後述参考例１記載の方法により、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１
０５／ｐＹＨＮＫ２株を培養した培養液（１）４０ｇと
メタノール１２ｇとを１００ｍｌ容ガラス製ネジ口瓶に
入れ、２５℃で５時間攪拌した。その後のこの混合液の
エステラーゼ活性は培養液（１）の９２％以上であり、
生菌数は０cfu/mlであった。
０５／ｐＹＨＮＫ２株を培養した培養液（１）４０ｍｌ
とメタノール１０ｍｌとを１００ｍｌ容ガラス製ネジ口
瓶に入れ、３０℃で４８時間攪拌した。その後のこの混
合液のエステラーゼ活性は培養液（１）の９５％以上で
あり、生菌数は０cfu/mlであった。 実施例８ 後述参考例１記載の方法により、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１
０５／ｐＹＨＮＫ２株を培養した培養液（１）４０ｇと
メタノール１２ｇとを１００ｍｌ容ガラス製ネジ口瓶に
入れ、２５℃で５時間攪拌した。その後のこの混合液の
エステラーゼ活性は培養液（１）の９２％以上であり、
生菌数は０cfu/mlであった。
【００３０】実施例９ 後述参考例１記載の方法により、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１
０５／ｐＹＨＮＫ２株を培養した培養液（１）４０ｍｌ
とアセトン１０ｍｌとを１００ｍｌ容ガラス製ネジ口瓶
に入れ、３０℃で２４時間攪拌した。その後のこの混合
液のエステラーゼ活性は培養液（１）の９５％以上であ
り、生菌数は０cfu/mlであった。
０５／ｐＹＨＮＫ２株を培養した培養液（１）４０ｍｌ
とアセトン１０ｍｌとを１００ｍｌ容ガラス製ネジ口瓶
に入れ、３０℃で２４時間攪拌した。その後のこの混合
液のエステラーゼ活性は培養液（１）の９５％以上であ
り、生菌数は０cfu/mlであった。
【００３１】実施例１０ 後述参考例１記載の方法により、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１
０５／ｐＹＨＮＫ２株を培養した培養液（１）４０ｍｌ
とアセトン１０ｍｌとを１００ｍｌ容ガラス製ネジ口瓶
に入れ、３０℃で６時間攪拌した。その後のこの混合液
のエステラーゼ活性は培養液（１）の９５％以上であ
り、生菌数は０cfu/mlであった。
０５／ｐＹＨＮＫ２株を培養した培養液（１）４０ｍｌ
とアセトン１０ｍｌとを１００ｍｌ容ガラス製ネジ口瓶
に入れ、３０℃で６時間攪拌した。その後のこの混合液
のエステラーゼ活性は培養液（１）の９５％以上であ
り、生菌数は０cfu/mlであった。
【００３２】実施例１１ 後述参考例１記載の方法により、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１
０５／ｐＹＨＮＫ２株を培養した培養液（１）４０ｍｌ
とアセトン１０ｍｌとを１００ｍｌ容ガラス製ネジ口瓶
に入れ、３０℃で４８時間攪拌した。その後のこの混合
液のエステラーゼ活性は培養液（１）の９５％以上であ
り、生菌数は０cfu/mlであった。
０５／ｐＹＨＮＫ２株を培養した培養液（１）４０ｍｌ
とアセトン１０ｍｌとを１００ｍｌ容ガラス製ネジ口瓶
に入れ、３０℃で４８時間攪拌した。その後のこの混合
液のエステラーゼ活性は培養液（１）の９５％以上であ
り、生菌数は０cfu/mlであった。
【００３３】実施例１２ 後述参考例１記載の方法により、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１
０５／ｐＹＨＮＫ２株を培養した培養液（１）４５ｍｌ
とアセトン６．５ｍｌとを１００ｍｌ容ガラス製ネジ口
瓶に入れ、３０℃で２４時間攪拌した。その後のこの混
合液のエステラーゼ活性は培養液（１）の９５％以上で
あり、生菌数は０cfu/mlであった。
０５／ｐＹＨＮＫ２株を培養した培養液（１）４５ｍｌ
とアセトン６．５ｍｌとを１００ｍｌ容ガラス製ネジ口
瓶に入れ、３０℃で２４時間攪拌した。その後のこの混
合液のエステラーゼ活性は培養液（１）の９５％以上で
あり、生菌数は０cfu/mlであった。
【００３４】上記実施例１〜１２におけるエステラーゼ
活性測定は、以下の方法で行なった。Ｎ−ベンジルアゼ
チジン−２−カルボン酸エチル０．０２ｇ、ｔ−ブチル
メチルエーテル１．０ｍｌおよび１００ｍＭリン酸１カ
リウム−リン酸２カリウムバッファー（ｐＨ７．０）
３．５ｍｌを１０ｍｌ容ねじ口試験管に入れ、これを３
５℃で１５分間保温した。この試験管にエステラーゼ活
性を測定する試料液２００μｌを加え、３５℃で１６分
間往復振盪（１２０str/min）した。ついで、この混合
液４００μｌにｔ−ブチルメチルエーテル１ｍｌを加え
て攪拌した後、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、５分間）
した。得られた水層のうち２００μｌを２０ｍＭリン酸
一カリウム水／アセトニトリル＝９０／１０に溶解し、
０．２μｍフィルターで濾過した後、高速液体クロマト
グラフィーでＮ−ベンジルアゼチジン−２−カルボン酸
を定量分析した（絶対検量線法による）。
活性測定は、以下の方法で行なった。Ｎ−ベンジルアゼ
チジン−２−カルボン酸エチル０．０２ｇ、ｔ−ブチル
メチルエーテル１．０ｍｌおよび１００ｍＭリン酸１カ
リウム−リン酸２カリウムバッファー（ｐＨ７．０）
３．５ｍｌを１０ｍｌ容ねじ口試験管に入れ、これを３
５℃で１５分間保温した。この試験管にエステラーゼ活
性を測定する試料液２００μｌを加え、３５℃で１６分
間往復振盪（１２０str/min）した。ついで、この混合
液４００μｌにｔ−ブチルメチルエーテル１ｍｌを加え
て攪拌した後、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、５分間）
した。得られた水層のうち２００μｌを２０ｍＭリン酸
一カリウム水／アセトニトリル＝９０／１０に溶解し、
０．２μｍフィルターで濾過した後、高速液体クロマト
グラフィーでＮ−ベンジルアゼチジン−２−カルボン酸
を定量分析した（絶対検量線法による）。
【００３５】上記実施例１〜１２における生菌数測定
は、以下の方法で行なった。生菌数を測定する試料液を
約１ｍｌを４℃に冷却した生理食塩水で希釈した。この
希釈液１００μｌをアンピシリン１００μｇ／ｍｌ含有
したＬＢ培地プレート（L-Broth Ager(BIO 101社製)）
に塗布し３７℃で１〜２日静置した。その後、生育した
コロニー数から試料液の生菌数を計算した。
は、以下の方法で行なった。生菌数を測定する試料液を
約１ｍｌを４℃に冷却した生理食塩水で希釈した。この
希釈液１００μｌをアンピシリン１００μｇ／ｍｌ含有
したＬＢ培地プレート（L-Broth Ager(BIO 101社製)）
に塗布し３７℃で１〜２日静置した。その後、生育した
コロニー数から試料液の生菌数を計算した。
【００３６】次に、実施例で使用した形質転換体及びそ
の培養液の製造について、参考例を示す。 参考例１ アスペルギルス・フラバス（Ａａｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｆｌａｖｕｓ）ＡＴＣＣ１１４９２株から「バイオ総合
カタログ１９９７／９８ Ｖｏｌ．１遺伝子工学Ｅ−２
４〜２７」記載の方法に基づいてｃＤＮＡライブラリー
を作製した。配列番号５で示されるオリゴヌクレオチド
と、ＳＰ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｐｒｉｍｅｒ（宝酒造社
製）とをプライマーに用い、前記のｃＤＮＡライブラリ
ーを鋳型に用いて、ＰＣＲを行った（パーキンエルマー
・キコーテック社製のＴａｑポリメラーゼＧｏｌｄ Ｐ
ＣＲキットを使用）。ＰＣＲ条件を以下に示す。
の培養液の製造について、参考例を示す。 参考例１ アスペルギルス・フラバス（Ａａｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｆｌａｖｕｓ）ＡＴＣＣ１１４９２株から「バイオ総合
カタログ１９９７／９８ Ｖｏｌ．１遺伝子工学Ｅ−２
４〜２７」記載の方法に基づいてｃＤＮＡライブラリー
を作製した。配列番号５で示されるオリゴヌクレオチド
と、ＳＰ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｐｒｉｍｅｒ（宝酒造社
製）とをプライマーに用い、前記のｃＤＮＡライブラリ
ーを鋳型に用いて、ＰＣＲを行った（パーキンエルマー
・キコーテック社製のＴａｑポリメラーゼＧｏｌｄ Ｐ
ＣＲキットを使用）。ＰＣＲ条件を以下に示す。
【００３７】 ［反応液組成］ ｃＤＮＡライブラリー原液 １μｌ ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ） １０μｌ プライマー（５ｐｍｏｌ／μｌ） 各１μｌ×２種 １０ｘｂｕｆｆｅｒ（ｗｉｔｈ ＭｇＣｌ） １０μｌ ＴａｑポリメラーゼＧｏｌｄ（２．５Ｕ／μｌ） １μｌ 超純水 ７６μｌ ［ＰＣＲ条件］反応混合液の入った容器をＧｅｎｅＡｍ
ｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ２４００（ＰＥＲＫＩＮ Ｅ
ＬＭＥＲ社製）にセットし、９８℃（７分間）加熱処理
した後、９７℃（０．３分間）−４５℃（１分間）−７
２℃（２分間）を２０サイクル繰り返し、次いで９４℃
（１分間）−５０℃（０．３分間）−７５℃（２．５分
間）を２０サイクル繰り返し、さらに７０℃（７分間）
の処理を行った。
ｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ２４００（ＰＥＲＫＩＮ Ｅ
ＬＭＥＲ社製）にセットし、９８℃（７分間）加熱処理
した後、９７℃（０．３分間）−４５℃（１分間）−７
２℃（２分間）を２０サイクル繰り返し、次いで９４℃
（１分間）−５０℃（０．３分間）−７５℃（２．５分
間）を２０サイクル繰り返し、さらに７０℃（７分間）
の処理を行った。
【００３８】こうして得られた配列番号１で示される塩
基配列を有するＤＮＡをＴＯＰＯT MＴＡ ｃｌｏｎｉｎ
ｇキットＶｅｒ．Ｅキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社
