JP2013530713A - (r)−選択的アミノ化 - Google Patents
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Abstract
【選択図】
Description
a)配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するタンパク質;
b)配列番号3のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するタンパク質;
c)配列番号5のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するタンパク質;
d)配列番号7のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するタンパク質;
e)配列番号9のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するタンパク質;
f)配列番号11のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するタンパク質;
g)配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するタンパク質;
h)配列番号15のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するタンパク質;
i)配列番号17のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するタンパク質;
j)配列番号19のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するタンパク質;
k)配列番号21のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するタンパク質;
l)配列番号23のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するタンパク質;
m)配列番号25のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するタンパク質;
n)配列番号30のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するタンパク質;
o)配列番号33のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するタンパク質;
p)配列番号35のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するタンパク質;
q)配列番号38のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するタンパク質;
r)配列番号40のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するタンパク質;
s)配列番号43のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するタンパク質;
t)配列番号46のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するタンパク質;および
u)トランスアミナーゼ活性を有し、かつラーネラ・アクアティリス(Rahnella aquatilis)、オクロバクテリウム・アンスロピ(Ochrobactrum anthropi)、オクロバクテリウム・トリティシ(Ochrobactrum tritici)、シノリゾビウム・モレレンス(Sinorhizobium morelense)、クルトバクテリウム・プシルム(Curtobacterium pusilllum)、ペキロマイセス・リアシヌス(Paecilomyces lilacinus)、ミクロバクテリウム・ゲンセンギソリ(Microbacterium ginsengisoli)、ミクロバクテリウム・トリコテセノリティクム(Microbacterium trichothecenolyticum)、シュードモナス・シトロネロリス(Pseudomonas citronellolis)、エルシニア・クリステンセニイ(Yersinia kristensenii)、アクロモバクター・スパニウス(Achromobacter spanius)、アクロモバクター・インソリタス(Achromobacter insolitus)、マイコバクテリウム・フォーチュイタム(Mycobacterium fortuitum)、マイコバクテリウム・フレデリクスバーゲンス(Mycobacterium frederiksbergense)、マイコバクテリウム・サクルム(Mycobacterium sacrum)、マイコバクテリウム・フルオランセニボランス(Mycobacterium fluoranthenivorans)、バークホルデリア(Burkholderia)種、バークホルデリア・トロピカ(Burkholderia tropica)、コスモスポラ・エピスファエリア(Cosmospora episphaeria)、およびフザリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)からなる生物の群から選択される微生物から単離されるタンパク質、
からなる群から選択される。
酵素一般、具体的にはトランスアミナーゼの鏡像異性選択性は、キラル中心を含む基質のラセミ混合物のラセミ分割で決定することができる。本発明によれば、(R)−選択的トランスアミナーゼは、ピルビン酸などのケトン基質の存在下で、(R)−α−メチルベンジルアミン(MBA)をラセミMBAから優先的にアミノ基転移させる酵素である。本発明の(R)−トランスアミナーゼは、ピルビン酸の存在下で、α−メチルベンジルアミンの(S)−鏡像異性体よりも(R)−鏡像異性体を優先的に変換する酵素であり、それによって、少なくとも10%の鏡像異性過剰(e.e.)となる、残存(S)−鏡像異性体の濃縮が生じる。好ましくは、(S)−MBAの得られるe.e.は、少なくとも50%である。より好ましくは、e.e.は少なくとも60%である。より一層好ましくは、e.e.は少なくとも70%である。より一層好ましくは、e.e.は少なくとも80%である。より一層好ましくは、e.e.は少なくとも90%である。より一層好ましくは、e.e.は少なくとも95%である。より一層好ましくは、e.e.は少なくとも96%である。より一層好ましくは、e.e.は少なくとも97%である。より一層好ましくは、e.e.は少なくとも98%である。最も好ましくは、e.e.は少なくとも99%である。
