CN103189519B

CN103189519B - (r)‑选择性胺化

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Publication number: CN103189519B
Application number: CN201180034658.9A
Authority: CN
Inventors: 马丁·斯库尔曼; 韦南德·彼得·赫勒纳·派特斯; 纳特斯卡·赫伯蒂娜·约翰尼斯·斯梅茨; 赫尔马特·施瓦布; 克斯廷·斯坦纳; 卡捷琳娜·尼古拉耶夫娜·里帕斯卡; 诺特·施特罗迈尔
Original assignee: DPx Holdings BV
Current assignee: Pa Sean Austria & Co KG GmbH
Priority date: 2010-07-14
Filing date: 2011-07-14
Publication date: 2018-01-26
Anticipated expiration: 2031-07-14
Also published as: WO2012007548A1; ES2650245T3; EP2593556A1; US20140199734A1; MX350510B; CN103189519A; US20160032335A1; EP2593556B1; US10023886B2; PT2593556T; JP5999565B2; JP2013530713A; MX2013000494A

Abstract

本发明涉及通过使用新颖转氨酶从通式[1][a]的酮酶促合成相应的通式[1][c]的对映异构体富集的(R)‑胺的方法

Description

(R)-选择性胺化

本发明涉及酮的(R)-选择性胺化的方法和在该方法中使用的酶。

相当多的(现有的以及开发中的)药物活性化合物含有不能通过合成直接从天然氨基酸衍生的手性胺官能团。根据药物制造商，从酮不对称合成胺是将来最为人们所期望的反应之一(Constable et al.,GreenChem.2007,9,411)。此外，在药物活性化合物的合成中尽可能多地依赖“绿色”途径是药物制造商的目标。生物催化转化因此是优选的。

用于手性胺的生物催化生产的吸引人的途径是根据反应[1]从酮和胺供体开始的立体选择性转氨作用（transamination）：

已报道所需的立体选择性酶(也可称为转氨酶、氨基转移酶或氨基转氨酶)，例如来自Vibrio fluvialis的(S)-选择性ω-转氨酶(Shin et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.2003,61,463)，但目前为止(S)-选择性酶比(R)-选择性酶更多。

立体选择性转氨酶例如已描述于欧洲专利公开EP1038953和EP987332中。

EP1038953涉及编码在存在仲丁胺情况下能合成光学活性(R)-α-甲基苄胺的转氨酶的DNA。

EP987332尤其涉及来自Mycobacterium aurum种的转氨酶，其可催化苯乙酮和仲丁胺的立体选择性转氨作用，成为对映异构体富集的(R)-α-甲基苄胺和2-丁酮。相同的转氨酶还用于(RS)-α-甲基苄胺的外消旋拆分，以获得对映异构体富集的(S)-α-甲基苄胺以及对映异构体富集的D-丙氨酸和D-丝氨酸的合成。

US7169592涉及来自Arthrobacter种的编码下述重组转氨酶的DNA，所述重组转氨酶可在存在氨基供体的情况下催化若干酮的(R)-立体选择性转氨作用，以产生对映异构体富集的(R)-胺。

为了能够将立体选择性转氨反应应用至更广范围的化合物，需要进一步的立体选择性转氨酶。

本发明涉及通过使用新颖转氨酶，从通式[1][a]的酮酶促合成相应的通式[1][c]对映异构体富集的(R)-胺的方法。

这些新颖转氨酶选自由下述蛋白组成的组：

a)与SEQ ID No.1的氨基酸序列具有至少90%同一性的蛋白；

b)与SEQ ID No.3的氨基酸序列具有至少90%同一性的蛋白；

c)与SEQ ID No.5的氨基酸序列具有至少90%同一性的蛋白；

d)与SEQ ID No.7的氨基酸序列具有至少90%同一性的蛋白；

e)与SEQ ID No.9的氨基酸序列具有至少90%同一性的蛋白；

f)与SEQ ID No.11的氨基酸序列具有至少90%同一性的蛋白；

g)与SEQ ID No.13的氨基酸序列具有至少90%同一性的蛋白；

h)与SEQ ID No.15的氨基酸序列具有至少90%同一性的蛋白；

i)与SEQ ID No.17的氨基酸序列具有至少90%同一性的蛋白；

j)与SEQ ID No.19的氨基酸序列具有至少90%同一性的蛋白；

k)与SEQ ID No.21的氨基酸序列具有至少90%同一性的蛋白；

l)与SEQ ID No.23的氨基酸序列具有至少90%同一性的蛋白；

m)与SEQ ID No.25的氨基酸序列具有至少90%同一性的蛋白；

n)与SEQ ID No.30的氨基酸序列具有至少90%同一性的蛋白；

o)与SEQ ID No.33的氨基酸序列具有至少90%同一性的蛋白；

p)与SEQ ID No.35的氨基酸序列具有至少90%同一性的蛋白；

q)与SEQ ID No.38的氨基酸序列具有至少90%同一性的蛋白；

r)与SEQ ID No.40的氨基酸序列具有至少90%同一性的蛋白；

s)与SEQ ID No.43的氨基酸序列具有至少90%同一性的蛋白；

t)与SEQ ID No.46的氨基酸序列具有至少90%同一性的蛋白，以及

u)蛋白，其具有转氨酶活性并分离自由下述生物体组成的生物体组中的微生物：Rahnella aquatilis、Ochrobactrum anthropi、Ochrobactrumtritici、Sinorhizobiummorelense、Curtobacterium pusilllum、Paecilomyceslilacinus、Microbacteriumginsengisoli、Microbacteriumtrichothecenolyticum、Pseudomonas citronellolis、Yersinia kristensenii、Achromobacter spanius、Achromobacter insolitus、Mycobacteriumfortuitum、Mycobacterium frederiksbergense、Mycobacterium sacrum、Mycobacterium fluoranthenivorans、Burkholderia sp.、Burkholderia tropica、Cosmospora episphaeria和Fusarium oxysporum。

根据本发明已发现，在缺省设定下使用ClustalW2多序列比对的序列比对研究(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2，Larkin et al.，Bioinformatics2007，23，2947)中，根据本发明的SEQ ID No.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23和25的转氨酶与转氨酶的SEQ IDNo.1的野生型氨基酸序列的同一性百分比在宽范围内变化。根据本发明发现，即使与SEQ ID No.1有约30%的同一性百分比仍然是非常合适的转氨酶。

然而，本发明人已发现，可在本发明中使用的转氨酶(以及从其衍生的突变体)都具有共同点：当与SEQ ID No.1的野生型的氨基酸序列相比时，它们在对应于氨基酸序列SEQ ID No.1中的下述位置的位置处具有至少37个保守的氨基酸，即A32、A44、D50、G52、D57、Y60、V65、G68、F71、L73、R79、V106、V116、R122、G123、P145、P177、K180、N181、W183、D185、E213、G216、N218、P230、L235、G237、R240、V243、E269、A276、G277、G278、P281、G296、W307和Y321。

通过在缺省设定下进行ClustalW2多序列比对，可鉴定对应于SEQ IDNo.1的转氨酶野生型氨基酸序列中的氨基酸残基位置的野生型或突变蛋白序列的氨基酸残基。在此类比对中与在SEQ ID No.1给出的转氨酶序列的氨基酸残基位于相同栏（column）中的氨基酸残基被定义为对应于SEQID No.1的转氨酶序列这些各自氨基酸残基对应的位置。

微生物Rahnella aquatilis、Ochrobactrum anthropi、Ochrobactrumtritici、Sinorhizobium morelense、Curtobacterium pusilllum、Paecilomyces lilacinus、Microbacterium ginsengisoli、Microbacteriumtrichothecenolyticum、Pseudomonascitronellolis、Yersiniakristensenii、Achromobacter spanius、Achromobacterinsolitus、Mycobacterium fortuitum、Mycobacterium frederiksbergense、Mycobacterium sacrum、Mycobacterium fluoranthenivorans、Burkholderia sp.、Burkholderia tropica、Cosmospora episphaeria和Fusarium oxysporum的每一种的样品于2010年7月13日保藏于德国不伦瑞克的德国微生物和细胞培养物保藏处（GermanCollection ofMicroorganisms and Cell Cultures，DSMZ）。

上述化学结构[1][a]以及[1][c]中，R₁和R₂不同并且可独立地为直链或支链脂肪族、杂脂肪族、芳香族、杂芳香族结构或形成环状结构。

更特别地，R₁和R₂不同，并且R₁和R₂独立地含有1至30个碳原子并且R₁和R₂独立地为取代或未取代脂肪族结构；取代或未取代支链脂肪族结构；取代或未取代环状脂肪族结构；含有至少一个氧原子、硫原子或氮原子的取代或未取代杂环脂肪族结构；取代或未取代芳香族结构；含有至少一个硫原子、氧原子或氮原子的取代或未取代杂-芳香族结构；或一起形成含有至少一个氧原子、硫原子或氮原子的取代或未取代环状结构或杂环结构；其中取代基选自，但不限于由下述组成的组：卤素原子、羟基、甲氧基、单氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、具有1至6个碳原子的烷基。

优选地，对映异构体富集的(R)-胺产物的终浓度在反应混合物的1重量%至50重量%之间。最优选地，对映异构体富集的(R)-胺产物的终浓度在反应混合物的5重量%至35重量%之间。