製）付属のｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターのＰＣＲ
Ｐｒｏｄｕｃｔ挿入サイトにライゲーションしてベクタ
ーｐＹＨＮＫ１を得た。このライゲーション反応液を
Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５コンピテントセル（ファルマ
シア バイオテック社製）に添加して、ライゲーション
反応により作製されたベクターｐＹＨＮＫ１が導入され
た形質転換体を得た。この形質転換体を培養し、ＱＩＡ
ＧＥＮ ｐｌａｓｍｉｄキット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を
用いて、該キット添付のプロトコールに従い、多量のベ
クターｐＹＨＮＫ１を調製した。
基配列を有するＤＮＡをＴＯＰＯT MＴＡ ｃｌｏｎｉｎ
ｇキットＶｅｒ．Ｅキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社
製）付属のｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターのＰＣＲ
Ｐｒｏｄｕｃｔ挿入サイトにライゲーションしてベクタ
ーｐＹＨＮＫ１を得た。このライゲーション反応液を
Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５コンピテントセル（ファルマ
シア バイオテック社製）に添加して、ライゲーション
反応により作製されたベクターｐＹＨＮＫ１が導入され
た形質転換体を得た。この形質転換体を培養し、ＱＩＡ
ＧＥＮ ｐｌａｓｍｉｄキット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を
用いて、該キット添付のプロトコールに従い、多量のベ
クターｐＹＨＮＫ１を調製した。
【００３９】一方、表１に示すオリゴヌクレオチドＡＦ
１とオリゴヌクレオチドＡＲ２とを、また、オリゴヌク
レオチドＡＦ２とオリゴヌクレオチドＡＲ３とを、それ
ぞれ９０℃で５分間保温してアニーリングさせ二本鎖Ｄ
ＮＡを得た。得られた２種の２本鎖オリゴヌクレオチド
と予めＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩによって切断し開環され
たｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造製）とをライゲーションキッ
ト（宝酒造製）を用いて連結し、分泌用ベクターを作製
した（以下、分泌用ベクターＡと記す。）。該分泌用ベ
クターに挿入されたリンカー領域にコードされているア
ミノ酸配列を配列番号４に示す。
１とオリゴヌクレオチドＡＲ２とを、また、オリゴヌク
レオチドＡＦ２とオリゴヌクレオチドＡＲ３とを、それ
ぞれ９０℃で５分間保温してアニーリングさせ二本鎖Ｄ
ＮＡを得た。得られた２種の２本鎖オリゴヌクレオチド
と予めＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩによって切断し開環され
たｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造製）とをライゲーションキッ
ト（宝酒造製）を用いて連結し、分泌用ベクターを作製
した（以下、分泌用ベクターＡと記す。）。該分泌用ベ
クターに挿入されたリンカー領域にコードされているア
ミノ酸配列を配列番号４に示す。
【００４０】
【表１】
【００４１】さらに、ベクターｐＹＨＮＫ１からＥｃｏ
ＲＩによって切り出されたＤＮＡ断片（約８００ｂｐ）
を上記分泌用ベクターＡのＥｃｏＲＩサイトに挿入する
ことによりプラスミドｐＹＨＮＫ２を得た。このように
して得られたプラスミドｐＹＨＮＫ２を含む反応液を
Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０５コンピテントセル（ファルマシ
アバイオテック社製）に添加し、１００μｌ／ｍｌのア
ンピシリンを含むＬＢ寒天培地（Ｌ−ｂｒｏｔｈ ｐｏ
ｗｄｅｒ（宝酒造社製））を用いて選抜することによ
り、プラスミドｐＹＨＮＫ２が導入された形質転換体
Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＹＨＮＫ２株を得た。
ＲＩによって切り出されたＤＮＡ断片（約８００ｂｐ）
を上記分泌用ベクターＡのＥｃｏＲＩサイトに挿入する
ことによりプラスミドｐＹＨＮＫ２を得た。このように
して得られたプラスミドｐＹＨＮＫ２を含む反応液を
Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０５コンピテントセル（ファルマシ
アバイオテック社製）に添加し、１００μｌ／ｍｌのア
ンピシリンを含むＬＢ寒天培地（Ｌ−ｂｒｏｔｈ ｐｏ
ｗｄｅｒ（宝酒造社製））を用いて選抜することによ
り、プラスミドｐＹＨＮＫ２が導入された形質転換体
Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＹＨＮＫ２株を得た。
【００４２】試験管に、液体培地（水１ｌにグリセロー
ル５ｇ、酵母エキス６ｇ、リン酸１カリウム４ｇ、リン
酸２カリウム９．３ｇを溶解したもの）１０ｍｌを入れ
て、滅菌した。ここにアンピシリンを５０μｇ／ｍｌと
なるように加え、さらにE.coli JM105/pYHNK2株のグリ
セロールストック０．１ｍｌを加え、３０℃で９時間振
盪培養した。３ｌ容の培養槽に液体培地（水１５００ｍ
ｌにグリセロール２２．５ｇ、酵母エキス１５ｇ、総合
アミノ酸Ｆ２２．５ｇ、リン酸１カリウム６ｇ、硫酸マ
グネシウム３．６ｇ、硫酸第１鉄７水和物０．０６ｇ、
塩化カルシウム２水和物０．０６ｇを溶解し、４Ｍリン
酸水溶液と１４％（ｗ／ｗ）アンモニア水でｐＨ７．０
としたもの）１５００ｍｌを入れて滅菌した。ここにア
ンピシリンを５０μｌ／ｍｌとなるように加え、さらに
ここに、上記の試験管で培養した培養液を０．７５ｍｌ
加え、３０℃で通気攪拌培養した。培養開始から、１８
時間後に、isopropyl thio β-D-galactoside（ＩＰＴ
Ｇ）を５０μＭとなるように加えた。また、培養開始か
ら１４時間後滅菌した培地（水１１０ｇにグリセロール
１５０ｇ、酵母エキス２８ｇ及び総合アミノ酸Ｆ４２ｇ
を溶解したもの）を徐々に加えて培養した。培養開始か
ら、４０時間培養することにより、培養液（１）を得
た。
ル５ｇ、酵母エキス６ｇ、リン酸１カリウム４ｇ、リン
酸２カリウム９．３ｇを溶解したもの）１０ｍｌを入れ
て、滅菌した。ここにアンピシリンを５０μｇ／ｍｌと
なるように加え、さらにE.coli JM105/pYHNK2株のグリ
セロールストック０．１ｍｌを加え、３０℃で９時間振
盪培養した。３ｌ容の培養槽に液体培地（水１５００ｍ
ｌにグリセロール２２．５ｇ、酵母エキス１５ｇ、総合
アミノ酸Ｆ２２．５ｇ、リン酸１カリウム６ｇ、硫酸マ
グネシウム３．６ｇ、硫酸第１鉄７水和物０．０６ｇ、
塩化カルシウム２水和物０．０６ｇを溶解し、４Ｍリン
酸水溶液と１４％（ｗ／ｗ）アンモニア水でｐＨ７．０
としたもの）１５００ｍｌを入れて滅菌した。ここにア
ンピシリンを５０μｌ／ｍｌとなるように加え、さらに
ここに、上記の試験管で培養した培養液を０．７５ｍｌ
加え、３０℃で通気攪拌培養した。培養開始から、１８
時間後に、isopropyl thio β-D-galactoside（ＩＰＴ
Ｇ）を５０μＭとなるように加えた。また、培養開始か
ら１４時間後滅菌した培地（水１１０ｇにグリセロール
１５０ｇ、酵母エキス２８ｇ及び総合アミノ酸Ｆ４２ｇ
を溶解したもの）を徐々に加えて培養した。培養開始か
ら、４０時間培養することにより、培養液（１）を得
た。
【００４３】さらに実施例で使用したアスペルギルス・
フラバス（Ａａｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｌａｖｕｓ）ＡＴ
ＣＣ１１４９２株由来のエステラーゼの熱変性温度の測
定の例を参考例２に記す。 参考例２ 上記の参考例１記載の培養液（１）５００ｍｌを遠心し
て得た菌体に３００ｍｌの１００ｍＭリン酸１カリウム
−リン酸２カリウムバッファー（ｐＨ７．０）を加え攪
拌した後、当該菌懸濁液を遠心しその上清を得た。この
上清を粗酵素液とした。この粗酵素液５０ｍｌを用いて
弱イオン交換クロマト（カラム：ＤＥＡＥＳｅｐｈａｒ
ｏｓｅＦＦ、カラム（３０ｍｌ）、（緩衝液Ａ；１０ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液 ｐＨ７．０（３００ｍｌ）、緩
衝液Ｂ；１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液 ｐＨ７．０、１
Ｍ ＮａＣｌ（３００ｍｌ）、流速；４ｍｌ/ｍｉｎ）
を行い、エステラーゼ活性を有する画分を得た。次に得
られた画分を濃縮して、これをゲル濾過クロマト（カラ
ム；ＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘｇ２
００（１２０ｍｌ）、緩衝液Ａ；１０ｍＭトリス−塩酸
緩衝液 ｐＨ７．０ ０、２Ｍ ＮａＣｌ、流速；１ｍ
ｌ/ｍｉｎ）に供試し、エステラーゼ活性を有する画分
を得た。得られた画分を次に強陰イオン交換クロマト
（カラム；Ｈｉｔｒａｐ Ｑ（１ｍｌ）、緩衝液Ａ；１
０ｍＭトリス−塩酸緩衝液 ｐＨ７．０（３０ｍｌ）、
緩衝液Ｂ；１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液 ｐＨ７．０、
１ＭＮａＣｌ（３０ｍｌ）、流速；１ｍｌ/ｍｉｎ）に
供試し、エステラーゼ活性を有する画分を得た。この画
分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果、単一バンドであっ
た。このエステラーゼ活性を有する画分を精製酵素とし
た。つぎにこの精製酵素を用いて円二色性スペクトルを
測定することにより熱変性温度を調べた。円二色性分散
計Ｊ−７２０（日本分光社製）を用い、５μｇ／ｍｌ精
製酵素（１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ
