KR102057590B1 - 스피로인돌론을 제조하기 위한 화학적 방법 및 그의 중간체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 스피로인돌론 화합물, 예컨대 (1'R,3'S)-5,7'-디클로로-6'-플루오로-3'-메틸-2',3',4',9'-테트라히드로스피로[인돌린-3,1'-피리도[3,4-b]인돌]-2-온 및 그의 염 및 수화물 및 용매화물을 제조하는데 유용한 방법 및 중간체에 관한 것이다.
Description
서열 목록, 표 또는 컴퓨터 프로그램에 대한 참조
공식적인 서열 목록 복사본은 "PAT055051_seql2.txt"의 파일명 (작성일 2013년 3월 22일, 및 크기 447 킬로바이트)으로 EFS-웹을 통해 ASCII 포맷 텍스트 파일로서 명세서와 동시에 제출되었다. EFS-웹을 통해 제출된 서열 목록은 명세서의 일부이고, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
(1'R,3'S)-5,7'-디클로로-6'-플루오로-3'-메틸-2',3',4',9'-테트라히드로스피로[인돌린-3,1'-피리도[3,4-b]인돌]-2-온 (예를 들어 스피로인돌론 모이어티를 포함하는 화학식 IV의 화합물) 및 제조를 위한 6-단계 합성 방법 (공지된 키랄 아민 중간체 화합물 IIA를 포함함)이 공지되어 있다 (WO 2009/132921):
본 발명은 스피로인돌론 화합물, 특히 (1'R,3'S)-5,7'-디클로로-6'-플루오로-3'-메틸-2',3',4',9'-테트라히드로스피로[인돌린-3,1'-피리도[3,4-b]인돌]-2-온을 합성하는 개선된 방법, 및 이러한 개선된 방법에 사용되는 중간체에 관한 것이다.
제1 실시양태에서, 본 발명은 하기 화학식 I의 화합물을 하기 화학식 II의 화합물 또는 그의 염, 용매화물 또는 수화물로 전환시키는 것을 포함하는, 화학식 II의 화합물 또는 그의 염 또는 용매화물 또는 수화물을 제조하는 방법이다.
<화학식 II>
<화학식 I>
상기 식에서, 파선은 결합이거나 또는 부재하고; A는 C=O 및 C=NH로부터 선택되거나; 또는 파선이 이중 결합인 경우에, A-R8은 
이고; Ra는 C1 -6 알킬이고; R1은 H, -CH3, 
,
이고;
R4 및 R7은 각각, 독립적으로, H 또는 -Cl이고; R5는 H, -OH, -CH3, -OCH3, -F, -Cl, -CF3 또는 -CN이고; R6은 H, -OH, -OCH3, -F 또는 -Cl이고; R8은 H, -CH3, -CH2CH3, -CH2OH, -CO2H, -CO2CH3, -CO2CH2CH3 또는 -CF3이고; n은 1 또는 2이다.
제2 실시양태에서, 본 발명은 하기 화학식 IA의 화합물 또는 그의 염 또는 용매화물 또는 수화물을 효소적으로 아미노교환시켜 하기 화학식 IIA의 화합물을 제공하는 것을 포함하는, 화학식 IIA의 화합물 또는 그의 염 또는 수화물 또는 용매화물을 제조하는 방법이다.
<화학식 IIA>
<화학식 IA>
제3 실시양태에서, 본 발명은 하기 화학식 III의 화합물 또는 그의 염 또는 수화물 또는 용매화물을 하기 화학식 II의 화합물 또는 그의 염 또는 수화물 또는 용매화물과 반응시키는 것을 포함하며, 여기서 화학식 II의 화합물 또는 그의 염 또는 수화물 또는 용매화물은 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 염 또는 수화물 또는 용매화물로부터 제조되는 것인, 하기 화학식 IV의 화합물 또는 그의 염 또는 수화물 또는 용매화물을 제조하는 방법이다.
<화학식 IV>
<화학식 III>
<화학식 II>
<화학식 I>
상기 식에서, 파선은 결합이거나 또는 부재하고; A는 C=O 및 C=NH로부터 선택되거나; 또는 파선이 이중 결합인 경우에, A-R8은 
이고; Ra는 C1 -6 알킬이고; R1은 아미노, (C1-C6) 알킬 아미노, (C1-C6) 알킬 디-알킬 아미노 또는 (C1-C6) 알킬 C(O)NH (C1 -6) 알킬로 임의로 치환된 (C1-C6) 알킬이고; R4 및 R7은 각각, 독립적으로, H 또는 할로이고; R5 및 R6은 각각, 독립적으로, 수소, 할로, 히드록실, (C1-C6) 알킬, 트리할로 (C1) 알킬, 시아노 또는 (C1-C6) 알콕시이고; R8은 히드록실로 임의로 치환된 (C1-C6) 알킬이고; n은 1 또는 2이고; R1'는 수소 또는 (C1-C6)알킬이고; R4', R5', R6' 및 R7'는 각각, 독립적으로, 수소, 할로, 히드록시, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, (C1-C6)알킬, 및 (C1-C6)알킬옥시이다.
제4 실시양태에서, 본 발명은 하기 화학식 IIIA의 화합물 또는 그의 염 또는 용매화물 또는 수화물을 하기 화학식 IIA의 화합물 또는 그의 염 또는 용매화물 또는 수화물과 반응시켜 하기 화학식 IVA의 화합물 또는 그의 염 또는 용매화물 또는 수화물을 제공하는 것을 포함하며, 여기서 화학식 IIA의 화합물은 하기 화학식 IA의 화합물 또는 그의 염 또는 수화물 또는 용매화물로부터 제조되는 것인, 화학식 IVA의 화합물 또는 그의 염 또는 용매화물 또는 수화물을 제조하는 방법이다.
<화학식 IVA>
<화학식 IIIA>
<화학식 IIA>
<화학식 IA>
제5 실시양태에서, 본 발명은 하기 화학식 IC의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 수화물 또는 용매화물이다.
<화학식 IC>
상기 식에서, R1은 아미노, (C1-C6) 알킬 아미노, (C1-C6) 알킬 디-알킬 아미노 또는 (C1-C6) 알킬 C(O)NH (C1 -6) 알킬로 임의로 치환된 (C1-C6) 알킬이고; R5 및 R6은 각각, 독립적으로, 수소, 할로, 히드록실, (C1-C6) 알킬, 트리할로 (C1) 알킬, 시아노 또는 (C1-C6) 알콕시이고; R8은 히드록실로 임의로 치환된 (C1-C6) 알킬이고; n은 1 또는 2이다.
제6 실시양태에서 본 발명은
로부터 선택된 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 수화물이다.
발명의 분야
본 발명은, 예를 들어 스피로인돌론 모이어티, 예컨대 (1'R,3'S)-5,7'-디클로로-6'-플루오로-3'-메틸-2',3',4',9'-테트라히드로스피로[인돌린-3,1'-피리도[3,4-b]인돌]-2-온을 포함하는, 기생충성 질환의 치료에 유용한 스피로인돌론 화합물의 제조에 유용한 신규 방법, 신규 방법 단계 및 신규 중간체에 관한 것이다.
발명의 배경
본 발명은 스피로인돌론 화합물, 예컨대 (1'R,3'S)-5,7'-디클로로-6'-플루오로-3'-메틸-2',3',4',9'-테트라히드로스피로[인돌린-3,1'-피리도[3,4-b]인돌]-2-온의 제조 방법에 관한 것이다.
(1'R,3'S)-5,7'-디클로로-6'-플루오로-3'-메틸-2',3',4',9'-테트라히드로스피로[인돌린-3,1'-피리도[3,4-b]인돌]-2-온은 감염 예컨대, 예를 들어, 플라스모디움 팔시파룸 (Plasmodium falciparum), 플라스모디움 비박스 (Plasmodium vivax), 플라스모디움 말라리아에 (Plasmodium malariae), 플라스모디움 오발레 (Plasmodium ovale), 트리파노소마 크루지 (Trypanosoma cruzi), 및 리슈마니아 (Leishmania) 속의 기생충, 예컨대 리슈마니아 도노바니 (Leishmania donovani)에 의해 유발되는 감염의 치료 및/또는 예방에 유용하며, 이는 하기 구조를 갖는다:
<화학식 IVA>
(1'R,3'S)-5,7'-디클로로-6'-플루오로-3'-메틸-2',3',4',9'-테트라히드로스피로[인돌린-3,1'-피리도[3,4-b]인돌]-2-온 및 그의 합성은 WO 2009/132921 A1, 특히 그의 실시예 49에 기재되어 있다.
(1'R,3'S)-5,7'-디클로로-6'-플루오로-3'-메틸-2',3',4',9'-테트라히드로스피로[인돌린-3,1'-피리도[3,4-b]인돌]-2-온을 제조하는데 적합하도록 전체 합성 효율을 개선시키기 위한 신규 제조 방법을 제공할 필요가 있다. 특히, 하기 키랄 아민 중간체 IIA의 합성 효율을 증가시킬 필요가 있다.
<화학식 IIA>
본원에 정의된 바와 같은 스피로인돌론 화합물, 예컨대 화학식 IV의 화합물 또는 그의 염 또는 수화물 또는 용매화물, 및 중간체를 제조하기 위한 본 발명에 따른 방법(들)을 반응식 1에 요약한다.
<반응식 1>
즉, 화학식 I의 화합물 또는 그의 염 또는 수화물 또는 용매화물을 하기 방법 1, 2, 3, 4, 5 또는 6에 따라 화학식 II의 화합물 또는 그의 염 또는 수화물 또는 용매화물로 전환시키고, 여기서
- 방법 1은
a) 화학식 I의 화합물 또는 그의 염 또는 수화물 또는 용매화물을 화학식 II의 화합물 또는 그의 염 또는 수화물 또는 용매화물로 전환시키기 위한 효소적 아미노교환을 포함하고;
- 방법 2는
a) 화학식 I의 화합물 또는 그의 염 또는 수화물 또는 용매화물을 화학식 II의 화합물 또는 그의 염으로 전환시키기 위한 화학적 비대칭 촉매작용을 포함하고;
- 방법 3은
a) 화학식 I의 화합물 또는 그의 염 또는 수화물 또는 용매화물을 화학식 II의 화합물 또는 그의 염 또는 수화물 또는 용매화물로 전환시키기 위한 화학적 비대칭 환원을 포함하고;
- 방법 4는
a) 화학식 I의 화합물 또는 그의 염 또는 수화물 또는 용매화물을 화학식 II의 화합물 또는 그의 염 또는 수화물 또는 용매화물로 전환시키기 위한 환원에 이은 키랄 분해를 포함하고;
- 방법 5는
a) 화학식 II의 화합물 또는 그의 염 또는 수화물 또는 용매화물의 라세미체를 화학식 II의 단일 거울상이성질체 화합물 또는 그의 염 또는 수화물 또는 용매화물로 전환시키기 위한 리파제 분해를 포함하고;
노보자임 435: 아크릴 수지 상에 고정된 칸디다 안타르크티카 (Candida antarctica) 리파제 B
- 방법 6은
a) 화학식 I의 화합물 또는 그의 염 또는 수화물 또는 용매화물을 화학식 II의 화합물 또는 그의 염 또는 수화물 또는 용매화물로 전환시키기 위한 방법 1-5 중 2가지 이상의 조합을 포함한다.
화학식 II의 화합물 또는 그의 염은, 예를 들어 본원에 참조로 포함되는 WO 2009/132921에 기재된 바와 같이, 특히 관련 특허청구범위 및 실시예에 기재된 바와 같이, 화학식 IV의 화합물 또는 그의 염으로 전환시킬 수 있다.
특히, 본 발명은 각각의 섹션에 기재된 방법에 관한 것이다. 마찬가지로, 본 발명은 독립적으로, 이러한 상응하는 섹션 내의 방법 순서에 기재된 모든 단일 단계에 관한 것이다. 따라서, 본원에 기재된 일련의 단계로 이루어진 임의의 방법 중 각각의 그리고 모든 단일 단계는 그 자체로 본 발명의 바람직한 실시양태이다. 따라서, 본 발명은 또한 방법의 임의의 단계에서 중간체로서 수득가능한 화합물을 출발 물질로서 사용할 수 있다는 것에 따른 상기 방법의 이러한 실시양태에 관한 것이다.
본 발명은 마찬가지로 본 발명에 따른 화합물의 제조를 위해 구체적으로 개발된 신규 출발 물질, 그의 용도 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 화합물의 제조를 위해 구체적으로 개발된 중간체, 그의 용도 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.
달리 언급되지 않는 한, 본 출원에서 통상적으로 하나의 섹션에서 이루어진 설명은 다른 섹션에 대해서도 적용된다는 것에 주의한다. 예를 들어 섹션 A에 주어진 화학식 I에서의 잔기 R1에 대한 설명은, 달리 언급되지 않는 한, 화학식 I이 다른 섹션, 예컨대 섹션 B에서 발생하는 경우에도 적용된다.
섹션 A: 화학식 I의 화합물의 제조
화학식 I의 화합물 또는 그의 염, 또는 수화물 또는 그의 용매화물은 하기 기재된 바에 따라 및/또는 본원에 포함된 실시예 1-3에 따라 제조될 수 있다.
섹션 B: 화학식 I의 화합물의 화학식
II
의 화합물로의 전환
제1 실시양태에서, 본 발명은 하기 화학식 I의 화합물을 하기 화학식 II의 화합물 또는 그의 염, 용매화물 또는 수화물로 전환시키는 것을 포함하는, 화학식 II의 화합물 또는 그의 염 또는 용매화물 또는 수화물을 제조하는 방법이다.
<화학식 II>
<화학식 I>
상기 식에서, 파선은 결합이거나 또는 부재하고; A는 C=O 및 C=NH로부터 선택되거나; 또는 파선이 이중 결합인 경우에, A-R8은 
이고; Ra는 C1 -6 알킬이고; R1은 H, -CH3, 
,
이고;
R4 및 R7은 각각, 독립적으로, H 또는 -Cl이고; R5는 H, -OH, -CH3, -OCH3, -F, -Cl, -CF3 또는 -CN이고; R6은 H, -OH, -OCH3, -F 또는 -Cl이고; R8은 H, -CH3, -CH2CH3, -CH2OH, -CO2H, -CO2CH3, -CO2CH2CH3 또는 -CF3이고; n은 1 또는 2이다.
제1 대안적 실시양태에서, 본 발명은 R8이 -CH3인 경우에 R5 및 R6이 플루오로이고, n이 1인, 화학식 I의 화합물을 화학식 II의 화합물로 전환시키는 방법이다.
제2 대안적 실시양태에서, 본 발명은 R8이 -CH3인 경우에 R5 및 R6이 플루오로 및 클로로이고, n이 1인, 화학식 I의 화합물을 화학식 II의 화합물로 전환시키는 방법이다.
제3 대안적 실시양태에서, 본 발명은 R8이 -CH3인 경우에 R5 및 R6이 수소이고, n이 1인, 화학식 I의 화합물을 화학식 II의 화합물로 전환시키는 방법이다.
제4 대안적 실시양태에서, 본 발명은 n이 1인 경우에 R5가 플루오로이고, R6이 수소인, 화학식 I의 화합물을 화학식 II의 화합물로 전환시키는 방법이다.
제6 대안적 실시양태에서, 본 발명은 화학식 II의 화합물이 하기 화학식 IIA의 화합물 또는 그의 염 또는 용매화물 또는 수화물인, 화학식 I의 화합물을 화학식 II의 화합물로 전환시키는 방법이다.
<화학식 IIA>
제7 대안적 실시양태에서, 본 발명은 화학식 II의 화합물이 효소적 아미노교환, 화학적 비대칭 촉매작용, 비대칭 환원 및 키랄 분해로부터 선택된 조건, 또는 2가지 이상의 조건의 조합 하에 화학식 I의 화합물로부터 전환되는 것인, 화학식 I의 화합물을 화학식 II의 화합물로 전환시키는 방법이다.
제8 대안적 실시양태에서, 본 발명은 A가 C=O인 화학식 I의 화합물을 화학식 II의 화합물로 전환시키는 방법이다.
제9 대안적 실시양태에서, 본 발명은 화학식 I의 화합물이 하기 화학식 IA의 화합물 또는 그의 염 또는 수화물 또는 용매화물인, 화학식 I의 화합물을 화학식 II의 화합물로 전환시키는 방법이다.
<화학식 IA>
예시적 실시양태에서, 효소는 서열 134이다.
제2 실시양태에서, 본 발명은 하기 화학식 IA의 화합물 또는 그의 염 또는 용매화물 또는 수화물을 효소적으로 아미노교환시켜 하기 화학식 IIA의 화합물을 제공하는 것을 포함하는, 화학식 IIA의 화합물 또는 그의 염 또는 수화물 또는 용매화물을 제조하는 방법이다.
<화학식 IIA>
<화학식 IA>
전형적으로, 케톤, 화합물 I을 유기 용매, 예를 들어 글리콜에 용해시키고, 이소프로필 아민 HCL 및 피리독살포스페이트의 수성 혼합물에 첨가한 후, TEA 완충제를 첨가한다. 이어서 적절한 염기, 예를 들어 NaOH를 사용하여 pH를 중성으로 조정한 후, 가온하고 트랜스아미나제를 첨가한다. 반응물을 대략 24시간 동안 그 온도에서 교반한다. 고체 키랄 아민 생성물 (화학식 II의 화합물)을 당업자에게 공지된 방법 및/또는 실시예 10-12에 따른 방법으로 단리한다.
예시적 실시양태에서, 효소는 서열 134이다.
섹션 C: 화학식
II
의 화합물의 화학식
IV
의 화합물로의 전환
제3 실시양태에서, 본 발명은 하기 화학식 III의 화합물 또는 그의 염 또는 수화물 또는 용매화물을 하기 화학식 II의 화합물 또는 그의 염 또는 수화물 또는 용매화물과 반응시키는 것을 포함하며, 여기서 화학식 II의 화합물 또는 그의 염 또는 수화물 또는 용매화물은 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 염 또는 수화물 또는 용매화물로부터 제조되는 것인, 하기 화학식 IV의 화합물 또는 그의 염 또는 수화물 또는 용매화물을 제조하는 방법이다.
<화학식 IV>
<화학식 III>
<화학식 II>
<화학식 I>
상기 식에서, 파선은 결합이거나 또는 부재하고; A는 C=O 및 C=NH로부터 선택되거나; 또는 파선이 이중 결합인 경우에, A-R8은 
이고; Ra는 C1 -6 알킬이고; R1은 아미노, (C1-C6) 알킬 아미노, (C1-C6) 알킬 디-알킬 아미노 또는 (C1-C6) 알킬 C(O)NH (C1-C6) 알킬로 임의로 치환된 (C1-C6) 알킬이고; R4 및 R7은 각각, 독립적으로, H 또는 할로이고; R5 및 R6은 각각, 독립적으로, 수소, 할로, 히드록실, (C1-C6) 알킬, 트리할로 (C1) 알킬, 시아노 또는 (C1-C6) 알콕시이고; R8은 히드록실로 임의로 치환된 (C1-C6) 알킬이고; n은 1 또는 2이고, R1'는 수소 또는 (C1-C6)알킬이고; R4', R5', R6' 및 R7'는 각각, 독립적으로, 수소, 할로, 히드록시, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, (C1-C6)알킬, 및 (C1-C6)알킬옥시이다.
제10 대안적 실시양태에서, 본 발명은 R8이 -CH3인 경우에 R5 및 R6이 플루오로이고, n이 1인, 화학식 IV의 화합물을 제조하는 방법이다.
제11 대안적 실시양태에서, 본 발명은 R8이 -CH3인 경우에 R5 및 R6이 플루오로 및 클로로이고, n이 1인, 화학식 IV의 화합물을 제조하는 방법이다.
제12 대안적 실시양태에서, 본 발명은 R8이 -CH3인 경우에 R5 및 R6이 수소이고, n이 1인, 화학식 IV의 화합물을 제조하는 방법이다.
제14 대안적 실시양태에서, 본 발명은 n이 1인 경우에 R5가 플루오로이고, R6이 수소인, 화학식 IV의 화합물을 제조하는 방법이다.
R1은 H, -CH3,
이고;
R4 및 R7은 각각, 독립적으로, H 또는 -Cl이고; R5는 H, -OH, -CH3, -OCH3, -F, -Cl, -CF3 또는 -CN이고; R6은 H, -OH, -OCH3, -F 또는 -Cl이고; R8은 H, -CH3, -CH2CH3, -CH2OH, -CO2H, -CO2CH3, -CO2CH2CH3 또는 -CF3이고; n은 1 또는 2이다.
제15 대안적 실시양태에서, 본 발명은 화학식 II의 화합물이 하기 화학식 IIA의 화합물 또는 그의 염 또는 용매화물 또는 수화물인, 화학식 IV의 화합물을 제조하는 방법이다.
<화학식 IIA>
제16 대안적 실시양태에서, 본 발명은 R5'가 할로인, 화학식 IV의 화합물을 제조하는 방법이다.
제17 대안적 실시양태에서, 본 발명은 R5'가 클로로이고, R1', R4', R6' 및 R7'가 각각 수소인, 화학식 IV의 화합물을 제조하는 방법이다.
제18 대안적 실시양태에서, 본 발명은 화학식 III의 화합물이 하기 화학식 IIIA의 화합물 또는 그의 염 또는 수화물 또는 용매화물인, 화학식 IV의 화합물을 제조하는 방법이다.
<화학식 IIIA>
예시적 실시양태에서, 효소는 서열 134이다.
제4 실시양태에서, 본 발명은 하기 화학식 IIIA의 화합물 또는 그의 염 또는 용매화물 또는 수화물을 하기 화학식 IIA의 화합물 또는 그의 염 또는 용매화물 또는 수화물과 반응시켜 하기 화학식 IVA의 화합물 또는 그의 염 또는 용매화물 또는 수화물을 제공하는 것을 포함하며, 여기서 화학식 IIA의 화합물은 하기 화학식 IA의 화합물 또는 그의 염 또는 수화물 또는 용매화물로부터 제조되는 것인, 화학식 IVA의 화합물 또는 그의 염 또는 용매화물 또는 수화물을 제조하는 방법이다.