根据本发明的方法可在水性反应混合物中进行，所有的反应溶解；或在淤浆中进行，一些反应物至少部分溶解且一些反应物至少部分作为固体材料。

使用水不可混溶的溶剂（比如有机溶剂）来在邻近含有转氨酶的缓冲水相处形成第二液相，这在转氨酶反应中比纯水性或水性淤浆反应有优势，因为有机溶剂可对较不溶于水的酮和氨基供体起存储器的作用。其相比淤浆反应(固体-水性)可增加较不溶于水的酮或氨基供体溶解进入含有转氨酶的水相的传质速率。进一步，其可通过可能的抑制剂的萃取去除减少可能的底物或产物抑制。而且这种至少一种转氨酶反应产物的萃取去除可将水相中的转氨酶反应的平衡推向产物侧，从而改进转氨酶催化反应的产率和/或效率。

根据本发明的方法可在包含水相和第二有机相的反应混合物中进行。在使用包含水相和第二有机相的反应混合物的情况下，反应混合物优选地包含水相和第二有机相并且水相：有机相的体积比在100和0.01之间。更优选地反应混合物包含水相和第二有机相并且水相：有机相的体积比在20和0.1之间。最优选地反应混合物包含水相和第二有机相并且水相：有机相的体积比在20和1之间。

合适的有机溶剂可例如选自，但不限于下述的组：环己酮、二氯甲烷、戊烷、庚烷、MTBE(甲基叔丁基醚)、甲苯、2-甲基-四氢呋喃、醋酸丁酯和乙酸乙酯。

根据本发明的上述转氨酶a)至m)经EMBL-EBI(http://www.ebi.ac.uk)或NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)服务器在诸如EMBL/GenBank/DDBJ，Swiss-Prot/UniProtKB(2010年6月15日发布)，RefSeq或非冗余（Non-redundant）的公共核苷酸和多肽数据库中的数据库搜索中鉴定出，注释为“假定的蛋白”（“hypothetical protein”），其与属于吡哆醛5'-磷酸酯依赖性酶IV类(PLPDE_IV)超家族的支链L-氨基酸氨基转移酶或4-氨基-4-脱氧分支酸裂解酶(EC4.1.3.38)具有最高相似度。迄今还未报道支持该注释的功能表达和活性。

令人吃惊地，如下面将要描述的，已发现转氨酶a)至m)实际上是(R)-选择性ω-转氨酶，而不是(S)-选择性氨基酸氨基转移酶。另外，转氨酶a)至m)的底物范围与EP1038953、EP987332和US7169592中描述的(R)-转氨酶的不同。

根据本发明的上述转氨酶a)至t)已经通过在下面一个或多个ω-转氨酶转化中通过它们的活性和立体选择性来表征：

(i)(RS)-α-甲基苄胺的外消旋拆分。

通常酶（具体地转氨酶）的立体选择性可在包含手性中心的底物外消旋混合物的外消旋拆分中测定。根据本发明，(R)-选择性转氨酶是在存在酮底物比如丙酮酸的情况下优先从外消旋甲基苄胺（MBA）诱导(R)-α-MBA转氨反应的酶。根据本发明的(R)-转氨酶是在存在丙酮酸的情况下相对于α-甲基苄胺的(S)-对映体优先转化(R)-对映体、产生对映体过量(e.e.)至少为10%的剩余(S)-对映体富集的酶。优选地所得(S)-MBA的e.e.是至少50%。更优选地e.e.至少为60%。甚至更优选地e.e.至少为70%。甚至更优选地e.e.至少为80%。甚至更优选地e.e至少为90%。甚至更优选地过量至少为95%。甚至更优选地e.e至少为96%。甚至更优选地e.e至少为97%。甚至更优选地e.e.至少为98%。最优选地e.e至少为99%。

典型地80mM的外消旋α-甲基苄胺(MBA)是在存在转氨酶的情况下与含有0.1mM吡哆醛5’-磷酸盐(PLP)pH7.0的100mM磷酸钾(KP_i)缓冲液中的40mL丙酮酸钠在28℃反应20h。(R)-和/或(S)-MBA的浓度和对映体过量可通过，例如具有合适的手性柱材料的高效液相色谱(HPLC)或气相色谱(GC)来测定。(R)-转氨酶的制剂形式不是关键的；其可以以(部分)纯化的酶、无细胞提取物(CFE)或粗细胞提取物；液体、粉末或固定形式；含有包含转氨酶的可透化处理细胞、完整细胞或培养物发酵液或以任何其他形式添加。

(ii)关于α-甲基苄胺的纯对映异构体的活性和选择性。

酶的立体选择性也通过其对对具体底物的单个对映异构体的比活性而表征。这些可在用底物的单个立体纯(enatiopure)形式的分开的活性检验中测定。在本发明上下文中，对α-甲基苄胺(MBA)的两个对映异构体的特异性转氨酶活性是转氨酶(R)-选择性的测量。在本发明的背景下，对(R)-MBA比活性与对(S)-MBA比活性的比定义为转氨酶立体选择性值(TEV)。(R)-选择性转氨酶定义为TEV值>1的转氨酶。良好的转氨酶(R)-选择性定义为TEV≥10的(R)-MBA与(S)-MBA的比活性比。高的转氨酶(R)-选择性定义为TEV≥100的(R)-MBA与(S)-MBA的比活性比。

使用分光光度法分别测定对(R)-MBA和(S)-MBA的转氨酶活性。在1ml的终反应体积中，50μl以液体形式的转氨酶合适的稀释物在试管中与12.5mM(R)-MBA或(S)-MBA和5mM丙酮酸钠在存在50mM含有0.1mM PLP pH7.5的KP_i缓冲液的情况下混合。在30℃预孵化5min之后，通过添加10μl的0.5M丙酮酸钠(在pH7.5，0.1mM PLP的50mM KP_i缓冲液中)至其他检验组分开始反应。在添加丙酮酸钠之后，记录在300nm处的吸收值并且使用苯乙酮在300nm处的摩尔消光系数ε=0.28cm²/μmol，根据比尔-朗伯定律计算样品中转氨酶活性。一单位(U)的转氨酶活性定义为在30℃下在含有0.1mM PLP pH7.5的50mM KP_i缓冲液中由12.5mM(R)-MBA或(S)-MBA和5mM丙酮酸钠每分钟形成1μmol的苯乙酮。通过体积活性值(U/ml CFE)除以液体转氨酶样品中总的蛋白浓度计算CFE的转氨酶比活性(U/mg总CFE蛋白)。通过对(R)-MBA的体积或比活性分别除以对(S)-MBA的体积或比活性计算转氨酶立体选择性值(TEV)。

优选地(R)-转氨酶具有至少为1的TEV，更优选地(R)-转氨酶具有至少为10的的TEV，甚至更优选地(R)-转氨酶具有至少为100的TEV。

(iii)从对应的酮和合适的氨基供体比如苄胺或α-甲基苄胺合成对映异构体富集的(R)-胺。

由(R)-选择性转氨酶催化的反应的典型期望的结果是从氨基供体和酮底物形成根据式1[c]的对映异构体富集的(R)-胺。用于(R)-选择性转氨酶反应的合适的氨基供体包含例如外消旋或(R)-MBA、外消旋或(R)-1-氨基茚满、外消旋或(R)-1-氨基四氢萘、外消旋或D-丙氨酸、异丙基胺、苄胺、外消旋或(R)-仲丁胺(2-氨基丁烷)、β-丙氨酸或外消旋或D-3-氨基丁酸。

一般地，就具体的转氨酶而言，某些氨基供体是优选的。令人吃惊地，我们发现就SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.13、SEQ ID No.15、SEQID No.17、SEQ ID No.21、SEQNO ID23和SEQ ID No.43的转氨酶而言，优选的氨基供体是外消旋或(R)-MBA或外消旋或(R)-仲丁胺。

典型地，70mM的氨基供体与70mM的酮底物在存在(R)-转氨酶的情况下在用pH7.5的100mM磷酸钾(KP_i)缓冲的水性反应混合物中在28℃下反应。任选地，水混溶的或不混溶的溶剂可用于溶解氨基供体或酮底物。根据本发明的(R)-选择性转氨酶从等摩尔量的氨基供体和酮底物开始，在28℃过夜反应之后，将有成为期望对映异构体富集的(R)-胺的至少0.5%的至少低转化，对映异构体富集的(R)-胺具有至少50%的对映体过量。(R)-转氨酶的形成不是关键的；其可以以(部分)纯化的酶、无细胞提取物或粗细胞提取物；液体、粉末或固定形式；含有包含转氨酶可渗透化细胞、完整细胞或培养物发酵液或以任何其他形式添加。

本领域技术人员已知转氨酶反应是可逆的反应并且转化的程度受具体底物和产物影响。进一步地，本领域技术人员已知在等摩尔的氨基供体和酮底物浓度时底物转化的程度可通过如下增加：例如通过蒸发一种反应产物或使用树脂原位去除产物，或添加进一步转化一种反应产物的酶，比如丙酮酸脱羧酶或乳酸脱氢酶。进一步地，已知酮底物1[a]向胺产物1[c]转化的程度可通过氨基供体1[b]过量而增加。

优选地产生的对映异构体富集的(R)-胺具有至少为50%的e.e.。更优选地e.e.至少为60%。甚至更优选地e.e.至少为70%。甚至更优选地e.e.至少为80%。甚至更优选地e.e.至少为90%。甚至更优选地e.e.至少为95%。甚至更优选地e.e.至少为96%。甚至更优选地e.e.至少为97%。甚至更优选地e.e.至少为98%。甚至更优选地e.e.至少为99%。最优选地产生的对映异构体富集的(R)-胺的e.e.大于99%。

在本申请中，“与(参考序列)的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的蛋白”表示：该蛋白是参考序列的同源物，其氨基酸序列与参考序列的氨基酸序列为至少90%相同，同一性是在用序列比对工具比如BLASTP(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)，ClustalW(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2)或Align Plus 5(Scientific &EducationalSoftware，Cary，NC，美国)进行的序列比对中测定的。