７．０）を、３０℃から７０℃の範囲（温度スロープ；
５０℃／時間）、波長２２２ｎｍの条件で円二色性スペ
クトルを測定した。得られた円二色性スペクトルから熱
変性曲線を求めた結果、本精製酵素の熱変性温度は５
３．１℃であった。
フラバス（Ａａｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｌａｖｕｓ）ＡＴ
ＣＣ１１４９２株由来のエステラーゼの熱変性温度の測
定の例を参考例２に記す。 参考例２ 上記の参考例１記載の培養液（１）５００ｍｌを遠心し
て得た菌体に３００ｍｌの１００ｍＭリン酸１カリウム
−リン酸２カリウムバッファー（ｐＨ７．０）を加え攪
拌した後、当該菌懸濁液を遠心しその上清を得た。この
上清を粗酵素液とした。この粗酵素液５０ｍｌを用いて
弱イオン交換クロマト（カラム：ＤＥＡＥＳｅｐｈａｒ
ｏｓｅＦＦ、カラム（３０ｍｌ）、（緩衝液Ａ；１０ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液 ｐＨ７．０（３００ｍｌ）、緩
衝液Ｂ；１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液 ｐＨ７．０、１
Ｍ ＮａＣｌ（３００ｍｌ）、流速；４ｍｌ/ｍｉｎ）
を行い、エステラーゼ活性を有する画分を得た。次に得
られた画分を濃縮して、これをゲル濾過クロマト（カラ
ム；ＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘｇ２
００（１２０ｍｌ）、緩衝液Ａ；１０ｍＭトリス−塩酸
緩衝液 ｐＨ７．０ ０、２Ｍ ＮａＣｌ、流速；１ｍ
ｌ/ｍｉｎ）に供試し、エステラーゼ活性を有する画分
を得た。得られた画分を次に強陰イオン交換クロマト
（カラム；Ｈｉｔｒａｐ Ｑ（１ｍｌ）、緩衝液Ａ；１
０ｍＭトリス−塩酸緩衝液 ｐＨ７．０（３０ｍｌ）、
緩衝液Ｂ；１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液 ｐＨ７．０、
１ＭＮａＣｌ（３０ｍｌ）、流速；１ｍｌ/ｍｉｎ）に
供試し、エステラーゼ活性を有する画分を得た。この画
分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果、単一バンドであっ
た。このエステラーゼ活性を有する画分を精製酵素とし
た。つぎにこの精製酵素を用いて円二色性スペクトルを
測定することにより熱変性温度を調べた。円二色性分散
計Ｊ−７２０（日本分光社製）を用い、５μｇ／ｍｌ精
製酵素（１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ
７．０）を、３０℃から７０℃の範囲（温度スロープ；
５０℃／時間）、波長２２２ｎｍの条件で円二色性スペ
クトルを測定した。得られた円二色性スペクトルから熱
変性曲線を求めた結果、本精製酵素の熱変性温度は５
３．１℃であった。
【００４４】さらに上記の実施例で調製した死菌化液を
用いた反応の例を参考例３に記す。 参考例３ Ｎ−ベンジルアゼチジン−２−カルボン酸エチル１．０
１ｇ、ヘプタン０．５６ｇおよび蒸留水１．２ｇを５ｍ
ｌのサンプル瓶に入れ、実施例４で得られた混合液０．
０６ｇを加え、１０℃で２４時間攪拌した。その後、反
応液を遠心分離（10000rpm、10分）し、得られた水層を
分析したところ、Ｎ−ベンジルアゼチジン−２−カルボ
ン酸が反応に使用したＮ−ベンジルアゼチジン−２−カ
ルボン酸エチルに対して４９％の収率で生成していた。
用いた反応の例を参考例３に記す。 参考例３ Ｎ−ベンジルアゼチジン−２−カルボン酸エチル１．０
１ｇ、ヘプタン０．５６ｇおよび蒸留水１．２ｇを５ｍ
ｌのサンプル瓶に入れ、実施例４で得られた混合液０．
０６ｇを加え、１０℃で２４時間攪拌した。その後、反
応液を遠心分離（10000rpm、10分）し、得られた水層を
分析したところ、Ｎ−ベンジルアゼチジン−２−カルボ
ン酸が反応に使用したＮ−ベンジルアゼチジン−２−カ
ルボン酸エチルに対して４９％の収率で生成していた。
【００４５】実施例１３ 後述参考例５記載の方法により、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１
０５／ｐＥＡＲ５株を培養した培養液（２）４５ｇとエ
タノール５ｇとを１００ｍｌ容ガラス製ネジ口瓶に入
れ、３０℃で２４時間攪拌した。その後のこの混合液の
エステラーゼ活性は培養液（２）の９５％以上であり、
生菌数は０cfu/mlであった。
０５／ｐＥＡＲ５株を培養した培養液（２）４５ｇとエ
タノール５ｇとを１００ｍｌ容ガラス製ネジ口瓶に入
れ、３０℃で２４時間攪拌した。その後のこの混合液の
エステラーゼ活性は培養液（２）の９５％以上であり、
生菌数は０cfu/mlであった。
【００４６】実施例１４ 後述参考例５記載の方法により、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１
０５／ｐＥＡＲ５株を培養した培養液（２）３７．５ｇ
とエタノール１２．５ｇを１００ｍｌ容ガラス製ネジ口
瓶に入れ、３０℃で２４時間攪拌した。その後のこの混
合液のエステラーゼ活性は培養液（２）の９５％以上で
あり、生菌数は０cfu/mlであった。
０５／ｐＥＡＲ５株を培養した培養液（２）３７．５ｇ
とエタノール１２．５ｇを１００ｍｌ容ガラス製ネジ口
瓶に入れ、３０℃で２４時間攪拌した。その後のこの混
合液のエステラーゼ活性は培養液（２）の９５％以上で
あり、生菌数は０cfu/mlであった。
【００４７】上記実施例１３〜１４におけるエステラー
ゼ活性測定は、以下の方法で行なった。培養液もしくは
死菌化液の希釈液（生理食塩水）５ｍｌに２，２−ジク
ロロ−３−（１−プロペニル）シクロプロパン−１−カ
ルボン酸メチルエステル（１Ｒ体／１Ｓ体＝５０／５
０、トランス体／シス体＝９８／２）１ｇを加えてｐＨ
１０．０となるように調整しながら４５℃で３０分間攪
拌した。ここで反応液の一部を取り、これに塩酸を加え
酸性とした後、酢酸エチルで抽出した。抽出物に内部標
準物質（けい皮酸メチル）を加えた後、ガスクロマトグ
ラフィ−（カラム：ＨＲ２０−Ｍ ０．５３φ ３０ｍ
１ミクロン ＵＬＢＯＮ製）により分析することによ
り、加水分解率を求めた。この加水分解率よりエステラ
ーゼ活性を算出した。
ゼ活性測定は、以下の方法で行なった。培養液もしくは
死菌化液の希釈液（生理食塩水）５ｍｌに２，２−ジク
ロロ−３−（１−プロペニル）シクロプロパン−１−カ
ルボン酸メチルエステル（１Ｒ体／１Ｓ体＝５０／５
０、トランス体／シス体＝９８／２）１ｇを加えてｐＨ
１０．０となるように調整しながら４５℃で３０分間攪
拌した。ここで反応液の一部を取り、これに塩酸を加え
酸性とした後、酢酸エチルで抽出した。抽出物に内部標
準物質（けい皮酸メチル）を加えた後、ガスクロマトグ
ラフィ−（カラム：ＨＲ２０−Ｍ ０．５３φ ３０ｍ
１ミクロン ＵＬＢＯＮ製）により分析することによ
り、加水分解率を求めた。この加水分解率よりエステラ
ーゼ活性を算出した。
【００４８】実施例１５ 後述参考例６記載の方法により、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１
０５／ｐＣＣ１６０Ｓ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍ株（特開
平７−２１３２８０）を培養した培養液（３）４５ｇと
エタノール５ｇとを１００ｍｌ容ガラス製ネジ口瓶に入
れ、３０℃で２４時間攪拌した。その後のこの混合液の
エステラーゼ活性は培養液（３）の９５％以上であり、
生菌数は０cfu/mlであった。
０５／ｐＣＣ１６０Ｓ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍ株（特開
平７−２１３２８０）を培養した培養液（３）４５ｇと
エタノール５ｇとを１００ｍｌ容ガラス製ネジ口瓶に入
れ、３０℃で２４時間攪拌した。その後のこの混合液の
エステラーゼ活性は培養液（３）の９５％以上であり、
生菌数は０cfu/mlであった。
【００４９】実施例１６ 後述参考例６記載の方法により、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１
０５／ｐＣＣ１６０Ｓ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍ株を培養
した培養液（３）３７．５ｇとエタノール１２．５ｇを
１００ｍｌ容ガラス製ネジ口瓶に入れ、３０℃で２４時
間攪拌した。その後のこの混合液のエステラーゼ活性は
培養液（３）の９５％以上であり、生菌数は０cfu/mlで
あった。
０５／ｐＣＣ１６０Ｓ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍ株を培養
した培養液（３）３７．５ｇとエタノール１２．５ｇを
１００ｍｌ容ガラス製ネジ口瓶に入れ、３０℃で２４時
間攪拌した。その後のこの混合液のエステラーゼ活性は
培養液（３）の９５％以上であり、生菌数は０cfu/mlで
あった。
【００５０】上記実施例１５〜１６記載のエステラーゼ
活性測定は、以下の方法で行なった。２％（Ｗ／Ｖ）ア
セトンに溶解したｐ−ニトロフェニルアセテート４０μ
Ｍを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７.２）に培養液
もしくは死菌化液を加え、３７℃でインキュベートした
後、遊離するｐ−ニトロフェノール量を４０５ｎｍの吸
光度の増加に基づき定量分析した。
活性測定は、以下の方法で行なった。２％（Ｗ／Ｖ）ア
セトンに溶解したｐ−ニトロフェニルアセテート４０μ
Ｍを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７.２）に培養液
もしくは死菌化液を加え、３７℃でインキュベートした
後、遊離するｐ−ニトロフェノール量を４０５ｎｍの吸
光度の増加に基づき定量分析した。
【００５１】上記実施例１３〜１６における生菌数測定
は、以下の方法で行なった。生菌数を測定する試料液を
約１ｍｌを４℃に冷却した生理食塩水で希釈した。この