酵素の鏡像異性選択性はまた、特異的基質の個々の鏡像異性体へのその比活性によって特徴づけられる。これらは、高光学純度形態の個々の基質について、個別に活性測定して決定することができる。本発明によれば、α−メチルベンジルアミン(MBA)の2つの鏡像異性体に対するトランスアミナーゼ比活性は、トランスアミナーゼの(R)−選択性の尺度となる。本発明の文脈では、(S)−MBAに関する比活性に対する(R)−MBAに関する比活性比が、トランスアミナーゼ鏡像異性選択性値(TEV)として定義される。(R)−選択的トランスアミナーゼとは、TEV値が1を超えるトランスアミナーゼとして定義される。トランスアミナーゼの良好な(R)−選択性とは、(S)−MBAに対する(R)−MBAの比活性比であるTEVが10以上であるとして定義される。トランスアミナーゼの高度な(R)−選択性とは、(S)−MBAに対する(R)−MBAの比活性比であるTEVが100以上であるとして定義される。
(R)−選択的トランスアミナーゼにより触媒される反応の所望される典型的な結果は、アミノドナーおよびケトン基質からの、式1[c]に記載の鏡像異性的に濃縮された(R)−アミンの形成である。(R)−選択的トランスアミナーゼ反応にとって適切なアミノドナーは、例えば、ラセミMBAもしくは(R)−MBA、ラセミ1−アミノインダンもしくは(R)−1−アミノインダン、ラセミ1−アミノテトラリンもしくは(R)−1−アミノテトラリン、ラセミアラニンもしくはD−アラニン、イソプロピルアミン、ベンジルアミン、ラセミsec−ブチルアミン(2−アミノブタン)もしくは(R)−sec−ブチルアミン(2−アミノブタン)、β−アラニン、またはラセミ3−アミノ酪酸もしくはD−3−アミノ酪酸を含む。
[全般]
[微生物増殖培地]
LB(Luria Bertani)培地
10g/l Bacto Trypton(BD,Le Pont de Claix,France)
5g/l Bacto Yeast Extract(BD,Le Pont de Claix,France)
5g/l NaCl(Sigma−Aldrich,Steinheim,Germany)
15g/l Bacto Agar(固体培地用、BD,Le Pont de Claix,France)
成分を脱イオン水に溶解し、必要に応じてpHを7.0に調整した。培地は、121℃で20分間高圧蒸気滅菌した。固体培地のために、高圧蒸気滅菌前に寒天を加えた。高圧蒸気滅菌した培地を60℃まで放冷した後、抗生物質を加えた。
10g/l Difco Yeast Carbon Base(YCB,BD,Sparks,MD,USA)
55mMグリセロール(Merck,Darmstadt,Germany)
10mMピルビン酸(Sigma−Aldrich,Steinheim,Germany)
5mM(R)−アミン基質
15g/l Difco Agar Noble(BD,Le Pont de Claix,France)
カルベニシリンまたはネオマイシン(neomycine)を100μg/mlの最終濃度で含有するLB培地を、[配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26]を含む発現ベクターを含有する組換えエシェリキア・コリ(Escherichia coli)株を選択し培養するために使用し、これらのプラスミドを維持した。カルベニシリンおよびネオマイシンの原液(50mg/ml)は、0.22μm滅菌フィルターを通す濾過により滅菌した。
標準的な遺伝子および分子生物学の手法については、当技術分野で一般に知られており、以前に記載されている(Maniatis et al.1982 ”Molecular cloning:a laboratory manual”.Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.;Miller 1972 ”Experiments in molecular genetics”,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor;Sambrook and Russell 2001 ”Molecular cloning:a laboratory manual”(3rd edition),Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press;F.Ausubel et al,eds.,”Current protocols in molecular biology”,Green Publishing and Wiley Interscience,New York 1987)。
E.コリ(E. coli)株TOP10(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)を、すべてのクローニング手順に使用した。E.コリ(E.coli)はまた、タンパク質発現のためにも使用した。遺伝子発現の誘導のために、L−アラビノースを最終濃度0.02%(w/v)で使用した。