本文使用的术语“同源物”尤其用于具有至少60%、优选地至少65%、更优选地至少70%、更优选地至少75%、更优选地至少80%、尤其至少85%、更特别地至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的多核苷酸或多肽。术语同源物也表示包括由于遗传密码的简并性不同于另一核酸序列并且编码相同多肽序列的核酸序列(多核苷酸序列)。

序列同一性或相似性在本文定义为两条或多条多肽序列或两条或多条核酸序列之间的关系，其通过比较序列来测定。通常，序列同一性或相似性在序列的全长上比较，但是可能也仅仅针对比对的序列的一部分彼此比较。在本领域中，“同一性”或“相似性”也表示多肽序列或核酸序列之间序列相关性的程度，根据具体情况而定，如通过这种序列之间的匹配来测定。设计测定同一性或相似性的优选方法以给出测试序列之间的最大匹配。在本发明的上下文中，确定两条序列之间的同一性和相似性的优选计算机程序方法包括BLASTP和BLASTN(Altschul,S.F.et al.,J. Mol.Biol.1990,215,403-410，从NCBI和其他来源公众可得到(BLAST Manual,Altschul,S.et al.,NCBI NLM NIH,Bethesda,MD,USA)。使用BLASTP的多肽序列比对的优选的参数是缺口10.0，缺口延伸0.5，Blosum62矩阵。使用BLASTN核酸序列比对的优选参数是缺口10.0、缺口延伸0.5、DNA全矩阵(DNA同一性矩阵)。

根据本发明的转氨酶可以任何形式使用。例如，转氨酶可以，例如以分散体、溶液或固定形式使用，如粗酶、如商业上可获得的酶，如从商业上可获得的制剂进一步纯化的酶、如通过已知纯化方法从其来源获得的酶、在天然的或通过遗传修饰而具有必要的转氨酶活性的(任选地可渗透化的和/或固化的)完整细胞中的酶，或在具有该活性的细胞裂解产物中的酶。

包含本发明方法中的转氨酶的细胞可使用本领域本身已知的分子生物学技术构建。例如，如果转氨酶在杂合系统中产生，这种技术可用来提供包含编码转氨酶的基因的载体。

编码具有转氨酶活性的多肽基因可针对用于生产多肽的宿主细胞的优选密码子使用而被改进，以改善多肽的表达水平。实现这种改进的合适的方法是，例如如在WO08000632中描述的密码子对优化。

包含这种基因的载体可包含一个或多个调节元件，例如一个或多个启动子，其可与编码转氨酶的基因可操作连接。这种载体的例子包含质粒，如pBAD/Myc-HisC、pBAD-DEST49、pET-DEST42(所有Invitrogen，Carlsbad，CA，美国)、pET系列质粒，例如pET-26b(+)(Novagen，Nottingham，UK)或pMS470Δ8(Balzer et al.,Nucleic Acids Research,1992,20(8):1851-1858)。

如本文所使用的，术语“可操作地连接”指多核苷酸元件(或编码序列或核酸序列)以功能关系连接。当与另一核酸序列放入功能关系中时，核酸序列是“可操作地连接”的。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，启动子或增强子与编码序列可操作连接。

如本文所使用的，术语“启动子”指下述起到控制一个或多个基因转录的功能，相对于基因的转录起始位点的转录方向位于上游，并且通过存在DNA-依赖性RNA聚合酶结合位点、转录起始位点和任何其他DN序列（包括但不限于转录因子结合位点、阻遏因子和激活因子蛋白结合位点）而从结构上鉴定出的核酸片段，以及直接或间接调节从启动子的转录数量的为本领域技术人员所已知的任何其他核苷酸序列。“组成型”启动子是在大部分环境和发育条件下有活性的启动子。“可诱导的”启动子是在环境或发育调节下有活性的启动子。当用于表示给定的(重组)核酸或多肽分子和给定的宿主生物体或宿主细胞之间关系时，术语“同源的”理解为表示核酸或多肽分子天然通过相同种，优选地相同变体或菌株的宿主细胞或生物体产生。

用于实现编码本发明方法中使用的酶，尤其是如本文上面所述的转氨酶的核苷酸序列表达的启动子，对编码待表达酶的核苷酸序列而言可以是天然的，或对与其可操作地连接的核苷酸序列(编码序列)而言可以是异源的。优选地，启动子对宿主而言是同源的，即内生的。

如果使用(对于编码感兴趣酶的核苷酸序列而言)异源的启动子，优选地，异源启动子比与编码序列同源的启动子能够产生更高稳定状态水平包含编码序列的转录体(或每单位时间能够生产较多的转录体分子，即mRNA分子)。在本发明上下文中，合适的启动子包括组成型和可诱导型天然启动子二者以及本领域技术人员所熟知的经工程改造的启动子。

“强组成型启动子”是与相比天然宿主细胞比较使得mRNA以高频率启动的启动子。

这种强组成型启动子在革兰氏阳性微生物中的例子包括SP01-26、SP01-15、veg、pyc(丙酮酸羧化酶启动子)和amyE。

可诱导的启动子在革兰氏阳性微生物中的例子包括，IPTG可诱导型Pspac启动子、木糖可诱导型Pxyl启动子。

组成型和可诱导型启动子在革兰氏阴性微生物中的例子包括，但不限于tac、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、ara(P_BAD)、SP6、λ-P_R和λ-P_L。

组成型和可诱导型启动子在真核微生物比如酵母和真菌中的例子包括，但不限于，AOX-、GAP-和TEF-启动子。

当用于核酸(DNA或RNA)或蛋白时，术语“异源”指下述核酸或蛋白：其不作为其存在于其中的生物体、细胞、基因组或DNA或RNA序列的一部分天然出现，或其在不同于其天然出现的细胞中或基因组或DNA或RNA序列中一个或多个位置中出现。异源核酸或蛋白对其所引入的细胞而言不是内生的，但是已经从另一细胞获得或合成产生或重组产生。一般而言，尽管不是必要的，这种核酸编码不被其中DNA被转录或表达的细胞所正常产生的蛋白。类似地，外生RNA编码通常不在外生RNA存在于其中的细胞中表达蛋白。异源核酸和蛋白也指外源核酸或蛋白。术语异源核酸或蛋白在本文中包括本领域技术人员将认为是对于表达其的细胞而言是异源或外源的任何核酸或蛋白。

宿主细胞或微生物可尤其选自由下述组成的属的组：Aspergillus、Bacillus、Corynebacterium、Escherichia、Saccharomyces、Pseudomonas、Gluconobacter、Penicillium和Pichia。尤其，宿主菌株，和因此适合生产转氨酶的宿主细胞可选自Escherichia coli、Bacillus subtilis、Bacillusamyloliquefaciens、Corynebacteriumglutamicum、Aspergillus niger、Penicillium chrysogenum和Pichia pastoris宿主细胞。

上文以n)提到的具有转氨酶活性的蛋白由在荷兰和德国收集的土壤样品中存在的微生物产生。在使用(R)-胺作为唯一氮源用于微生物生长的培养基中，富集来自这些土壤样品的这些微生物。为了该目的，下述6个结构上不同的(R)-胺用作唯一氮源：(R)-2-氨基丁烷、(R)-3,3-二甲基-2-氨基丁烷、(R)-α-甲基苄胺、(R)-α-乙基苄基胺、(R)-1-氨基茚满和(R)-1-氨基四氢萘。

在液体培养基中富集之后，在含有各自(R)-胺作为唯一氮源的琼脂平板上分离微生物，纯培养物再次在各自的液体富集培养基中生长并且用于完整细胞系统中的转氨酶反应。通过HPLC或GC分析检测所得转化反应和产生的(R)-胺对映体过量。

由(R)-选择性转氨酶催化的反应的典型期望的结果是从氨基供体和酮底物形成根据式1[c]的对映异构体富集的(R)-胺。用于(R)-选择性转氨酶反应合适的氨基供体包含例如外消旋或(R)-MBA、外消旋或(R)-1-氨基茚满、外消旋或(R)-1-氨基四氢萘、外消旋或D-丙氨酸、异丙基胺、苄胺、外消旋或(R)-仲丁胺(2-氨基丁烷)、β-丙氨酸或外消旋或D-3-氨基丁酸。

典型地，80mM的氨基供体与40mM的酮底物在存在(R)-转氨酶的情况下在用100mM磷酸钾(KP_i)缓冲的水性反应混合物中在pH7.528℃下反应。在用100mM磷酸钾(KP_i)缓冲的水性反应混合物中存在(R)-转氨酶的情况下pH7.5在28℃下优选地使用至少100mM的酮底物。任选地水混溶的或不混溶的溶剂可用于溶解氨基供体或酮底物。根据本发明的(R)-选择性转氨酶从等摩尔量的氨基供体和酮底物开始，在28℃过夜反应之后，将有成为期望对映异构体富集的(R)-胺的至少0.5%的至少低转化，对映异构体富集的(R)-胺具有至少50%的对映体过量。

(R)-转氨酶的形式不是关键的；其可以以(部分)纯化的酶，无细胞提取物或粗细胞提取物；液体，粉末或固定形式；含有包含转氨酶可渗透化细胞，完整细胞或培养物发酵液或以任何其他形式添加。

本领域技术人员已知转氨酶反应是可逆的反应并且转化的程度受具体底物和产物影响。进一步地，本领域技术人员已知在等摩尔量的氨基供体和酮底物浓度时底物转化的程度可通过如下增加：例如通过蒸发一种反应产物或使用树脂的原位产物去除，或添加进一步转化一种反应产物的酶，比如丙酮酸脱羧酶或乳酸脱氢酶。