希釈液１００μｌをアンピシリン１００μｇ／ｍｌ含有
したＬＢ培地プレート（L-Broth Ager(BIO 101社製)）
に塗布し３７℃で１〜２日静置した。その後、生育した
コロニー数から試料液の生菌数を計算した。
は、以下の方法で行なった。生菌数を測定する試料液を
約１ｍｌを４℃に冷却した生理食塩水で希釈した。この
希釈液１００μｌをアンピシリン１００μｇ／ｍｌ含有
したＬＢ培地プレート（L-Broth Ager(BIO 101社製)）
に塗布し３７℃で１〜２日静置した。その後、生育した
コロニー数から試料液の生菌数を計算した。
【００５２】次に、実施例で使用した形質転換体及びそ
の培養液の製造について、参考例を示す。 参考例４ 上記実施例で使用したアルスロバクタ−ＳＣ−６−９８
−２８株由来のエステラ−ゼ遺伝子導入大腸菌Ｅ．ｃｏ
ｌｉ ＪＭ１０５／ｐＥＡＲ５株は特開平５−５６７８
７号公報記載の方法に準じて調製した。即ち、特開平５
−５６７８７号公報記載のアルスロバクターＳＣ−６−
９８−２８株由来のエステラーゼ遺伝子を含むプラスミ
ドｐＡＧＥ−１を、制限酵素Ｎｓｐ(7524)ＶおよびＨｉ
ｎｄIIIで消化することによりエステラーゼ遺伝子の翻
訳領域を含むＤＮＡ断片を切り出し、これを特開平５−
５６７８７号公報に記載のようにエステラーゼ遺伝子の
開始コドンとその近傍のＤＮＡ配列を変換するために合
成したＤＮＡ断片、およびｌａｃプロモーターを有する
発現ベクターｐＵＣ１１８（宝酒造株式会社）の制限酵
素ＢａｍＨI、ＨｉｎｄIII消化物とライゲーションし
た。このようにして、ｌａｃプロモーターの下流にアル
スロバクターＳＣ−６−９８−２８株由来のエステラー
ゼ遺伝子を有する大腸菌用発現プラスミドを調製し、こ
れをＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０５株に導入した。
の培養液の製造について、参考例を示す。 参考例４ 上記実施例で使用したアルスロバクタ−ＳＣ−６−９８
−２８株由来のエステラ−ゼ遺伝子導入大腸菌Ｅ．ｃｏ
ｌｉ ＪＭ１０５／ｐＥＡＲ５株は特開平５−５６７８
７号公報記載の方法に準じて調製した。即ち、特開平５
−５６７８７号公報記載のアルスロバクターＳＣ−６−
９８−２８株由来のエステラーゼ遺伝子を含むプラスミ
ドｐＡＧＥ−１を、制限酵素Ｎｓｐ(7524)ＶおよびＨｉ
ｎｄIIIで消化することによりエステラーゼ遺伝子の翻
訳領域を含むＤＮＡ断片を切り出し、これを特開平５−
５６７８７号公報に記載のようにエステラーゼ遺伝子の
開始コドンとその近傍のＤＮＡ配列を変換するために合
成したＤＮＡ断片、およびｌａｃプロモーターを有する
発現ベクターｐＵＣ１１８（宝酒造株式会社）の制限酵
素ＢａｍＨI、ＨｉｎｄIII消化物とライゲーションし
た。このようにして、ｌａｃプロモーターの下流にアル
スロバクターＳＣ−６−９８−２８株由来のエステラー
ゼ遺伝子を有する大腸菌用発現プラスミドを調製し、こ
れをＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０５株に導入した。
【００５３】参考例５ 試験管に、L-Broth培地（ＳＩＧＭＡ社製）１０ｍｌを
入れて、滅菌した。ここにアンピシリンを５０μｇ／ｍ
ｌとなるように加え、さらにＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５
／ｐＥＡＲ５株のグリセロールストック０．１ｍｌを加
え、３０℃で１６時間振盪培養した。５００ｍｌ容のバ
ッフル付三角フラスコにL-Broth培地（ＳＩＧＭＡ社
製）１００ｍｌを入れて滅菌した。ここにアンピシリン
を５０μｌ／ｍｌとなるように加え、さらにここに、上
記の試験管で培養した培養液を１ｍｌ加え、３０℃で攪
拌培養した。培養開始から、４時間後にＩＰＴＧを１ｍ
Ｍとなるように加えた。培養開始から２４時間培養する
ことにより、培養液（２）を得た。
入れて、滅菌した。ここにアンピシリンを５０μｇ／ｍ
ｌとなるように加え、さらにＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５
／ｐＥＡＲ５株のグリセロールストック０．１ｍｌを加
え、３０℃で１６時間振盪培養した。５００ｍｌ容のバ
ッフル付三角フラスコにL-Broth培地（ＳＩＧＭＡ社
製）１００ｍｌを入れて滅菌した。ここにアンピシリン
を５０μｌ／ｍｌとなるように加え、さらにここに、上
記の試験管で培養した培養液を１ｍｌ加え、３０℃で攪
拌培養した。培養開始から、４時間後にＩＰＴＧを１ｍ
Ｍとなるように加えた。培養開始から２４時間培養する
ことにより、培養液（２）を得た。
【００５４】参考例６ 上記実施例で使用したクロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−
１株由来のエステラーゼ遺伝子導入大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ
ＪＭ１０５／ｐＣＣ１６０Ｓ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍ
株は特開平７−２１３２８０号公報記載の方法に準して
調製した。ここで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＣＣ
１６０Ｓ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍ株が産生するエステラ
ーゼとは、前述にある、配列番号３で示される塩基配列
に併記されるアミノ酸配列において１６０番目のアミノ
酸がセリンに置換され、かつ１８９番目のアミノ酸がチ
ロシンに置換される特異的変異が導入された耐熱性酵素
である。
１株由来のエステラーゼ遺伝子導入大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ
ＪＭ１０５／ｐＣＣ１６０Ｓ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍ
株は特開平７−２１３２８０号公報記載の方法に準して
調製した。ここで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＣＣ
１６０Ｓ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍ株が産生するエステラ
ーゼとは、前述にある、配列番号３で示される塩基配列
に併記されるアミノ酸配列において１６０番目のアミノ
酸がセリンに置換され、かつ１８９番目のアミノ酸がチ
ロシンに置換される特異的変異が導入された耐熱性酵素
である。
【００５５】参考例７ 試験管に、L-Broth培地（ＳＩＧＭＡ社製）１０ｍｌを
入れて、滅菌した。ここにアンピシリンを５０μｇ／ｍ
ｌとなるように加え、さらにＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５
／ｐＣＣ１６０Ｓ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍ株のグリセロ
ールストック０．１ｍｌを加え、３０℃で１６時間振盪
培養した。５００ｍｌ容のバッフル付三角フラスコにL-
Broth培地（ＳＩＧＭＡ社製）１００ｍｌを入れて滅菌
した。ここにアンピシリンを５０μｌ／ｍｌとなるよう
に加え、さらにここに、上記の試験管で培養した培養液
を１ｍｌ加え、３０℃で攪拌培養した。培養開始から、
４時間後にＩＰＴＧを１ｍＭとなるように加えた。培養
開始から１２時間培養することにより、培養液（３）を
得た。
入れて、滅菌した。ここにアンピシリンを５０μｇ／ｍ
ｌとなるように加え、さらにＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５
／ｐＣＣ１６０Ｓ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍ株のグリセロ
ールストック０．１ｍｌを加え、３０℃で１６時間振盪
培養した。５００ｍｌ容のバッフル付三角フラスコにL-
Broth培地（ＳＩＧＭＡ社製）１００ｍｌを入れて滅菌
した。ここにアンピシリンを５０μｌ／ｍｌとなるよう
に加え、さらにここに、上記の試験管で培養した培養液
を１ｍｌ加え、３０℃で攪拌培養した。培養開始から、
４時間後にＩＰＴＧを１ｍＭとなるように加えた。培養
開始から１２時間培養することにより、培養液（３）を
得た。
【００５６】実施例で使用したアルスロバクタ−ＳＣ−
６−９８−２８株由来のエステラ−ゼの熱変性温度の測
定の例を参考例８に記す。 参考例８ ５００ｍｌ三角フラスコに液体培地（水１Ｌにグリセロ
−ル５ｇ、酵母エキス６ｇ、リン酸１カリウム９ｇおよ
びリン酸2カリウム４ｇを溶解し、ｐＨ７．０とす
る。）１００ｍｌを入れて滅菌した後、アンピシリンを
５０μｇ／ｍｌになるように加え、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ
１０５／ｐＥＡＲ５株を斜面培養から１白金耳接種し、
３０℃で２４時間回転振とう培養した。次に３Ｌ容の小
型培養槽（丸菱バイオエンジ社製、ＭＤＬ型）に滅菌し
た液体培地（水１Ｌにグリセロ−ル１５ｇ、酵母エキス
２５ｇ、リン酸１カリウム０．４ｇ、硫酸マグネシウム
２ｇおよび硫酸第一鉄０．１ｇを溶解し、ｐＨ７．０と
する。）１５００ｍｌを入れ、これに上記の培養液１５
ｍｌを接種した。３０℃で通気攪拌培養し、対数増殖期
中期（培養開始１０〜１５時間後）にＩＰＴＧを終濃度
１ｍＭとなるように培養液に添加した後、滅菌した培地
を流加し、さらに培養を続け４０時間培養し、培養液を
得た。得られた培養液２０００ｍｌを遠心することによ
り得た菌体を純水で洗浄後、５０ｍＭトリス塩酸バッフ
ァー（ｐＨ８．０）に全量が１０００ｍｌになるように
懸濁した。この懸濁液を氷水中で超音波破砕した後、１
００００ｒｐｍ、３０分間遠心することにより上清を得
た。この上清に１ＭになるようにＮａＣｌを添加した
後、６０℃、３０分間熱処理を行なった。熱処理を行な
った後、１００００ｒｐｍ、３０分間遠心することによ
り上清を得た。この熱処理後の上清に３５％飽和濃度の
硫安を添加し、再度遠心することにより沈殿を得た。得