[配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26]の標的遺伝子を、国際公開第08000632号パンフレットに記載の手順に従って、コドン対最適化を行った。Gateway技術(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)を使用するクローニングを容易にするために、すべての遺伝子に対して、リボソーム結合部位および開始コドンの上流、ならびに停止コドンの下流にattB部位を付加した。合成遺伝子は、Geneart(Regensburg,Germany)から入手した。これらの遺伝子構築物を、Gateway技術(Invitrogen)を使用し、導入したattB部位および製造業者のプロトコール(www.invitrogen.com)に記載のエントリーベクターとしてのpDONR201(Invitrogen)を介してpBAD/Myc−HisC(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)由来の発現ベクターにクローニングした。このようにして、pBAD発現ベクターをそれぞれ得た。化学的にコンピテントなE.コリ(E.coli)細胞を、それぞれのpBAD−発現ベクターにより形質転換して、対応する発現株を得た。
相異なる遺伝子を保持するプラスミドを、形質転換細胞の抗生物質に対する抵抗性、形質転換細胞のPCR診断分析またはプラスミドDNAの精製、精製プラスミドDNAの制限酵素分析またはDNA配列分析などの当技術分野で一般に公知の遺伝的、生化学的、および/または表現型手段によって同定した。
無細胞抽出物(CFE)など、溶液中のタンパク質濃度は、Anal.Biochem.72:248−254(1976)でBradfordが記載するような改変タンパク質色素結合法を使用して測定した。適切に希釈した各試料50μlを、試薬(エタノール46mlに溶解した100mgのブリリアントブルーG250および85%オルトリン酸100mlをmilli−Q水で1,000mlにした)950μlと共に、室温で少なくとも5分間インキュベートした。各試料の波長595nmにおける吸収を、Perkin Elmer Lambda20またはLambda35 UV/VIS分光光度計で測定した。既知濃度のウシ血清アルブミン(BSA、0.0125mg/ml〜0.20mg/mlの範囲)を含有する溶液を用いて決定した検量線を使用して、試料中のタンパク質濃度を計算した。
[高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)分析]
芳香族基を含有するケトンおよびアミンは、Prevail C18の15cmカラム上で分析した。α−メチルベンジルアミン、α−エチルベンジルアミン、2−アミノテトラリンの鏡像異性体の分離および定量については、Crownpak Cr(+)カラム(Daicel)に加えて、o−フタルアルデヒドおよびメルカプトエタノールを使用するアミンのポストカラム誘導体化ならびに蛍光検出を使用した。1−アミノテトラリンおよび1−アミノインダンの鏡像異性体の分離および定量ついては、Prevail C18 15cmおよびCrownpak Cr(+)カラムに加えて、o−フタルアルデヒドおよびメルカプトエタノールを使用するアミンのポストカラム誘導体化を使用し、蛍光検出を使用した。
2−ブタノン、2−アミノブタン、3,3−ジメチル−ブタノン、および3,3−ジメチル−2−アミノブタンなどのアルキルケトンおよびアルキルアミンは、アミンカラム用のCP−Sil 8 CBカラム(Varian)上で、市販の参照物質(Sigma−Aldrich)を使用して分析した。(R)−および(S)−アルキルアミンの分離および定量については、Chiralsil−CBカラム(Agilent)を使用した。
オランダおよびドイツの様々な場所からの土壌試料を100mMリン酸カリウム(KPi)緩衝液pH7.0に懸濁し、180の毎分回転数(rpm)で振盪させながら、28℃で1時間インキュベートした。この懸濁液をワットマン濾紙に通して濾過した。濾液100μlをそれぞれ使用して、(R)−2−アミノブタン、(R)−3,3−ジメチル−2−アミノブタン、(R)−α−メチルベンジルアミン、(R)−α−エチルベンジルアミン、(R)−1−アミノインダン、および(R)−1−アミノテトラリンの群から選択される6種の(R)−アミンの1つを含有するSEM10mlが入っている100mlの三角フラスコに接種した。このフラスコを、オービタリーシェーカー(orbitary shaker)上にて180rpmで振盪させながら、28℃でインキュベートした。微生物増殖が顕著な培地濁度または「細胞凝集物」の形態で得られた場合に、この培地100μlを使用して、同じ(R)−アミン(5mM)を含有するSEMに接種した。このような継代接種を2回した後に、1:100希釈した最後の培地100μlを、対応する(R)−アミン(5mM)を含有するSEM寒天プレート上に播種した。さらに、無希釈培養物約10μlを、対応する(R)−アミン(5mM)を含有するSEM寒天プレート上に画線した。接種した寒天プレートを、増殖が観察されるまで、28℃でインキュベートした。種々の形態のコロニーを、新たなSEMプレート上に再画線し、異なる微生物種を分離した。均一形態を有する純粋培養物が28℃のインキュベーションおよび4℃での保存の後に得られるまで、再画線接種を継続した。
SEM寒天プレート上の増菌単離物の純粋培養物を、微生物が増菌した、5mMのそれぞれの(R)−アミンを含有するSEM培養液25mlに接種し、培養物が濁るまで、オービタリーシェーカー上で180の毎分回転数(rpm)、28℃で培養した。次いで、培養物を50mlの遠心管に移し、Beckman Avanti J−20 XPI遠心分離機(Beckman−Coulter,Woerden,The Netherlands)にてJA−25.50ローター中、50,000×gで10分間遠心分離した。細胞ペレットを、0.1mMピリドキサル5’−リン酸(PLP)を含有する、2mlの100mMリン酸カリウム(KPi)緩衝液pH7.0に再懸濁した。この細胞懸濁液を使用し、40mMのアミノドナーおよびケトン基質を用いて、(R)−トランスアミナーゼ活性を測定した。増菌単離物3Kb、3Na、3Ba、3Db、および3H1の細胞懸濁液について、アミンドナーとして40mM(R)−α−メチルベンジルアミン、ケトン基質として1−テトラロンを用い、生成物としてアセトフェノンおよび1−アミノテトラリンを生成させる試験を実施した。増菌単離物5BaBおよび5BaSの細胞懸濁液について、アミンドナーとして40mM(R)−α−メチルベンジルアミン、ケトン基質として1−アミノインダンを用い、生成物としてアセトフェノンおよび1−アミノインダンを生成させる試験を実施した。増菌単離物2A2、2Ca、2Cb、2M1、2Da、および2K1の細胞懸濁液について、アミンドナーとして40mM(R)−α−メチルベンジルアミン、ケトン基質としてプロピオフェノンを用い、生成物としてアセトフェノンおよびα−エチルベンジルアミンを生成させる試験を実施した。増菌単離物5BaBおよび5BaSの細胞懸濁液について、アミンドナーとして40mM(R)−α−メチルベンジルアミン、ケトン基質として1−アミノインダンを用い、生成物としてアセトフェノンおよび1−アミノインダンを生成させる試験を実施した。増菌単離物6Ab、6Bb、6I、および6Fの細胞懸濁液について、アミンドナーとして40mMベンジルアミン、ケトン基質としてアセトフェノンを用い、生成物としてベンズアルデヒドおよびα−メチルベンジルアミンを生成させる試験を実施した。形成されたアミン生成物の濃度および鏡像異性過剰(e.e.)を、全般の部で記載のようにHPLCにより測定した。HPLC分析の結果を表3に要約する。