<화학식 IVA>
<화학식 IIIA>
<화학식 IIA>
<화학식 IA>
제19 대안적 실시양태에서, 본 발명은 화학식 IIA의 화합물을 화학식 IIIA의 화합물과의 반응 전에 하기 화학식 IIB의 염으로 전환시키는 것인, 화학식 IVA의 화합물을 제조하는 방법이다.
<화학식 IIB>
예시적 실시양태에서, 효소는 서열 134이다.
제20 대안적 실시양태에서, 본 발명은 반응을 염기성 조건 하에 수행하는 것인, 화학식 IVA의 화합물을 제조하는 방법이다.
제21 대안적 실시양태에서, 본 발명은 반응을 트리에틸 아민의 존재 하에 수행하는 것인, 화학식 IVA의 화합물을 제조하는 방법이다.
제22 대안적 실시양태에서, 본 발명은 화학식 IVA의 화합물을 하기 화학식 IVB의 염으로서 단리하는 것인, 화학식 IVA의 화합물을 제조하는 방법이다.
<화학식 IVB>
제23 대안적 실시양태에서, 본 발명은 화학식 IVB의 염을 유리 염기의 화학식 IVA의 화합물로 전환시키는 것인, 화학식 IVA의 화합물을 제조하는 방법이다.
제24 대안적 실시양태에서, 본 발명은 화학식 IVB의 염을 탄산나트륨에 의해 유리 염기의 화학식 IVA의 화합물로 전환시키는 것인, 화학식 IVA의 화합물을 제조하는 방법이다.
제25 대안적 실시양태에서, 본 발명은 화학식 IVA의 화합물이 수화물인, 화학식 IVA의 화합물을 제조하는 방법이다.
제26 대안적 실시양태에서, 본 발명은 화학식 IVA의 화합물이 ½ 수화물인, 화학식 IVA의 화합물을 제조하는 방법이다.
제27 대안적 실시양태에서, 본 발명은 화학식 IVA의 화합물 ½ 수화물을 단리 후 분쇄하는 것인, 화학식 IVA의 화합물 ½ 수화물을 제조하는 방법이다.
섹션 D:
신규한
본 발명의 화학식
IC
의 화합물의 용도
제5 실시양태에서, 본 발명은 하기 화학식 IC의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 수화물 또는 용매화물이다.
<화학식 IC>
상기 식에서, R1은 아미노, (C1-C6) 알킬 아미노, (C1-C6) 알킬 디-알킬 아미노 또는 (C1-C6) 알킬 C(O)NH (C1 -6) 알킬로 임의로 치환된 (C1-C6) 알킬이고; R5 및 R6은 각각, 독립적으로, 수소, 할로, 히드록실, (C1-C6) 알킬, 트리할로 (C1) 알킬, 시아노 또는 (C1-C6) 알콕시이고; R8은 히드록실로 임의로 치환된 (C1-C6) 알킬이고; n은 1 또는 2이다.
제28 대안적 실시양태에서, 본 발명은 R8이 -CH3인 경우에 R5 및 R6이 플루오로이고, n이 1인, 화학식 IC의 화합물이다.
제29 대안적 실시양태에서, 본 발명은 R8이 -CH3인 경우에 R5 및 R6이 플루오로 및 클로로이고, n이 1인, 화학식 IC의 화합물이다.
제30 대안적 실시양태에서, 본 발명은 R8이 -CH3인 경우에 R5 및 R6이 수소이고, n이 1인, 화학식 IC의 화합물이다.
제31 대안적 실시양태에서, 본 발명은 n이 1인 경우에 R5가 플루오로이고, R6이 수소인, 화학식 IC의 화합물이다.
제32 대안적 실시양태에서, 본 발명은 R1이 H, -CH3, 
이고; R5가 H, -OH, -CH3, -OCH3, -F, -Cl, -CF3 또는 -CN이고; R6이 H, -OH, -OCH3, -F 또는 -Cl이고; R8이 H, -CH3, -CH2CH3, -CH2OH, -CO2H, -CO2CH3, -CO2CH2CH3 또는 -CF3이고; n이 1 또는 2인, 화학식 IC의 화합물이다.
제33 대안적 실시양태에서, 본 발명은 하기 화학식 IA의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 수화물 또는 용매화물인, 화학식 I의 화합물이다.
<화학식 IA>
제6 실시양태에서, 본 발명은
로부터 선택된 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 수화물이다.
섹션 I: 일반적 용어
본 발명의 신규 중간체 및 합성 단계를 기재하는데 사용되는 다양한 용어의 정의를 하기에 열거한다. 이러한 정의는, 본 개시내용에 사용된 일반적 표현 또는 기호 중 하나, 하나 초과 또는 전부를 대체하여 본 발명의 실시양태를 구성하며, 이들이 특정 예에서 개별적으로 또는 더 큰 기의 부분으로서 달리 정의되지 않는 한, 특히 본 명세서 전반에 걸쳐서 사용되는 해당 용어에 적용된다. 따라서 상기 및 하기에 사용되는 일반적인 정의는, 달리 정의되지 않는 한 하기 의미를 갖는다:
용어 "C1-C20-"은 최대 20개 (포함)까지, 특히 최대 7개 (포함)까지의 탄소 원자를 갖는 모이어티를 정의하며, 상기 모이어티는 분지형이거나 (1회 이상) 직쇄형이며, 말단 또는 비-말단 탄소를 통해 결합된다.
알킬은 직쇄형 또는 분지형 (1회, 또는 목적하고 가능하다면 1회 초과)의 탄소 쇄인 라디칼 또는 라디칼의 부분이고, 특히 C1-C7-알킬, 예컨대 C1-C4-알킬, 특히 분지형 C1-C4-알킬, 예컨대 이소프로필이다. 용어 "저급" 또는 "C1-C7-"은 최대 7개 (포함)까지, 특히 최대 4개 (포함)까지의 탄소 원자를 갖는 모이어티를 정의하며, 상기 모이어티는 분지형이거나 (1회 이상) 직쇄형이며, 말단 또는 비-말단 탄소를 통해 결합된다. 저급 또는 C1-C7-알킬은, 예를 들어 n-펜틸, n-헥실 또는 n-헵틸 또는 바람직하게는 C1-C4-알킬, 특히 메틸, 에틸, n-프로필, 이소-프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 특히 메틸, 에틸, n-프로필, 이소-프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸이고; 바람직하게는 메틸이다.
알킬아미노 및 디알킬아미노는 알킬-NH- 및 (알킬)2N-을 각각 지칭하고, 상기 알킬은 선형 또는 분지형일 수 있다. 알킬 기는, 예를 들어 1 내지 7개, 특히 1 내지 4개의 C 원자를 포함한다. 일부 예는 메틸아미노, 디메틸아미노, 에틸아미노 및 디에틸아미노이고; 바람직하게는 메틸아미노이다.
할로 또는 할로겐은 바람직하게는 플루오로, 클로로, 브로모 또는 아이오도, 바람직하게는 플루오로 또는 클로로이고; 할로가 치환기로서 언급되는 경우에, 가능하다면, 예를 들어 할로-C1-C7-알킬, 예컨대 트리플루오로메틸, 2,2-디플루오로에틸 또는 2,2,2-트리플루오로에틸에서 1개 이상 (예를 들어 3개까지 또는 1개)의 할로겐 원자가 존재할 수 있다.
할로-C1-C7-알킬은 선형 또는 분지형일 수 있고, 특히 1 내지 4개의 C 원자, 예를 들어 1 또는 2개의 C 원자를 포함한다. 예는 플루오로메틸, 디플루오로메틸, 트리플루오로메틸, 클로로메틸, 디클로로메틸, 트리클로로메틸, 2-클로로에틸 및 2,2,2-트리플루오로에틸; 바람직하게는 트리플루오로메틸이다.
라디칼 또는 라디칼의 부분인 알콕시는 알킬-O-를 지칭하고, 상기 용어 알킬은 본원에 정의된 바와 같고, 예를 들어 C1-C20-알콕시 (-O-C1-C20알킬), 바람직하게는 C1-C7-알콕시 (-O-C1-C7알킬)를 포함한다. 특히, 알콕시는, 예를 들어 메톡시, 에톡시, n-프로필옥시, 이소프로필옥시, n-부틸옥시, 이소부틸옥시, sec-부틸옥시, tert-부틸옥시, 펜틸옥시, 헥실옥시 및 헵틸옥시 라디칼; 바람직하게는 메톡시를 포함한다.
용어 "광학 활성 염기"는, 예를 들어 키랄 아민, 바람직하게는 키랄 3급 아민, 보다 바람직하게는 신코나 알칼로이드, 예컨대 퀴니딘 및 퀴닌, 가장 바람직하게는 변형된 신코나 알칼로이드를 기재한다. 이러한 변형된 신코나 알칼로이드의 예는, 예를 들어 [Tian, S.-K.; Chen, Y.; Hang, J.; Tang, L.; McDiad, P.; Deng, L. Acc. Chem. Res. 2004, 37, 621-631] 및 상기 문헌에서 인용된 참고문헌에 상술되어 있다.
본원에 사용된 용어 "상 이동 촉매"는 반응물 중 하나, 가장 일반적으로는 음이온을 계면을 가로질러 다른 상으로 추출함으로써, 상이한 상에 위치하는 화학종들 (예를 들어 불혼화성 액체 또는 고체와 액체) 사이의 반응 속도를 증진시키는 촉매량의 화학적 작용제를 지칭한다. 이러한 촉매는 4급 암모늄 또는 포스포늄 염 (예를 들어 테트라알킬암모늄 염 (여기서, 알킬은 동일하거나 상이할 수 있음)) 또는 무기 양이온과 착물화하는 작용제 (예를 들어 크라운 에테르 또는 다른 크립탄드)를 포함한다. 촉매 양이온은, 음이온 교환이 일어나더라도 반응에서 소비되지 않는다. 특히, 본 발명에 따라 사용되는 적합한 상 이동 촉매는, 예를 들어 화학식 RmRnRlRkNX (여기서, RmRnRlRk는 동일하거나 상이한 알킬이고, X는 할로 (예를 들어 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드)임) 또는 히드록시드의 4급 암모늄 염, 예를 들어 테트라-n-부틸암모늄 히드록시드이다.
본원에서 "불균질" 촉매란 담체, 전형적으로 반드시는 아니지만 무기 물질, 예를 들어 탄소, 규소 및/또는 산화알루미늄과 같은 다공성 물질로 구성된 기재 상에 지지된 촉매를 지칭한다.
본원에서 "균질" 촉매란 담체 상에 지지되지 않은 촉매를 지칭한다.
용어 "키랄"은 그의 거울상 파트너에 비-중첩가능한 특성을 갖는 분자를 지칭하고, 용어 "비키랄"은 그의 거울상 파트너에 중첩가능한 분자를 지칭한다.
용어 "촉매"는 화학 반응의 활성화 에너지를 낮춤으로써 화학 반응 속도에 영향을 미치는 임의의 물질을 의미한다.
용어 "분말 촉매"는 물 함량이 0 내지 30 질량%인 촉매를 의미한다.
용어 "기질 대 촉매 비율 (S/C)"은 출발 화합물 또는 그의 염 대 "전이 금속 촉매"의 몰비를 지칭한다.
용어 "후처리"는 일단 반응이 종료되면 수행되는 단리 및/또는 정제의 작업을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "실온" 또는 "주위 온도"는, 달리 명시되지 않는 한, 15 내지 30℃, 예컨대 20 내지 30℃, 예컨대 20 내지 25℃의 온도를 의미한다.
본 출원 전반에 걸쳐 사용된 용어 "불활성"은 임의의 반응물, 용매 또는 반응 혼합물의 기타 성분과 비반응성인 것을 의미한다. 이러한 불활성 조건은 일반적으로 다른 기체보다도 불활성 기체, 예컨대 이산화탄소, 헬륨, 질소, 아르곤을 사용하여 수행된다.
별표 (*)로 표시된 결합은 분자의 나머지에 대한 결합 지점을 나타낸다.
본 발명의 화합물은 1개 이상의 비대칭 중심을 가질 수 있다. 바람직한 절대 배위는 본원에 구체적으로 개시된 바와 같다. 그러나, 임의의 가능한 순수한 거울상이성질체, 순수한 부분입체이성질체, 또는 그의 혼합물, 예를 들어 거울상이성질체의 혼합물, 예컨대 라세미체가 본 발명에 포괄된다.
본원의 화학식에서 C-sp3 상의 표시 
는 결합의 입체화학이 정의되지 않은 공유 결합을 나타낸다. 이는 C-sp3 상의 표시 
가 각 키랄 중심의 (S) 배위 뿐만 아니라 (R) 배위도 포함한다는 것을 의미한다. 추가로, 혼합물이 또한 포괄되며, 예를 들어 거울상이성질체의 혼합물, 예컨대 라세미체가 본 발명에 포괄된다.
본원의 화학식에서 C-sp2 상의 표시 
는 결합의 입체화학 또는 기하학이 정의되지 않은 공유 결합을 나타낸다. 이는 C-sp2 상의 표시 
가 각 이중 결합의 시스 (Z) 배위 뿐만 아니라 트랜스 (E) 배위를 포함한다는 것을 의미한다. 추가로, 혼합물이 또한 포괄되며, 예를 들어 이중 결합 이성질체의 혼합물이 본 발명에 포괄된다.
본원의 화학식에서, 표시 
는 Csp3-Csp3 결합 또는 Csp2-Csp2 결합을 나타낸다.
본 발명의 화합물은 1개 이상의 비대칭 중심을 가질 수 있다. 바람직한 절대 배위는 본원에 구체적으로 개시된 바와 같다.
본원의 화학식에서, C-sp3 상의 표시 
는 (R) 또는 (S)의 절대 입체화학을 나타낸다.
본원의 화학식에서, C-sp3 상의 표시 
는 (R) 또는 (S)의 절대 입체화학을 나타낸다.
주어진 백분율에서의 용어 "이성질체 순도"는 지정된 입체이성질체가 입체이성질체의 혼합물 중에서 상기 주어진 백분율로 우세함을 의미한다.
용어 "입체이성질체"는 1개 이상의 비대칭 탄소를 갖는 단일 유기 분자의 절대 배위 중 하나를 의미한다. 입체이성질체의 정의에는 거울상이성질체 및 부분입체이성질체가 포함된다.
용어 "분해"는 분자의 입체이성질체 중 1종의 분리 또는 농축 또는 감손을 지칭한다.
염은 특히 제약상 허용되는 염 또는 일반적으로 본원에 언급된 임의의 중간체의 염이고, 당업자는 화학적 이유로 염이 배제되는 경우를 용이하게 이해할 것이다. 이들은 염 형성 기, 예컨대 염기성 또는 산성 기가 존재하는 경우에 형성될 수 있고, 이는 적어도 부분적으로 해리된 형태로, 예를 들어 수용액 중 4 내지 10의 pH 범위에서 존재할 수 있거나, 또는 특히 고체, 특히 결정질 형태로 단리될 수 있다.
이러한 염은, 예를 들어 염기성 질소 원자 (예를 들어 이미노 또는 아미노)를 갖는 본원에 언급된 화합물 또는 임의의 중간체로부터, 바람직하게는 유기 또는 무기 산과의 산 부가염으로서, 특히 제약상 허용되는 염으로서 형성된다. 적합한 무기 산은, 예를 들어 할로겐산, 예컨대 염산, 황산 또는 인산이다. 적합한 유기산은, 예를 들어 카르복실산, 포스폰산, 술폰산 또는 술팜산, 예를 들어 아세트산, 프로피온산, 락트산, 푸마르산, 숙신산, 시트르산, 아미노산, 예컨대 글루탐산 또는 아스파르트산, 말레산, 히드록시말레산, 메틸말레산, 벤조산, 메탄- 또는 에탄-술폰산, 에탄-1,2-디술폰산, 벤젠술폰산, 2-나프탈렌술폰산, 1,5-나프탈렌-디술폰산, N-시클로헥실술팜산, N-메틸-, N-에틸- 또는 N-프로필-술팜산, 또는 기타 유기 프로톤산, 예컨대 아스코르브산이다.
음으로 하전된 라디칼, 예컨대 카르복시 또는 술포의 존재 하에, 염은 또한 염기와 함께 형성될 수 있고, 예를 들어 금속 또는 암모늄 염, 예컨대 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 마그네슘 또는 칼슘 염, 또는 암모니아 또는 적합한 유기 아민, 예를 들어 트리에틸아민 또는 트리(2-히드록시에틸)아민, N-에틸-피페리딘, N,N'-디메틸피페라진, t-부틸아민, n-부틸아민, 페닐에틸아민, 디시클로헥실아민 또는 시클로헥실아민과의 암모늄 염이 있다.
염기성 기 및 산성 기가 동일한 분자 내에 존재할 경우에, 본원에 언급된 임의의 중간체는 내부 염을 또한 형성할 수 있다.
본원에 언급된 임의의 중간체의 단리 또는 정제 목적으로 제약상 허용되지 않는 염, 예를 들어 피크레이트 또는 퍼클로레이트를 또한 사용할 수 있다.
바람직한 염 형태는, 예를 들어 산 부가염을 포함한다. 또한, 1개 이상의 산 기 (예를 들어 COOH 또는 5-테트라졸릴)를 갖는 화합물은 염기와 염을 형성할 수 있다. 적합한 염기와의 염은, 예를 들어 금속 염, 예컨대 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 칼슘 또는 마그네슘 염, 또는 암모니아 또는 유기 아민, 예컨대 모르폴린, 티오모르폴린, 피페리딘, 피롤리딘, 모노-, 디- 또는 트리-저급 알킬아민, 예를 들어 에틸-, tert-부틸-, 디에틸-, 디이소프로필-, 트리에틸-, 트리부틸- 또는 디메틸프로필아민, 또는 모노-, 디- 또는 트리히드록시 저급 알킬아민, 예를 들어 모노-, 디- 또는 트리-에탄올아민과의 염이다. 또한, 상응하는 내부 염이 형성될 수 있다. 제약 용도로는 부적합하지만, 유리 화합물 I 또는 그의 제약상 허용되는 염의 단리 또는 정제에 사용될 수 있는 염이 또한 포함된다. 가장 바람직하게는 화학식 IV의 염은 캄포르술폰산 염이다.
특히, 용어 "화학식 IV의 화합물의 염"은, 예를 들어 그의 아민 염, 그의 알칼리 염 또는 그의 알칼리 토금속 염 (예를 들어 나트륨 염, 칼륨 염, 칼슘 염, 마그네슘 염 등)을 지칭한다. 특히, 표현 "그의 아민 염"에서의 용어 "아민"은, 예를 들어 화학식 IV의 화합물의 아민 염을 지칭할 경우에, 화학식 NR9R10R11의 3급 아민, 화학식 NHR9R10R의 2급 아민 또는 화학식 NH2R9의 1급 아민을 의미하고, 여기서 R9, R10 및 R11은, 서로 독립적으로, 본원에 정의된 바와 같은 알킬, 아릴, 시클로알킬 또는 헤테로시클릴, 바람직하게는 알킬 또는 시클로알킬이다. 용어 "아민"은, 예를 들어 디페닐아민, 디이소프로필아민, 디메틸아민, 트리에틸아민, 디이소프로필에틸아민, 디시클로헥실아민, t-부틸아민, n-부틸아민 또는 시클로헥실아민, 특히, t-부틸아민, n-부틸아민 또는 시클로헥실아민, 보다 바람직하게는 n-부틸아민 또는 시클로헥실아민이다.
본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에 사용된 단수형은 문맥이 달리 명백히 나타내지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "폴리펩티드"에 대한 언급은 하나 초과의 폴리펩티드를 포함한다.
유사하게, "포함하다", "포함한다" 및 "포함하는"은 서로 구별 없이 사용되며 제한하는 것으로 의도되는 것은 아니다.
다양한 실시양태의 기재에서 "포함하는"의 용어가 사용된 경우에, 당업자는 일부 특정한 예에서는 실시양태가 "로 본질적으로 이루어진" 또는 "로 이루어진"의 표현을 사용하여 다르게 기재될 수 있음을 이해할 것임이 추가로 이해되어야 한다.
도면을 포함하여 상기 일반적 설명 및 하기 상세한 설명은 둘 다 단지 예시적이고 설명적인 것이고, 본 개시내용을 제한하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본원에서 사용된 섹션의 제목은 단지 구성상의 목적을 위한 것이지, 기재된 대상을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
유전학적으로 코딩된 아미노산에 대해 사용된 약어는 통상적인 것이며, 다음과 같다:
3-문자의 약어가 사용된 경우에, "L" 또는 "D"가 구체적으로 선행되지 않거나 또는 약어가 사용된 문맥으로부터 분명하지 않다면, 아미노산은 α-탄소 (Cα)에 대해 L- 또는 D-배위로 있을 수 있다. 예를 들어 "Ala"는 α-탄소에 대해 배위를 명시하지 않고 알라닌을 지정하는 것이며, "D-Ala" 및 "L-Ala"는 각각 D-알라닌 및 L-알라닌을 지정한다. 1-문자의 약어가 사용된 경우에, 대문자는 α-탄소에 대해 L-배위의 아미노산을 지정하고, 소문자는 α-탄소에 대해 D-배위의 아미노산을 지정한다. 예를 들어 "A"는 L-알라닌을 지정하고, "a"는 D-알라닌을 지정한다. 폴리펩티드 서열이 일련의 1-문자 또는 3-문자 약어 (또는 그의 혼합)로 표시되는 경우에, 서열은 통상의 관습에 따라 아미노 (N)에서 카르복시 (C) 방향으로 표시된다.