优选地产生的对映异构体富集的(R)-胺具有至少为50%的e.e.。更优选地e.e.至少为60%。甚至更优选地e.e.至少为70%。甚至更优选地e.e.至少为80%。甚至更优选地e.e.至少为90%。甚至更优选地e.e.至少为95%。甚至更优选地e.e.至少为96%。甚至更优选地e.e.至少为97%。最优选地产生的对映异构体富集的(R)-胺的e.e.至少为99%。

最终的结果是收集到31种微生物，其如表1所示被表征。

表1.于2010年7月13日保藏于德国，不伦瑞克的德国微生物和细胞培养物保藏处(DSMZ)

为了从四氢萘酮合成对映异构体富集的(R)-氨基四氢萘，优选地使用微生物Sinorhizobium morelense、Rahnella aquatilis或Ochrobactrumanthropi或可从这些种的任何一种中获得的转氨酶。更优选地微生物Rahnella aquatilis或Ochrobactrumanthropi或可从这些种的任何一种中获得的转氨酶。最优选地使用微生物Ochrobactrumanthropi或可从该种中获得的转氨酶。

为了从茚满酮合成对映异构体富集的(R)-氨基茚满，优选地使用微生物Paecilomyces lilacinus或Curtobacterium pusillum或可从这些种的任何一种中获得的转氨酶。最优选地使用微生物Curtobacterium pusillum或可从该种中获得的转氨酶。

为了从苯丙酮合成对映异构体富集的(R)-α-乙基苄基胺，优选地使用微生物Microbacterium ginsengisoli、Yersinia kristensenii、Pseudomonascitronellolis或Ochrobactrum anthropi或可从这些种的任何一种中获得的转氨酶。更优选地使用微生物Yersinia kristensenii、Pseudomonas citronellolis或Ochrobactrum anthropi或可从这些种的任何一种中获得的转氨酶。甚至更优选地使用微生物Pseudomonascitronellolis或Ochrobactrum anthropi或可从这些种的任何一种中获得的转氨酶。最优选地使用微生物Ochrobactrum anthropi或可从该种中获得的转氨酶。

为了从苯乙酮合成对映异构体富集的(R)-α-甲基苄胺，优选地使用微生物Mycobacterium fortuitum、Ochrobactrum tritici或Achromobacterspanius或可从这些种的任何一种中获得的转氨酶。更优选地使用微生物Ochrobactrum tritici或Achromobacter spanius或可从这些种的任何一种中获得的转氨酶。最优选地使用微生物Achromobacter spanius或可从该种中获得的转氨酶。

为了从3,3-二甲基-2-丁酮合成对映异构体富集的(R)-3,3-二甲基-2-氨基丁烷，优选地使用Mycobacterium属微生物或从该属获得的转氨酶。更优选地使用来自下述组的微生物：Mycobacterium frederiksbergense、Mycobacterium sacrum或Mycobacteriumfluoranthenivorans，或可分别从这些种之一获得的转氨酶。甚至更优选地使用微生物Microbacteriumginsengisoli或Achromobacter insolitus或可从这些种的任何一种中获得的转氨酶。最优选地使用微生物Achromobacter insolitus或可从该种中获得的转氨酶。

为了从2-丁酮合成对映异构体富集的(R)-2-氨基丁烷，优选地使用Burkholderia微生物属或可从该属获得的转氨酶。更优选地使用来自下述组的微生物：Cosmosporaepisphaeria或Fusarium oxysporum或可分别从这些种的任何一种中获得的转氨酶。甚至更优选地使用微生物Microbacterium trichothecenolyticum或可从该种中获得的转氨酶。最优选地使用下述微生物：Burkholderia sp.、Burkholderia tropica或Rahnellaaquatilis，或可分别从这些种的任何一种中获得的转氨酶。

可通过如下方式实现来自保藏库的单个微生物的再分离：在含有各自(R)-胺的、最初用于富集微生物的选择性富集培养基上对库存微生物的适当稀释液铺平板并且再划线。在含有各自(R)-胺的选择性富集培养基上进行重复的再划线，直到获得相同形态学的单菌落。随后进行16S rRNA或D2-LSU rRNA测序，例如通过使用验证的(AppliedBiosystme，Carlsbad，CA，美国)系统进行，以再确认单个微生物。

可从表1中的菌株获得转氨酶包括源自表1中菌株的转氨酶基因序列的酶。这些基因序列可通过本领域技术人员已知的各种方法鉴定和分离，比如基因组测序和与已知转氨酶序列的序列比对、DNA分离和使用具有与已知转氨酶基因具有高度同一性(至少80%)的DNA序列的探针、酶纯化和酶测序、源自其他宿主生物体中这些菌株的DNA转化和在(R)-胺上的选择生长随后DNA测序，或这些方法的组合(Ausubel et al.，eds.，"Currentprotocols in molecular biology"，Green Publishing and WileyInterscience，New York1987)。

所以，本发明也涉及包含具有(R)-转氨酶活性的酶的微生物，所述微生物为选自由下述组成的生物体组的微生物：Rahnella aquatilis(保藏为DSM23797)、Ochrobactrumanthropi(保藏为DSM23793)、Ochrobactrumtritici(保藏为DSM23786)、Sinorhizobiummorelense(保藏为DSM23794)、Curtobacterium pusilllum(保藏为DSM23787)、Paecilomyceslilacinus(保藏为DSM23771)、Microbacterium ginsengisoli、Microbacterium trichothecenolyticum(保藏为DSM23788)、Pseudomonascitronellolis(保藏为DSM23795)、Yersinia kristensenii(保藏为DSM23792)、Achromobacter spanius(保藏为DSM23791)、Achromobacterinsolitus(保藏为DSM23790)、Mycobacteriumfortuitum(保藏为DSM23789)、Mycobacterium frederiksbergense(保藏为DSM23798)、Mycobacterium sacrum(保藏为DSM23785)、Mycobacteriumfluoranthenivorans(保藏为DSM23796)、Burkholderia sp.、Burkholderiatropica(保藏为DSM23799)、Cosmosporaepisphaeria(保藏为DSM23772)和Fusarium oxysporum(保藏为DSM23770)。

根据进一步的实施方式，本发明涉及包含具有(R)-转氨酶活性的酶或蛋白的微生物，所述酶选自由下述组成的组：Cpu-TA1[SEQ ID No.30]、Cpu-TA2[SEQ ID No.33]、Cpu-TA3[SEQ ID No.35]、Raq-TA2[SEQ IDNo.38]、Raq-TA3[SEQ ID No.40]、Asp-TA1[SEQ IDNo.43]和Mgi-TA1[SEQ ID No.46]，所述蛋白与这些氨基酸序列的任一条具有至少90%、优选地至少91%、优选地至少92%、优选地至少93%、优选地至少94%、优选地至少95%、优选地至少96%、优选地至少97%、优选地至少98%、优选地至少99%的同一性。

根据进一步的实施方式，本发明涉及具有(R)-转氨酶活性的多肽并且其可从选自由下述组成的生物体组的生物体中获得：Rahnella aquatilis(保藏为DSM23797)、Ochrobactrum anthropi(保藏为DSM23793)、Ochrobactrum tritici(保藏为DSM23786)、Sinorhizobium morelense(保藏为DSM23794)、Curtobacterium pusilllum(保藏为DSM23787)、Paecilomyceslilacinus(保藏为DSM23771)、Microbacterium ginsengisoli、Microbacterium trichothecenolyticum(保藏为DSM23788)、Pseudomonascitronellolis(保藏为DSM23795)、Yersinia kristensenii(保藏为DSM23792)、Achromobacter spanius(保藏为DSM23791)、Achromobacterinsolitus(保藏为DSM23790)、Mycobacteriumfortuitum(保藏为DSM23789)、Mycobacterium frederiksbergense(保藏为DSM23798)、Mycobacterium sacrum(保藏为DSM23785)、Mycobacteriumfluoranthenivorans(保藏为DSM23796)、Burkholderia sp.、Burkholderiatropica(保藏为DSM23799)、Cosmosporaepisphaeria(保藏为DSM23772)和Fusarium oxysporum(保藏为DSM23770)。

根据进一步的实施方式，本发明涉及下述多肽，其具有(R)-转氨酶活性并与具有(R)-转氨酶活性并且可从选自下述生物体组的生物体中获得的多肽具有至少90%、优选地至少91%、优选地至少92%、优选地至少93%、优选地至少94%、优选地至少95%、优选地至少96%、优选地至少97%、优选地至少98%、优选地至少99%序列同一性，所述生物体组由下述组成：Rahnella aquatilis(保藏为DSM23797)、Ochrobactrum anthropi(保藏为DSM23793)、Ochrobactrum tritici(保藏为DSM23786)、Sinorhizobium morelense(保藏为DSM23794)、Curtobacterium pusilllum(保藏为DSM23787)、Paecilomyces lilacinus(保藏为DSM23771)、Microbacterium ginsengisoli、Microbacterium trichothecenolyticum(保藏为DSM23788)、Pseudomonas citronellolis(保藏为DSM23795)、Yersiniakristensenii(保藏为DSM23792)、Achromobacter spanius(保藏为DSM23791)、Achromobacterinsolitus(保藏为DSM23790)、Mycobacteriumfortuitum(保藏为DSM23789)、Mycobacterium frederiksbergense(保藏为DSM23798)、Mycobacterium sacrum(保藏为DSM23785)、Mycobacteriumfluoranthenivorans(保藏为DSM23796)、Burkholderia sp.、Burkholderiatropica(保藏为DSM23799)、Cosmospora episphaeria(保藏为DSM23772)和Fusarium oxysporum(保藏为DSM23770)。