られた沈殿を２０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ８．
０）約５０ｍｌに溶解し、２００倍の体積の０．１Ｍ
ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ
８．０）に対して透析を行なった。透析した液を遠心す
ることにより上清を得た。この上清を用いて陰イオン交
換クロマト（カラム；ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
ｆａｓｔ ｆｌｏｗ（直径２６ｍｍ、長さ４００ｍ
ｍ）、緩衝液Ａ；０、１Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭト
リス−塩酸緩衝液 ｐＨ８．０（２００ｍｌ）、緩衝液
Ｂ；０、６Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩
衝液 ｐＨ８．０（２００ｍｌ）、流速；１２ｍｌ/ｍ
ｉｎ）を行い、エステラーゼ活性を有する画分を得た。
このエステラーゼ画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果、
単一バンドであったが、銀染色法ではマイナーバンドが
あった。そこで、この画分をフラクトゲル−ＥＭＡＥ
（カラム；スパーフォーマンスカラム（直径１０ｍｍ、
長さ１５０ｍｍ）、ベッド；フラクトゲル−ＴＭＡＥ
ＥＭＤ ６５０（Ｓ）（ＭＥＲＣＫ社製）、緩衝液Ａ；
２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液 ｐＨ８．０ 緩衝液Ｂ；
１．０Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
ｐＨ８．０、流速；１．５ｍｌ/ｍｉｎ）に供試し、
エステラーゼ活性を有する画分を得た。このエステラー
ゼ活性を有する画分を精製酵素とした。つぎにこの精製
酵素を用いて円二色性スペクトルを測定し熱変性温度を
測定した。円二色性分散計Ｊ−７２０（日本分光社製）
を用い、４０μｇ／ｍｌの上記精製酵素（１０ｍＭリン
酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）を４０から８０
℃の範囲（温度スロープ；２０℃／時間）、波長２２２
ｎｍの条件で円二色性スペクトルを測定した。得られた
円二色性スペクトルから熱変性曲線を求めた結果、本精
製酵素の熱変性温度は６７．０℃であった。
６−９８−２８株由来のエステラ−ゼの熱変性温度の測
定の例を参考例８に記す。 参考例８ ５００ｍｌ三角フラスコに液体培地（水１Ｌにグリセロ
−ル５ｇ、酵母エキス６ｇ、リン酸１カリウム９ｇおよ
びリン酸2カリウム４ｇを溶解し、ｐＨ７．０とす
る。）１００ｍｌを入れて滅菌した後、アンピシリンを
５０μｇ／ｍｌになるように加え、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ
１０５／ｐＥＡＲ５株を斜面培養から１白金耳接種し、
３０℃で２４時間回転振とう培養した。次に３Ｌ容の小
型培養槽（丸菱バイオエンジ社製、ＭＤＬ型）に滅菌し
た液体培地（水１Ｌにグリセロ−ル１５ｇ、酵母エキス
２５ｇ、リン酸１カリウム０．４ｇ、硫酸マグネシウム
２ｇおよび硫酸第一鉄０．１ｇを溶解し、ｐＨ７．０と
する。）１５００ｍｌを入れ、これに上記の培養液１５
ｍｌを接種した。３０℃で通気攪拌培養し、対数増殖期
中期（培養開始１０〜１５時間後）にＩＰＴＧを終濃度
１ｍＭとなるように培養液に添加した後、滅菌した培地
を流加し、さらに培養を続け４０時間培養し、培養液を
得た。得られた培養液２０００ｍｌを遠心することによ
り得た菌体を純水で洗浄後、５０ｍＭトリス塩酸バッフ
ァー（ｐＨ８．０）に全量が１０００ｍｌになるように
懸濁した。この懸濁液を氷水中で超音波破砕した後、１
００００ｒｐｍ、３０分間遠心することにより上清を得
た。この上清に１ＭになるようにＮａＣｌを添加した
後、６０℃、３０分間熱処理を行なった。熱処理を行な
った後、１００００ｒｐｍ、３０分間遠心することによ
り上清を得た。この熱処理後の上清に３５％飽和濃度の
硫安を添加し、再度遠心することにより沈殿を得た。得
られた沈殿を２０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ８．
０）約５０ｍｌに溶解し、２００倍の体積の０．１Ｍ
ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ
８．０）に対して透析を行なった。透析した液を遠心す
ることにより上清を得た。この上清を用いて陰イオン交
換クロマト（カラム；ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
ｆａｓｔ ｆｌｏｗ（直径２６ｍｍ、長さ４００ｍ
ｍ）、緩衝液Ａ；０、１Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭト
リス−塩酸緩衝液 ｐＨ８．０（２００ｍｌ）、緩衝液
Ｂ；０、６Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩
衝液 ｐＨ８．０（２００ｍｌ）、流速；１２ｍｌ/ｍ
ｉｎ）を行い、エステラーゼ活性を有する画分を得た。
このエステラーゼ画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果、
単一バンドであったが、銀染色法ではマイナーバンドが
あった。そこで、この画分をフラクトゲル−ＥＭＡＥ
（カラム；スパーフォーマンスカラム（直径１０ｍｍ、
長さ１５０ｍｍ）、ベッド；フラクトゲル−ＴＭＡＥ
ＥＭＤ ６５０（Ｓ）（ＭＥＲＣＫ社製）、緩衝液Ａ；
２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液 ｐＨ８．０ 緩衝液Ｂ；
１．０Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
ｐＨ８．０、流速；１．５ｍｌ/ｍｉｎ）に供試し、
エステラーゼ活性を有する画分を得た。このエステラー
ゼ活性を有する画分を精製酵素とした。つぎにこの精製
酵素を用いて円二色性スペクトルを測定し熱変性温度を
測定した。円二色性分散計Ｊ−７２０（日本分光社製）
を用い、４０μｇ／ｍｌの上記精製酵素（１０ｍＭリン
酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）を４０から８０
℃の範囲（温度スロープ；２０℃／時間）、波長２２２
ｎｍの条件で円二色性スペクトルを測定した。得られた
円二色性スペクトルから熱変性曲線を求めた結果、本精
製酵素の熱変性温度は６７．０℃であった。
【００５７】実施例で使用したクロモバクテリウム（Ch
romobacterium）SC-YM-1株由来のエステラ−ゼ（即ち、
Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＣＣ１６０Ｓ１８９Ｙ３
６３ｔｅｒｍ株が産生するエステラーゼ）の熱変性温度
の測定の例を参考例９に記す。 参考例９ ２００ｍｌの三角フラスコに５０ｍｌのＭ９培地（硫酸
マグネシウム２ｍＭ、塩化カルシウム０．１ｍＭ、グル
コース５ｇ／Ｌ、リン酸水素ナトリウム3．4ｇ／Ｌ、リ
ン酸１カリウム０．６７ｇ／Ｌ、塩化アンモニウム０．
２２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．１１ｇ／Ｌ、ｐＨ７．
０）にチアミンを２．０ｍｇ／Ｌ、アンピシリンを５０
μｇ／ｍｌになるように添加した培地を入れ、同じ組成
の培地のプレートで静置培養したＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１
０５／ｐＣＣ１６０Ｓ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍ株を１白
金耳植菌し、３７℃で１２時間攪拌培養した。２０００
ｍｌ三角フラスコに液体培地（水１Ｌにグリセロ−ル４
ｇ、酵母エキス２４ｇ、トリプトン１２ｇ、リン酸１カ
リウム２．３ｇおよびリン酸2カリウム１２．５ｇを溶
解し、ｐＨ７．０とする。）３００ｍｌを入れて滅菌し
た後、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌになるように加え
た培地に上記培養液３ｍｌを植菌し、３７℃で振とう培
養した。ＯＤ６６０が２に到達した時に、ＩＰＴＧを終
濃度0．１ｍＭとなるように培養液に添加した後、さら
に６時間培養を続け、培養液を得た。得られた培養液全
量を遠心することにより湿菌体約４３ｇを得た。この湿
菌体をＴＥ緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した後、同じ緩
衝液にＯＤ６６０が６０になるように懸濁した。この懸
濁液を氷水中で超音波破砕した後、３２０００ｇ、１０
分間遠心した後、１１００００ｇ、６０分間遠心するこ
とにより上清を得た。この上清液を限外濾過膜を用いて
濃縮し５０ｍｌの濃縮液を得た。この濃縮液を用いて陰
イオン交換クロマト（カラム；ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅ ｆａｓｔｆｌｏｗ（直径２６ｍｍ、長さ３２０
ｍｍ）、緩衝液Ａ；０、１５Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液 ｐＨ７．５（５００ｍｌ）、緩
衝液Ｂ；０、３５Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭトリス−
塩酸緩衝液 ｐＨ７．５（５００ｍｌ）、流速；３ｍｌ
/ｍｉｎ）を行い、エステラーゼ活性を有する各分を得
た。この画分を疎水クロマト（カラム；ブチルトヨパー
ル ６５０Ｓ（直径１６ｍｍ、長さ３００ｍｍ）、緩衝
液Ａ；１０％硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭトリス−
塩酸緩衝液 ｐＨ７．５（２００ｍｌ），緩衝液Ｂ；１