유전자 코딩 뉴클레오시드에 사용되는 약어는 통상적이며, 다음과 같다: 아데노신 (A); 구아노신 (G); 시티딘 (C); 티미딘 (T); 및 우리딘 (U). 구체적으로 기재되지 않는 한, 약어로 기재된 뉴클레오티드는 리보뉴클레오시드 또는 2'-데옥시리보뉴클레오시드일 수 있다. 뉴클레오시드는 개별적 기준으로 또는 집합적 기준으로 리보뉴클레오시드 또는 2'-데옥시리보뉴클레오시드로 언급될 수 있다. 핵산 서열이 일련의 1-문자 약어로 표시되는 경우에, 서열은 통상의 관습에 따라 5'에서 3' 방향으로 표시되며, 포스페이트는 표기되지 않는다.
본 개시내용에 관하여, 본원의 상세한 설명에 사용된 기술 및 과학 용어는, 달리 구체적으로 정의되지 않는 한, 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 따라서, 하기 용어는 하기 의미를 지니도록 의도된다:
"단백질", "폴리펩티드" 및 "펩티드"는 길이 또는 번역후 변형 (예를 들어 글리코실화, 인산화, 지질화, 미리스틸화, 유비퀴틴화 등)과 관계없이, 아미드 결합에 의해 공유적으로 연결된 2개 이상의 아미노산의 중합체를 나타내는 것으로 본원에서 교환가능하게 사용된다. 이러한 정의에는 D- 및 L-아미노산, 및 D- 및 L-아미노산 혼합물이 포함된다.
"폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 공유적으로 함께 연결된 2개 이상의 뉴클레오시드를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 전적으로 리보뉴클레오시드 (즉, RNA), 전적으로 2' 데옥시리보뉴클레오티드 (즉, DNA) 또는 리보- 및 2' 데옥시리보뉴클레오티드의 혼합물로 구성될 수 있다. 뉴클레오시드는 전형적으로 표준 포스포디에스테르 연결을 통해 함께 연결될 수 있을 것인 반면, 폴리뉴클레오티드는 1개 이상의 비-표준 연결을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있거나, 또는 단일-가닥 영역 및 이중-가닥 영역을 둘 다 포함할 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 자연 발생 코딩 핵염기 (즉, 아데닌, 구아닌, 우라실, 티민 및 시토신)로 구성될 것이지만, 이는 1개 이상의 변형 및/또는 합성 핵염기, 예컨대, 예를 들어 이노신, 크산틴, 하이포크산틴 등을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 변형 또는 합성 핵염기는 코딩 핵염기일 것이다.
"아미노트랜스퍼라제" 및 "트랜스아미나제"는 1급 아민으로부터 아미노 기 (NH2)를 수용자 분자의 카르보닐 기 (C=O)로 전달하는 효소능을 갖는 폴리펩티드를 지칭하는데 본원에서 교환가능하게 사용된다. 본원에 사용된 트랜스아미나제에는 자연 발생 (야생형) 트랜스아미나제 뿐만 아니라 인간의 조작에 의해 생성된, 비-자연 발생 조작된 폴리펩티드도 포함된다.
"아미노 수용자" 및 "아민 수용자", "케토 기재", "케토" 및 "케톤"은 공여자 아민으로부터 아미노 기를 수용하는 카르보닐 (케토 또는 케톤) 화합물을 지칭하는 것으로 본원에서 교환가능하게 사용된다. 일부 실시양태에서, 아미노 수용자는 하기 화학식의 분자이다.
상기 식에서 각각의 Rα 및 Rβ는 독립적으로, 알킬, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴이며, 이는 비치환되거나 또는 1개 이상의 효소적으로 수용가능한 기에 의해 치환될 수 있다. Rα는 구조 또는 키랄성에서 Rβ와 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, Rα 및 Rβ는 함께, 비치환된, 치환된, 또는 다른 고리에 융합된 고리를 형성할 수 있다. 아미노 수용자는 케토 카르복실산 및 알카논 (케톤)을 포함한다. 전형적인 케토 카르복실산은 α-케토 카르복실산, 예컨대 글리옥살산, 피루브산, 옥살로아세트산 등, 뿐만 아니라 이들 산의 염이다. 아미노 수용자는 또한 다른 효소 또는 전세포 과정에 의해 아미노 수용자로 전환되는 물질, 예컨대 푸마르산 (옥살로아세트산으로 전환될 수 있음), 글루코스 (피루베이트로 전환될 수 있음), 락테이트, 말레산 등을 포함한다. 사용될 수 있는 아미노 수용자는, 예로서 제한없이, 3,4-디히드로나프탈렌-1(2H)-온, 1-페닐부탄-2-온, 3,3-디메틸부탄-2-온, 옥탄-2-온, 에틸 3-옥소부타노에이트, 4-페닐부탄-2-온, 1-(4-브로모페닐)에타논, 2-메틸-시클로헥사몬, 7-메톡시-2-테트랄론, 1-히드록시부탄-2-온, 피루브산, 아세토페논, 3'-히드록시아세토페논, 2-메톡시-5-플루오로아세토페논, 레불린산, 1-페닐프로판-1-온, 1-(4-브로모페닐)프로판-1-온, 1-(4-니트로페닐)프로판-1-온, 1-페닐프로판-2-온, 2-옥소-3-메틸부탄산, 1-(3-트리플루오로메틸페닐)프로판-1-온, 히드록시프로파논, 메톡시옥시프로파논, 1-페닐부탄-1-온, 1-(2,5-디메톡시-4-메틸페닐)부탄-2-온, 1-(4-히드록시페닐)부탄-3-온, 2-아세틸나프탈렌, 페닐피루브산, 2-케토글루타르산 및 2-케토숙신산 (가능한 경우에 (R) 및 (S) 단일 이성질체를 둘 다 포함함)을 포함한다.
"아미노 공여자" 또는 "아민 공여자"는 아미노 기를 아미노 수용자에게 공여함으로써 카르보닐 종이 되는 아미노 화합물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 아미노 공여자는 하기 화학식의 분자이고
상기 식에서 각각의 Rε 및 Rδ는 독립적으로, 알킬, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴이며, 이는 비치환되거나 또는 1개 이상의 효소적 비-억제 기에 의해 치환된다. Rε는 구조 또는 키랄성에서 Rδ와 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, Rε 및 Rδ는 함께, 비치환되거나, 치환되거나, 또는 다른 고리에 융합되는 고리를 형성할 수 있다. 사용될 수 있는 전형적인 아미노 공여자는 키랄 및 비키랄 아미노산 및 키랄 및 비키랄 아민을 포함한다. 사용될 수 있는 아미노 공여자는, 예로서 제한없이, 이소프로필아민 (또한 2-아미노프로판으로 지칭됨), α-페네틸아민 (또한 1-페닐에탄아민으로 지칭됨), 및 그의 거울상이성질체 (S)-1-페닐에탄아민 및 (R)-1-페닐에탄아민, 2-아미노-4-페닐부탄, 글리신, L-글루탐산, L-글루타메이트, 일나트륨 글루타메이트, L-알라닌, D-알라닌, D,L-알라닌, L-아스파르트산, L-리신, D,L-오르니틴, β-알라닌, 타우린, n-옥틸아민, 시클로헥실아민, 1,4-부탄디아민 (또한 푸트레신으로 지칭됨), 1,6-헥산디아민, 6-아미노헥산산, 4-아미노부티르산, 티라민, 및 벤질 아민, 2-아미노부탄, 2-아미노-1-부탄올, 1-아미노-1-페닐에탄, 1-아미노-1-(2-메톡시-5-플루오로페닐)에탄, 1-아미노-1-페닐프로판, 1-아미노-1-(4-히드록시페닐)프로판, 1-아미노-1-(4-브로모페닐)프로판, 1-아미노-1-(4-니트로페닐)프로판, 1-페닐-2-아미노프로판, 1-(3-트리플루오로메틸페닐)-2-아미노프로판, 2-아미노프로파놀, 1-아미노-1-페닐부탄, 1-페닐-2-아미노부탄, 1-(2,5-디메톡시-4-메틸페닐)-2-아미노부탄, 1-페닐-3-아미노부탄, 1-(4-히드록시페닐)-3-아미노부탄, 1-아미노-2-메틸시클로펜탄, 1-아미노-3-메틸시클로펜탄, 1-아미노-2-메틸시클로헥산, 1-아미노-1-(2-나프틸)에탄, 3-메틸시클로펜틸아민, 2-메틸시클로펜틸아민, 2-에틸시클로펜틸아민, 2-메틸시클로헥실아민, 3-메틸시클로헥실아민, 1-아미노테트랄린, 2-아미노테트랄린, 2-아미노-5-메톡시테트랄린 및 1-아미노인단 (가능한 경우에 (R) 및 (S) 단일 이성질체를 둘 다 포함하고, 아민의 모든 가능한 염을 포함함)을 포함한다.
"키랄 아민"은 화학식 R1-CH(NH2)-R1의 아민을 지칭하고, 본원에서, 수소 원자 이외에도 (i) 키랄 시클릭 구조를 형성하는 2가 기, 또는 (ii) 서로 구조 또는 키랄성이 상이한 2개의 치환기 (수소 이외의 것)를 운반하는, 2급 탄소 원자에 결합된 1급 아미노 기의 존재를 특징으로 하는, 상이하고 혼합된 관능 유형의 매우 다양한 지방족 및 지환족 화합물을 포함하는 가장 넓은 의미로 사용된다. 키랄 시클릭 구조를 형성하는 2가 기는, 예를 들어 2-메틸부탄-1,4-디일, 펜탄-1,4-디일, 헥산-1,4-디일, 헥산-1,5-디일, 2-메틸펜탄-1,5-디일을 포함한다. 2급 탄소 원자 상의 2개의 상이한 치환기 (상기 R1 및 R2)는 또한 매우 다양할 수 있고, 알킬, 아르알킬, 아릴, 할로, 히드록시, 저급 알킬, 저급 알콕시, 저급 알킬티오, 시클로알킬, 카르복시, 카르브알콕시, 카르바모일, 모노- 및 디-(저급 알킬) 치환된 카르바모일, 트리플루오로메틸, 페닐, 니트로, 아미노, 모노- 및 디-(저급 알킬) 치환된 아미노, 알킬술포닐, 아릴술포닐, 알킬카르복스아미도, 아릴카복스아미도 등, 뿐만 아니라 상기에 의해 치환된 알킬, 아르알킬 또는 아릴을 포함한다.
"피리독살-포스페이트", "PLP", "피리독살-5'-포스페이트", "PYP" 및 "P5P"는 트랜스아미나제 반응에서 조효소로서 작용하는 화합물을 지칭하는 것으로 본원에서 교환가능하게 사용된다. 일부 실시양태에서, 피리독살 포스페이트는 구조식 1-(4'-포르밀-3'-히드록시-2'-메틸-5'-피리딜)메톡시포스폰산, CAS 번호 [54-47-7]로 정의되고, 피리독살-5'-포스페이트는 피리독솔 (또한 비타민 B6로 공지됨)의 인산화 및 산화에 의해 생체내에서 생성될 수 있다. 트랜스아미나제 효소를 사용하는 아미노교환 반응에서, 아미노 공여자의 아민 기는 조효소로 전달되어 케토 부산물이 생성되고, 피리독살-5'-포스페이트는 피리독사민 포스페이트로 전환된다. 피리독살-5'-포스페이트는 다양한 케토 화합물 (아미노 수용자)과의 반응에 의해 재생된다. 피리독사민 포스페이트에서 아미노 수용자로의 아민 기의 전달은 키랄 아민을 생성하고, 조효소를 재생한다. 일부 실시양태에서, 피리독살-5'-포스페이트는 피리독신 (PN), 피리독살 (PL), 피리독사민 (PM) 및 그의 인산화 대응물; 피리독신 포스페이트 (PNP) 및 피리독사민 포스페이트 (PMP)를 비롯한 비타민 B6 패밀리의 다른 구성원에 의해 대체될 수 있다.
"코딩 서열"은 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 부분 (예를 들어 유전자)을 지칭한다.
"자연 발생" 또는 "야생형"은 자연에서 발견되는 형태를 지칭한다. 예를 들어 자연 발생 또는 야생형 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 천연 공급원으로부터 단리될 수 있고 인간의 조작에 의해 고의적으로 변형되지 않은 유기체 내에 존재하는 서열이다.
"재조합" 또는 "조작된" 또는 "비-자연 발생"은 예를 들어 세포, 핵산 또는 폴리펩티드와 관련하여 사용되는 경우에, 자연에 존재하지 않을 방식으로 변형된, 또는 천연 또는 본래 형태의 물질과 동일하지만 합성 물질로부터 및/또는 재조합 기술을 사용하는 조작에 의해 생성 또는 유래된 물질, 또는 천연 또는 본래 형태의 물질에 상응하는 물질을 지칭한다. 비제한적 예는, 특히 본래 (비-재조합) 형태의 세포에서는 발견되지 않는 유전자를 발현하거나 또는 본래 유전자를 달리 상이한 수준으로 발현하는 재조합 세포를 포함한다.
"서열 동일성의 백분율" 및 "백분율 상동성"은 폴리뉴클레오티드들 및 폴리펩티드들 간의 비교를 지칭하는 것으로 본원에서 교환가능하게 사용되고, 비교 윈도우에서 최적으로 정렬된 2개의 서열을 비교함으로써 결정되며, 여기서 2개의 서열의 최적의 정렬을 위해 비교 윈도우 내의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 일부분은 참조 서열과 비교하여 부가 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 양쪽 서열에서 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 발생하는 위치의 개수를 결정하여 매칭되는 위치의 개수를 산출하고, 매칭되는 위치의 개수를 비교 윈도우 내의 위치의 전체 개수로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 백분율이 계산될 수 있다. 대안적으로, 양쪽 서열에서 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 발생하거나 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 갭과 함께 정렬되는 위치의 개수를 결정하여 매칭되는 위치의 개수를 산출하고, 매칭되는 위치의 개수를 비교 윈도우 내의 위치의 전체 개수로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 백분율이 계산될 수 있다. 당업자는 2개의 서열을 정렬하는데 이용할 수 있는 다수의 확립된 알고리즘이 있음을 이해한다. 비교를 위한 서열들의 최적의 정렬은, 예를 들어 [Smith and Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482]의 국소 상동성 알고리즘에 의해, [Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443]의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, [Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444]의 유사성 방법에 대한 검색에 의해, 이러한 알고리즘들의 컴퓨터화된 실행 (GCG 위스콘신 소프트웨어 패키지(Wisconsin Software Package) 내의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA)에 의해, 또는 육안 검사에 의해 실행될 수 있다 (일반적으로, [Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (1995 Supplement) (Ausubel)] 참조). 퍼센트 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하기에 적합한 알고리즘들의 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이고, 이들은 [Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410, 및 Altschul et al., 1977, Nucleic Acids Res. 3389-3402]에 각각 기재되어 있다. BLAST 분석을 실행하기 위한 소프트웨어는 미국 국립 생물 정보 센터의 웹사이트로부터 공개적으로 입수가능하다. 상기 알고리즘은 먼저 데이터베이스 서열 내 동일한 길이의 워드와 정렬하였을 때 어떠한 양의 값의 역치 점수 T에 매칭되거나 이를 충족시키는, 질의 서열 내의 길이 W의 짧은 워드들을 확인함으로써 높은 점수의 서열 쌍 (HSP)을 확인하는 것을 포함한다. T는 이웃 워드 점수 역치로 지칭된다 (Altschul et al., 상기 문헌). 이들 초기 이웃 워드 히트는 이것을 함유하는 보다 긴 HSP를 찾는 검색을 개시하기 위한 시드로 작용한다. 그후, 누적 정렬 점수가 증가될 수 있는 만큼 각각의 서열을 따라 양쪽 방향으로 워드 히트가 확장된다. 누적 점수는 뉴클레오티드 서열에 대해 파라미터 M (매치 잔기의 쌍에 대한 보상 점수; 항상 >0) 및 N (미스매치 잔기에 대한 패널티 점수, 항상 <0)을 사용하여 계산된다. 아미노산 서열의 경우에는 점수화 매트릭스를 이용하여 누적 점수를 계산한다. 누적 정렬 점수가 그의 최대 달성 값으로부터 X의 양만큼 하락하거나; 1개 이상의 음의 값으로 점수화된 잔기 정렬의 축적으로 인해 누적 점수가 0 이하로 떨어지거나; 또는 어느 한쪽의 서열의 끝에 도달한 경우에, 각 방향으로의 워드 히트의 연장이 중단된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X는 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램 (뉴클레오티드 서열용)은 디폴트로서 워드길이 (W) 11, 기대값 (E) 10, M=5, N=-4, 및 양쪽 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열용으로, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 워드 길이 (W) 3, 기대값 (E) 10, 및 BLOSUM62 점수화 매트릭스 ([Henikoff and Henikoff, 1989, Proc Natl Acad Sci USA 89:10915] 참조)를 사용한다. 서열 정렬 및 % 서열 동일성의 예시적인 측정법은, 제공된 디폴트 파라미터를 사용하여, GCG 위스콘신 소프트웨어 패키지 (엑셀리스(Accelrys), 위스콘신주 매디슨) 내의 BESTFIT 또는 GAP 프로그램을 사용할 수 있다.
"참조 서열"은 서열 비교를 위한 기준으로 사용되는 규정된 서열을 지칭한다. 참조 서열은 더 큰 서열의 하위세트, 예를 들어 전장 유전자 또는 폴리펩티드 서열의 절편일 수 있다. 일반적으로, 참조 서열은 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 20개 이상의 길이, 잔기 25개 이상의 길이, 잔기 50개 이상의 길이, 또는 전장 핵산 또는 폴리펩티드이다. 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 각각 (1) 2개의 서열 간에 유사한 서열 (즉, 완전한 서열의 일부분)을 포함할 수 있고, (2) 2개의 서열 간에 다른 서열을 추가로 포함할 수 있기 때문에, 2개 (또는 그 초과) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 간의 서열 비교는 전형적으로 "비교 윈도우"에서 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열을 비교하여 서열 유사성 영역을 확인 및 비교함으로써 실행된다. 일부 실시양태에서, "참조 서열"은 1차 아미노산 서열을 기반으로 할 수 있고, 여기서 참조 서열은 1차 서열에서 1개 이상의 변경을 가질 수 있는 서열이다. 예를 들어 "X14에 상응하는 잔기에서 발린을 갖는 서열 4를 기반으로 하는 참조 서열" 또는 X14V는 서열 4의 X14에 상응하는 잔기 (티로신)가 발린으로 변경된 참조 서열을 지칭한다.
"비교 윈도우"은 약 20개 이상의 인접 뉴클레오티드 위치 또는 아미노산 잔기의 개념적인 절편을 지칭하고, 여기서 서열은 20개 이상의 인접 뉴클레오티드 또는 아미노산의 참조 서열과 비교될 수 있으며, 비교 윈도우 내의 서열의 일부분은 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 참조 서열 (부가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 20% 이하의 부가 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 비교 윈도우는 20개보다 긴 인접한 잔기일 수 있고, 임의로 30, 40, 50, 100개 또는 그보다 긴 윈도우를 포함한다.
"실질적 동일성"은 20개 이상의 잔기 위치의 비교 윈도우, 종종 30-50개 이상의 잔기의 윈도우에서 참조 서열과 비교하여 80 퍼센트 이상의 서열 동일성, 85 퍼센트 이상의 동일성, 및 89 내지 95 퍼센트 이상의 서열 동일성, 보다 통상적으로는 99 퍼센트 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열을 지칭하고, 여기서 서열 동일성의 백분율은 비교 윈도우에서 총계가 참조 서열의 20 퍼센트 이하인 결실 또는 부가를 포함하는 서열에 참조 서열을 비교함으로써 계산된다. 폴리펩티드에 적용되는 구체적 실시양태에서, 용어 "실질적 동일성"은 2개의 폴리펩티드 서열이, 예컨대 디폴트 갭 폭을 사용하여 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해 최적으로 정렬되었을 때, 80 퍼센트 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 89 퍼센트 이상의 서열 동일성, 95 퍼센트 이상의 서열 동일성 또는 그 초과의 서열 동일성 (예를 들어 99 퍼센트 서열 동일성)을 공유하는 것을 의미한다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 상이하다.
주어진 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 넘버링과 관련하여 사용되는 경우의 "에 상응하는", "를 참조하여" 또는 "와 관련하여"는 주어진 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열이 참조 서열과 비교될 때 특정 참조 서열의 잔기의 넘버링을 지칭한다. 달리 말하면, 주어진 중합체의 잔기 번호 또는 잔기 위치는 주어진 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열 내에서의 잔기의 실제 수적 위치에 의해서 보다는 참조 서열에 대하여 지정된다. 예를 들어, 갭을 도입하여 2개의 서열 간의 잔기 매치를 최적화함으로써 주어진 아미노산 서열, 예컨대 조작된 트랜스아미나제의 서열이 참조 서열에 대해 정렬될 수 있다. 이 경우에, 갭이 존재하더라도, 주어진 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열 내의 잔기의 넘버링은 함께 정렬되는 참조 서열에 대해 이루어진다.