表4にまとめられている推定上のトランスアミナーゼのポリペプチドをコードするコドン対最適化遺伝子を、全般の部に記載のように、製造業者のプロトコール(www.invitrogen.com)に従い、Gateway技術(Invitrogen)を使用して、pBAD/Myc−HisC由来発現ベクターにクローニングした(欧州特許第1513946号明細書に記載のように)。
E.コリ(E.coli)で異種性に発現されたトランスアミナーゼXP_001209325およびEDH25885を含む無細胞抽出物(CFE)を、(R)−トランスアミナーゼ活性について試験し、E.コリ(E.coli)で異種性に発現された、ストレプトミセス・アベルミチリス(Streptomyces avelmitilis)由来のL−スレオニンアルドラーゼ(LTA_SAV、受託番号Q82N15)(陰性対照として)ならびに(R)−トランスアミナーゼABN35871(米国特許第7169592号明細書の配列2)およびAAN21261(欧州特許第987332号明細書の配列1)を含有するCFEと、(RS)−α−メチルベンジルアミンのラセミ分割に関して比較した。全反応容量0.25mlにおいて、CFE0.1mlを、0.1mM PLP含有100mM KPi緩衝液中の80mM(RS)−α−メチルベンジルアミン(MBA)、40mMピルピン酸ナトリウムと混合し、28℃で20時間インキュベートした。停止試薬(0.1%(v/v)ギ酸を含有するH20中の50%(v/v)アセトニトリル)0.9mlを反応容量0.1mlに添加して反応を停止し、全般の部に記載のように、キラル相上でHPLCにより分析した。HPLC分析の結果を表5に示す。
100mMリン酸カリウム(KP)pH7.5で緩衝化された最終容量0.25μlにおいて、等モル量の70mMアミノドナーおよび70mMケトン基質を、CFE0.1mlのトランスアミナーゼの存在下、28℃で24時間反応させた。トランスアミナーゼXP_001209325、AAN21261、およびABN35871をそれぞれ含むCFEを、4−フェニル−2−ブチルアミンおよびアセトフェノンを生成するベンジルアセトンおよびα−メチルベンジルアミン;α−エチルベンジルアミンおよびアセトフェノンを生成するプロピオフェノンおよびα−メチルベンジルアミン;1−アミノインダンおよびアセトフェノンを生成する1−インダノンおよびα−メチルベンジルアミン;1−アミノテトラリンおよびアセトフェノンを生成する1−テトラロンおよびα−メチルベンジルアミン;2−アミノテトラリンおよびアセトフェノンを生成する2−テトラロンおよびα−メチルベンジルアミン;2−アミノブタンおよびアセトフェノンを生成するブタノンおよびα−メチルベンジルアミン;3,3−ジメチル−2−アミノブタンおよびアセトフェノンを生成する3,3−ジメチル−2−ブタノンおよびα−メチルベンジルアミンのそれぞれと共にインキュベートした。停止試薬(0.1%(v/v)ギ酸を含有するH2O中の50%(v/v)アセトニトリル)0.75mlを反応容量0.25mlに添加して反応を停止した。生成物濃度および鏡像異性過剰を、全般の部に記載のように、HPLCにより分析した。HPLC分析の結果を表6に示す。
(R)−トランスアミナーゼの鏡像異性選択性を検討するために、α−メチルベンジルアミン(MBA)の純粋な鏡像異性体形態の変換に関し試験した。実施例3で調製されたトランスアミナーゼを含有する無細胞抽出物について、(R)−MBAおよび(S)−MBAそれぞれに対する活性を、ケトン基質としてピルベートを用い、サーモスタット付きPerkin Elmer Lambda35 UV/VIS分光光度計において、波長300nm、30℃で分光光度法にて個別に試験した。
全般の部および実施例1に記載のように、プールされた寄託物からの個々の微生物の再単離は、6種の(R)−アミンの1つを唯一の窒素源として含有する選択増菌培地(SEM)寒天プレート上に、1:1000、1:10,000、およびさらなる希釈のプールされた寄託物を播種することにより達成される。初めにその上で培養物が増菌された、それぞれの(R)−アミンを含有するSEM寒天プレート上に再画線を反復することにより、純粋な培養物が得られる。均一形態のコロニーのみが得られるまで、それぞれの(R)−アミンを含有する選択的増菌培地上への再画線を反復して実施する。続いて、16SリボソームRNAまたはD2−LSUリボソームRNAの配列決定を、検証済みのMicroSEQ(登録商標)(Applied Biosystems,Carlsbad,CA,USA)システムを使用して実施し、個々の微生物を再同定する。
実施例3および実施例6のように生成およびアッセイされた、E.コリ(E.coli)で異種性に発現された(R)−トランスアミナーゼXP_001209325[配列番号1](2U/ml)を含む無細胞抽出物を、0.1Mのケトン基質であるフェノシキアセトンならびに0.5Mのアミノドナーであるイソプロピルアミン、(RS)−2−ブチルアミン(事実上、0.25M(R)−2−ブチルアミン)、および(RS)−α−メチルベンジルアミン(事実上、0.25M(R)−MBA)のそれぞれと、0.1mM PLP含有50mM KPi緩衝液pH7.5中で、30℃、24時間インキュベートした。形成された1−フェノキシ−2−プロピルアミンの量をHPLC分析により測定した。HPLCの条件は以下の通りであった。