０ｍＭトリス−塩酸緩衝液 ｐＨ７．５（２００ｍ
ｌ）、流速；２ｍｌ/ｍｉｎ）に供試し、エステラーゼ
活性を有する画分を得た。このエステラーゼ活性を有す
る画分を精製酵素とした。つぎにこの精製酵素を用いて
円二色性スペクトルを測定し熱変性温度を測定した。円
二色性分散計Ｊ−７２０（日本分光社製）を用い、４μ
ｇ／ｍｌの上記精製酵素（１０ｍＭリン酸ナトリウムバ
ッファー（ｐＨ７．５）を３０℃から７０℃の範囲（温
度スロープ；２０℃／時間）、波長２２２ｎｍの条件で
円二色性スペクトルを測定した。得られた円二色性スペ
クトルから熱変性曲線を求めた結果、本精製酵素の熱変
性温度は６２．６℃であった。因みに、クロモバクテリ
ウム（Chromobacterium）SC-YM-1株が本来有する野生型
のエステラーゼの熱変性温度は５０．５℃であった。
romobacterium）SC-YM-1株由来のエステラ−ゼ（即ち、
Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＣＣ１６０Ｓ１８９Ｙ３
６３ｔｅｒｍ株が産生するエステラーゼ）の熱変性温度
の測定の例を参考例９に記す。 参考例９ ２００ｍｌの三角フラスコに５０ｍｌのＭ９培地（硫酸
マグネシウム２ｍＭ、塩化カルシウム０．１ｍＭ、グル
コース５ｇ／Ｌ、リン酸水素ナトリウム3．4ｇ／Ｌ、リ
ン酸１カリウム０．６７ｇ／Ｌ、塩化アンモニウム０．
２２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．１１ｇ／Ｌ、ｐＨ７．
０）にチアミンを２．０ｍｇ／Ｌ、アンピシリンを５０
μｇ／ｍｌになるように添加した培地を入れ、同じ組成
の培地のプレートで静置培養したＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１
０５／ｐＣＣ１６０Ｓ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍ株を１白
金耳植菌し、３７℃で１２時間攪拌培養した。２０００
ｍｌ三角フラスコに液体培地（水１Ｌにグリセロ−ル４
ｇ、酵母エキス２４ｇ、トリプトン１２ｇ、リン酸１カ
リウム２．３ｇおよびリン酸2カリウム１２．５ｇを溶
解し、ｐＨ７．０とする。）３００ｍｌを入れて滅菌し
た後、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌになるように加え
た培地に上記培養液３ｍｌを植菌し、３７℃で振とう培
養した。ＯＤ６６０が２に到達した時に、ＩＰＴＧを終
濃度0．１ｍＭとなるように培養液に添加した後、さら
に６時間培養を続け、培養液を得た。得られた培養液全
量を遠心することにより湿菌体約４３ｇを得た。この湿
菌体をＴＥ緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した後、同じ緩
衝液にＯＤ６６０が６０になるように懸濁した。この懸
濁液を氷水中で超音波破砕した後、３２０００ｇ、１０
分間遠心した後、１１００００ｇ、６０分間遠心するこ
とにより上清を得た。この上清液を限外濾過膜を用いて
濃縮し５０ｍｌの濃縮液を得た。この濃縮液を用いて陰
イオン交換クロマト（カラム；ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅ ｆａｓｔｆｌｏｗ（直径２６ｍｍ、長さ３２０
ｍｍ）、緩衝液Ａ；０、１５Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液 ｐＨ７．５（５００ｍｌ）、緩
衝液Ｂ；０、３５Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭトリス−
塩酸緩衝液 ｐＨ７．５（５００ｍｌ）、流速；３ｍｌ
/ｍｉｎ）を行い、エステラーゼ活性を有する各分を得
た。この画分を疎水クロマト（カラム；ブチルトヨパー
ル ６５０Ｓ（直径１６ｍｍ、長さ３００ｍｍ）、緩衝
液Ａ；１０％硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭトリス−
塩酸緩衝液 ｐＨ７．５（２００ｍｌ），緩衝液Ｂ；１
０ｍＭトリス−塩酸緩衝液 ｐＨ７．５（２００ｍ
ｌ）、流速；２ｍｌ/ｍｉｎ）に供試し、エステラーゼ
活性を有する画分を得た。このエステラーゼ活性を有す
る画分を精製酵素とした。つぎにこの精製酵素を用いて
円二色性スペクトルを測定し熱変性温度を測定した。円
二色性分散計Ｊ−７２０（日本分光社製）を用い、４μ
ｇ／ｍｌの上記精製酵素（１０ｍＭリン酸ナトリウムバ
ッファー（ｐＨ７．５）を３０℃から７０℃の範囲（温
度スロープ；２０℃／時間）、波長２２２ｎｍの条件で
円二色性スペクトルを測定した。得られた円二色性スペ
クトルから熱変性曲線を求めた結果、本精製酵素の熱変
性温度は６２．６℃であった。因みに、クロモバクテリ
ウム（Chromobacterium）SC-YM-1株が本来有する野生型
のエステラーゼの熱変性温度は５０．５℃であった。
【００５８】
【発明の効果】本発明により、有用物質生産に用いられ
る酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤ
ＮＡを導入した形質転換微生物を、前記酵素の活性を失
活させることなく、死菌化させることができる。
る酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤ
ＮＡを導入した形質転換微生物を、前記酵素の活性を失
活させることなく、死菌化させることができる。
【００５９】［配列表フリーテキスト］配列番号５ＰＣ
Ｒのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
Ｒのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
【００６０】
【配列表】 <110> Sumitomo Chemical Co. Ltd. <120> Microorganism-sterilizing methods <130> P153590 <150> JP 2000/368180 <151> 2000-12-04 <160> 5 <210> 1 <211> 798 <212> DNA <213> Aspergillus flavus <220> <221> CDS <222> (1)...(768) <400> 1 atg cat ctt cct atc aag act ctc ttt gtc tct ctc ctc gga gcc agc 48 Met His Leu Pro Ile Lys Thr Leu Phe Val Ser Leu Leu Gly Ala Ser 1 5 10 15 gtt ctc gca cgc cct ctt ccc aat gat gct ctc gtt gag aga aac gct 96 Val Leu Ala Arg Pro Leu Pro Asn Asp Ala Leu Val Glu Arg Asn Ala 20 25 30 ccc cta aac gag ttc ctc agc gtc ctt ctg tct cat ttg cct gcc att 144 Pro Leu Asn Glu Phe Leu Ser Val Leu Leu Ser His Leu Pro Ala Ile 35 40 45 aac ggc tct atc act gcg gtg tcg ggt ctg atc acc gat ttt gat caa 192 Asn Gly Ser Ile Thr Ala Val Ser Gly Leu Ile Thr Asp Phe Asp Gln 50 55 60 ttg ctt gct gac atc acc ggt gct caa aca acc ctg aat gga ttt act 240 Leu Leu Ala Asp Ile Thr Gly Ala Gln Thr Thr Leu Asn Gly Phe Thr 65 70 75 80 ggt gcc tgc acg gat tac acc gtt ctc ttc gcc cgc gga acc agt gag 288 Gly Ala Cys Thr Asp Tyr Thr Val Leu Phe Ala Arg Gly Thr Ser Glu 85 90 95 ccc gga aac gtt ggt gtc ctc gtc gga cct cct ctt gct gag gcg ttt 336 Pro Gly Asn Val Gly Val Leu Val Gly Pro Pro Leu Ala Glu Ala Phe 100 105 110 gag gga gcc gtc ggt gcg tcc gcc ttg agc ttc cag ggt gtc aac ggc 384 Glu Gly Ala Val Gly Ala Ser Ala Leu Ser Phe Gln Gly Val Asn Gly 115 120 125 tat tct gca tct gtc gag gga tat ttg gct gga ggt gaa gcc gct ggc 432 Tyr Ser Ala Ser Val Glu Gly Tyr Leu Ala Gly Gly Glu Ala Ala Gly 130 135 140 agc aag gca atg gca tct cag gcc agc gac att ctc tcc aag tgt ccc 480 Ser Lys Ala Met Ala Ser Gln Ala Ser Asp Ile Leu Ser Lys Cys Pro 145 150 155 160 gac acc aag ctt gtc atg agt ggc tat tcc cag ggc tgc cag att gtt 528 Asp Thr Lys Leu Val Met Ser Gly Tyr Ser Gln Gly Cys Gln Ile Val 165 170 175 cac aat gcc gtt gag caa ctt cct gcg gaa cac gca agc aag atc agc 576 His Asn Ala Val Glu Gln Leu Pro Ala Glu His Ala Ser Lys