"아미노산 차이" 또는 "잔기 차이"는 참조 서열에서 상응하는 위치의 아미노산 잔기와 관련하여 폴리펩티드 서열 위치에서의 아미노산 잔기의 변화를 지칭한다. 아미노산 차이의 위치는 일반적으로 본원에서 "Xn"으로 지칭되며, 여기서 n은 잔기 차이의 기초가 되는 참조 서열 내 상응하는 위치를 지칭한다. 예를 들어 "서열 4와 비교하여 위치 X14에서의 잔기 차이"는 서열 4의 위치 14에 상응하는 폴리펩티드 위치에서의 아미노산 잔기의 변화를 지칭한다. 따라서, 서열 4의 참조 폴리펩티드가 위치 14에서 티로신을 갖는 경우에, "서열 4와 비교하여 위치 X14에서의 잔기 차이"는 서열 4의 위치 14에 상응하는 폴리펩티드의 위치에서 티로신이 아닌 임의의 잔기의 아미노산 치환을 지칭한다. 본원의 대부분의 예에서, 위치에서의 특정 아미노산 잔기 차이는 "XnY"로 표시되고, 여기서 "Xn"은 상기한 바와 같이 상응하는 위치를 나타내는 것이고, "Y"는 조작된 폴리펩티드에서 발견된 아미노산 (즉, 참조 폴리펩티드와 다른 잔기)의 단일 문자 식별자이다. 일부 실시양태에서, 명시된 잔기 위치 내에 1개 초과의 아미노산이 존재할 수 있고, 대안적 아미노산은 XnY/Z의 형태로 열거될 수 있으며, 여기서 Y 및 Z는 대안적 아미노산 잔기를 나타낸다. 일부 경우 (예를 들어 표 2A 및 2B)에서, 본 개시내용은 또한 종래 표기법 "AnB"로 표시되는 특정 아미노산 차이를 제공하고, 여기서 A는 참조 서열 내 잔기의 단일 문자 식별자이며, "n"은 참조 서열 내 잔기 위치의 번호이고, B는 조작된 폴리펩티드의 서열 내 잔기 치환의 단일 문자 식별자이다. 또한, 일부 경우에서, 본 개시내용의 폴리펩티드는 참조 서열과 관련하여 1개 이상의 아미노산 잔기 차이를 포함할 수 있고, 이는 참조 서열과 관련하여 변화가 생긴 명시된 위치의 목록으로 표시된다. 본 개시내용은 보존적 및 비-보존적 아미노산 치환 중 어느 하나/또는 둘 모두를 포함하는 1개 이상의 아미노산 차이를 포함하는 조작된 폴리펩티드 서열을 포함한다.
"보존적 아미노산 치환"은 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 상이한 잔기로 치환된 것을 지칭하고, 따라서 전형적으로 폴리펩티드 내의 아미노산이 동일하거나 유사한 규정된 아미노산 클래스의 아미노산으로 치환되는 것을 수반한다. 예로서 제한없이, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산은 또 다른 지방족 아미노산, 예를 들어 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신으로 치환될 수 있고; 히드록실 측쇄를 갖는 아미노산은 또 다른 히드록실 측쇄를 갖는 아미노산, 예를 들어 세린 및 트레오닌으로 치환되고; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산은 또 다른 방향족 측쇄를 갖는 아미노산, 예를 들어 페닐알라닌, 티로신, 트립토판 및 히스티딘으로 치환되고; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산은 또 다른 염기성 측쇄를 갖는 아미노산, 예를 들어 리신 및 아르기닌으로 치환되고; 산성 측쇄를 갖는 아미노산은 또 다른 산성 측쇄를 갖는 아미노산, 예를 들어 아스파르트산 또는 글루탐산으로 치환되고; 소수성 또는 친수성 아미노산은 각각 또 다른 소수성 또는 친수성 아미노산으로 대체된다. 예시적인 보존적 치환을 하기 표 1에 제공한다.
<표 1>
"비-보존적 치환"은 폴리펩티드 내의 아미노산이 유의하게 다른 측쇄 특성을 갖는 아미노산으로 치환된 것을 지칭한다. 비-보존적 치환은 규정된 그룹 내 보다는 규정된 그룹들 사이의 아미노산을 이용할 수 있고, (a) 치환 영역 내의 펩티드 골격의 구조 (예를 들어 프롤린 대 글리신), (b) 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 크기에 영향을 미친다. 예로서 제한없이, 예시적인 비-보존적 치환은 산성 아미노산이 염기성 또는 지방족 아미노산으로 치환된 것; 방향족 아미노산이 작은 아미노산으로 치환된 것; 및 친수성 아미노산이 소수성 아미노산으로 치환된 것일 수 있다.
"결실"은 참조 폴리펩티드로부터 1개 이상의 아미노산의 제거로 인한 폴리펩티드의 변형을 지칭한다. 결실은 효소적 활성을 유지하고/하거나 조작된 트랜스아미나제 효소의 개선된 특성은 유지하면서, 1개 이상의 아미노산, 2개 이상의 아미노산, 5개 이상의 아미노산, 10개 이상의 아미노산, 15개 이상의 아미노산, 또는 20개 이상의 아미노산, 아미노산 전체 개수의 10% 이하, 또는 참조 효소를 구성하는 아미노산 전체 개수의 20% 이하를 제거하는 것을 포함할 수 있다. 결실은 폴리펩티드의 내부 부분 및/또는 말단 부분에 대해 지시될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 결실은 연속 절편을 포함할 수 있거나, 또는 불연속적일 수 있다.
"삽입"은 참조 폴리펩티드로부터 1개 이상의 아미노산의 추가에 의한 폴리펩티드의 변형을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 개선된 조작된 트랜스아미나제 효소는 자연 발생 트랜스아미나제 폴리펩티드에 대한 1개 이상의 아미노산의 삽입, 뿐만 아니라 또 다른 개선된 트랜스아미나제 폴리펩티드에 대한 1개 이상의 아미노산의 삽입을 포함한다. 삽입은 폴리펩티드의 내부 부분 내에, 또는 카르복시 또는 아미노 말단에서 이루어질 수 있다. 본원에서 사용되는 삽입은 당업계에 공지된 바와 같은 융합 단백질을 포함한다. 삽입은 아미노산의 연속 절편일 수 있거나, 또는 자연 발생 폴리펩티드 내의 아미노산 중 1개 이상에 의해 분리될 수 있다.
본원에서 사용된 "단편"은 아미노-말단 및/또는 카르복시-말단 결실을 갖지만 나머지 아미노산 서열이 서열 내의 상응하는 위치와 동일한 폴리펩티드를 지칭한다. 단편은 아미노산 14개 이상, 아미노산 20개 이상, 아미노산 50개 이상 또는 그보다 길 수 있고, 전장 트랜스아미나제 폴리펩티드, 예를 들어 서열 2의 폴리펩티드 또는 서열 34의 조작된 트랜스아미나제의 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 및 99% 이하일 수 있다.
"단리된 폴리펩티드"는 자연적으로 동반되는 다른 오염물, 예를 들어 단백질, 지질 및 폴리뉴클레오티드로부터 실질적으로 분리된 폴리펩티드를 지칭한다. 이러한 용어는 그의 자연 발생 환경 또는 발현 시스템 (예를 들어 숙주 세포 또는 시험관내 합성)으로부터 제거 또는 정제된 폴리펩티드를 포괄한다. 개선된 트랜스아미나제 효소는 세포 내에 존재할 수 있거나, 세포 배지 내에 존재할 수 있거나, 또는 용해물 또는 단리된 제제와 같은 다양한 형태로 제조될 수 있다. 이에 따라, 일부 실시양태에서, 개선된 트랜스아미나제 효소는 단리된 폴리펩티드일 수 있다.
"실질적으로 순수한 폴리펩티드"는 폴리펩티드 종이 우세하게 존재하는 종 (즉, 몰 또는 중량 기준으로 조성물 내의 임의의 다른 개별적인 거대분자 종보다 더 풍부함)인 조성물을 지칭하고, 일반적으로, 몰 또는 중량% 기준으로 대상 종이 존재하는 거대분자 종들의 약 50% 이상을 구성하는 경우에 실질적으로 정제된 조성물이다. 일반적으로, 실질적으로 순수한 트랜스아미나제 조성물은 몰 또는 중량% 기준으로 조성물 내에 존재하는 모든 거대분자 종들의 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 98% 이상을 구성할 것이다. 일부 실시양태에서, 대상 종은 조성물이 본질적으로 단일 거대분자 종으로 이루어진 본질적인 균질성 (즉, 통상적인 검출 방법에 의해 오염물 종이 조성물 내에서 검출될 수 없음)으로 정제된다. 용매 종, 소분자 (＜500 달톤), 및 원소 이온 종은 거대분자 종으로 고려되지 않는다. 일부 실시양태에서, 단리된 개선된 트랜스아미나제 폴리펩티드는 실질적으로 순수한 폴리펩티드 조성물이다.
"입체선택성"은 화학 또는 효소적 반응에서 하나의 입체이성질체가 또 다른 입체이성질체에 비해 우선적으로 형성되는 것을 지칭한다. 입체선택성은 하나의 입체이성질체의 형성이 다른 입체이성질체에 비해 선호되는 경우에 부분적일 수 있거나, 또는 하나의 입체이성질체만 형성되는 경우에 완전할 수 있다. 입체이성질체가 거울상이성질체인 경우에, 입체선택성은 양쪽 거울상이성질체의 합계 중 하나의 거울상이성질체의 분율 (전형적으로 백분율로 보고됨)인 거울상선택성으로 지칭된다. 대안적으로, 이는 [주요 거울상이성질체 - 부차적 거울상이성질체]/[주요 거울상이성질체 + 부차적 거울상이성질체]의 식에 따라 계산된 거울상이성질체 과잉률 (e.e.)로 당업계에서 통상적으로 보고된다 (전형적으로, 백분율). 입체이성질체가 부분입체이성질체인 경우에, 입체선택성은 2개의 부분입체이성질체의 혼합물 내의 하나의 부분입체이성질체의 분율 (전형적으로 백분율로 보고됨)인 부분입체선택성으로 지칭되고, 대안적으로 부분입체이성질체 과잉률 (d.e.)로 통상적으로 보고된다. 거울상이성질체 과잉률 및 부분입체이성질체 과잉률은 입체이성질체 과잉률의 유형이다.
"고도로 입체선택적"은 약 85% 이상의 입체이성질체 과잉률로 기질, 예를 들어 화합물 IA를 그의 상응하는 키랄 아민 생성물, 예를 들어 화합물 IIA로 전환시킬 수 있는 화학적 또는 효소적 반응을 지칭한다.
"개선된 효소 특성"은 임의의 효소 특성에서 참조 트랜스아미나제와 비교하여 개선을 나타내는 트랜스아미나제 폴리펩티드를 지칭한다. 본원에 기재된 조작된 트랜스아미나제 폴리펩티드의 경우에, 일반적으로 야생형 트랜스아미나제 효소에 대한 비교가 이루어지지만, 일부 실시양태에서, 참조 트랜스아미나제는 또 다른 개선된 조작된 트랜스아미나제일 수 있다. 개선이 바람직한 효소 특성은 효소적 활성 (기질의 퍼센트 전환으로 표현될 수 있음), 열 안정성, 용매 안정성, pH 활성 프로파일, 보조인자 요건, 억제제 (예를 들어 기질 또는 생성물 억제)에 대한 내화성, 입체특이성 및 입체선택성 (거울상선택성 포함)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
"증가된 효소적 활성"은 참조 트랜스아미나제 효소와 비교하여 특정 활성 (예를 들어 생산된 생성물/시간/단백질 중량)에서의 증가 또는 기질의 생성물로의 퍼센트 전환 (예를 들어 지정된 기간 동안 지정된 양의 트랜스아미나제를 이용한, 출발량의 기질의 생성물로의 퍼센트 전환)에서의 증가에 의해 나타내어질 수 있는, 조작된 트랜스아미나제 폴리펩티드의 개선된 특성을 지칭한다. 효소 활성을 결정하는 예시적인 방법들이 실시예에서 제공된다. Km, Vmax 또는 kcat의 고전적인 효소 특성을 비롯한 효소 활성에 관한 임의의 특성이 영향을 받을 수 있고, 이러한 변화는 증가된 효소적 활성을 야기할 수 있다. 효소 활성에서의 개선은 트랜스아미나제 폴리펩티드가 유래된 자연 발생 트랜스아미나제 또는 또 다른 조작된 트랜스아미나제 보다 상응하는 야생형 트랜스아미나제의 효소적 활성의 약 1.2배에서 많게는 2배, 5배, 10배, 20배, 25배, 50배, 75배, 100배 또는 그 초과까지일 수 있다. 트랜스아미나제 활성은, 표준 검정 중 임의의 것에 의해, 예컨대 반응물 또는 생성물의 분광광도 특성에서의 변화를 모니터링함으로써 측정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 생성된 생성물의 양은, 예컨대 o-프탈디알데히드 (OPA)에 의한 유도체화 이후 UV 흡광도 또는 형광 검출과 조합된 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 분리에 의해 측정할 수 있다. 본원에서 상세하게 추가로 기재된 바와 같은, 규정된 효소 제제, 설정 조건 하에서의 규정된 검정, 및 1종 이상의 규정된 기질을 사용하여 효소 활성을 비교한다. 일반적으로, 용해물을 비교하는 경우에, 세포의 개수 및 검정되는 단백질의 양이 결정될 뿐만 아니라, 숙주 세포에 의해 생산되어 용해물 내에 존재하는 효소의 양에서의 변동을 최소화하기 위해 동일한 발현 시스템 및 동일한 숙주 세포가 사용된다.
"전환"은 기질(들)의 상응하는 생성물(들)로의 효소적 전환을 지칭한다. "퍼센트 전환"은 지정된 조건 하에 소정의 기간 내에 생성물로 전환된 기질의 퍼센트를 지칭한다. 따라서, 트랜스아미나제 폴리펩티드의 "효소적 활성" 또는 "활성"은 기질의 생성물로의 "퍼센트 전환"으로 표현될 수 있다.
"열안정성"은 소정의 기간 (예를 들어 0.5-24시간) 동안 상승된 온도 (예를 들어 40-80℃)에 노출된 후에 야생형 효소와 비교하여 유사한 활성 (예를 들어 60% 내지 80% 초과)을 유지하는 트랜스아미나제 폴리펩티드를 지칭한다.
"용매 안정성"은 소정의 기간 (예를 들어 0.5-24시간) 동안 다양한 농도 (예를 들어 5-99%)의 용매 (에탄올, 이소프로필 알콜, 디메틸술폭시드 (DMSO), 테트라히드로푸란, 2-메틸테트라히드로푸란, 아세톤, 톨루엔, 부틸 아세테이트, 메틸 tert-부틸 에테르 등)에 노출된 후에 야생형 효소와 비교하여 유사한 활성 (예를 들어 60% 내지 80% 초과)을 유지하는 트랜스아미나제 폴리펩티드를 지칭한다.
"열- 및 용매 안정성"은 열안정성이면서도 용매 안정성인 트랜스아미나제 폴리펩티드를 지칭한다.
"엄격한 혼성화"는 핵산 하이브리드가 안정적인 조건을 지칭하도록 본원에서 사용된다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 하이브리드의 안정성은 하이브리드의 용융 온도 (Tm)에 반영된다. 일반적으로, 하이브리드의 안정성은 이온 강도, 온도, G/C 함량, 및 카오트로픽제의 존재의 함수이다. 용융 온도를 예측하기 위한 공지된 방법을 사용하여 폴리뉴클레오티드에 대한 Tm 값을 계산할 수 있다 (예를 들어 [Baldino et al., Methods Enzymology 168:761-777; Bolton et al., 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:1390; Bresslauer et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci USA 83:8893-8897; Freier et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci USA 83:9373-9377; Kierzek et al., Biochemistry 25:7840-7846; Rychlik et al., 1990, Nucleic Acids Res 18:6409-6412] (정오표, 1991, Nucleic Acids Res 19:698); Sambrook et al., 상기 문헌; [Suggs et al., 1981, In Developmental Biology Using Purified Genes (Brown et al., eds.), pp. 683-693, Academic Press; 및 Wetmur, 1991, Crit Rev Biochem Mol Biol 26:227-259] 참조. 모든 간행물들은 본원에 참조로 포함됨). 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 본원에 개시된 폴리펩티드를 코딩하고, 규정된 조건, 예컨대 중등도로 엄격한 조건 또는 고도로 엄격한 조건 하에, 본 개시내용의 조작된 트랜스아미나제 효소를 코딩하는 서열의 상보물에 혼성화한다.
"혼성화 엄격도"는 핵산의 혼성화에 있어서 혼성화 조건, 예컨대 세척 조건과 관련된다. 일반적으로, 낮은 엄격도의 조건 하에 혼성화 반응이 실행된 후, 다양한 더 높은 엄격도의 세척이 이어진다. 용어 "중등도로 엄격한 혼성화"는 표적 DNA에 대해 약 60% 동일성, 바람직하게는 약 75% 동일성, 약 85% 동일성, 표적-폴리뉴클레오티드에 대해 약 90%를 초과하는 동일성을 갖는 상보적 핵산에 표적 DNA가 결합하도록 하는 조건을 지칭한다. 예시적인 중등도의 엄격한 조건은 42℃에서 50% 포름아미드, 5x 덴하르트 용액, 5xSSPE, 0.2% SDS에서의 혼성화에 이어서 42℃에서 0.2xSSPE, 0.2% SDS에서 세척하는 것과 등가인 조건이다. "고 엄격도 혼성화"는 규정된 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 용액 조건 하에 결정된 열 용융 온도 Tm으로부터 약 10℃ 이하인 조건을 일반적으로 지칭한다. 일부 실시양태에서, 고 엄격도 조건은 65℃에서 0.018M NaCl에서 안정한 하이브리드를 형성하는 핵산 서열에 대해서만 혼성화되도록 하는 조건을 지칭한다 (즉, 하이브리드가 65℃에서 0.018M NaCl에서 안정하지 않을 경우에, 본원에서 예상되는 바와 같이 고 엄격도 조건 하에 안정하지 않을 것이다). 예를 들어 42℃에서의 50% 포름아미드, 5x 덴하르트 용액, 5xSSPE, 0.2% SDS와 등가인 조건에서의 혼성화에 이어서 65℃에서 0.1xSSPE, 및 0.1% SDS에서 세척하는 것에 의해, 고 엄격도 조건이 제공될 수 있다. 또 다른 고 엄격도 조건은 65℃에서 0.1% (w:v) SDS를 함유하는 5X SSC에서 혼성화하고, 65℃에서 0.1% SDS를 함유하는 0.1x SSC에서 세척하는 것과 등가인 조건에서 혼성화하는 것이다. 또 다른 고 엄격도 혼성화 조건들, 뿐만 아니라 중등도의 엄격한 조건들이 상기 인용된 참고문헌에 기재되어 있다.
"이종" 폴리뉴클레오티드는 실험실 기술에 의해 숙주 세포 내로 도입된 임의의 폴리뉴클레오티드를 지칭하고, 숙주 세포로부터 제거되어 실험실 조작된 후, 숙주 세포 내로 재도입된 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
"코돈 최적화"는 코딩되는 단백질이 관심 유기체에서 효율적으로 발현되도록, 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 코돈이 특정한 유기체 내에서 우세하게 사용되는 것으로 바뀌는 것을 지칭한다. 대부분의 아미노산이 "동의어" 또는 "동의성" 코돈으로 불리는 여러 코돈에 의해 나타내어진다는 점에서 유전자 코드는 축중성이지만, 특정한 유기체에 의한 코돈 용법은 무작위적이지 않고 특정한 코돈 트리플렛으로 편향된다는 것이 널리 공지되어 있다. 이러한 코돈 용법 편향은 주어진 유전자, 공통적인 기능 또는 조상 기원의 유전자들, 고도로 발현되는 단백질 대 카피수가 낮은 단백질, 및 유기체의 게놈의 응집 단백질 코딩 영역에 관하여 더 높을 수 있다. 일부 실시양태에서, 트랜스아미나제 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 발현을 위해 선택된 숙주 유기체로부터의 최적의 생산을 위해 코돈 최적화될 수 있다.
"바람직한, 최적의, 코돈 용법 편향이 높은 코돈"은 동일한 아미노산을 코딩하는 다른 코돈들보다 단백질 코딩 영역에서 더 높은 빈도로 사용되는 코돈을 교환가능하게 지칭한다. 바람직한 코돈은 단일 유전자, 기능 또는 기원이 공통적인 유전자의 세트, 고도로 발현되는 유전자에서의 코돈 용법, 전체 유기체의 응집 단백질 코딩 영역에서의 코돈 빈도, 관련된 유기체들의 응집 단백질 코딩 영역에서의 코돈 빈도, 또는 이들의 조합과 관련하여 결정될 수 있다. 유전자 발현 수준과 함께 빈도가 증가하는 코돈이 전형적으로 발현을 위한 최적의 코돈이다. 예를 들어 클러스터 분석 또는 상응 분석을 사용하는 다변량 분석, 및 유전자에서 사용되는 코돈의 유효 개수를 포함하는, 특정한 유기체에서의 코돈 빈도 (예를 들어 코돈 용법, 상대적인 동의성 코돈 용법) 및 코돈 선호도를 결정하기 위한 다양한 방법들이 공지되어 있다 ([GCG CodonPreference, Genetics Computer Group Wisconsin Package; CodonW, John Peden, University of Nottingham; McInerney, J. O, 1998, Bioinformatics 14:372-73; Stenico et al., 1994, Nucleic Acids Res. 222437-46; Wright, F., 1990, Gene 87:23-29] 참조). 유기체의 성장 목록에 대한 코돈 용법 표가 이용가능하다 (예를 들어 [Wada et al., 1992, Nucleic Acids Res. 20:2111-2118; Nakamura et al., 2000, Nucl. Acids Res. 28:292; Duret, et al., 상기 문헌; Henaut and Danchin, "Escherichia coli and Salmonella," 1996, Neidhardt, et al. Eds., ASM Press, Washington D.C., p. 2047-2066] 참조). 코돈 용법을 수득하기 위한 데이터 공급원은 단백질을 코딩할 수 있는 임의의 이용가능한 뉴클레오티드 서열에 의존적일 수 있다. 이러한 데이터 세트는 발현된 단백질 (예를 들어 완전한 단백질 코딩 서열-CDS), 발현된 서열 태그 (ESTS), 또는 게놈 서열의 예상되는 코딩 영역을 코딩하는 것으로 실제로 공지된 핵산 서열을 포함한다 (예를 들어 [Mount, D., Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis, Chapter 8, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001; Uberbacher, E. C., 1996, Methods Enzymol. 266:259-281; Tiwari et al., 1997, Comput. Appl. BioSci. 13:263-270] 참조).