HPLCの条件:
カラム:Purospher Star RP C18(250×4.0,5μm)
溶出液A:0.01%ギ酸水溶液
溶出液B:アセトニトリル
流速:0.8ml/分
カラム温度:30℃
注入容量:4μl
検出:UV210nm(または254nm)
実施例3および実施例6のように生成およびアッセイされた、E.コリ(E.coli)で異種性に発現された(R)−トランスアミナーゼXP_001209325[配列番号1](2U/ml)を含む無細胞抽出物を、0.1Mのケトン基質であるベンジルアセトンおよび0.25Mのアミノドナーである(RS)−α−メチルベンジルアミンと、0.5mM PLP含有50mM KPi緩衝液pH7.5中で、30℃、24時間インキュベートした。反応は、15%(v/v)の非水混和性有機溶媒シクロヘキサンの存在下および非存在下で実施した。形成された4−フェニル−2−プロピルアミンの量および反応の鏡像異性過剰(e.e.)は、実施例8に記載のように、HPLC分析により測定した。鏡像異性過剰の測定は、キラル固定相上でHPLC分析により以下のように実施した。
HPLCの条件:
カラム:Purospher Star RP C18(250×4.0,5μm)
溶出液A:0.01%ギ酸水溶液
溶出液B:アセトニトリル
流速:1ml/分
カラム温度:30℃
注入容量:2μl
検出:UV338.1nm
均一濃度50/50 溶出液A/溶出液B
(R)−選択的トランスアミナーゼ活性に対する選択培地上で増菌された6株(実施例1および2)、すなわち、ラーネラ・アクアティリス(Rahnella aquatilis)3Kb、ミクロバクテリウム・ゲンセンギソリ(Microbacterium ginsengisoli)1A1 DSM 23784、シノリゾビウム・モレレンス(Sinorhizobium morelense)3H1 DSM 23794、クルトバクテリウム・プシルム(Curtobacterium pusillum)5BaB DSM 23787、マイコバクテリウム・フレデリクスバーゲンス(Mycobacterium frederiksbergense)1la DSM 23798、およびアクロモバクター・スパニウス(Achromobacter spanius)6l DSM 23791から、ゲノムDNAを、製造業者のマニュアルに従い、Easy−DNAキット(Invitrogen)を用いて単離し、最終的にTE緩衝液で溶出した。DNAの品質は、測光法ならびにBsp143lまたはBamHI(Fermentas,St.Leon−Rot)による消化とその後のアガロースゲル電気泳動により確認した。ラーネラ・アクアティリス(Rahnella aquatilis)3Kb、ミクロバクテリウム・ゲンセンギソリ(Microbacterium ginsengisoli)1A1 DSM 23784、クルトバクテリウム・プシルム(Curtobacterium pusillum)5BaB DSM 23787、アクロモバクター・スパニウス(Achromobacter spanius)6I DSM 23791およびミクロバクテリウム・ゲンセンギソリ(Microbacterium ginsengisoli)1A1 DSM 23784から、このようにして単離されたゲノムDNA試料を使用してゲノムの配列決定を行った。
実施例3および実施例6のように生成およびアッセイされた、E.コリ(E.coli)で異種性に発現された(R)−トランスアミナーゼXP_001209325[配列番号1]を含む無細胞抽出物を、0.08Mのアミノドナー(R)−α−メチルベンジルアミン(MBA)および1.5倍過剰量のケトン基質ベンジルアセトン(0.12M)と、0.1mM PLP含有50mM KPi緩衝液pH7.5中で、28℃、20時間インキュベートした。反応は、10%(v/v)の非水混和性有機溶媒シクロヘキサンの存在下および非存在下で実施した。形成された4−フェノキシ−2−プロピルアミンの量を、全般の部で記載のように、HPLC分析により測定した。
トランスアミナーゼXP_001209325[配列番号1]、XP_002564064[配列番号3]、EEU44019[配列番号5]、XP_001402221[配列番号7]、YP_761201[配列番号9]、YP_838940[配列番号11]、YP_955297[配列番号13]、EDI73966[配列番号15]、NP_085750[配列番号17]、EDH25885[配列番号19]、EBP64591[配列番号21]、およびECU93014[配列番号23]、ならびにABN35871およびAAN21261を、実施例3に記載のように生成した。異種性に発現されたトランスアミナーゼを含有する無細胞抽出物を、25mMブタノンおよび50mM(R)−α−メチルベンジルアミンと、全量1mlの0.1mM PLP含有100mM KPi緩衝液pH7.5中で28℃、24時間、400rpmで振盪させながら反応させた。20時間後、各反応の試料100μlを2−ヘキサノン溶液50μlおよびアセトニトリル850μlに添加して反応を停止し、3000×gで10分間遠心分離した。参照物質として市販のMBA、アセトフェノン、ブタノンおよびsec−ブチルアミン(Sigma−Aldrich)を使用して、アミン用CpSil 8カラム(30m x 0.25 x 0.5)上でGC−FID検出により、試料を分析した。結果を表12にまとめてある。
実施例3に記載のように生成された、異種性に発現されたトランスアミナーゼXP_001209325[配列番号1]、YP_955297[配列番号13]、ABN35871、およびAAN21261を含有する無細胞抽出物を、25mM 3,3−ジメチル−ブタノンおよび50mM(R)−α−メチルベンジルアミンと、全量1mlの0.1mM PLP含有100mM KPi緩衝液pH7.5中で28℃、24時間、400rpmで振盪させながら反応させた。20時間後、各反応の試料100μlを2−ヘキサノン溶液50μlおよびアセトニトリル850μlに添加して反応を停止し、3000×gで10分間遠心分離した。参照物質として市販のMBA、アセトフェノン、ブタノンおよびsec−ブチルアミン(Sigma−Aldrich)を使用して、アミン用CpSil 8カラム(30m x 0.25 x 0.5)上でGC−FID検出により、試料を分析した。結果を表13にまとめてある。