根据进一步实施方式，本发明涉及具有(R)-转氨酶活性的多肽或蛋白，所述多肽选自由下述组成的组：Cpu-TA1[SEQ ID No.30]、Cpu-TA2[SEQ ID No.33]、Cpu-TA3[SEQ IDNo.35]、Raq-TA2[SEQ ID No.38]、Raq-TA3[SEQ ID No.40]、Asp-TA1[SEQ ID No.43]和Mgi-TA1[SEQ ID No.46]，所述蛋白与这些多肽序列的任一条具有至少90%、优选地至少91%、优选地至少92%、优选地至少93%、优选地至少94%、优选地至少95%、优选地至少96%、优选地至少97%、优选地至少98%、优选地至少99%的同一性。

根据进一步实施方式，本发明涉及包含编码下述多肽的序列的核酸，所述多肽具有(R)-转氨酶活性并与具有(R)-转氨酶活性并且可从选自下述生物体组的生物体中获得的多肽至少90%、优选地至少91%、优选地至少92%、优选地至少93%、优选地至少94%、优选地至少95%、优选地至少96%、优选地至少97%、优选地至少98%、优选地至少99%序列同一性，所述生物体组由下述生物体组成：Rahnella aquatilis(保藏为DSM23797)、Ochrobactrumanthropi(保藏为DSM23793)、Ochrobactrum tritici(保藏为DSM23786)、Sinorhizobiummorelense(保藏为DSM23794)、Curtobacterium pusilllum(保藏为DSM23787)、Paecilomyces lilacinus(保藏为DSM23771)、Microbacterium ginsengisoli、Microbacteriumtrichothecenolyticum(保藏为DSM23788)、Pseudomonas citronellolis(保藏为DSM23795)、Yersinia kristensenii(保藏为DSM23792)、Achromobacterspanius(保藏为DSM23791)、Achromobacter insolitus(保藏为DSM23790)、Mycobacteriumfortuitum(保藏为DSM23789)、Mycobacteriumfrederiksbergense(保藏为DSM23798)、Mycobacterium sacrum(保藏为DSM23785)、Mycobacterium fluoranthenivorans(保藏为DSM23796)、Burkholderia sp.、Burkholderia tropica(保藏为DSM23799)、Cosmosporaepisphaeria(保藏为DSM23772)和Fusarium oxysporum(保藏为DSM23770)。

根据进一步的实施方式，本发明涉及包含编码下述多肽或蛋白的序列的核酸，所述多肽具有(R)-转氨酶活性，选自由下述组成的组：Cpu-TA1[SEQ ID No.30]、Cpu-TA2[SEQID No.33]、Cpu-TA3[SEQ ID No.35]、Raq-TA2[SEQ ID No.38]、Raq-TA3[SEQ ID No.40]、Asp-TA1[SEQ IDNo.43]和Mgi-TA1[SEQ ID No.46]，所述蛋白与这些多肽序列的任一条具有至少90%、优选地至少91%、优选地至少92%、优选地至少93%、优选地至少94%、优选地至少95%、优选地至少96%、优选地至少97%、优选地至少98%、优选地至少99%的同一性。

源自表1中菌株的基因序列的酶也包括具有至少90%、优选地至少91%、优选地至少92%、优选地至少93%、优选地至少94%、优选地至少95%、优选地至少96%、优选地至少97%、优选地至少98%、优选地至少99%序列同一性，通过诱变源自表1个菌株的基因获得的酶。本领域技术人员知道诱变方法，所述方法包括基因合成以及使用诱变引物的诱变方法(Bloom &Arnold,Proc Natl Acad Sci USA2009,106,9995)。

实施例

通用

微生物生长培养基

LB(Luria Bertani)培养基

10g/l Bacto蛋白胨(BD，Le Pont de Claix，法国)

5g/l Bacto酵母提取物(BD，Le Pont de Claix，法国)

5g/l NaCl(Sigma-Aldrich，Steinheim，德国)

15g/l Bacto琼脂(用于固体培养基，BD，Le Pont de Claix，法国)

各成分溶解在去矿物质水中并且如果必要的话，将pH调整至7.0。通过121℃下高压灭菌20min灭菌培养基。对于固体培养基，高压灭菌之前添加琼脂。在高压灭菌的培养基冷却至60℃之后添加抗生素。

选择性富集培养基(SEM)

10g/l Difco酵母碳基础(YCB，BD，Sparks，MD，美国)

55mM甘油(Merck，Darmstadt，德国)

10mM丙酮酸(Sigma-Aldrich，Steinheim，德国)

5mM(R)-胺底物

15g/l Difco纯化琼脂(BD，Le Pont de Claix，法国)

在MilliQ水(Millipore，Billerica，MA，美国)中制备YCB培养基(100g/l)、550mM甘油和100mM丙酮酸的原料液并且通过经0.22μm灭菌滤器的过滤灭菌。通过添加选自(R)-2-氨基丁烷、(R)-3,3-二甲基-2-氨基丁烷、(R)-α-甲基苄胺、(R)-α-乙基苄基胺、(R)-1-氨基茚满和(R)-1-氨基四氢萘的组的(R)-胺底物至具有灭菌的MilliQ水稀释的富集培养基原料液的1:10稀释液，来制备液体富集培养基。相应地用含纯化琼脂的高压灭菌的MilliQ水制备固体富集培养基以获得15g/l的终浓度。

抗生素

含有终浓度为100μg/ml的羧苄青霉素或新霉素的LB培养基用于选择并培养含有包含[SEQ IDs No.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26]的表达载体的重组Escherichia coli菌株以保持质粒。通过经0.22μm灭菌滤器来过滤灭菌羧苄青霉素和新霉素原料液(50mg/ml)。

分子和遗传技术

标准的遗传和分子生物学技术是本领域通常已知的并且之前已经描述过(Maniatis et al.1982“Molecular cloning:a laboratory manual”.Cold SpringHarborLaboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.;Miller1972“Experiments inmoleculargenetics”,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor;Sambrook andRussell 2001"Molecular cloning:a laboratory manual”(3rdedition),Cold SpringHarbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press;F.Ausubel et al,eds.,"Current protocols in molecular biology",GreenPublishing and WileyInterscience,New York1987)。

质粒和菌株

E.coli菌株TOP10(Invitrogen，Carlsbad，CA，美国)用于所有的克隆程序。E.coli也用于蛋白表达。为了诱导基因表达，L-阿拉伯糖以终浓度为0.02%(w/v)使用。

目标基因的克隆

根据WO08000632中描述的程序，对根据[SEQ IDs No.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26]的目标基因进行使用密码子对优化。attB位点添加至核糖体结合位点和起始密码子的所有基因上游和终止密码子的下游以利于使用Gateway技术的克隆(Invitrogen，Carlsbad，CA，美国)。从Geneart(Regensburg，德国)获得合成基因。如在制造商的方案中所描述(www.invitrogen.com)的，使用Gateway技术(Invitrogen)，通过引入的attB位点并且pDONR201(Invitrogen)作为进入载体，将基因构建体进入pBAD/Myc-HisC(Invitrogen，Carlsbad，CA，美国)得到的表达载体。这样分别获得pBAD表达载体。通过用各自pBAD-表达载体转化化学感受态E.coli细胞获得对应的表达菌株。

质粒的鉴定

通过使用本领域通常已知的遗传、生物化学和/或表型手段，比如转化体对抗生素的抗性、转化体的PCR诊断分析或质粒DNA的纯化、纯化的质粒DNA的限制性分析或DNA序列分析，来鉴定携带不同基因的质粒。

测定溶液中的蛋白浓度

使用如Bradford在Anal.Biochem.72:248-254(1976)中描述的改进的蛋白染色结合方法，测定蛋白在溶液中比如无细胞提取物(CFE)中的浓度。将适当的稀释的每个50μl的样品用950μl试剂(溶解在46ml乙醇中的100mg Brilliant Blue G250和100ml85%正磷酸，用milli-Q水补充至1,000ml)在室温下孵育至少5分钟。在Perkin Elmer Lambda20或Lambda35UV/VIS的分光光度计中测量每个样品在595nm波长时的吸收值。使用用含有已知浓度牛血清白蛋白(BSA，范围为0.0125mg/ml至0.20mg/ml)的溶液测定的校准线，来计算样品中的蛋白浓度。

分析

高压液相色谱(HPLC)分析

在Prevail C18 15cm柱上分析含有芳香基的酮和胺。对于α-甲基苄胺、α-乙基苄基胺、2-氨基四氢萘对映异构体的分离和定量，使用了具有用o-苯二醛加巯基乙醇的胺的后衍生柱的Crownpak Cr(+)柱(Daicel)，并使用荧光探测。对于1-氨基四氢萘和1-氨基茚满对映异构体的分离和定量，使用Prevail C18 15cm加Crownpak Cr(+)柱，所述柱具有用o-苯二醛加巯基乙醇的胺的后衍生柱。

气相色谱分析

在使用商业上可得到的参考材料(Sigma-Aldrich)的用于胺柱的CP-Sil8CB柱(Varian)上，分析烷基酮和烷基胺，比如2-丁酮、2-氨基丁烷、3,3-二甲基-丁酮和3,3-二甲基-2-氨基丁烷。对于(R)-和(S)-烷基胺的分离和定量，使用Chiralsil-CB柱(Agilent)。