"제어 서열"은 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드의 발현에 필요하거나 유리한 모든 성분을 포함하는 것으로 본원에서 정의된다. 각각의 제어 서열은 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열에 대해 본래의 서열 또는 외래 서열일 수 있다. 이러한 제어 서열은 리더, 폴리아데닐화 서열, 프로펩티드 서열, 프로모터, 신호 펩티드 서열, 및 전사 종결인자를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 최소한, 제어 서열은 프로모터, 및 전사 및 번역 정지 신호를 포함한다. 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 코딩 영역과 제어 서열의 라이게이션을 용이하게 하는 특정한 제한 부위를 도입하기 위하여 링커가 제어 서열에 제공될 수 있다.
"작동가능하게 연결된"은 제어 서열이 관심 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드의 발현을 지시 또는 조절하도록 제어 서열을 관심 폴리뉴클레오티드와 관련된 위치에 적절히 (즉 기능적 관계로) 위치하도록 한 배치로서 본원에서 정의된다.
"프로모터 서열"은 코딩 서열과 같은 관심 폴리뉴클레오티드의 발현을 위해 숙주 세포에 의해 인식되는 핵산 서열을 지칭한다. 프로모터 서열은 관심 폴리뉴클레오티드의 발현을 매개하는 전사 제어 서열을 함유한다. 프로모터는 돌연변이체, 말단절단된 프로모터 및 하이브리드 프로모터를 포함하는, 선택된 숙주 세포에서 전사 활성을 나타내는 임의의 핵산 서열일 수 있고, 숙주 세포에 대해 동종 또는 이종인 세포외 또는 세포내 폴리펩티드를 코딩하는 유전자로부터 수득될 수 있다.
"적합한 반응 조건"은 생체촉매적 반응 용액 중에서 본 개시내용의 트랜스아미나제 폴리펩티드가 기질 화합물을 생성물 화합물로 전환 (예를 들어 화합물 IA의 화합물 IIA로의 전환)시킬 수 있는 조건 (예를 들어 효소 부하, 기질 부하, 보조인자 부하, 온도, pH, 완충제, 공용매 등의 범위)을 지칭한다. 예시적인 "적합한 반응 조건"이 본 개시내용에 제공되고, 실시예에 의해 예시된다.
"화합물 부하" 또는 "효소 부하" 또는 "보조인자 부하"에서와 같은 "부하"는 반응 출발시 반응 혼합물 중의 성분의 농도 또는 양을 지칭한다.
생체촉매 매개 방법과 관련하여 "기질"은 생체촉매의 작용을 받는 화합물 또는 분자를 지칭한다. 예를 들어 본원에 개시된 방법에서 트랜스아미나제 생체촉매에 대한 예시적인 기질은 화합물 IA이다.
생체촉매 매개 방법과 관련하여 "생성물"은 생체촉매의 작용으로부터 야기되는 화합물 또는 분자를 지칭한다. 예를 들어 본원에 개시된 방법에서 트랜스아미나제 생체촉매에 대한 예시적인 생성물은 화합물 IIA이다.
본 개시내용은 (R)-1-(1H-5-플루오로-6-클로로-인돌-3-일)프로판-2-아민보다 거울상이성질체 과잉률로 (S)-1-(1H-5-플루오로-6-클로로-인돌-3-일)프로판-2-아민을 합성하는데 트랜스아미나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 사용하는 방법을 제공한다. 기재 내용이 폴리펩티드와 관련된 것일 경우에, 이는 또한 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 기재하는 것으로도 이해되어야 한다.
또한 트랜스아미나제로 공지된 아미노트랜스퍼라제는 아미노 공여자 기질의 1급 아민으로부터 아미노 수용자 분자의 카르보닐 기 (예를 들어 케토 또는 알데히드 기)로의 아미노 기의 전달을 촉매한다. 아미노트랜스퍼라제는 다양한 유기체, 예컨대 알칼리게네스 데니트리피칸스 (Alcaligenes denitrificans), 보르데텔라 브론키셉티카 (Bordetella bronchiseptica), 보르데텔라 파라페르투시스 (Bordetella parapertussis), 브루셀라 멜리텐시스 (Brucella melitensis), 부르크홀데리아 말레 (Burkholderia malle), 부르크홀데리아 슈도말레이 (Burkholderia pseudomallei), 크로모박테리움 바이올라세움 (Chromobacterium violaceum), 오셔니콜라 그라눌로수스 (Oceanicola granulosus) HTCC2516, 오셔노박터 종 (Oceanobacter sp.) RED65, 오셔노스피릴룸 종 (Oceanospirillum sp.) MED92, 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida), 랄스토니아 솔라나세아룸 (Ralstonia solanacearum), 리조비움 멜리로티 (Rhizobium meliloti), 리조비움 종 (Rhizobium sp.) (균주 NGR234), 비브리오 플루비알리스 (Vibrio fluvialis), 바실루스 투린겐시스 (Bacillus thuringensis) 및 클레브시엘라 뉴모니아에 (Klebsiella pneumoniae)로부터 확인되었다 ([Shin et al., 2001, BioSci. Biotechnol, Biochem. 65:1782-1788]).
트랜스아미나제는 입체특이적 방식으로 반응이 이루어지게 하는, 즉, 하나의 거울상이성질체를 상응하는 케톤으로 우선 전환시켜 다른 거울상이성질체 내에 풍부한 혼합물이 되게 하는 트랜스아미나제의 능력을 이용하는 것에 라세미체 아민을 키랄 분해하는데 유용하다 (예를 들어 [Koselewski et al., 2009, Org Lett. 11(21):4810-2)] 참조). 케톤을 상응하는 아민으로 전환시키는데 있어서 트랜스아미나제의 입체선택성은 또한 이들 효소가 상응하는 케토 혼합물로부터 광학적으로 순수한 아민을 비대칭 합성하는데 유용하게 한다 (예를 들어 [Hoehne et al., "Biocatalytic Routes to Optically Active Amines," Chem Cat Chem 1(1):42-51; Zua and Hua, 2009, Biotechnol J. 4(10):1420-31)] 참조).
비브리오 플루비알리스로부터의 ω-트랜스아미나제 (ω-VfT)는 키랄 아민의 (S)-거울상이성질체에 대해 높은 거울상선택성을 나타내고, 키랄 방향족 아민에 대해 구분되는 기질 특이성을 갖는다 ([Shin and Kim, 2001, J. Org. Chem. 67:2848-2853]). ω-VfT의 높은 거울상선택성은 아민의 키랄 분해에 적용되어 왔다 ([H. Yun, B.-K. Cho, B.-G. Kim, Biotechnol. Bioeng. 2004, 87, 772-778; J.-S. Shin, B.-G. Kim, Biotechnol. Bioeng. 1997, 55, 348-358; M. Hoehne, K. Robins, U. T. Bornscheuer, Adv. Synth. Catal. 2008, 350,802-807]). 또한, 효소는 프로키랄 케톤 기질을 이용한 광학적으로 순수한 아민의 비대칭 합성에도 사용되어 왔다. 그러나, 비대칭 합성에 있어서의 한계는 바람직하지 않은 전환 반응의 평형 ([Shin and Kim, 1999, Biotechnol. Bioeng. 65, 206-211]), 아민 생성물에 의한 ω-VfT 효소의 억제 ([Shin et al., 2001, Biotechnol Bioeng 73:179-187; Yun and Kim, 2008, BioSci. Biotechnol. Biochem. 72(11):3030-3033]); 방향족 기와 같은 큰 측쇄를 갖는 아미노 수용자에 대한 낮은 활성 ([Shin and Kim, 2002, J. Org. Chem. 67:2848-2853]); 및 낮은 효소 안정성 ([Yun and Kim, 상기 문헌])이다.
지방족 케톤에 대해 증가된 내성을 갖는 비브리오 플루비알리스의 트랜스아미나제로부터 유래된 조작된 트랜스아미나제가 문헌 [Yun et al., 2005, Appl Environ Micriobiol., 71(8):4220-4224)]에 기재되어 있고, 확장된 아미노 공여자 기질 특이성을 갖는 ω-VfT가 문헌 [Cho et al., 2008, Biotechnol Bioeng. 99(2):275-84]에 기재되어 있다. 본원에 참조로 포함되는 특허 등록공보 WO2010081053 및 US20100209981에는 온도 및/또는 유기 용매에 대해 증가된 안정성 및 구조적으로 상이한 아미노 수용자 분자에 대해 효소적 활성을 갖는 조작된 ω-VfT가 기재되어 있다.
본 개시내용은 1-(1H-5-플루오로-6-클로로-인돌-3-일)프로판-2-온의 생성물 화합물 (S)-1-(1H-5-플루오로-6-클로로-인돌-3-일)프로판-2-아민으로 거울상이성질체 과잉률로의 전환을 효율적으로 매개하는 브이. 플루비알리스로부터 유래된 조작된 트랜스아미나제 폴리펩티드를 사용하는 방법에 관한 것이다. 유의하게는, 개시내용은 효소적 활성, 거울상선택성, 안정성, 및 1-(1H-5-플루오로-6-클로로-인돌-3-일)프로판-2-온의 생성물 화합물 (S)-1-(1H-5-플루오로-6-클로로-인돌-3-일)프로판-2-아민으로의 전환에 있어서 생성물 억제에 대한 내화성을 증가시키는, 트랜스아미나제 폴리펩티드 내의 아미노 잔기 위치 및 상응하는 돌연변이를 확인한다.
따라서, 한 측면에서, 본 개시내용은 아미노 공여자의 존재 하에, 기질 화합물 IA, 1-(1H-5-플루오로-6-클로로-인돌-3-일)프로판-2-온을 생성물 화합물 IIA, (S)-1-(1H-5-플루오로-6-클로로-인돌-3-일)프로판-2-아민으로 전환시킬 수 있는 폴리펩티드를 사용하며, 여기서 (S)-1-(1H-5-플루오로-6-클로로-인돌-3-일)프로판-2-아민은 화합물 IIC, (R)-1-(1H-5-플루오로-6-클로로-인돌-3-일)프로판-2-아민보다 거울상이성질체 과잉률로 생성되는 것인 방법에 관한 것이다.
<반응식 1>
일부 실시양태에서, 방법에 사용되는 폴리펩티드는 서열 2의 야생형 브이. 플루비알리스 폴리펩티드 또는 또 다른 조작된 폴리펩티드, 예를 들어 서열 4와 비교하여 특성이 개선되도록 조작된 비-자연 발생 트랜스아미나제이다. 1-(1H-5-플루오로-6-클로로-인돌-3-일)프로판-2-온의 (S)-1-(1H-5-플루오로-6-클로로-인돌-3-일)프로판-2-아민으로의 효율적인 전환을 위해 적합화된 이러한 조작된 트랜스아미나제 폴리펩티드는 서열 2의 아미노산 서열 또는 조작된 참조 트랜스아미나제 폴리펩티드, 예컨대 서열 4의 참조 폴리펩티드와 비교하여 1개 이상의 잔기 차이를 갖는다. 잔기 차이는 효소적 활성, 효소 안정성 및 생성물 아민에 의한 억제에 대한 내성을 비롯한, 효소 특성에서의 증진과 연관된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용에서 사용되는 조작된 트랜스아미나제 폴리펩티드는 기질 1-(1H-5-플루오로-6-클로로-인돌-3-일)프로판-2-온의 생성물 (S)-1-(1H-5-플루오로-6-클로로-인돌-3-일)프로판-2-아민으로의 전환에 있어서, 야생형 또는 조작된 참조 효소와 비교하여 규정된 시간 내에서 동량의 효소에 의한 것보다 거울상이성질체 과잉률의 증가된 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 조작된 트랜스아미나제 폴리펩티드는 적합한 반응 조건 하에 서열 4에 의해 나타내어진 폴리펩티드와 비교하여 약 1.2배, 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 30배, 40배 또는 50배 또는 그 초과의 활성을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용에서 사용되는 조작된 트랜스아미나제 폴리펩티드는 야생형 또는 조작된 참조 효소와 비교하여 전환 반응에 사용되는 온도 및/또는 용매에 대해 증가된 안정성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 조작된 트랜스아미나제 폴리펩티드는 적합한 반응 조건 하에 서열 4의 폴리펩티드와 비교하여 1.2배, 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배 이상 또는 그 초과의 안정성을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용에서 사용되는 조작된 트랜스아미나제 폴리펩티드는 야생형 또는 조작된 참조 효소와 비교하여 생성물 아민 (S)-1-(1H-5-플루오로-6-클로로-인돌-3-일)프로판-2-아민에 대해 증가된 내화성 또는 내성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 조작된 트랜스아미나제 폴리펩티드는, 이하에서 추가로 상술하는 바와 같이, 적합한 반응 조건 하에 1-(1H-5-플루오로-6-클로로-인돌-3-일)프로판-2-온, 특히 (S)-1-(1H-5-플루오로-6-클로로-인돌-3-일)프로판-2-아민에 의한 억제에 대하여, 서열 4에 의해 나타내어진 폴리펩티드와 비교하여 1.2배, 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배 이상 또는 그 초과의 내성을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용에서 사용되는 조작된 트랜스아미나제 폴리펩티드는 적합한 반응 조건 하에 기질 1-(1H-5-플루오로-6-클로로-인돌-3-일)프로판-2-온을 생성물 (S)-1-(1H-5-플루오로-6-클로로-인돌-3-일)프로판-2-아민으로, (R)-1-(1H-5-플루오로-6-클로로-인돌-3-일)프로판-2-아민과 비교하여 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5 초과, 또는 그보다 더 큰 거울상이성질체 과잉률로 전환시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용에서 사용되는 조작된 트랜스아미나제 폴리펩티드는 적합한 반응 조건 하에 서열 4의 참조 폴리펩티드와 비교하여 기질의 존재에 대해 증가된 내성으로 화합물 IA를 화합물 IIA로 전환시킬 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서 조작된 트랜스아미나제 폴리펩티드는 적합한 반응 조건 하에 약 72시간 이하, 약 48시간 이하, 약 36시간 이하, 또는 약 24시간 이하의 반응 시간 내에 적어도 약 1 g/L, 약 5 g/L, 약 10 g/L, 약 20 g/L, 약 30 g/L, 약 40 g/L, 약 50 g/L, 약 70 g/L, 약 100 g/L, 약 125 g/L, 약 150 g/L, 약 175 g/L 또는 약 200 g/L 또는 그 초과의 기질 부하 농도의 존재 하에 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 퍼센트 전환으로 기질 화합물 IIA를 생성물 화합물 IA로 전환시킬 수 있다.
상기 개선된 특성의 조작된 폴리펩티드가 전환을 수행하는 적합한 반응 조건은, 이하 및 실시예에서 추가로 기재하는 바와 같이, 폴리펩티드, 기질, 보조인자, 완충제, 공용매, pH, 및/또는 온도 및 반응 시간을 비롯한 조건과 관련하여 결정될 수 있다.
본 개시내용에 사용되는 예시적인 조작된 폴리펩티드는 화합물 IA를 화합물 IIA로 전환시키기 위해 개선된 특성과 관련이 있고, 서열 2와 비교하여 하기 잔기 위치에서 1개 이상의 잔기 차이를 포함한다:
표 2A 및 2B의 예시적인 폴리펩티드의 개선된 특성과 관련이 있는 각각의 이러한 위치에서의 구체적인 아미노산 차이는 하기를 포함한다:
서열 4에 의해 나타내어진 조작된 트랜스아미나제와 비교되는 잔기 차이는 잔기 위치
에서의 차이를 포함한다. 이러한 위치에서의 구체적인 아미노산 차이는 하기를 포함한다:
서열 4와 비교하여 잔기 위치 X153 및 X383에서도 잔기 차이가 발생하지만, 이들 차이는 서열 2의 야생형 서열 상에 존재하는 아미노산 잔기로의 전환을 나타내고, 이는 잔기 위치 X153에서 아미노산 S 및 V 사이 및 잔기 위치 X383에서 아미노산 A 및 V 사이에서의 상호전환이 조작된 효소 특성에 유의한 유해 효과를 갖지 않음을 나타낸다.
본 개시내용의 방법에 사용되는 예시적인 비자연 발생 (또는 조작된) 트랜스아미나제 폴리펩티드에 대한 구조 및 기능 정보를 하기 표 2A 및 2B에 나타낸다. 홀수 서열 식별자 (즉, 서열 번호)는 짝수 서열 번호에 의해 제공되는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 지칭하고, 서열은 본원에 참조로 포함되는, 본 개시내용에 첨부된 전자 서열 목록 파일로 제공된다. 아미노산 잔기 차이는 서열 4의 참조 서열과의 비교를 기초로 하고, 이는 서열 2와 관련하여 하기 24개의 아미노산 잔기 차이를 갖는 야생형 ω-VfT 폴리펩티드로부터 유래된 조작된 트랜스아미나제이다:
서열 4의 참조 폴리펩티드와 관련하여 각각의 조작된 폴리펩티드의 활성은 1차 스크린으로 사용된 고처리량 (HTP) 검정에서 설정된 시간 및 온도에 걸친 케톤 기질 1-(1H-5-플루오로-6-클로로-인돌-3-일)프로판-2-온의 생성물 아민 화합물 (S)-1-(1H-5-플루오로-6-클로로-인돌-3-일)프로판-2-아민으로의 전환으로 결정하였다. 표 2A의 HTP 검정 값은 표 및 실시예에서 언급한 바와 같은 검정 반응 조건에 따라 웰 당 ~200 μL 부피의 96 웰-플레이트 포맷으로 이. 콜라이 (E.coli) 투명 세포 용해물을 이용하여 결정하였다. 일부 경우에, 진탕-플라스크 분말 (SFP) 및/또는 하류 (DSP) 분말 검정을 2차 스크린으로 사용하여 조작된 트랜스아미나제의 특성을 평가하였고, 그 결과를 표 2B에 제공한다. SFP 및 DSP 형태는 조작된 폴리펩티드의 보다 정제된 분말 제제를 제공한다. 예를 들어 SFP 제제에서 조작된 트랜스아미나제는 전체 단백질의 대략 30%이고, DSP 제제는 전체 단백질의 대략 80%인 조작된 트랜스아미나제를 함유할 수 있다
활성 수준 (즉, "+" "++" 등)은 다음과 같이 정의된다: "+"는 조작된 트랜스아미나제 폴리펩티드 서열 6 내지 14의 경우에 서열 4의 것과 비교하여 1.2배 이상의 활성을 나타내고, 조작된 트랜스아미나제 폴리펩티드 서열 16 내지 154의 경우에 서열 8의 것과 비교하여 1.2 이상의 활성을 나타내며; "++"는 조작된 트랜스아미나제 폴리펩티드 서열 6-14의 경우에 서열 4의 것과 비교하여 5배 이상의 활성을 나타내고, 조작된 트랜스아미나제 폴리펩티드 서열 16 내지 154의 경우에 서열 8의 것과 비교하여 5배 이상의 활성을 나타낸다. 안정성 데이터는 검정에서 하기 양의 생성물 (S)-1-(1H-5-플루오로-6-클로로-인돌-3-일)프로판-2-아민을 모으고, 동일한 조건 하에 그 활성을 참조 효소의 활성과 비교하는 것에 의해 수득한다: 서열 6 내지 14의 조작된 트랜스아미나제 폴리펩티드의 분석의 경우에 14 g/L, 조작된 트랜스아미나제 폴리펩티드 서열 16 내지 154의 분석의 경우에 16 g/L. 안정성은 55℃ 및 50℃의 2종의 상이한 온도에서 활성을 비교함으로써 평가하였다.
<표 2A>
<표 2B>
본 발명의 방법에 유용한 예시적인 폴리펩티드의 검사로부터, 효소 특성의 개선은 서열 4와 비교하여 잔기 위치
에서의 잔기 변화와 관련이 있다. 개선된 특성과 관련이 있는 각각의 이러한 위치에서의 구체적인 잔기 변화는
를 포함한다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법에 유용한 조작된 트랜스아미나제 폴리펩티드는 서열 4와 비교하여 개선된 특성으로 기질 화합물 IA, 1-(1H-5-플루오로-6-클로로-인돌-3-일)프로판-2-온을 생성물 화합물 IIA, (S)-1-(1H-5-플루오로-6-클로로-인돌-3-일)프로판-2-아민으로 전환시킬 수 있고, 참조 서열인 서열 2에 대해 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열 4와 비교하여
로부터 선택된 잔기 위치에서 1개 이상의 잔기 차이를 포함하며, 잔기 위치 X31; X57; X86; X163; X168; X314; X324; X398; 및 X417에서의 잔기 차이는 X31S; X57Y; X86D; X163I; X163L; X163R; X163V; X168S; X314N; X324H; X398L; X398V; X398W; 및 X417M으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 개시된 방법에 유용한 조작된 트랜스아미나제 폴리펩티드는 서열 4와 비교하여 개선된 특성으로 기질 화합물 IA를 생성물 화합물 IIA로 전환시킬 수 있고, 참조 서열인 서열 4에 대해 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열 4와 비교하여
로부터 선택된 잔기 위치에서 1개 이상의 잔기 차이를 포함하며, 잔기 위치 X31; X57; X86; X163; X168; X314; X324; X398; 및 X417에서의 잔기 차이는 X31S; X57Y; X86D; X163I; X163L; X163R; X163V; X168S; X314N; X324H; X398L; X398V; X398W; 및 X417M으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 조작된 트랜스아미나제 폴리펩티드는 상기한 거울상선택성으로, 예를 들어 ≥ 90% ee로 전환시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 개시된 방법에 유용한 트랜스아미나제 폴리펩티드는 서열 4와 비교하여 개선된 특성으로 기질 화합물 IA를 생성물 화합물 IIA로 전환시킬 수 있고, 서열 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 및 154로부터 선택된 참조 서열에 대해 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 그 초과의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열 4와 비교하여
로부터 선택된 잔기 위치에서 1개 이상의 잔기 차이를 포함하며, 잔기 위치 X31; X57; X86; X163; X168; X314; X324; X398; 및 X417에서의 잔기 차이는 X31S; X57Y; X86D; X163I; X163L; X163R; X163V; X168S; X314N; X324H; X398L; X398V; X398W; 및 X417M으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 참조 서열은 서열 4, 8, 14, 16, 132, 134 및 146으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 참조 서열은 서열 4이다. 일부 실시양태에서, 참조 서열은 서열 8이다. 일부 실시양태에서, 참조 서열은 서열 134이다. 일부 실시양태에서, 참조 서열은 서열 146이다.