Claims (17)
- 一般式[1][a]の対応するケトンおよび適切なアミノドナーからの一般式[1][c]の鏡像異性的に濃縮された(R)−アミンの酵素的合成のための方法であって、
(式中、R1およびR2は異なっており、かつ独立して直鎖または分岐鎖脂肪族、芳香族、ヘテロ芳香族であるか、または環式構造を形成する)
a.配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するタンパク質;
b.配列番号3のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するタンパク質;
c.配列番号5のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するタンパク質;
d.配列番号7のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するタンパク質;
e.配列番号9のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するタンパク質;
f.配列番号11のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するタンパク質;
g.配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するタンパク質;
h.配列番号15のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するタンパク質;
i.配列番号17のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するタンパク質;
j.配列番号19のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するタンパク質;
k.配列番号21のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するタンパク質;
l.配列番号23のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するタンパク質;
m.配列番号25のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するタンパク質;
n.配列番号30のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するタンパク質;
o.配列番号33のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するタンパク質;
p.配列番号35のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するタンパク質;
q.配列番号38のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するタンパク質;
r.配列番号40のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するタンパク質;
s.配列番号43のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するタンパク質;
t.配列番号46のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するタンパク質;および
u.トランスアミナーゼ活性を有し、かつラーネラ・アクアティリス(Rahnella aquatilis)、オクロバクテリウム・アンスロピ(Ochrobactrum anthropi)、オクロバクテリウム・トリティシ(Ochrobactrum tritici)、シノリゾビウム・モレレンス(Sinorhizobium morelense)、クルトバクテリウム・プシルム(Curtobacterium pusilllum)、ペキロマイセス・リアシヌス(Paecilomyces lilacinus)、ミクロバクテリウム・ゲンセンギソリ(Microbacterium ginsengisoli)、ミクロバクテリウム・トリコテセノリティクム(Microbacterium trichothecenolyticum)、シュードモナス・シトロネロリス(Pseudomonas citronellolis)、エルシニア・クリステンセニイ(Yersinia kristensenii)、アクロモバクター・スパニウス(Achromobacter spanius)、アクロモバクター・インソリタス(Achromobacter insolitus)、マイコバクテリウム・フォーチュイタム(Mycobacterium fortuitum)、マイコバクテリウム・フレデリクスバーゲンス(Mycobacterium frederiksbergense)、マイコバクテリウム・サクルム(Mycobacterium sacrum)、マイコバクテリウム・フルオランセニボランス(Mycobacterium fluoranthenivorans)、バークホルデリア(Burkholderia)種、バークホルデリア・トロピカ(Burkholderia tropica)、コスモスポラ・エピスファエリア(Cosmospora episphaeria)、およびフザリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)からなる生物の群から選択される生物から得ることができるタンパク質、
からなる群から選択されるトランスアミナーゼを使用することによる方法。 - R1およびR2が異なっており、かつR1およびR2が独立して1〜30の炭素原子を含有し、R1およびR2が、独立して、置換または非置換脂肪族;置換または非置換分岐鎖脂肪族;置換または非置換環状脂肪族;少なくとも1つの酸素、イオウ、または窒素原子を含有する置換または非置換ヘテロ環式脂肪族;置換または非置換芳香族;少なくとも1つのイオウ、または窒素原子を含有する置換または非置換ヘテロ芳香族であるか;あるいは一緒になって、置換もしくは非置換環式構造または少なくとも1つの酸素、イオウ、もしくは窒素原子を含有するヘテロ環式構造を形成し;前記置換基が、これらに限定されないが、ハロゲン原子、炭素原子数1〜6のアルキル基、ヒドロキシル基、メトキシ基、モノフルオロメチル、ジフルオロメチル、およびトリフルオロメチル基からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記鏡像異性的に濃縮された(R)−アミン生成物の最終濃度が、反応混合物の1〜50重量%の間にあることを特徴とする、請求項1または2に記載の方法。