实施例1-(R)-胺作为唯一氮源富集微生物

将来自荷兰和德国各个地方的土壤样品悬浮在pH7.0d100mM磷酸钾(KP_i)缓冲液中并且用180转每分钟(rpm)的振荡并在28℃下孵育1小时。经Whatman滤纸过滤悬浮液。每个100μl的滤液用于孵育含有10ml SEM的100ml Erlenmeyer烧瓶，所述SEM含有选自(R)-2-氨基丁烷、(R)-3,3-二甲基-2-氨基丁烷、(R)-α-甲基苄胺、(R)-α-乙基苄基胺、(R)-1-氨基茚满和(R)-1-氨基四氢萘组的六种(R)-胺之一。将烧瓶在回旋振荡器上以180rpm振荡，在28℃下孵育。当以培养基或“细胞块”的显著浑浊的形式获得微生物生长时，100μl的该培养基用于孵育含有5mM相同(R)-胺的SEM。在2次这种的传代之后，将100μl的上次培养基的1:100稀释液在含有5mM对应(R)-胺的SEM琼脂平板上铺平板。将另外约10μl的未稀释的培养物在含有5mM的对应(R)-胺的SEM琼脂平板上划线。接种的琼脂平板在28℃下孵育，直到观察到生长。具有不同形态学的菌落在新鲜的SEM平板上再划线，以分离不同的微生物种。继续再划线直到在28℃下孵育之后获得相同形态学的纯培养物并且保存在4℃下。

选择的微生物被送至BaseClear(Leiden，荷兰)用于(AppliedBiosystem，Carlsbad，CA，美国)鉴定。获得的细菌或真菌16S或D2-LSU rRN序列与经证实的序列数据库(位于BaseClear，Leiden，荷兰)比较，并且万一没有获得高于99%的同一性，使用NCBIBlast主页(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)的BlastN算法与非冗余(nr)核苷酸数据库比较。这些序列分析的结果的概述在表2中给出。

表2：通过MicroSeq鉴定处的富集分离物的鉴定

实施例-2富集分离物中(R)-转氨酶活性的检测

从在SEM琼脂平板富集分离物的纯培养物，已经在其上富集微生物的含有5mM各自(R)-胺的25ml液体SEM培养物，在回旋振荡器上以180转每分钟(rpm)并在28℃下孵育并培养，直到培养物变得浑浊。随后培养物转移至50ml离心管并且在Beckman Avanti J-20XPI离心机(Beckman-Coulter，Woerden，荷兰)的JA-25.50转子中以50,000x g离心10min。细胞小球再悬浮在pH7.0含有0.1mM吡哆醛5’-磷酸盐(PLP)的2ml100mM磷酸钾(KP_i)缓冲液中。细胞悬浮液用来测定使用40mM的氨基供体和酮底物的(R)-转氨酶活性。测试富集分离物3Kb、3Na、3Ba、3Db和3H1的细胞悬浮液，40mM(R)-α-甲基苄胺作为胺供体和1-四氢萘酮作为酮底物，产生的苯乙酮和1-氨基四氢萘作为产物。测试富集分离物5BaB和5BaS的细胞悬浮液，40mM(R)-α-甲基苄胺作为胺供体和1-氨基茚满作为酮底物，产生的苯乙酮和1-氨基茚满作为产物。测试富集分离物2A2、2Ca、2Cb、2M1、2Da和2K1的细胞悬浮液，40mM(R)-α-甲基苄胺作为胺供体和苯丙酮作为酮底物，产生的苯乙酮和α-乙基苄基胺作为产物。测试富集分离物5BaB和5BaS的细胞悬浮液，40mM(R)-α-甲基苄胺作为胺供体和1-氨基茚满作为酮底物，产生的苯乙酮和1-氨基茚满作为产物。测试富集分离物6Ab、6Bb、6I和6F的细胞悬浮液，40mM苄胺作为胺供体和苯乙酮作为酮底物，产生的苯甲醛和α-甲基苄胺作为产物。如在通用部分所描述的，通过HPLC测定形成的胺产物的浓度和对映过量(e.e.)。HPLC分析的结果总结在表3中。

表3：从氨基供体和酮底物通过富集的微生物产生的(R)-胺浓度和对映体过量。

产生的(R)-胺	分离物	胺产物[g/l]	e.e.(R)
				1-氨基四氢萘	3Na	0.31	99
1-氨基四氢萘	3Kb	0.24	99.6
				1-氨基四氢萘	3Ba	0.40	98
1-氨基四氢萘	3Db	0.41	99
				1-氨基四氢萘	3H1	0.12	88
1-氨基茚满	5BaB	0.17	99.8
				1-氨基茚满	5BaS	0.17	99.8
α-乙基苄胺	2A2	0.32	95
				α-乙基苄胺	2Ca	0.29	98
α-乙基苄胺	2Cb	0.25	98
				α-乙基苄胺	2M1	0.33	98
α-乙基苄胺	2Da	0.34	96
				α-乙基苄胺	2K1	0.30	98
α-甲基苄胺	6Ab	0.08	94
				α-甲基苄胺	6Bb	0.17	64
α-甲基苄胺	6I	0.09	94
				α-甲基苄胺	6F	0.10	70

这些结果表明在富集的微生物中，转氨酶的存具有从良好至极好的(R)-选择性。

实施例3–来自公共数据库的(R)-转氨酶表达

如通用部分所描述的，使用Gateway技术(Invitrogen)，根据制造商的方案(www.invitrogen.com)，将编码如表4中总结的推定转氨酶多肽的密码子对优化的基因克隆进入pBAD/Myc-HisC得到的表达载体(如EP1513946中所描述)。

表4:多肽、核苷序列和登录号的概述

定制编码(R)-转氨酶ABN35871(来自US7169592的序列2)和AAN21261(来自US6413752的序列1)以及来自Streptomyces avelmitilis的多肽L-苏氨酸醛缩酶(LTA_SAV，登录号Q82N15)（最为阴性对照）的另外密码子对最优化的合成基因并且如上述克隆。在转化感受态E.coliTOP10细胞并且在含有100μg/ml抗生素的选择性LB琼脂平板上铺平板之后，获得表4中给出的各自重组E.coli pBAD菌株。用来自各自琼脂平板的培养物接种5mlLB预培养物加50μg/ml抗生素预培养物，并在28℃和180rpm回旋振荡器上孵育过夜。将来自预培养物表达培养物的培养物在含有50–100ml LB加50μg/ml抗生素的Erlenmeyer烧瓶中接种至起始细胞密度为OD₆₂₀=0.05。这些培养物在28℃和180rpm回旋振荡器上孵育。指数生长期中间(OD₆₂₀为约0.6)，通过添加0.02%(w/v)L-阿拉伯糖至培养烧瓶来诱导目标基因的表达。诱导之后在28℃和180rpm回旋振荡器上继续培养过夜(约20h)。随后通过以5,000x g在4℃下离心10min收获细胞。丢弃上清液并且再悬浮细胞并且称重。细胞小球再悬浮在两倍体积的pH7.5含有0.1mM PLP的湿重冰冷的50mM KP_i缓冲液中。在冰/丙酮浴中冷却并且在Eppendorf(Hamburg，德国)5415R离心机中以13,000x g在4℃下离心30min，通过使用Sonics(Meyrin/Satigny，瑞士)Vibra-CellVCX130超声仪(输出100%，10s开/10s关，10min)超声细胞悬浮液，获得无细胞提取物（CFE）。上清液(=CFE)转移至新管并且存储在冰上立即使用或保存在-20℃下。如通用部分所描述的，使用根据Bradford改进的方法，测定CFE中的蛋白浓度。

实施例4-(RS)-α-甲基苄胺的外消旋拆分

在(RS)-α-甲基苄胺的消旋拆分中，测试具有在E.coli中异源表达的转氨酶XP_001209325和EDH25885的无细胞提取物(CFE)的(R)-转氨酶活性并且与含有在E.coli中异源表达的(R)-转氨酶ABN35871(来自US7169592的序列2)和AAN21261(来自EP987332的序列1)以及来自Streptomycesavelmitilis的L-苏氨酸醛缩酶(LTA_SAV，登录号Q82N15)(作为阴性对照)的CFE比较。在总的0.25ml反应体积中，将0.1ml的CFE与80mM(RS)-α-甲基苄胺(MBA)、在含有0.1mM PLP的100mM KP_i缓冲液中的40mM丙酮酸钠混合并且在28℃下孵育20h。通过添加0.9ml终止试剂(含有0.1%(v/v)甲酸的H₂O中的50%(v/v)乙腈)至0.1ml反应体积终止反应并且如通用部分所描述的，通过HPLC对手性相分析。HPLC分析的结果在表5中给出。

表5：转氨酶反应中α-MBA的浓度和对映体过量

这些结果显示XP_001209325是非常高效的选择性(R)-转氨酶，因为它选择性转化所有的(R)-α-MBA而不转化(S)-α-MBA。其他(R)-转氨酶，如ABN35871或AAN21261也是选择性的，但是明显产量较低，导致(RS)-α-MBA外消旋拆分的较低的对映体过量。EDH25885也展示对(RS)-α-MBA低的(R)-选择性转氨酶活性。