일부 실시양태에서, 서열 4와 비교하여 개선된 특성으로 기질 화합물 IA를 생성물 화합물 IIA로 전환시킬 수 있는 트랜스아미나제 폴리펩티드는 서열 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 및 154로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 서열 4와 비교하여
로부터 선택된 잔기 위치에서 1개 이상의 잔기 차이를 가지며, 잔기 위치 X31; X57; X86; X163; X168; X314; X324; X398; 및 X417에서의 잔기 차이는 X31S; X57Y; X86D; X163I; X163L; X163R; X163V; X168S; X314N; X324H; X398L; X398V; X398W; 및 X417M으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 서열 4, 8, 14, 16, 132, 134 및 146으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 서열 4이다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 서열 8이다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 서열 134이다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 서열 146이다.
일부 실시양태에서, 조작된 트랜스아미나제 폴리펩티드는 서열 4와 관련하여 1.2배 이상의 활성으로 기질 화합물 IA를 생성물 화합물 IIA로 전환시킬 수 있고, 서열 6, 8, 10, 12, 14, 16, 22, 24, 28, 30, 32, 48, 52, 56, 62, 64, 66, 68, 86, 88, 90, 92, 98, 100, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 124, 126, 128, 132, 134, 136, 142, 144, 148, 및 154로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 조작된 트랜스아미나제 폴리펩티드는 서열 4와 관련하여 5배 이상의 활성으로 기질 화합물 IA를 생성물 화합물 IIA로 전환시킬 수 있고, X14V, X26R; X33T; X88A/L; X163I/L; 및 X284A로부터 선택된 1개 이상의 잔기 차이를 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 개시된 방법에 유용한 조작된 트랜스아미나제 폴리펩티드는 서열 4와 관련하여 5배 이상의 활성으로 기질 화합물 IA를 생성물 화합물 IIA로 전환시킬 수 있고, 서열 6, 8, 10, 14, 16, 22, 24, 28, 30, 32, 48, 52, 56, 62, 64, 86, 88, 90, 92, 98, 100, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 124, 126, 128, 132, 134, 136, 142, 144, 148, 및 154로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 조작된 트랜스아미나제 폴리펩티드는 화합물 IA의 화합물 IIA로의 전환에 있어서 서열 4에 의해 나타내어진 폴리펩티드와 비교하여, 1-(1H-5-플루오로-6-클로로-인돌-3-일)프로판-2-아민, 특히 (S)-1-(1H-5-플루오로-6-클로로-인돌-3-일)프로판-2-아민에 의한 억제에 대해 1.2배, 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배 이상 또는 그 초과의 내화성을 갖는다. 일반적으로, 생성물 화합물에 의한 억제에 대한 내화성 또는 내성의 증가는, 표 2A 및 2B 및 실시예에 기재된 바와 같이, 14 g/L 또는 16 g/L의 화합물 IIA의 존재 하에 HTP 검정 조건 하에서 측정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 1-(1H-5-플루오로-6-클로로-인돌-3-일)프로판-2-아민에 의한 억제에 대해 1.2배 이상 또는 그 초과의 내화성을 갖는 조작된 트랜스아미나제 폴리펩티드는, 서열 4와 비교하여 X26R; X70A; X86D; X88A/L; X132F; X163L; X315G; X395P; X398L; 및 X419S로부터 선택된, 1개 이상의 잔기 변화를 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 화합물 IA의 화합물 IIA로의 전환에 있어서 개선된 특성을 갖는 조작된 트랜스아미나제 폴리펩티드는 서열 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 및 154로부터 선택된 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 적합한 반응 조건 하에 화합물 IA를 화합물 IIA로 전환시킬 수 있는 조작된 트랜스아미나제는 서열 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 및 154 중 하나에 대해 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열 4와 비교하여 아미노산 잔기 차이는, 표 2A 및 2B에 제공된 바와 같이, 서열 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 및 154 중 어느 하나에 존재한다.
일부 실시양태에서, 조작된 폴리펩티드는, 예를 들어 단리된 제제, 실질적으로 정제된 효소, 효소를 코딩하는 유전자(들)로 형질전환된 전세포, 및/또는 세포 추출물 및/또는 그러한 세포의 용해물과 같은 다양한 형태로 존재할 수 있다. 효소는 이하에서 추가로 논의되는 바와 같이, 동결건조될 수 있거나, 분무 건조될 수 있거나, 침전될 수 있거나, 또는 조물질 페이스트의 형태일 수 있다.
일부 실시양태에서, 트랜스아미나제 폴리펩티드는 물리적 기질 상에 부착될 수 있다. 트랜스아미나제 폴리펩티드는 물리적 기질 상에 비-공유적으로 또는 공유적으로 부착되어, 서열 4의 참조 폴리펩티드와 관련하여 그의 개선된 활성, 입체선택성, 생성물 내성, 안정성 및/또는 그 밖의 개선된 특성을 보유할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 고정된 폴리펩티드는 적합한 케톤 기질, 예를 들어 화합물 IA 또는 그의 구조적 유사체의, 상응하는 아민 생성물, 예를 들어 화합물 IIA 또는 상응하는 구조적 유사체로의 생체촉매적 전환을 용이하게 할 수 있고, 반응이 완료된 후에는 용이하게 유지된 후 (예를 들어 폴리펩티드가 비드 상에 고정된 채로 유지됨으로써), 후속 반응에서 재사용 또는 재활용된다. 이러한 고정된 효소 방법은 추가적 효율 및 비용 절감을 위해 고려된다. 효소 고정 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 기질, 예를 들어 막, 비드, 유리 등에의 접합을 위한 다양한 방법이 특히 문헌 [Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques, Second Edition, Academic Press; (2008), 및 Bioconjugation Protocols: Strategies and Methods, In Methods in Molecular Biology, C.M. Niemeyer ed., Humana Press (2004)]에 기재되어 있고, 그 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
조작된
트랜스아미나제를
코딩하는 폴리뉴클레오티드, 발현 벡터 및 숙주 세포
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 조작된 트랜스아미나제 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 폴리뉴클레오티드는 유전자 발현을 제어하는 1종 이상의 이종 조절 서열에 작동가능하게 연결되어 폴리펩티드를 발현할 수 있는 재조합 폴리뉴클레오티드를 생성할 수 있다. 조작된 트랜스아미나제를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 구축물을 적절한 숙주 세포에 도입하여 상응하는 트랜스아미나제 폴리펩티드를 발현시킬 수 있다.
당업자에게 명백한 바와 같이, 단백질 서열의 이용가능성 및 다양한 아미노산에 상응하는 코돈에 대한 지식은 대상 폴리펩티드를 코딩할 수 있는 모든 폴리뉴클레오티드에 대한 설명을 제공한다. 동일한 아미노산이 대안적이거나 유사한 코돈에 의해 코딩되는 유전자 코드의 축중성은 매우 많은 수의 핵산이 제조되도록 하고, 이들 모두는 개선된 트랜스아미나제 효소를 코딩한다. 따라서, 특정한 아미노산 서열에 대한 지식을 가진 당업자는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 방식으로 1개 이상의 코돈의 서열을 간단하게 변형시킴으로써 임의의 개수의 상이한 핵산을 제조할 수 있다. 이와 관련하여, 본 개시내용은 구체적으로, 가능한 코돈 선택에 기초하여 조합을 선택함으로써, 본원에서 기재하는 폴리펩티드가 코딩되게 할 수 있는 폴리뉴클레오티드의 각각의 그리고 모든 가능한 변형을 의도하고, 그러한 모든 변형은, 표 2A 및 2B에 나타낸 아미노산 서열 및 서열 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 및 154로서 본원에 참조로 포함되는 서열 목록에 개시되어 있는 것을 비롯하여, 본원에서 기재하는 임의의 폴리펩티드를 구체적으로 개시하는 것으로 간주된다.
다양한 실시양태에서, 바람직하게는 코돈은 단백질이 생산되는 숙주 세포에 맞도록 선택된다. 예를 들어 박테리아에서 사용되는 바람직한 코돈이 박테리아에서 유전자를 발현시키는데 사용되고, 효모에서 사용되는 바람직한 코돈이 효모에서의 발현에 사용되며, 포유동물에서 사용되는 바람직한 코돈이 포유동물 세포에서의 발현에 사용된다. 일부 실시양태에서, 천연 서열이 바람직한 코돈을 포함할 것이고, 바람직한 코돈의 사용이 모든 아미노산 잔기에 대해 요구되지 않을 수 있기 때문에, 트랜스아미나제의 코돈 용법을 최적화하도록 모든 코돈이 교체될 필요는 없다. 결과적으로, 트랜스아미나제 효소를 코딩하는 코돈 최적화 폴리뉴클레오티드는 바람직한 코돈을 전장 코딩 영역의 약 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 초과의 코돈 위치에서 함유할 수 있다.
개선된 트랜스아미나제 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드의 발현을 제공하도록 다양한 방식으로 조작될 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드의 발현을 조절하기 위해 1개 이상의 제어 서열이 존재하는 발현 벡터로서 제공될 수 있다. 발현 벡터에 따라, 단리된 폴리뉴클레오티드를 벡터 내로의 삽입 전에 조작하는 것이 바람직하거나 필요할 수 있다. 재조합 DNA 방법을 활용하여 폴리뉴클레오티드 및 핵산 서열을 변형시키는 기술이 당업계에 널리 공지되어 있다. 지침은 문헌 [Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press; 및 Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel. F. ed., Greene Pub. Associates, 1998, updates to 2006]에 제공되어 있다.
본원의 실시양태에서, 개선된 폴리펩티드 및 상응하는 폴리뉴클레오티드는 당업자에 의해 사용되는 방법을 사용하여 수득할 수 있다. 비브리오 플루비알리스의 야생형 폴리펩티드를 코딩하는 모 폴리뉴클레오티드 서열은 [Shin et al., 2003, Appl. Microbiol. Biotechnol. 61(5-6):463-471]에 기재되어 있고, 개선된 안정성 및 기질 인식 특성을 갖는 조작된 트랜스아미나제 폴리펩티드를 생성하는 방법은, 본원에 참조로 포함되는 특허 출원 공개 WO2010081053 및 US20100209981에 개시되어 있다.
조작된 폴리펩티드의 서열이 공지되어 있는 경우에, 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 공지된 합성 방법에 따라 표준 고체-상 방법에 의해 제조할 수 있다. 일부 실시양태에서, 염기 약 100개 이하의 단편을 개별적으로 합성하고, 이어서 임의의 목적하는 연속 서열을 형성하도록 연결할 수 있다 (예를 들어 효소적 또는 화학적 결찰 방법, 또는 폴리머라제 매개 방법에 의해). 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드를, 예를 들어 문헌 [Beaucage et al., 1981, Tet Lett 22:1859-69]에 기재되어 있는 고전적인 포스포르아미다이트 방법 또는 문헌 [Matthes et al., 1984, EMBO J. 3:801-05]에 기재되어 있는 방법을 이용하여 화학적 합성에 의해 제조할 수 있다 (예를 들어 전형적으로 자동화된 합성 방법으로 실행됨). 포스포르아미다이트 방법에 따르면, 예를 들어 자동 DNA 합성기에서, 올리고뉴클레오티드를 합성하고, 정제하고, 어닐링시키고, 결찰시키고, 적절한 벡터 내로 클로닝한다. 또한, 본질적으로 임의의 핵산은 다양한 상업적 공급원으로부터 수득할 수 있다.
따라서, 일부 실시양태에서, 조작된 트랜스아미나제 폴리펩티드를 제조하는 방법은 (a) 서열 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 및 154로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 서열 4와 비교하여
로부터 선택된 잔기 위치에서 1개 이상의 잔기 차이를 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 합성하며, 여기서 잔기 위치 X31; X57; X86; X163; X168; X314; X324; X398; 및 X417에서의 잔기 차이는 X31S; X57Y; X86D; X163I; X163L; X163R; X163V; X168S; X314N; X324H; X398L; X398V; X398W; 및 X417M으로부터 선택되고, (b) 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 트랜스아미나제 폴리펩티드를 발현시키는 것을 포함할 수 있다.
발현된 조작된 트랜스아미나제는 화합물 IA의 화합물 IIA로의 전환에 있어서, 본원에 기재된 임의의 검정 조건에 의해 목적하는 개선된 특성, 예를 들어 활성, 거울상선택성, 안정성, 및 생성물 내성이 측정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 숙주 세포에서 발현된 임의의 조작된 트랜스아미나제 효소는, 리소자임 처리, 음파처리, 여과, 염석, 초원심분리 및 크로마토그래피가 특히 포함되는, 단백질 정제를 위한 널리 공지된 기술들 중 임의의 1개 이상을 사용하여 세포 및/또는 배양 배지로부터 회수할 수 있다. 박테리아, 예컨대 이. 콜라이로부터 단백질을 용해시키고 고효율로 추출하기 위한 적절한 용액이 시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich, 미주리주 세인트 루이스)로부터 상표명 셀라이틱 B(CelLytic B)™로 상업적으로 입수가능하다.
트랜스아미나제 폴리펩티드의 단리를 위한 크로마토그래피 기술은, 특히, 역상 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 전기영동, 및 친화성 크로마토그래피를 포함한다. 특정한 효소를 정제하기 위한 조건은, 부분적으로, 순전하, 소수성, 친수성, 분자량, 분자 형상 등과 같은 인자에 좌우될 것이고, 이는 당업자에게 명백할 것이다.
일부 실시양태에서, 친화성 기술을 사용하여 개선된 트랜스아미나제 효소를 단리할 수 있다. 친화성 크로마토그래피 정제를 위해, 트랜스아미나제 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 사용할 수 있다. 항체의 생산을 위해, 토끼, 마우스, 래트 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 숙주 동물이 트랜스아미나제 폴리펩티드, 또는 그의 단편의 주사에 의해 면역화될 수 있다. 트랜스아미나제 폴리펩티드 또는 단편은 측쇄 관능기 또는 측쇄 관능기에 부착된 링커에 의해 적합한 담체, 예컨대 BSA에 부착될 수 있다. 숙주 종에 따라 면역학적 반응을 증가시키기 위해, 프로인트 (완전 및 불완전), 미네랄 겔, 예컨대 수산화알루미늄, 표면 활성 물질, 예컨대 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 다가음이온, 펩티드, 오일 에멀젼, 키홀 림펫 헤모시아닌, 디니트로페놀, 및 잠재적으로 유용한 인간 아주반트, 예컨대 BCG (바실루스 칼메트 게랭) 및 코리네박테리움 파르붐을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 아주반트를 사용할 수 있다.
조작된
트랜스아미나제
효소를 사용하는 방법
또 다른 측면에서, 아미노 공여자로부터 아미노기가 아미노 수용자, 예를 들어 케톤 기질로 전달되어 아민을 생성하는 트랜스아미나제 반응을 수행하기 위한 방법에 본원에 기재된 트랜스아미나제를 사용할 수 있다. 프로키랄 케톤 수용자의 사용은 키랄 아민을 거울상이성질체 과잉률로 생성할 수 있다. 일반적으로, 아미노교환 반응을 수행하기 위한 방법은 아미노 수용자가 아민으로 전환되는데 적합한 반응 조건 하에 아미노 공여자 및 아미노 수용자를 본 개시내용의 조작된 트랜스아미나제 폴리펩티드와 함께 접촉시키거나 인큐베이션하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 트랜스아미나제는 화학식 I의 기질 화합물을 화학식 II의 생성물 화합물로 전환시키는데 사용할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 화학식 II의 화합물을 거울상이성질체 과잉률로 제조하는 방법은 화학식 I의 화합물을 적합한 반응 조건 하에 아미노 공여자의 존재 하에 본원에서 기재하는 조작된 트랜스아미나제 폴리펩티드와 접촉시키는 것을 포함한다. 방법의 일부 실시양태에서, 화학식 II의 화합물은 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 그 초과의 거울상이성질체 과잉률로 형성될 수 있다.
상기 방법을 위해, 본원에서 기재하는 임의의 조작된 트랜스아미나제를 사용할 수 있다. 예로서 제한없이, 일부 실시양태에서, 상기 방법은 서열 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 및 154로부터 선택된 참조 서열과 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 그 초과의 동일성을 갖고, 서열 4와 비교하여
로부터 선택된 잔기 위치에서 1개 이상의 잔기 차이를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 조작된 트랜스아미나제 폴리펩티드를 사용할 수 있고, 잔기 위치 X31; X57; X86; X163; X168; X314; X324; X398; 및 X417에서의 잔기 차이는 X31S; X57Y; X86D; X163I; X163L; X163R; X163V; X168S; X314N; X324H; X398L; X398V; X398W; 및 X417M으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 참조 서열은 서열 4, 8, 14, 16, 132, 134, 및 146으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 참조 서열은 서열 4이다. 일부 실시양태에서, 참조 서열은 서열 8이다. 일부 실시양태에서, 참조 서열은 서열 134이다. 일부 실시양태에서, 참조 서열은 서열 146이다.
일부 실시양태에서, 상기 방법을 수행할 수 있는 예시적인 트랜스아미나제는 서열 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 및 154로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다. 조작된 트랜스아미나제의 선택 및 사용에 관한 지침을 본원의 상세한 설명, 예를 들어 표 2 및 실시예에서 제공한다.
본원 및 실시예에 설명되어 있는 실시양태에서, 아미노 공여자, pH, 온도, 완충제, 용매계, 기질 부하, 폴리펩티드 부하, 보조인자 부하, 압력 및 반응 시간의 범위를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 범위의 적합한 반응 조건이 방법에 사용될 수 있다. 본원에 기재된 조작된 트랜스아미나제 폴리펩티드를 사용하여 기질 화합물을 생성물 화합물로 생체촉매적으로 전환시키기 위한 방법을 수행하는데 적합한 추가의 반응 조건은, 농도, pH, 온도, 용매 조건의 실험적 반응 조건 하에 조작된 트랜스아미나제 폴리펩티드와 기질 화합물을 접촉시키고 생성물 화합물을 검출하는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는 통상적인 실험에 의해, 본원에 제공된 지침의 관점에서 용이하게 최적화될 수 있다.
본원에 기재된 실시양태에서, 트랜스아미나제 폴리펩티드는 아미노 공여자를 사용하여 생성물 화합물을 형성한다. 일부 실시양태에서, 반응 조건 중 아미노 공여자는 이소프로필아민 (또한 본원에서 "IPM"으로 지칭함), 푸트레신, L-리신, α-페네틸아민, D-알라닌, L-알라닌 또는 D,L-알라닌 또는 D,L-오르니틴으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노 공여자는 IPM, 푸트레신, L-리신, D- 또는 L-알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 아미노 공여자는 IPM이다. 일부 실시양태에서, 적합한 반응 조건은 약 0.1 내지 약 3.0 M, 0.2 내지 약 2.5 M, 약 0.5 내지 약 2 M 또는 약 1 내지 약 2 M 이상의 농도로 존재하는 아미노 공여자, 특히 IPM을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노 공여자는 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 1, 1.5, 2, 2.5 또는 3 M의 농도로 존재한다. 아민 생성물 형성 쪽으로 평형을 이동시키기 위해 보다 높은 농도의 아미노 공여자, 예를 들어 IPM을 사용할 수 있다.
조작된 트랜스아미나제 폴리펩티드를 사용하는 적합한 반응 조건은 또한 전형적으로 보조인자를 포함한다. 조작된 트랜스아미나제 효소를 이용하는 방법에 유용한 보조인자는 피리독살-5'-포스페이트 (또한 피리독살-포스페이트, PLP, P5P로 공지됨), 피리독신 (PN), 피리독살 (PL), 피리독사민 (PM), 및 그의 인산화 대응물; 피리독신 포스페이트 (PNP), 및 피리독사민 포스페이트 (PMP)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 보조인자 PLP는 세포 추출물 내에 자연적으로 존재하며, 보충될 필요가 없다. 방법의 일부 실시양태에서, 예를 들어 부분적으로 정제되거나 또는 정제된 트랜스아미나제 효소를 사용하는 경우에, 적합한 반응 조건은 효소 반응 혼합물에 첨가된 보조인자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적합한 반응 조건은 PLP, PN, PL, PM, PNP, 및 PMP로부터 선택된 보조인자의 약 0.1 g/L 내지 약 10 g/L, 약 0.2 g/L 내지 약 5 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 2.5 g/L의 농도로의 존재를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 반응 조건은 PLP를 약 0.1 g/L 이하, 0.2 g/L 이하, 0.5 g/L 이하, 1 g/L 이하, 2.5 g/L 이하, 5 g/L 이하, 또는 10 g/L 이하의 농도로 포함한다. 일부 실시양태에서, 보조 인자는 반응의 초반에 첨가될 수 있고/거나 반응 동안 추가의 보조인자가 첨가된다.
반응 혼합물 중 기질 화합물은, 예를 들어 생성물 화합물의 목적하는 양, 효소 활성에 대한 기질 농도의 효과, 반응 조건 하에서의 효소의 안정성, 및 기질의 생성물로의 퍼센트 전환을 고려하여 달라질 수 있다. 일부 실시양태에서, 적합한 반응 조건은 약 0.5 내지 약 200 g/L, 1 내지 약 200 g/L, 5 내지 약 150 g/L, 약 10 내지 약 100 g/L, 20 내지 약 100 g/L 또는 약 50 내지 약 100 g/L 이상의 기질 화합물 부하를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적합한 반응 조건은 약 0.5 g/L 이상, 약 1 g/L 이상, 약 5 g/L 이상, 약 10 g/L 이상, 약 15 g/L 이상, 약 20 g/L 이상, 약 30 g/L 이상, 약 50 g/L 이상, 약 75 g/L 이상, 약 100 g/L 이상, 약 150 g/L 이상 또는 약 200 g/L 이상, 또는 그 초과의 기질 화합물 부하를 포함한다.