Ile Ser 180 185 190 agc gtc ctc ctt ttc gga gac cca tac aag ggc aag gct ctc ccc aac 624 Ser Val Leu Leu Phe Gly Asp Pro Tyr Lys Gly Lys Ala Leu Pro Asn 195 200 205 gtt gat gct tcc cgc gtc cac act gtg tgc cac gct gga gac act att 672 Val Asp Ala Ser Arg Val His Thr Val Cys His Ala Gly Asp Thr Ile 210 215 220 tgc gag aac agc gtt att att ctg ccc gct cac ttg acc tac gct gtt 720 Cys Glu Asn Ser Val Ile Ile Leu Pro Ala His Leu Thr Tyr Ala Val 225 230 235 240 gat gtg gct tct gcg gct gac ttc gct gtt gcg gct gca aag aac taa 768 Asp Val Ala Ser Ala Ala Asp Phe Ala Val Ala Ala Ala Lys Asn 245 250 255 attacgataa gggctccatg ttcactgtaa 798 <210> 2 <211> 1125 <212> DNA <213> Arthrobacter globiformis SC-6-98-28 (FERM BP-3618) <220> <221> CDS <222> (1)...(1125) <400> 2 gtg gat gca cag acg att gcc cct gga ttc gaa tca gtc gcc gaa ctc 48 Val Asp Ala Gln Thr Ile Ala Pro Gly Phe Glu Ser Val Ala Glu Leu 1 5 10 15 ttt ggc cgt ttc ctg agc gaa gac cgg gaa tat tca gcc cag ctc gcg 96 Phe Gly Arg Phe Leu Ser Glu Asp Arg Glu Tyr Ser Ala Gln Leu Ala 20 25 30 gcc tac cac cgc gga gtc aag gta ttg gac atc agc ggt ggg ccg 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ctt 480 Ala Phe Gly Tyr His Ala Leu Thr Ile Gly Val Phe Met Glu Glu Leu 145 150 155 160 tgc cgc cgg atc acc ggg tcc acg ctc cag gaa atc tac gaa cag cgg 528 Cys Arg Arg Ile Thr Gly Ser Thr Leu Gln Glu Ile Tyr Glu Gln Arg 165 170 175 atc cgc tcg gtc acg ggc gcc cac ttc ttc ctg gga ctg cct gag tcc 576 Ile Arg Ser Val Thr Gly Ala His Phe Phe Leu Gly Leu Pro Glu Ser 180 185 190 gag gaa ccc cgc tat gcc acc ctc cgt tgg gct gca gac ccc tcc cag 624 Glu Glu Pro Arg Tyr Ala Thr Leu Arg Trp Ala Ala Asp Pro Ser Gln 195 200 205 ccg tgg att gat ccc gcc agc cat ttc ggc ctt tcc gca aac tcg gcc 672 Pro Trp Ile Asp Pro Ala Ser His Phe Gly Leu Ser Ala Asn Ser Ala 210 215 220 gtg ggg gac atc ctt gac ctg ccc aac ctc cgc gag gtc cgc gca gcc 720 Val Gly Asp Ile Leu Asp Leu Pro Asn Leu Arg Glu Val Arg Ala Ala 225 230 235 240 ggc ctg agt tca gcc gcc gga gtc gcc agc gcg gaa ggc atg gcc cgc 768 Gly Leu Ser Ser Ala Ala Gly Val Ala Ser Ala Glu Gly Met Ala Arg 245 250 255 gtc tac gct gcg gca ctc acc gga ctt gcc gcc aac ggc gac cga gcc 816 Val Tyr Ala Ala Ala Leu Thr Gly Leu Ala Ala Asn Gly Asp Arg Ala 260 265 270 gcc gtc gcg ccc ctc ctc agc gaa gag acc atc caa acc gtc acg gcc 864 Ala Val Ala Pro Leu Leu Ser Glu Glu Thr Ile Gln Thr Val Thr Ala 275 280 285 gag cag gtc ttc ggc atc gac cgg gtg ttc ggc gag acg agc tgc ttt 912 Glu Gln Val Phe Gly Ile Asp Arg Val Phe Gly Glu Thr Ser Cys Phe 290 295 300 ggg aca gtg ttc atg aaa tcg cat gca cgc tcg cct tat ggc agc tac 960 Gly Thr Val Phe Met Lys Ser His Ala Arg Ser Pro Tyr Gly Ser Tyr 305 310 315 320 cgg gcg ttc ggg cac gac ggc gcc agc gca tct ttg ggg ttc gct gac 1008 Arg Ala Phe Gly His Asp Gly Ala Ser Ala Ser Leu Gly Phe Ala Asp 325 330 335 cct gtg tat gaa ctc gcc ttc ggg tac gtg ccg caa cag gcc gag ccg 1056 Pro Val Tyr Glu Leu Ala Phe Gly Tyr Val Pro Gln Gln Ala Glu Pro 340 345 350 ggc gga gcg gga tgc cgc aac ctt gag ctg agc gcc gcc gtg cgg aag 1104 Gly Gly Ala Gly Cys Arg Asn Leu Glu Leu Ser Ala Ala Val Arg Lys 355 360 365 gca gtc acc gaa ctg gct cag 1125 Ala Val Thr Glu Leu Ala Gln 370 375 <210> 3 <211> 1110 <212> DNA <213> Chromobacterium sp． <220> <221> CDS <222> (1)...(1110) <400> 3 atg act ctg ttc gat ggt atc act tcg cga atc gta gat act gat cgt 48 Met Thr Leu Phe Asp Gly Ile Thr Ser Arg Ile Val Asp Thr Asp Arg 5 10 15 ctg act gtt aac atc ctg gaa cgt gcg gcc gac gac ccg cag acc ccg 96 Leu Thr Val Asn Ile Leu Glu Arg Ala Ala Asp Asp Pro Gln Thr Pro 20 25 30 ccc gac cgc acg gtc gtg ttc gtc cac ggg aat gtg tcc tcc gcg ctg 144 Pro Asp Arg Thr Val Val Phe Val His Gly Asn Val Ser Ser Ala Leu 35 40 45 ttc tgg cag gag atc atg cag gac ctg ccg agc gac ctg cgc gcc atc 192 Phe Trp Gln Glu Ile Met Gln Asp Leu Pro Ser Asp Leu Arg Ala Ile 50 55 60 gcg gtc gac ctg cgc ggc ttc ggc ggc tcg gag cac gcg ccg gtc gac 240 Ala Val Asp Leu Arg Gly Phe Gly Gly ser Glu His Ala Pro Val Asp 65 70 75 80 gcc acc cgc ggc gtc cgc gac ttc agc gac gat ctg cac gcg acc ctc 288 Ala Thr Arg Gly Val Arg Asp Phe Ser Asp Asp Leu His Ala Thr Leu 85 90 95 gag gcg ctc gac 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acg tcc acc gcc gac gga aac tac ccc ggc gat gcg gtg ccg agc 672 Thr Thr Ser Thr Ala Asp Gly Asn Tyr Pro Gly Asp Ala Val Pro Ser 210 215 220 gac aac tgg ccg ggc ttc gcc gcc ggc cgc cac ggc gtg ctg aac acc 720 Asp Asn Trp Pro Gly Phe Ala Ala Gly Arg His Gly Val Leu Asn Thr 225 230 235 240 atg gcc ccg cag tac ttc gat