实施例5-合成对映异构体富集的(R)-胺

在用100mM磷酸钾(KP_i)缓冲的pH7.5的0.25μl终体积中，等摩尔量的70mM的氨基供体和70mM的酮底物在存在0.1ml转氨酶CFE的情况下在28℃下反应24h。分别包含转氨酶XP_001209325、AAN21261和ABN35871的CFE，分别孵育苄基丙酮和α-甲基苄胺，产生4-苯基-2-丁胺和苯乙酮；孵育苯丙酮和α-甲基苄胺，产生α-乙基苄基胺和苯乙酮；孵育1-茚满酮和α-甲基苄胺，产生1-氨基茚满和苯乙酮；孵育1-四氢萘酮和α-甲基苄胺，产生1-氨基四氢萘和苯乙酮；孵育2-四氢萘酮和α-甲基苄胺，产生2-氨基四氢萘和苯乙酮；孵育丁酮和α-甲基苄胺，产生2-氨基丁烷和苯乙酮；孵育3,3-二甲基-2-丁酮和α-甲基苄胺，产生3,3-二甲基-2-氨基丁烷和苯乙酮。通过添加0.75ml终止试剂(含有0.1%(v/v)甲酸的H₂O中的50%(v/v)乙腈)至0.25ml的反应体积终止反应。如通用部分所描述的，通过HPLC分析产物浓度和对映体过量。HPLC分析的结果在表6中给出。

表6：较之转氨酶AAN21261和ABN35871，用转氨酶XP_001209325的胺产物浓度和对映体过量。n.d.:未检测到

进一步地，包含转氨酶YP_955297的CFE孵育苯丙酮和α-甲基苄胺，产生α-乙基苄基胺和苯乙酮。通过添加0.75ml终止试剂(含有0.1%(v/v)甲酸的H₂O中的50%(v/v)乙腈)至0.25ml的反应体积终止反应。如通用部分所描述，通过HPLC分析产物浓度和对映过量。在28℃下24h孵育之后获得99%对映体过量的0.87mmol/l(R)-α-乙基苄基胺。

上面的结果显示转氨酶XP_001209325和YP_955297是高度选择性(R)-转氨酶。进一步地，很明显XP_001209325具有与转氨酶AAN21261和ABN35871不同的底物范围：通过XP_001209325，而不能通过转氨酶AAN21261和ABN35871，以明显的浓度形成4-苯基-2-丁胺(表6)。另外XP_001209325从2-丁酮产生对映异构体富集的(R)-2-氨基丁烷，而ABN35871递送对映异构体富集的(S)-2-氨基丁烷(表6)。

实施例6-(R)-转氨酶对手性α甲基苄基胺的选择性

为了检测(R)-转氨酶的立体选择性，测试它们转化α-甲基苄胺(MBA)的纯对映异构体形式。在恒温于30℃下的Perkin Elmer Lambda35UV/VIS分光光度计中，以分光光度法单独测试300nm波长下的如实施例3中制备的含有转氨酶的无细胞提取物分别对(R)-MBA和(S)-MBA的活性，丙酮酸盐作为酮底物。

在1ml的终反应体积中，50μl适当稀释的含有转氨酶的CFE在一次性塑料UV或石英试管中与12.5mM(R)-或(S)-MBA和5mM丙酮酸钠在存在pH7.5的含有0.1mM PLP的50mM KP_i缓冲液的情况下混合。通过添加10μl的0.5M丙酮酸钠(50mM KP_i缓冲液中pH7.5，0.1mMPLP)至已经在30℃光度计下预孵育5min的其他检验组分，来开始反应。在添加丙酮酸钠之后，记录300nm下的吸收值，并且用苯乙酮的摩尔消光系数ε=0.28cm²/μmol，根据比尔-朗伯定律，计算样品(CFE)中转氨酶活性。一单位(U)的转氨酶活性定义为30℃下在pH7.5含有0.1mM PLP的50mMKP_i缓冲液中由12.5mM(R)-MBA或(S)-MBA和5mM丙酮酸钠每分钟形成1μmol的苯乙酮。如根据概要程序所测定的，通过体积活性值(U/mlCFE)除以总的蛋白浓度，来计算CFE的比转氨酶活性(U/mg总CFE蛋白)。比转氨酶活性对(R)-MBA与(S)-MBA比定义为转氨酶立体选择性值(TEV)。(R)-选择性转氨酶定义为TEV值>1的转氨酶。良好的(R)-选择性定义为TEV≥5的对(R)-MBA与(S)-MBA的比活性比。高的(R)-选择性定义为TEV≥10的对(R)-MBA与(S)-MBA的比活性比。如在这些实验中测定的CFE中对(R)-MBA和(S)-MBA的比转氨酶活性以及TEV，在表7中给出。

表7：对(R)-和(S)-MBA的比转氨酶活性和TEV

从该实验中清楚地，如转氨酶ABN35871和AAN21261，转氨酶XP_001209325、XP_002564064、YP_761201、YP_955297、NP_085750、EBP64591和EDI73966是(R)-选择性转氨酶。转氨酶YP_955297和NP_085750展示良好的(R)-选择性，TEV大于5，而XP_001209325和XP_002564064并且甚至显示高的(R)-选择性，TEV大于10。

实施例7–来自库存保藏物的微生物的再分离

如通用部分和实施例1所描述的，通过在含有6种(R)-胺之一作为唯一氮源的选择性富集培养基(SEM)琼脂平板上对1:1000、1:10,000和进一步稀释的库存保藏物铺平板，实现来自库存保藏物的单个微生物的再分离。通过在其上微生物已被初始富集的含有各自(R)-胺的SEM琼脂平板上重复的再划线，获得纯培养物。在含有选择性富集培养基的各自(R)-胺上进行重复的再划线直到获得相同形态学的单菌落。随后使用经验证的(Applied Biosystem,Carlsbad,CA,USA)系统进行16S rRNA或D2-LSU rRNA测序，以再确认单个微生物。

实施例8–苯氧基乙酮的酶促转氨作用

如实施例3和实施例6中产生并检验的，具有在E.coli异源表达的(R)-转氨酶XP_001209325[SEQ ID No.1](2U/ml)的无细胞提取物分别与0.1M的酮底物苯氧基乙酮和0.5M的氨基供体异丙基胺、(RS)-2-丁胺(有效地0.25M(R)-2-丁胺)和(RS)-α-甲基苄胺(有效地0.25M(R)-MBA)在pH7.5含有0.1mM PLP的50mM KP_i缓冲液中在30℃下孵育24h。通过HPLC分析测量形成的1-苯氧基-2-丙胺的量。HPLC条件如下：

50μl的反应混合物添加至具有0.01%(v/v)甲酸的950μl的乙腈/水的50:50混合物中，并在13,000rpm下离心5min。

HPLC条件：

柱:Purospher Star RP C18(250x4.0，5μm)

洗体液A:水中0.01%甲酸

洗体液B:乙腈

流速:0.8ml/min

柱温度:30℃

注入体积:4μl

检测:UV210nm(或254nm)

这些实验的结果在表8中给出。

表8：通过(R)-转氨酶XP_001209325[SEQ ID No.1]催化的苯氧基丙酮向1-苯氧基-2-丙胺的转化

对于(R)-选择性转氨酶XP_001209325[SEQ ID No.1]，2-丁胺和MBA是比异丙基胺更有效更好的氨基供体，因为较之0.5M的手性氨基供体异丙基胺，(R)-2-丁胺和(R)-MBA的实际浓度是0.25M。因而，与氨基供体异丙基胺相比，分别用以相对较低的氨基供体浓度的氨基供体2-丁胺和MBA，获得了相当的或甚至更好的转化。甚至获得高产物浓度1.0wt%(2-丁胺作为氨基供体)。

实施例9-在存在第二有机溶剂相的情况下苄基丙酮的转氨作用

如在实施例3和实施例6中产生并检验的，具有在E.coli异源表达的(R)-转氨酶XP_001209325[SEQ ID No.1](2U/ml)的无细胞提取物用0.1M的酮底物苄基丙酮和0.25M的氨基供体(RS)-α-甲基苄胺在pH7.5含有0.5mM PLP的50mM KP_i缓冲液中在30℃下孵育24h。在存在或缺乏15%(v/v)的水不可混溶的有机溶剂环己胺的情况下进行反应。如实施例8中所描述的，通过HPLC分析测量形成的4-苯基-2-丙胺和反应的对映体过量(e.e)。如下在手性固相上通过HPLC分析进行对映体过量的测定：

20μl的反应混合物与50μl的Marfey试剂溶液(丙酮中1%w/vN-α-[2,4-二硝苯基-5-氟苯基]-L-丙氨酸氨基化合物)和10μl NaHCO₃的标准溶液混合。混合物在40℃下孵育1小时之后，添加10μl2N HCl和920μl乙腈并且离心样品5min然后注入。

HPLC条件：

柱:Purospher Star RP C18(250x4.0，5μm)

洗体液A:水中0.01%甲酸

洗体液B:乙腈

流速:1ml/min

柱温度:30℃

注入体积:2μl

探测:UV338.1nm

等梯度50/50洗体液A/洗体液B

这些实验的结果在表9中给出。

表9：在存在或缺乏水不可混溶的有机溶剂环己胺的情况下，通过XP_001209325[SEQ ID No.1]，从苄基丙酮形成的(R)-4-苯基-2-丙胺的转化和对映体过量

这些结果显示(R)-选择性转氨酶XP_001209325[SEQ ID No.1]较好地耐受水不可混溶的有机溶剂环己胺的存在并且其存在不影响酶反应的立体选择性。

实施例10-来自富集的微生物的基因组的重组(R)-转氨酶

根据制造商的手册，用Easy-DNA试剂盒(Invitrogen)分离在选择性培养基上针对它们的(R)-选择性转氨酶活性(实施例1和2)富集的6个菌株——Rahnella aquatilis3Kb、Microbacterium ginsengisoli 1A1 DSM 23784、Sinorhizobium morelense 3H1 DSM23794、Curtobacterium pusillum 5BaBDSM 23787、Mycobacteriumfrederiksbergense1Ia DSM 23798和Achromobacter spanius6I DSM23791的基因组DNA并且最后用TE缓冲液提取。通过Bsp143I或BamHI(Fermentas，St.Leon-Rot)消化随后通过琼脂糖凝胶电泳，分光光度检测DNA的质量。从Rahnella aquatilis 3Kb、Microbacteriumginsengisoli 1A1 DSM 23784、Curtobacterium pusillum 5BaBDSM 23787、Achromobacter spanius6I DSM 23791和Microbacteriumginsengisoli 1A1 DSM 23784这样分离的基因组DNA样品用于基因组测序。