본원에 개시된 조작된 트랜스아미나제 폴리펩티드의 개선된 활성 및/또는 입체선택성은 보다 낮은 농도의 조작된 폴리펩티드로 보다 높은 백분율 전환이 달성될 수 있게 하는 방법을 제공한다. 그러한 방법의 일부 실시양태에서, 적합한 반응 조건은 조작된 폴리펩티드를 약 0.01 내지 약 50 g/L; 약 0.05 내지 약 50 g/L; 약 0.1 내지 약 40 g/L; 약 1 내지 약 40 g/L; 약 2 내지 약 40 g/L; 약 5 내지 약 40 g/L; 약 5 내지 약 30 g/L; 약 0.1 내지 약 10 g/L; 약 0.5 내지 약 10 g/L; 약 1 내지 약 10 g/L; 약 0.1 내지 약 5 g/L; 약 0.5 내지 약 5 g/L; 또는 약 0.1 내지 약 2 g/L의 농도로 포함한다. 일부 실시양태에서, 트랜스아미나제 폴리펩티드의 농도는 약 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 또는 50 g/L이다.
아미노교환 반응의 과정 동안, 반응 혼합물의 pH는 변화될 수 있다. 반응 혼합물의 pH는 목적하는 pH로 또는 목적하는 pH 범위 이내로 유지될 수 있다. 이는 반응의 과정 이전 및/또는 반응의 과정 동안 산 또는 염기를 첨가하는 것에 의해 이루어질 수 있다. 대안적으로, pH는 완충제를 이용하는 것에 의해 제어될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 반응 조건은 완충제를 포함한다. 목적하는 pH 범위를 유지시키기 위한 적합한 완충제가 당업계에 공지되어 있으며, 예로서 제한없이, 보레이트, 카르보네이트, 포스페이트, 트리에탄올아민 완충제 등이 포함된다. 일부 실시양태에서, 완충제는 보레이트이다. 상기 방법의 일부 실시양태에서, 적합한 반응 조건은 트리에탄올아민의 완충 용액을 포함하고, 상기 트리에탄올아민 농도는 약 0.01 내지 약 0.4 M, 0.05 내지 약 0.4 M, 0.1 내지 약 0.3 M, 또는 약 0.1 내지 약 0.2 M이다. 일부 실시양태에서, 반응 조건은 약 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.07, 0.1, 0.12, 0.14, 0.16, 0.18, 0.2, 0.3, 또는 0.4 M 농도의 트리에탄올아민을 포함한다. 일부 실시양태에서, 반응 조건은 완충제 없이 적합한 용매로서 물을 포함한다.
방법의 실시양태에서, 반응 조건은 적합한 pH를 포함할 수 있다. 목적하는 pH 또는 목적하는 pH 범위는 산 또는 염기, 적절한 완충제, 또는 완충제 및 산 또는 염기 첨가의 조합을 이용하는 것에 의해 유지될 수 있다. 반응 혼합물의 pH는 반응 과정 이전에 및/또는 반응 과정 동안 조절될 수 있다. 일부 실시양태에서, 적합한 반응 조건은 pH 약 6 내지 약 12, pH 약 6 내지 약 10, pH 약 6 내지 약 8, pH 약 7 내지 약 10, pH 약 7 내지 약 9, 또는 pH 약 7 내지 약 8의 용액 pH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 반응 조건은 약 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5 또는 12의 용액 pH를 포함한다.
본원의 방법의 실시양태에서, 예를 들어 보다 높은 온도에서의 반응 속도의 증가 및 반응 기간 동안의 효소의 활성을 고려하여, 반응 조건상 적합한 온도가 사용될 수 있다. 예를 들어 본 개시내용의 조작된 폴리펩티드는 자연 발생 트랜스아미나제 폴리펩티드, 예를 들어 서열 2의 야생형 폴리펩티드와 관련하여 증가된 안정성을 가지며, 이는 조작된 폴리펩티드를 보다 높은 온도에서 반응상 증가된 전환 속도 및 개선된 기질 용해도 특성으로 사용 가능하게 한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 적합한 반응 조건은 약 10℃ 내지 약 70℃, 약 10℃ 내지 약 65℃, 약 15℃ 내지 약 60℃, 약 20℃ 내지 약 60℃, 약 20℃ 내지 약 55℃, 약 30℃ 내지 약 55℃, 또는 약 40℃ 내지 약 50℃의 온도를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적합한 반응 조건은 약 10℃, 15℃, 20℃, 25℃, 30℃, 35℃, 40℃, 45℃, 50℃, 55℃, 60℃, 65℃, 또는 70℃의 온도롤 포함한다. 일부 실시양태에서, 효소적 반응 동안의 온도는 반응 과정 전반에 걸친 온도로 유지될 수 있다. 일부 실시양태에서, 효소적 반응 동안의 온도는 반응 과정 동안의 온도 프로파일 보다 높게 조정될 수 있다.
본 개시내용의 방법은 일반적으로 용매 중에서 수행된다. 적합한 용매는 물, 수성 완충 용액, 유기 용매, 중합 용매 및/또는 공용매를 포함하고, 이는 일반적으로 수성 용매, 유기 용매 및/또는 중합 용매를 포함한다. 수성 용매 (물 또는 수성 공용매계)는 pH-완충되거나 완충되지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 조작된 트랜스아미나제 폴리펩티드를 사용하는 방법은 일반적으로 유기 용매 (예를 들어 에탄올, 이소프로판올 (IPA), 디메틸 술폭시드 (DMSO), 에틸 아세테이트, 부틸 아세테이트, 1-옥탄올, 헵탄, 옥탄, 메틸 t 부틸 에테르 (MTBE), 톨루엔 등), 이온성 또는 극성 용매 (예를 들어 1 에틸 4 메틸이미다졸륨 테트라플루오로보레이트, 1 부틸 3 메틸이미다졸륨 테트라플루오로보레이트, 1 부틸 3 메틸이미다졸륨 헥사플루오로포스페이트, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜 등)를 포함하는 수성 공용매계 중에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 공용매는 극성 용매, 예컨대 폴리올, 디메틸술폭시드, DMSO, 또는 저급 알콜일 수 있다. 수성 공용매계의 비-수성 공용매 성분은 수성 성분과 혼화성이어서 단일 액체 상을 제공할 수 있거나, 또는 수성 성분과 부분적으로 혼화성이거나 불혼화성이어서 2개의 액체 상을 제공할 수 있다. 예시적인 수성 공용매계는 물, 및 유기 용매, 극성 용매 및 폴리올 용매로부터 선택된 1종 이상의 공용매를 포함할 수 있다. 일반적으로, 수성 공용매계의 공용매 성분은 반응 조건 하에 트랜스아미나제 효소를 유해하게 불활성화시키지 않도록 선택된다. 본원에 기재된 것과 같은 효소 활성 검정을 이용하여 명시된 조작된 트랜스아미나제 효소의 효소적 활성을 후보 용매계 중에서 규정된 관심 기질로 측정함으로써 적절한 공용매계를 용이하게 확인할 수 있다.
상기 방법의 일부 실시양태에서, 적합한 반응 조건은 수성 공용매를 포함하며, 상기 공용매는 폴리올 용매, 특히 글리콜을 포함한다. 적합한 폴리올 용매의 예는, 예로서 제한없이, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 메틸 에테르, 디에틸렌 글리콜 디메틸 에테르, 트리에틸렌 글리콜 디메틸 에테르, 및 폴리프로필렌 글리콜을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수성 공용매는 폴리에틸렌 글리콜을 포함하며, 이는 다양한 분자량으로 이용가능하다. 특히 유용한 것은 PEG200 내지 PEG600과 같은 보다 낮은 분자량의 글리콜이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 수성 공용매는 PEG200을 약 1% 내지 약 40% v/v; 약 1% 내지 약 40% v/v; 약 2% 내지 약 40% v/v; 약 5% 내지 약 40% v/v; 2% 내지 약 30% v/v; 5% 내지 약 30% v/v; 1 내지 약 20% v/v; 약 2% 내지 약 20% v/v; 약 5% 내지 약 20% v/v; 약 1% 내지 약 10% v/v; 약 2% 내지 약 10% v/v 포함한다. 일부 실시양태에서, 적합한 반응 조건은 PEG200을 약 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 35% 또는 약 40% v/v 포함하는 수성 공용매를 포함한다.
방법의 일부 실시양태에서, 적합한 반응 조건은 수성 공용매를 포함하고, 여기서 공용매는 DMSO를 약 1% 내지 약 80% (v/v), 약 1 내지 약 70% (v/v), 약 2% 내지 약 60% (v/v), 약 5% 내지 약 40% (v/v), 10% 내지 약 40% (v/v), 10% 내지 약 30% (v/v), 또는 약 10% 내지 약 20% (v/v) 포함한다. 방법의 일부 실시양태에서, 적합한 반응 조건은 DMSO를 약 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 또는 80% (v/v) 이상 포함하는 수성 공용매를 포함한다.
아미노교환 반응에서 사용되는 반응물의 양은 일반적으로 목적하는 생성물의 양, 및 이와 동시에, 사용된 트랜스아미나제 기질의 양에 따라 변할 것이다. 당업자는 이러한 양을 변화시켜 이를 목적하는 수준의 생산성 및 생산 규모에 맞추는 방법을 용이하게 이해할 것이다.
일부 실시양태에서, 반응물의 첨가 순서는 중요하지 않다. 반응물은 동시에 용매 (예를 들어 1상 용매, 2상 수성 공용매계 등)에 함께 첨가될 수 있거나, 또는 대안적으로, 반응물 중 일부는 따로, 일부는 함께 다양한 시점에 첨가될 수 있다. 예를 들어 보조인자, 트랜스아미나제 및 트랜스아미나제 기질은 용매에 첫번째로 첨가될 수 있다.
고체 반응물 (예를 들어 효소, 염 등)은 분말 (예를 들어 동결건조된 것, 분무 건조된 것 등), 용액, 에멀젼, 현탁액 등을 비롯한 다양한 상이한 형태로 반응에 제공될 수 있다. 당업자에게 공지된 방법 및 장치를 사용하여 반응물을 용이하게 동결건조 또는 분무 건조시킬 수 있다. 예를 들어 단백질 용액을 -80℃에서 소분취액으로 동결시킨 후, 미리 냉각된 동결건조 챔버에 첨가하고 나서, 진공을 적용할 수 있다.
수성 공용매계가 사용되는 경우에 개선된 혼합 효율을 위해, 트랜스아미나제 및 보조인자를 첨가하여 첫번째 수성 상으로 혼합할 수 있다. 이어서 유기 상을 첨가하고 혼합한 후, 트랜스아미나제 기질을 첨가할 수 있다. 대안적으로, 트랜스아미나제 기질을 유기 상 중에 미리 혼합한 후, 수성 상에 첨가할 수 있다.
아미노교환 반응은 일반적으로, 케톤 기질의 아민 생성물로의 추가의 전환이 반응 시간에 따라 유의하게 변화되지 않을 때까지, 예를 들어 10% 미만의 기질이 전환되거나, 또는 5% 미만의 기질이 전환될 때까지 진행시킨다. 일부 실시양태에서, 기질 케톤이 생성물 아민으로 완전히 또는 거의 완전히 전환될 때까지 반응을 진행시킨다. 기질의 생성물로의 전환은 공지의 방법을 이용하여 기질 및/또는 생성물을 검출함으로써 모니터링할 수 있다. 적합한 방법은 기체 크로마토그래피, HPLC 등을 포함한다. 반응 혼합물에서 생성된 키랄 아민 생성물의 전환율은 일반적으로 약 50%를 초과하며, 또한 약 60%를 초과할 수 있고, 또한 약 70%를 초과할 수 있고, 또한 약 80%를 초과할 수 있고, 또한 90%를 초과할 수 있고, 종종 약 97%를 초과한다. 일부 실시양태에서, 적합한 반응 조건 하에 조작된 트랜스아미나제 폴리펩티드를 사용하여 화학식 II의 화합물을 제조하는 방법은 케톤 기질, 예를 들어 화학식 I의 화합물을 아민 생성물 화합물, 예를 들어 화학식 II의 화합물로 약 48 h 이내, 약 36 h 이내, 약 24 h 이내, 또는 그보다 짧은 시간 이내에 약 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 그 초과로 전환시킨다.
방법의 일부 실시양태에서, 적합한 반응 조건은 약 20 g/L, 30 g/L, 40 g/L, 50 g/L, 60 g/L, 70 g/L, 100 g/L 이상 또는 그 초과의 기질 화합물의 기질 부하를 포함하고, 이러한 방법은 약 48 h 이내, 약 36 h 이내, 또는 약 24 h 이내에 기질 화합물을 생성물 화합물로 약 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 그 초과로 전환시킨다.
본 개시내용의 조작된 트랜스아미나제 폴리펩티드는 적합한 반응 조건 하에 본 방법에 사용될 경우에 키랄 아민을 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9% e.e. 이상의 거울상이성질체 과잉률로 생성한다.
조작된 트랜스아미나제 폴리펩티드를 사용하여 기질 화합물을 아민 생성물 화합물로 전환시키기 위한 방법의 추가 실시양태에서, 적합한 반응 조건은 반응 용액에의 초기 기질 부하를 포함하며, 이는 이후 폴리펩티드에 접촉된다. 이러한 반응 용액은 시간에 걸쳐 약 1 g/L/h 이상, 약 2 g/L/h 이상, 약 4 g/L/h 이상, 약 6 g/L/h 이상, 또는 그 초과의 속도로의 연속 첨가로서 부가적인 화합물 기질이 추가로 보충된다. 따라서, 이러한 적합한 반응 조건에 따르면, 폴리펩티드는 약 20 g/L, 30 g/L, 또는 40 g/L 이상의 초기 기질 부하를 갖는 용액에 첨가된다. 이어서, 폴리펩티드의 첨가에 이어, 약 30 g/L, 40 g/L, 50 g/L, 60 g/L, 70 g/L, 100 g/L, 150 g/L, 200 g/L 이상 또는 그 초과의 훨씬 높은 최종 기질 부하에 이를 때까지 추가의 기질이 약 2 g/L/h, 4 g/L/h, 또는 6 g/L/h의 속도로 용액에 연속 첨가된다. 따라서, 상기 방법의 일부 실시양태에서, 적합한 반응 조건은 약 20 g/L, 30 g/L, 또는 40 g/L 이상의 초기 기질 부하를 갖는 용액에 폴리펩티드를 첨가한 후, 약 30 g/L, 40 g/L, 50 g/L, 60 g/L, 70 g/L, 100 g/L 이상 또는 그 초과의 최종 기질 부하에 이를 때까지 추가의 기질을 용액에 약 2 g/L/h, 4 g/L/h, 또는 6 g/L/h의 속도로 첨가하는 것을 포함한다. 이러한 기질 보충 반응 조건은 케톤 기질의 아민 생성물로의 전환이 약 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 그 초과의 높은 속도로 유지되게 하면서 보다 높은 기질 부하가 달성되게 한다. 이러한 방법의 일부 실시양태에서, 첨가되는 추가의 기질은 이소프로필아민 또는 이소프로필아민 아세테이트를 약 0.5 M 이상, 약 1.0 M 이상, 약 2.5 M 이상, 약 5.0 M 이상, 약 7.5 M 이상, 약 10.0 M 이상의 농도로 포함하는 용액 중에 존재한다.
상기 방법의 일부 실시양태에서, 조작된 트랜스아미나제 폴리펩티드를 사용하는 아미노교환 반응은 하기 적합한 반응 조건을 포함할 수 있다: (a) 기질 부하 약 5 g/L 내지 200 g/L; (b) 트랜스아미나제 폴리펩티드 약 0.1 내지 50 g/L; (c) 이소프로필아민 (IPM) 약 0.1 내지 4 M; (d) 피리독살 포스페이트 (PLP) 보조인자 약 0.1 내지 10 g/L; (e) pH 약 6 내지 9; 및 (f) 온도 약 30 내지 60℃.
상기 방법의 일부 실시양태에서, 조작된 트랜스아미나제 폴리펩티드를 사용하는 아미노교환 반응은 하기 적합한 반응 조건을 포함할 수 있다: (a) 기질 부하 약 5 내지 약 20 g/L; (b) 트랜스아미나제 폴리펩티드 약 0.05 내지 2 g/L; (c) PEG200 약 1 내지 10% v/v; (d) 이소프로필아민 (IPM) 약 1 내지 2 M; (e) 피리독살 포스페이트 (PLP) 보조인자 약 0.1 내지 1 g/L; (f) 트리에탄올아민 (TEA) 약 0.1 내지 약 0.5 M; (g) pH 약 6 내지 8; 및 (h) 온도 약 45 내지 55℃.
상기 방법의 일부 실시양태에서, 조작된 트랜스아미나제 폴리펩티드를 사용하는 아미노교환 반응은 하기 적합한 반응 조건을 포함할 수 있다: (a) 기질 부하 약 25 내지 약 100 g/L; (b) 트랜스아미나제 폴리펩티드 약 0.5 내지 10 g/L; (c) PEG200 약 1 내지 10% v/v; (d) 이소프로필아민 (IPM) 약 1 내지 2 M; (e) 피리독살 포스페이트 (PLP) 보조인자 약 0.1 내지 1 g/L; (f) 트리에탄올아민 약 0.1 내지 약 0.5 M; (g) pH 약 6 내지 8; 및 (h) 온도 약 45 내지 55℃.
일부 실시양태에서, 반응 조건을 보충하기 위해 부가적인 반응 성분 또는 부가적인 기술이 수행되었다. 이들은 효소의 불활성화를 안정화 또는 방지하거나, 생성물 억제를 감소시키거나, 반응 평형을 생성물 아민 형성으로 이동시키기 위한 조치를 취하는 것을 포함할 수 있다.
따라서, 아민, 예컨대 키랄 아민을 제조하기 위한 방법의 일부 실시양태에서, 부가적인 양의 아미노 수용자를 (포화될 때까지) 첨가할 수 있고/거나 형성되는 아미노 수용자 (케톤)을 반응 혼합물로부터 연속적으로 제거할 수 있다. 예를 들어 용매 브리지 또는 2상 공용매계를 사용하여 아민 생성물을 추출 용액으로 옮길 수 있고, 그에 의해 아민 생성물에 의한 억제를 감소시키고 또한 평형을 생성물 형성 쪽으로 이동시킬 수 있다 (예를 들어 [Yun and Kim, 2008, BioSci. Biotechnol. Biochem. 72(11):3030-3033] 참조).
방법의 일부 실시양태에서, 적합한 반응 조건은 환원된 보조인자, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NADH)의 존재를 포함하고, 이는 트랜스아미나제 효소의 불활성화를 제한하는 작용을 할 수 있다 (예를 들어 [van Ophem et al., 1998, Biochemistry 37(9):2879-88] 참조). NADH가 존재하는 이러한 실시양태에서, 보조인자 재생 시스템, 예컨대 글루코스 데히드로게나제 (GDH) 및 글루코스 또는 포르메이트 데히드로게나제 및 포르메이트를 사용하여 반응 매질 중에서 NADH를 재생시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 아미노 기가 아미노 기 수용자로 전달될 때 아미노 기 공여자로부터 형성되는 카르보닐 부산물을 제거하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 계내 제거는 역 반응 속도를 감소시켜 정 반응을 우세하게 하고, 이어서 보다 많은 기질이 생성물로 전환되게 할 수 있다. 카르보닐 부산물의 제거는 다양한 방식으로 이루어질 수 있다. 아미노 기 공여자가 아미노산, 예컨대 알라닌인 경우에, 카르보닐 부산물인 케토산은 퍼옥시드를 이용한 반응으로 제거할 수 있다 (예를 들어 본원에 참조로 포함되는 US 2008/0213845 참조). 사용할 수 있는 퍼옥시드는, 특히 과산화수소; 퍼옥시산 (과산), 예컨대 퍼아세트산 (CH3CO3H), 트리플루오로퍼아세트산 및 메타크롤로퍼옥시벤조산; 유기 퍼옥시드, 예컨대 t-부틸 퍼옥시드 ((CH3)3COOH) 또는 다른 선택적 산화제, 예컨대 테트라프로필암모늄 퍼루테네이트, MnO2, KMnO4, 루테늄 테트록시드 및 관련 화합물을 포함한다. 대안적으로, 피루베이트를 락테이트 데히드로게나제를 이용한 락테이트로의 환원을 통해 제거하여, 평형을 생성물 아민으로 이동시킬 수 있다 (예를 들어 [Koszelewski et al., 2008, Adv. Syn. Catal. 350: 2761-2766] 참조). 피루베이트는 또한 피루베이트 데카르복실라제 (예를 들어 [Hoehne et al., 2008, Chem BioChem 9: 363-365] 참조) 또는 아세토락테이트 신타제 (Yun and Kim, 상기 문헌 참조)를 이용한 탈카르복실화를 통해 제거할 수 있다.
대안적으로, 아미노 기 공여자로서 아미노산이 사용되는 실시양태에서, 케토 산 카르보닐 부산물은 암모니아와 같은 아민 공여자의 존재 하에 적절한 데히드로게나제 효소, 예를 들어 아미노산 데히드로게나제를 사용하여 암모니아 및 NADH를 반응시켜 다시 아미노산으로 재활용함으로써, 아미노 기 공여자를 보충할 수 있다.
일부 실시양태에서, 아미노 공여자의 선택이 물보다 높은 증기압을 갖는 카르보닐 부산물을 생성시키는 경우에 (예를 들어 휘발성 유기 카르보닐 화합물과 같은 비점이 낮은 공-생성물), 카르보닐 부산물은 반응 용액에 비-반응성 기체를 주입하거나, 또는 진공을 적용하여 반응 압력을 낮추고 기체 상으로 존재하는 카르보닐 부산물을 제거함으로써 제거할 수 있다. 비-반응성 기체는 반응 성분과 반응하지 않는 임의의 기체이다. 다양한 비-반응성 기체는 질소 및 영족 기체 (예를 들어 불활성 기체)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-반응성 기체는 질소 기체이다. 일부 실시양태에서, 방법에 사용되는 아미노 공여자는 이소프로필아민 (IPM)이고, 이는 아미노 기가 아미노 기 수용자로 전달될 때 카르보닐 부산물 아세톤을 형성한다. 아세톤은 질소 기체를 주입하거나, 또는 반응 용액에 진공을 적용하고 아세톤 포집기, 예컨대 응축기 또는 다른 냉각 포집기로 기체 상으로부터 아세톤을 제거함으로써 제거할 수 있다. 대안적으로, 아세톤은 트랜스아미나제를 사용하여 이소프로판올로 환원시키는 것에 의해 제거할 수 있다.