- 前記トランスアミナーゼが、配列番号1のアミノ酸と少なくとも90%の同一性を有するタンパク質である、請求項3に記載の方法。
- 前記アミノドナーが、α−メチルベンジルアミンである、請求項4に記載の方法。
- 前記エミノドナーが、sec−ブチルアミンである、請求項4に記載の方法。
- 前記鏡像異性的に濃縮された(R)−アミン生成物の最終濃度が、反応混合物の5〜35重量%の間にあることを特徴とする、請求項1または2に記載の方法。
- 前記反応混合物が、水相および第2の有機相を含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記反応混合物が、水相および第2の有機相を含み、水相:有機相の容積比が100〜0.01の間にある、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記反応混合物が、水相および第2の有機相を含み、水相:有機相の容積比が20〜0.1の間にある、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記反応混合物が、水相および第2の有機相を含み、水相:有機相の容積比が20〜1の間にある、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- ラーネラ・アクアティリス(Rahnella aquatilis)(DSM 23797として寄託された)、オクロバクテリウム・アンスロピ(Ochrobactrum anthropi)(DSM 23793として寄託された)、オクロバクテリウム・トリティシ(Ochrobactrum tritici)(DSM 23786として寄託された)、シノリゾビウム・モレレンス(Sinorhizobium morelense)(DSM 23794として寄託された)、クルトバクテリウム・プシルム(Curtobacterium pusilllum)(DSM 23787として寄託された)、ペキロマイセス・リアシヌス(Paecilomyces lilacinus)(DSM 23771として寄託された)、ミクロバクテリウム・ゲンセンギソリ(Microbacterium ginsengisoli)、ミクロバクテリウム・トリコテセノリティクム(Microbacterium trichothecenolyticum)(DSM 23788として寄託された)、シュードモナス・シトロネロリス(Pseudomonas citronellolis)(DSM 23795として寄託された)、エルシニア・クリステンセニイ(Yersinia kristensenii)(DSM 23792として寄託された)、アクロモバクター・スパニウス(Achromobacter spanius)(DSM 23791として寄託された)、アクロモバクター・インソリタス(Achromobacter insolitus)(DSM 23790として寄託された)、マイコバクテリウム・フォーチュイタム(Mycobacterium fortuitum)(DSM 23789として寄託された)、マイコバクテリウム・フレデリクスバーゲンス(Mycobacterium frederiksbergense)(DSM 23798として寄託された)、マイコバクテリウム・サクルム(Mycobacterium sacrum)(DSM 23785として寄託された)、マイコバクテリウム・フルオランセニボランス(Mycobacterium fluoranthenivorans)(DSM 23796として寄託された)、バークホルデリア(Burkholderia)種、バークホルデリア・トロピカ(Burkholderia tropica)(DSM 23799として寄託された)、コスモスポラ・エピスファエリア(Cosmospora episphaeria)(DSM 23772として寄託された)およびフザリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)(DSM 23770として寄託された)からなる生物の群からの(R)−トランスアミナーゼ活性を有する酵素を含む微生物。
- (R)−トランスアミナーゼ活性を有する前記酵素が、Cpu−TA1[配列番号30]、Cpu−TA2[配列番号33]、Cpu−TA3[配列番号35]、Raq−TA2[配列番号38]、Raq−TA3[配列番号40]、Asp−TA1[配列番号43]、およびMgi−TA1[配列番号46]からなる群から選択されるか、またはこれらのアミノ酸配列のいずれかと少なくとも90%、好ましくは少なくとも91%、好ましくは少なくとも92%、好ましくは少なくとも93%、好ましくは少なくとも94%、好ましくは少なくとも95%、好ましくは少なくとも96%、好ましくは少なくとも97%、好ましくは少なくとも98%、好ましくは少なくとも99%の同一性を有するタンパク質である、請求項12に記載の微生物。