这些基因组序列上传至服务器并且针对已知的(R)-转氨酶序列SEQ IDNo.1并且针对在一个基因组中发现的样点(hit)进行BLAST搜索。鉴定并选择具有不同相似程度的若干样点，用于随后的NdeI/HindIII克隆进入pMS470Δ8(Balzer et al.，Nucleic AcidsResearch，1992，20(8):1851-1858)并且在E.coli中表达。3个基因不能通过PCR扩增并且一个基因在天然序列中含有NdeI和HindIII并且因此从Geneart/生物技术(Regensburg，德国)定制密码子最优化的用于在E.colii中表达的Asp-TA1、Cpu-TA1、Cpu-TA3Raq-TA2和Mgi-TA1。

表10：BLAST搜索与SEQ ID No.1的(R)-转氨酶的同一性

在用0.5mM IPTG在25℃下o/n诱导之后，6个目标基因在补充氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基的E.coli TOP10F’中表达。作为对照，使用含有pMS470载体而没有插入的转氨酶基因的E.coli TOP10F’培养物。收获细胞并且通过在pH7.5含有0.1mM PLP的50mM KP_i缓冲液中超声裂解并离心。使用VivaSpin浓缩器(Sartorius，Vienna，Austria)浓缩裂解产物。通过Bradford蛋白检验测定裂解产物的蛋白浓度。

使用在其上已经富集供体微生物的对应的大量胺作为供体和丙酮酸盐作为受体，在转氨作用反应中测试所有的裂解产物。在pH7.5含有0.1mM PLP的50mM KP_i缓冲液中，在30℃下使用超过丙酮酸(10mM)的5倍过量的外消旋或对映纯的胺(50mM)24h。在有Mgi-TA1的反应中，10mM的丙酮酸和10mM的氨基供体MBA或1-氨基四氢萘在30℃下分别在pH7.5含有0.1mM PLP的50mM KP_i缓冲液中施用19h。如在实施例8和9中所描述的，在HPLC上检测对应的酮的形成。通过L-或D-丙氨酸的形成和各自胺的不同对映异构体的反应性，测定新转氨酶的选择性。新转氨酶Cpu-TA1[SEQ ID No.30]、Cpu-TA2[SEQ ID No.33]、Cpu-TA3[SEQ IDNo.35]、Raq-TA2[SEQ ID No.38]、Raq-TA3[SEQ ID No.40]、Asp-TA1[SEQ ID No.43]和Mgi-TA1[SEQ ID No.46]显示(R)-选择性(表11)。分别用MBA和丙氨酸作为氨基供体，苯氧基乙酮和苯乙酮作为受体酮，也测试了Cpu-TA2。这两个反应的胺产物分别是对映异构体富集的(R)-1-苯氧基-2-丙胺和(R)-MBA(表11)。

这些结果显示新转氨酶Cpu-TA1[SEQ ID No.30]、Cpu-TA2[SEQ IDNo.33]、Cpu-TA3[SEQ ID No.35]、Raq-TA2[SEQ ID No.38]、Raq-TA3[SEQ ID No.40]、Asp-TA1[SEQ IDNo.43]和Mgi-TA1[SEQ ID No.46]的确是(R)-选择性转氨酶。

实施例11-在存在水不可混溶的有机溶剂的情况下从苄基丙酮和(R)-α-甲基苄胺合成4-苯基-2-丙胺

如在实施例3和实施例6中产生并检验的，在E.coli中异源表达的(R)-转氨酶XP_001209325[SEQ ID No.1]的无细胞提取物用0.08M的氨基供体(R)-α-甲基苄胺(MBA)和1.5倍过量的酮底物苄基丙酮(0.12M)在pH7.5含有0.1mM PLP的50mM KP_i缓冲液中在28℃下孵育20h。在存在或缺少10%(v/v)的水不可混溶的有机溶剂环己胺的情况下进行反应。如通用部分所描述的，通过HPLC分析测量形成的4-苯基-2-丙胺的数量。

不添加环己酮，形成42.8mM4-苯基-2-丙胺，而用10%(v/v)环己酮，以(R)-MBA作为氨基供体，从苄基丙酮形成甚至更高浓度的44.3mM4-苯基-2-丙胺。

实施例12–从(R)-α-甲基苄胺酶促合成(R)-仲丁胺

如实施例3中所描述的，产生转氨酶XP_001209325[SEQ ID No.1]、XP_002564064[SEQ ID No.3]、EEU44019[SEQ ID No.5]、XP_001402221[SEQ ID No.7]、YP_761201[SEQID No.9]、YP_838940[SEQ ID No.11]、YP_955297[SEQ ID No.13]、EDI73966[SEQ IDNo.15]、NP_085750[SEQ ID No.17]、EDH25885[SEQ ID No.19]、EBP64591[SEQ ID No.21]和ECU93014[SEQ ID No.23]以及ABN35871和AAN21261。含有异源表达的转氨酶的无细胞提取物与25mM丁酮和50mM(R)-α-甲基苄胺在28℃下，以400rpm的震荡在pH7.5含有0.1mM PLP的100mM KP_i缓冲液的1ml总的体积中反应24h。20h之后，通过添加每个反应的100μl样品至50μl的2-己酮溶液和850μl乙腈液中，淬灭反应并且以3000xg离心10min。使用商业MBA、苯乙酮、丁酮和仲丁胺作为参考物(Sigma-Aldrich)，在CpSil8胺柱(30mx0.25x0.5)上通过GC-FID检测分析样品。结果总结在表12中。

表12：使用各自转氨酶24h之后从(R)-MBA和丁酮形成的仲丁胺的浓度，以mM计

转氨酶	仲-丁胺[mM]
		ABN35871	0.99
AAN21261	7.96
		YP_955297	1.52
YP_838940	0.45
		XP_001209325	15.74
EBP64591	0.06
		EDI73966	0.42
XP_002564064b	0.63
		YP_761201	0.42
EEU44019b	0.23
		XP_001402221	0.71
NP_085750b	0.08

实施例13–从(R)-MBA和3,3-二甲基-丁酮酶促合成(R)-3,3-二甲基-2-丁胺

如实施例3中所描述的，含有异源表达的转氨酶XP_001209325[SEQID No.1]、YP_955297[SEQ ID No.13]、ABN35871和AAN21261的无细胞提取物与25mM3,3-二甲基-丁酮和50mM(R)-α-甲基苄胺在28℃下，以400rpm振荡在pH7.5含有0.1mM PLP的100mM KP_i缓冲液的1ml总体积中反应24h。20h之后，通过添加每个反应的100μl样品至50μl的2-己酮溶液和850μl乙腈中淬灭反应并以3000x g离心10min。使用商业MBA、苯乙酮、丁酮和仲丁胺作为参考物(Sigma-Aldrich)，在CpSil8的胺柱(30mx0.25x0.5)上，通过GC-FID探测分析样品。结果总结在表13中。

表13：使用各自转氨酶24h之后从(R)-MBA和3,3-二甲基-丁酮形成的仲丁胺的浓度，以mM计

转氨酶	3,3-二甲基-2-丁胺[mM]
		ABN35871	0.00
AAN21261	3.28
		YP_955297	0.34
XP_001209325	1.49

Claims

1.通过使用其氨基酸序列如SEQ ID No.1中所示的转氨酶，从通式[1][a]的酮和合适的氨基供体酶促合成对应的通式[1][c]对映异构体富集的(R)-胺的方法，

其中R₁和R₂不同并且独立地为直链或支链脂肪族、芳香族、杂-芳香族结构或形成环状结构。

2.根据权利要求1所述的方法，其中R₁和R₂不同并且R₁和R₂独立地含有1至30个碳原子并且R₁和R₂独立地为取代或未取代脂肪族结构；取代或未取代支链脂肪族结构；取代或未取代环状脂肪族结构；含有至少一个氧原子、硫原子或氮原子的取代或未取代杂环脂肪族结构；取代或未取代芳香族结构；含有至少一个硫原子或氮原子的取代或未取代杂-芳香族结构；或R₁和R₂一起形成含有至少一个氧原子、硫原子或氮原子的取代或未取代环状结构或杂环结构；其中取代基选自但不限于由下述基团组成的组：卤素原子、羟基、甲氧基、单氟甲基、二氟甲基、三氟甲基基团和具有1至6个碳原子的烷基基团。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述对映异构体富集的(R)-胺产物的终浓度在反应混合物的1和50重量％之间。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述氨基供体是α-甲基苄胺。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述氨供体是仲丁胺。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述对映异构体富集的(R)-胺产物的终浓度在反应混合物的5和35重量％之间。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述反应混合物包含水相和第二有机相。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述反应混合物包含水相和第二有机相，并且水相：有机相的体积比在100和0.01之间。

9.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述反应混合物包含水相和第二有机相，并且水相：有机相的体积比在20和0.1之间。

10.根据权利要求1或2所述的方法，其中反应混合物包含水相和第二有机相，并且水相：有机相的体积比在20和1之间。