gtg tcg ggg att gtc gac ctg gcc gag 768 Met Ala Pro Gln Tyr Phe Asp Val Ser Gly Ile Val Asp Leu Ala Glu 245 250 255 aag cct ccg atc ctg tgg atc cac ggc acc gcg gac gcg atc gtc tcc 816 Lys Pro Pro Ile Leu Trp Ile His Gly Thr Ala Asp Ala Ile Val Ser 260 265 270 gac gcg tcg ttc tac gac ctc aac tac ctc ggc cag ctg ggc atc gtc 864 Asp Ala Ser Phe Tyr Asp Leu Asn Tyr Leu Gly Gln Leu Gly Ile Val 275 280 285 ccc ggc tgg ccc ggc gaa gac gtc gcg ccc gcg cag gag atg gtg tcg 912 Pro Gly Trp Pro Gly Glu Asp Val Ala Pro Ala Gln Glu Met Val Ser 290 295 300 cag acc cgc gat gtc ctc ggc cgc tac gct gcg ggc ggc gga acg gtc 960 Gln Thr Arg Asp Val Leu Gly Arg Tyr Ala Ala Gly Gly Gly Thr Val 305 310 315 320 acc gag gtc gcc gtc gag ggc gcg ggc cac tcc gcg cac ctg gag cgt 1008 Thr Glu Val Ala Val Glu Gly Ala Gly His Ser Ala His Leu Glu Arg 325 330 335 ccc gcg gtg ttc cgc cac gcg ctg ctc gag atc atc ggc tac gtc ggc 1056 Pro Ala Val Phe Arg His Ala Leu Leu Glu Ile Ile Gly Tyr Val Gly 340 345 350 gcg gcg gcc gac ccc gcc ccg ccg acc gag gcg atc atc atc cgc tcc 1104 Ala Ala Ala Asp Pro Ala Pro Pro Thr Glu Ala Ile Ile Ile Arg Ser 355 360 365 gcc gac 1110 Ala Asp 370 <210> 4 <211> 33 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 4 Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr 1 5 10 15 Pro Val Ala Asn Ala Ala Pro Thr Ser Asn Pro Ala Gln Glu Leu Glu 20 25 30 Ala 33 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 5 aacgaattcc tsagygt 17
フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA03 AA11 BA07 DA06 GA11 GA30 HA20 4B065 AA26X AB01 AC14 BA30 BD08 BD13 BD27 BD28 CA31 CA60
Claims (10)
- 【請求項１】熱変性温度が５０℃以上である酵素のアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡをエシェ
リヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属の微生物に導入し
た形質転換微生物を含む液と、該微生物含有液に対し、
１０重量％以上３５重量％以下の量の炭素数１〜３の１
価のアルコール及び／又はアセトンとを２５℃以上３５
℃未満で混合することを特徴とする形質転換微生物の死
菌化方法。 - 【請求項２】前記酵素が加水分解酵素であることを特徴
とする請求項１記載の死菌化方法。 - 【請求項３】前記酵素が６０℃以上の熱変性温度を有
し、かつ前記アルコール及び／又はアセトンの量が１０
重量％以上３５重量％以下であることを特徴とする請求
項１記載の死菌化方法。 - 【請求項４】前記酵素が５３℃以上の熱変性温度を有
し、かつ前記アルコール及び／又はアセトンの量が１０
重量％以上３０重量％以下であることを特徴とする請求
項１記載の死菌化方法。 - 【請求項５】前記酵素が５０℃以上の熱変性温度を有
し、かつ前記アルコール及び／又はアセトンの量が１０
重量％以上２５重量％以下であることを特徴とする請求
項１記載の死菌化方法。 - 【請求項６】前記形質転換微生物が、下記（ａ）、
（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のいずれかを有するＤＮＡ
をエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属の微生物
に導入した形質転換微生物であることを特徴とする請求
項１記載の死菌化方法。 （ａ）配列番号１で示される塩基配列。 （ｂ）配列番号２で示される塩基配列。 （ｃ）配列番号３で示される塩基配列。 （ｄ）配列番号１、２又は３で示される塩基配列からな
るＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
するＤＮＡの塩基配列であって、かつ前記の配列番号
１、２又は３で示される塩基配列によりコードされるア
ミノ酸配列からなる酵素と同等な触媒機能を有するタン
パク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列。 - 【請求項７】前記形質転換微生物が、下記（ａ）または
（ｂ）のいずれかを有するＤＮＡをエシェリヒア（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属の微生物に導入した形質転換微
生物であることを特徴とする請求項１、２、４又は５記
載の死菌化方法。 （ａ）配列番号１で示される塩基配列。 （ｂ）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡと
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
の塩基配列であって、かつラセミ体のＮ−ベンジルアゼ
チジン−２−カルボン酸エチルエステルを不斉加水分解
し、（Ｓ）体のＮ−ベンジルアゼチジン−２−カルボン
酸を優先的に生産する能力を有するタンパク質のアミノ
酸配列をコードする塩基配列。 - 【請求項８】前記形質転換微生物が、下記（ｃ）または
（ｄ）のいずれかを有するＤＮＡをエシェリヒア（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属の微生物に導入した形質転換微
生物であることを特徴とする請求項１、２又は３記載の
死菌化方法。 （ｃ）配列番号２で示される塩基配列。 （ｄ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡと
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
の塩基配列であって、かつ菊酸または菊酸誘導体のエス
テルを不斉加水分解する酵素のアミノ酸配列をコードす
る塩基配列。 - 【請求項９】前記形質転換微生物が、下記（ｅ）、
（ｆ）または（ｇ）のいずれかを有するＤＮＡをエシェ
リヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属の微生物に導入し
た形質転換微生物であることを特徴とする請求項１、２
または３記載の死菌化方法。 （ｅ）配列番号３で示される塩基配列。 （ｆ）配列番号３で示される塩基配列に併記されるアミ
ノ酸配列において１６０番目のアミノ酸が下記のＡ群か
ら選ばれるアミノ酸に置換され、かつ１８９番目のアミ
ノ酸が下記のアミノ酸からなるＢ群から選ばれるアミノ
酸に置換されてなるアミノ酸配列をコードする塩基配
列。 （ｇ）前記（ｆ）からなるＤＮＡとストリンジェントな
条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列であっ
て、かつ前記（ｆ）によりコードされるアミノ酸配列か
らなる酵素と同等な触媒機能を有する酵素のアミノ酸配
列をコードする塩基配列。 （Ａ群） アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン （Ｂ群） アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、
スレオニン、フェニルアラニン、ヒスチジン、チロシ
ン、アルギニン - 【請求項１０】エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ）属の微生物が、エシェリヒア コリ（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）種であることを特徴とする請求
項１記載の死菌化方法。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006325504A (ja) * | 2005-05-27 | 2006-12-07 | Sumitomo Chemical Co Ltd | 光学活性シクロプロパンカルボン酸の製造方法 |
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2001
- 2001-11-13 JP JP2001347082A patent/JP4039041B2/ja not_active Expired - Fee Related
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