- ラーネラ・アクアティリス(Rahnella aquatilis)(DSM 23797として寄託された)、オクロバクテリウム・アンスロピ(Ochrobactrum anthropi)(DSM 23793として寄託された)、オクロバクテリウム・トリティシ(Ochrobactrum tritici)(DSM 23786として寄託された)、シノリゾビウム・モレレンス(Sinorhizobium morelense)(DSM 23794として寄託された)、クルトバクテリウム・プシルム(Curtobacterium pusilllum)(DSM 23787として寄託された)、ペキロマイセス・リアシヌス(Paecilomyces lilacinus)(DSM 23771として寄託された)、ミクロバクテリウム・ゲンセンギソリ(Microbacterium ginsengisoli)、ミクロバクテリウム・トリコテセノリティクム(Microbacterium trichothecenolyticum)(DSM 23788として寄託された)、シュードモナス・シトロネロリス(Pseudomonas citronellolis)(DSM 23795として寄託された)、エルシニア・クリステンセニイ(Yersinia kristensenii)(DSM 23792として寄託された)、アクロモバクター・スパニウス(Achromobacter spanius)(DSM 23791として寄託された)、アクロモバクター・インソリタス(Achromobacter insolitus)(DSM 23790として寄託された)、マイコバクテリウム・フォーチュイタム(Mycobacterium fortuitum)(DSM 23789として寄託された)、マイコバクテリウム・フレデリクスバーゲンス(Mycobacterium frederiksbergense)(DSM 23798として寄託された)、マイコバクテリウム・サクルム(Mycobacterium sacrum)(DSM 23785として寄託された)、マイコバクテリウム・フルオランセニボランス(Mycobacterium fluoranthenivorans)(DSM 23796として寄託された)、バークホルデリア(Burkholderia)種、バークホルデリア・トロピカ(Burkholderia tropica)(DSM 23799として寄託された)、コスモスポラ・エピスファエリア(Cosmospora episphaeria)(DSM 23772として寄託された)およびフザリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)(DSM 23770として寄託された)からなる生物の群から選択される生物から得ることができる(R)−トランスアミナーゼ活性を有するポリペプチド。
- (R)トランスアミナーゼ活性および(R)−トランスアミナーゼ活性を有するポリペプチドと少なくとも90%、好ましくは少なくとも91%、好ましくは少なくとも92%、好ましくは少なくとも93%、好ましくは少なくとも94%、好ましくは少なくとも95%、好ましくは少なくとも96%、好ましくは少なくとも97%、好ましくは少なくとも98%、好ましくは少なくとも99%の配列同一性を有し、かつラーネラ・アクアティリス(Rahnella aquatilis)(DSM 23797として寄託された)、オクロバクテリウム・アンスロピ(Ochrobactrum anthropi)(DSM 23793として寄託された)、オクロバクテリウム・トリティシ(Ochrobactrum tritici)(DSM 23786として寄託された)、シノリゾビウム・モレレンス(Sinorhizobium morelense)(DSM 23794として寄託された)、クルトバクテリウム・プシルム(Curtobacterium pusilllum)(DSM 23787として寄託された)、ペキロマイセス・リアシヌス(Paecilomyces lilacinus)(DSM 23771として寄託された)、ミクロバクテリウム・ゲンセンギソリ(Microbacterium ginsengisoli)、ミクロバクテリウム・トリコテセノリティクム(Microbacterium trichothecenolyticum)(DSM 23788として寄託された)、シュードモナス・シトロネロリス(Pseudomonas citronellolis)(DSM 23795として寄託された)、エルシニア・クリステンセニイ(Yersinia kristensenii)(DSM 23792として寄託された)、アクロモバクター・スパニウス(Achromobacter spanius)(DSM 23791として寄託された)、アクロモバクター・インソリタス(Achromobacter insolitus)(DSM 23790として寄託された)、マイコバクテリウム・フォーチュイタム(Mycobacterium fortuitum)(DSM 23789として寄託された)、マイコバクテリウム・フレデリクスバーゲンス(Mycobacterium frederiksbergense)(DSM 23798として寄託された)、マイコバクテリウム・サクルム(Mycobacterium sacrum)(DSM 23785として寄託された)、マイコバクテリウム・フルオランセニボランス(Mycobacterium fluoranthenivorans)(DSM 23796として寄託された)、バークホルデリア(Burkholderia)種、バークホルデリア・トロピカ(Burkholderia tropica)(DSM 23799として寄託された)、コスモスポラ・エピスファエリア(Cosmospora episphaeria)(DSM 23772として寄託された)およびフザリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)(DSM 23770として寄託された)からなる生物の群から選択される生物から得ることができるポリペプチド。
- Cpu−TA1[配列番号30]、Cpu−TA2[配列番号33]、Cpu−TA3[配列番号35]、Raq−TA2[配列番号38]、Raq−TA3[配列番号40]、Asp−TA1[配列番号43]、およびMgi−TA1[配列番号46]からなる群から選択される(R)−トランスアミナーゼ活性を有する請求項14または15に記載のポリペプチド、またはこれらのアミノ酸配列のいずれかと少なくとも90%、好ましくは少なくとも91%、好ましくは少なくとも92%、好ましくは少なくとも93%、好ましくは少なくとも94%、好ましくは少なくとも95%、好ましくは少なくとも96%、好ましくは少なくとも97%、好ましくは少なくとも98%、好ましくは少なくとも99%の同一性を有するタンパク質。
- 請求項14〜16のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸。
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