카르보닐 부산물을 제거하는 방법의 일부 실시양태에서, 아미노교환 반응 동안 상응하는 아미노 기 공여자를 첨가하여 아미노 기 공여자를 보충하고/거나 반응의 pH를 유지시킬 수 있다. 아미노 기 공여자를 보충하는 것은, 또한 평형을 생성물 형성 쪽으로 이동시켜 기질의 생성물로의 전환을 증가시킨다. 따라서, 아미노 기 공여자가 이소프로필아민이고 아세톤 생성물이 계내 제거되는 일부 실시양태에서, 이소프로필아민을 용액에 첨가하여 아세톤 제거 동안 손실되는 아미노 기 공여자를 보충하고, 반응물의 pH를 (예를 들어 약 8.5로) 유지시킬 수 있다.
추가 실시양태에서, 기질 화합물을 생성물 화합물로 전환시키기 위한 임의의 상기 방법은, 생성물 화합물의 추출; 단리; 정제 및 결정화로부터 선택된 1개 이상의 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 개시된 방법에 의해 생성된 생체촉매적 반응 혼합물로부터 생성물 아민을 추출, 단리, 정제 및/또는 결정화하기 위한 방법, 기술 및 프로토콜은 당업자에게 공지되어 있고/거나 통상적인 실험을 통해 접근가능하다. 추가로, 예시적인 방법을 하기 실시예에서 제공한다.
섹션 J:
실시예
하기 실시예는 본 발명의 범위를 제한하지 않으면서 본 발명을 예시하는 역할을 하며, 다른 한편으로는 이들은 본 발명의 반응 단계, 중간체 및/또는 방법의 바람직한 실시양태를 제시한다.
약어:
실시예
1: 케톤 중간체의 합성
6-
클로로
-5-
플루오로
-3-히드록시-3-(2-옥소-프로필)-1,3-
디히드로
-인돌-2-온
아세톤 (620 ml) 중 6-클로로-5-플루오로-이사틴 (25 g, 125 mmol)의 현탁액에, Et2NH (0.9 g, 12.5 mmol) 및 K2CO3 (1.7g, 12.5 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 환류 하에 2 시간 동안 가열하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 여과하고, 용매를 감압 하에 제거하였다. 조 생성물을 50℃에서 MeOH (300 ml) 중에 재용해시키고, 물 (300 ml)을 첨가하였다. 물의 첨가로 고체가 침전되었다. MeOH (250 mL)를 감압 하에 50℃에서 제거하였다. 혼합물을 0-5℃로 냉각시키고, 30분 동안 교반하였다. 고체를 여과하고, 건조시켜 6-클로로-5-플루오로-3-히드록시-3-(2-옥소-프로필)-1,3-디히드로-인돌-2-온 (27g)을 수득하였다.
HPLC 방법: 칼럼: 애질런트 익스텐드(Agilent Extend)-C18; 150×3.0mm; 3.5 μm. 물 중 이동상 A (0.1% H3PO4), 이동상 B (아세토니트릴). 구배: 0 분 (95% A); 0.5 분 (95% A), 14 분 (5% A), 19.5 분 (5% A). 유량: 0.5 ml 분-1. 파장: 210 nm. 온도: 40℃. 체류 시간: 7.52 분.
6-
클로로
-5-
플루오로
-3-히드록시-3-(2-
메틸
-[1,3]
디옥솔란
-2-
일메틸
)-1,3-디히드로-인돌-2-온
에틸렌 글리콜 (250 mL) 중 6-클로로-5-플루오로-3-히드록시-3-(2-옥소프로필)인돌린-2-온 (25g, 97mmol)의 현탁액에, 트리에틸 오르토포르메이트 (43g, 291mmol) 및 톨루엔-4-술폰산 1수화물 (0.9g, 4.8mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 40-50℃에서 2 시간 동안 가열하였다. MeTHF (500 mL) 및 10% NaCl 수용액 (500 mL)을 연속적으로 첨가하였다. 유기 층을 분리하고, 물로 2회 세척하였다. 용매를 진공 하에 증발시킨 후, 백색 고체를 TBME (400 mL)로 세척하고, 건조시켜 6-클로로-5-플루오로-3-히드록시-3-(2-메틸-[1,3]디옥솔란-2-일메틸)-1,3-디히드로-인돌-2-온 (27.8 g)을 수득하였다.
HPLC 방법: 칼럼: 애질런트 익스텐드-C18; 150×3.0mm; 3.5 μm. 물 중 이동상 A (0.1% H3PO4); 이동상 B (아세토니트릴). 구배: 0 분 (95% A); 0.5 분 (95% A), 14 분 (5% A), 19.5 분 (5% A). 유량: 0.5 ml 분-1. 파장: 210 nm. 온도: 40℃. 체류 시간: 7.94 분.
1-(6-
클로로
-5-
플루오로
-1H-인돌-3-일)-프로판-2-온
THF (250 mL) 중 6-클로로-5-플루오로-3-히드록시-3-((2-메틸-1,3-디옥솔란-2-일)메틸)인돌린-2-온 (27.8g, 92mmol)의 용액에, THF (100 mL) 중 적색-Al (79.8g, 276mmol)를 60℃에서 N2 분위기 하에 천천히 첨가하였다. 첨가한 후, 혼합물을 실온에서 3 시간 동안 교반하였다. 20% HCl (400 mL)을 첨가하고, 혼합물을 20분 동안 교반하였다. 에틸 아세테이트 (500 mL)를 첨가하고, 10분 동안 교반하였다. 유기 층을 분리하고, 물 (100ml x 2)로 세척하였다. Na2SO4 (50 g) 및 활성탄 (5 g)으로 실온에서 처리한 후, 혼합물을 여과하고, 여과물을 농축시켰다. 조 생성물을 MeOH (80 mL) 및 물 (60 mL)로 재결정화하여 1-(6-클로로-5-플루오로-1H-인돌-3-일)-프로판-2-온 (15.5 g)을 수득하였다.
HPLC 방법: 칼럼: 애질런트 익스텐드-C18; 150×3.0mm; 3.5 μm. 물 중 이동상 A (0.1% H3PO4); 이동상 B (아세토니트릴). 구배: 0 분 (95% A); 0.5 분 (95% A), 14 분 (5% A), 19.5 분 (5% A). 유량: 0.5 ml 분-1. 파장: 210 nm. 온도: 40℃. 체류 시간: 10.75 분.
실시예
2: 제2 대안적 케톤 출발 물질의 합성
1-(6-
클로로
-5-
플루오로
-1H-인돌-3-일)-프로판-2-온
N2 하에, Pt/C (10 g, 탄소상 5% Pt)를 에틸 아세테이트 (500 mL) 중의 6-클로로-5-플루오로-3-((Z)-2-니트로-프로페닐)-1H-인돌 (100 g, 0.39 mol)의 현탁액에 넣었다. 반응 혼합물에 진공을 걸고, H2로 3회 퍼징하고, 실온에서 밤새 교반하였다. 촉매를 여과하고, 유기 용매를 감압 하에 제거하여 갈색 오일을 수득하였다. 오일을 EtOH (500 mL) 중에 재용해시키고, H2O 중 중아황산나트륨 (81.7 g, 0.79 mol)을 첨가하였다. 현탁액을 80℃까지 밤새 가열하였다. 침전물을 여과하고, 에탄올을 압력 하에 제거하였다. 잔류물을 물 (500 mL)로 희석하고, 에틸 아세테이트 (300mL X2)로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 회전 증발기 상에서 응축시켜, 갈색 오일 (53 g, 60% 수율)을 수득하였다.
실시예
3: 제2 대안적 케톤 중간체의 합성
1-(6-
클로로
-5-
플루오로
-1H-인돌-3-일)-프로판-2-온
라니/Ni (0.75g) 및 아세트산 (1.1 mL, 19.6 mmol)을 MeOH 및 H2O의 혼합물 (2:1, 50 mL) 중의 6-클로로-5-플루오로-3-((Z)-2-니트로-프로페닐)-1H-인돌 (5g, 19.6 mmol)의 현탁액에 실온에서 넣었다. 반응 혼합물에 진공을 걸고, H2로 3회 퍼징하고, 50℃에서 밤새 가열하였다. MeOH (50 mL)를 반응 혼합물에 첨가하고, 촉매를 셀라이트로 여과하였다. 용매를 50 mL로 농축시키고, H2O (300 ml)를 첨가하였다. H2O 첨가에 의해, 회백색 고체가 생성되었다. 고체를 여과하고, 물로 세척하였다. 오븐에서 건조시킨 후, 2.53 g의 회백색 고체가 단리되었다.
실시예
4: 조작된
트랜스아미나제
폴리펩티드의 합성, 최적화, 및 스크리닝
유전자 합성 및 최적화: 서열 2의 비브리오 플루비알리스로부터의 보고된 야생형 오메가 트랜스아미나제 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 코돈 최적화하고, 서열 1의 유전자로서 합성하였다. 서열 1의 합성 유전자를 pCK110900 벡터 시스템으로 클로닝하고 (예를 들어 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 출원 공개 20060195947 참조), 이어서 이. 콜라이 W3110fhuA에서 발현시켰다. 이. 콜라이 W3110은 트랜스아미나제 폴리펩티드를 lac 프로모터의 제어 하에 세포내 단백질로서 발현한다. 코돈-최적화된 유전자 서열 1의 지시된 진화에 의해 서열 4의 조작된 트랜스아미나제 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (서열 3)을 수득하였다. 서열 4의 폴리펩티드는 서열 2와 관련하여 24개의 아미노산 잔기 차이를 갖는다 (A9T; G18A; D21H; V31M; N45H; F86Y; A133R; R146L; W147K; V153S; K163F; V177L; R211K; P233T; A235P; P244T; M294V; P318D; A323T; S324G; A383V; T391A; C424A; F427Y). 이러한 합성 유전자 서열 3 (서열 4의 폴리펩티드를 코딩함)을, 유전자 합성에 이어 히트를 스크리닝 및 서열분석하는 것에 의한 반복적 변이체 라이브러리 생성을 통해 표준 방향적 진화 방법을 이용하여 추가의 최적화를 위한 출발 백본으로 사용함으로써, 폴리펩티드 서열 2 및 4와 관련하여 효소 특성이 개선된, 화합물 IA를 화합물 IIA로 전환시킬 수 있는 조작된 트랜스아미나제를 코딩하는 유전자를 생성하였다. 생성된 조작된 트랜스아미나제 폴리펩티드 서열 및 구체적인 돌연변이 및 관련 활성을 표 2A에 열거한다.
실시예
5: 조작된
트랜스아미나제의
생성
조작된 트랜스아미나제 폴리펩티드를, 이. 콜라이 W3110 내에서 lac 프로모터의 제어 하에 발현된 세포내 단백질로서 생산하였다. 폴리펩티드는 주로 가용성 시토졸 활성 효소로서 축적된다. 진탕-플라스크 절차를 이용하여 조작된 폴리펩티드 분말을 생성하였고, 이는 본원에 개시된 활성 검정 또는 생체촉매 방법에 사용될 수 있다.
고처리량 성장 & 발현. 세포를 골라내어 1% 글루코스 및 30 ㎍/mL 클로람페니콜 (CAM)을 함유하는 LB 배지 중에서 밤새 성장시켰다 (30℃, 200 rpm, 85% 습도). 밤샘 성장물 20 μL를 30 μg/mL CAM, 1 mM IPTG, 1 mM MgSO4를 함유하는 380 μL 2xYT 성장 배지를 함유하는 깊은 웰 플레이트로 옮기고, 30℃, 200 rpm, 85% 습도에서 ~18 h 동안 인큐베이션하였다. 계대배양 TB 배지를 TB 배지 (380 uL/웰), 30 μg/mL CAM, 1 mM MgSO4, 및 1 mM IPTG로 구성하였다. 세포 배양물을 4000 rpm, 4℃에서 10분 동안 원심분리하고, 배지를 따라내었다. 세포 펠릿을 이하에서 기재하는 바와 같이, 200 또는 400 μL 용해 완충제 (0.1 M 트리에탄올아민 (TEA) 완충제, pH 9.0, 1 mM MgSO4, 400 μg/mL PMBS 및 500 μg/mL 리소자임을 함유함) 중에 재현탁시켰다.
진탕 플라스크 분말 ( SFP )의 제조: 진탕 플라스크 절차를 이용하여 본원에 개시된 2차 스크리닝 검정 또는 생체촉매 방법에서 사용할 조작된 트랜스아미나제 폴리펩티드 분말을 생성하였다. 진탕 플라스크 분말 (SFP)은 대략 30%의 총 단백질을 포함하며, 따라서 HTP 검정에 사용되는 세포 용해물과 비교하여 보다 정제된 조작된 효소 제제를 제공한다. 관심 대상인 조작된 트랜스아미나제를 코딩하는 플라스미드를 함유하는 이. 콜라이의 단일 미생물 콜로니를 30 μg/ml 클로람페니콜 및 1% 글루코스를 함유하는 50 mL 루리아 베르타니(Luria Bertani) 브로쓰에 접종하였다. 세포를 밤새 (16 시간 이상) 30℃의 인큐베이터 내에서 250 rpm으로 진탕하면서 성장시켰다. 배양물을 1 리터 플라스크 내에서 30 ㎍/ml 클로람페니콜을 함유하는 250 mL 테리픽(Terrific) 브로쓰 (12 g/L 박토-트립톤, 24 g/L 효모 추출물, 4 mL/L 글리세롤, 65 mM 인산칼륨, pH 7.0, 1 mM MgSO4) 중으로 600 nm (OD600)에서의 광학 밀도 0.2로 희석시키고, 30℃에서 성장시켰다. 배양물의 OD600이 0.6 내지 0.8일 때 이소프로필-β-D-티오갈락토시드 ("IPTG")를 최종 농도 1 mM로 첨가하여 트랜스아미나제 유전자의 발현을 유도한 후, 인큐베이션을 밤새 (16 시간 이상) 계속하였다. 원심분리 (5000 rpm, 15분, 4℃)에 의해 세포를 수확하고, 상청액을 따라내었다. 세포 펠릿을 동부피의 냉 (4℃) 100 mM 트리에탄올아민 (클로라이드) 완충제, pH 7.0 (임의로 2 mM MgSO4 포함)으로 재현탁시키고, 상기한 바와 같이 원심분리에 의해 수확하였다. 세척한 세포를 2 부피의 냉 트리에탄올아민 (클로라이드) 완충제 중에 재현탁시키고, 4℃로 유지하면서 프렌치 프레스를 통해 12,000 psi에서 2회 통과시켰다. 원심 분리 (9000 rpm, 45 분, 4℃)에 의해 세포 잔해물을 제거하였다. 투명한 용해물 상청액을 수집하고, -20℃에서 저장하였다. 동결된 투명한 용해물의 동결건조는 조 트랜스아미나제 폴리펩티드의 건조 진탕-플라스크 분말을 제공한다. 대안적으로, 세포 펠릿 (세척 이전 또는 이후)을 4℃ 또는 -80℃에서 저장할 수 있다.
하류 공정 ( DSP ) 분말의 제조: DSP 분말은 대략 80%의 총 단백질을 함유하고, 따라서 고처리량 검정에 사용되는 세포 용해물과 비교하여 보다 정제된 조작된 트랜스아미나제 효소 제제를 제공한다. DSP 분말의 생산을 위해 보다 큰 규모 (~100 - 120 g)의 조작된 트랜스아미나제 발효를 짧은 배치로 수행한 후, 표준 생물공정 방법에 따라 회분 공정을 수행할 수 있다. 간략하게, IPTG를 최종 농도 1 mM로 첨가하여 트랜스아미나제 발현을 유도한다. 발효 후에, 세포를 수확하고, 100 mM 트리에탄올아민-H2SO4 완충제 중에 재현탁시키고, 이어서 균질화에 의해 기계적으로 분쇄한다. 세포 잔해물 및 핵산을 폴리에틸렌이민 (PEI)으로 응집시키고, 원심분리에 의해 현탁액을 투명하게 한다. 생성된 투명한 상청액을 접선 교차-흐름 한외여과 막을 이용하여 농축시켜 염 및 물을 제거한다. 이어서, 농축되고 부분적으로 정제된 효소 농축액을 동결건조기 내에서 건조시키고 포장할 수 있다 (예를 들어 폴리에틸렌 용기 내로).
실시예
6: 분석 절차
HTP 반응의 HPLC 분석: 켄칭된 반응의 분취액을 하기 조건 하에 HPLC 분석하였다.
화합물 IA의 화합물 IIA로의 전환은 다음과 같은 생성된 크로마토그램으로부터 결정하였다:
전환 (%) = 생성물 영역/(생성물 영역 + 기질 영역 x 0.73) x 100%
5 mL 및 100 mL 규모 반응의 HPLC 분석: 켄칭된 반응의 분취액을 하기 조건 하에 HPLC 분석하였다.
화합물 IA의 화합물 IIA로의 전환은 다음과 같은 크로마토그램으로부터 결정하였다:
전환 (%) = 생성물 영역/(생성물 영역 + 기질 영역 x 0.73) x 100%
생성물 키랄 순도 (% ee )의 결정: 화합물 IIA의 키랄 순도 또는 거울상이성질체 과잉률은 하기 조건을 사용하여 HPLC에 의해 평가하였다.
생성물 순도의 결정: 생성물의 순도는 하기 조건을 사용하여 HPLC에 의해 결정하였다.
실시예
7: 화합물
IA
의 화합물
IIA
로의 전환에 대한
트랜스아미나제의
고처
리량 (HTP) 스크리닝
HTP 스크리닝 검정: 변이체의 1차 선택을 가이드하는데 사용되는 고처리량 스크리닝은, 96-웰 플레이트에서 세포 용해물을 사용하여 10 g/L 화합물 IA; 1 mM 피리독살 포스페이트 (PLP); 2 M 이소프로필아민 (IPM), pH 7.0; 0.1 M 트리에탄올아민 (TEA), pH 7; 5% v/v PEG200; 10 uL 용해물; 및 50 또는 55℃의 검정 조건 하에 수행하였다.
세포를 상기한 바와 같이 96-웰 플레이트에서 성장시키고, 200 uL (1 라운드 용) 또는 400 uL (2 라운드 용)의 용해 완충제 (1 mg/mL 리소자임, 0.5 mg/mL 폴리믹신 B 술페이트, 1 mM PLP, 0.1 M 트리에탄올아민 (TEA), pH 7.0)를 각 웰에 분배하여 용해물을 제조하였다. 플레이트를 밀봉하고, 2 h 동안 진탕하고, 이어서 20분 동안 4,000 rpm으로 4℃에서 원심분리하여 세포 잔해물을 펠릿화하였다.
기질 원액 10 uL (PEG200 중에 용해된 200 g/L 화합물 IIA)를 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가한 후, 이소프로필아민 (IPM)/피리독살 포스페이트 (PLP) (100 mM TEA 중 2.2 M IPM 및 1.06 mM PLP, pH 7.0) 원액 180 uL를 첨가하였다. 생성물 화합물 IIA 억제에 대한 내화성을 평가하기 위해, 화합물 IIA를 반응 혼합물에 1 라운드 검정의 경우에 최종 14 g/L로, 2 라운드 검정의 경우에 최종 16 g/L로 첨가하였다. 반응은 10 uL의 세포 용해물/웰을 첨가하여 개시시켰다. 플레이트를 밀봉하고, 50 또는 55℃에서 24 h 동안 진탕하면서 인큐베이션하였다. 600 uL 아세토니트릴을 사용하여 반응을 켄칭시키고, 실시예 5에 기재된 바와 같이 HPLC에 의해 샘플을 검사하였다.
실시예
8: 5
mL
규모에서의 화합물
IA
의 화합물
IIA
로의 전환을 위한 방법
5 ml 규모 반응은 다음과 같이 수행하였다. 교차형 자기 교반용 막대가 장착된 20 mL 유리 바이알에 100 mM TEA 완충제 (pH 7.0) 0.75 mL (또는 10% v/v PEG 200 농도의 경우에 0.5 mL)를 첨가하였다. 5 M IPM·HCl 원액 2 mL를 바이알에 첨가한 후, 5 mM PLP 원액 1 mL를 첨가하였다. 혼합물을 500 rpm에서 교반하였다 (자기 교반). 1 M NaOH 용액을 사용하여 혼합물의 pH를 7.0으로 조정하였다. 이어서, 기질 (고체) 125 mg (또는 50 g/L 농도의 경우에 250 mg 또는 100 g/L 농도의 경우에 500 mg)을 바이알에 첨가하였다. 이어서, PEG 200 0.25 mL (또는 10% v/v의 경우에 0.5 mL)를 혼합물에 첨가하였다. 성분의 최종 농도는 화합물 IA 25 g/L (또는 50 또는 100 g/L); 1 mM PLP; 2 M IPM; 5% v/v (또는 10%) PEG 200; 2 g/L TA 효소; 100 mM TEA, pH 7.0이었다. 이어서 혼합물을 교반하고, 50℃로 가열하였다.
효소 원액 (10 g/L) 1 mL를 첨가하여 반응을 개시시켰다. 다양한 시점에 샘플 20 uL를 취하고, 메탄올 750 uL로 희석시키고, HPLC에 의해 분석하였다. 24 h 후, 반응 혼합물을 5 mL 아세토니트릴로 켄칭시키고, 샘플을 HPLC에 의해 분석하여 최종 % 전환을 수득하였다.
실시예
9: 100
mL
규모에서의 화합물
IA
의 화합물
IIA
로의 전환을 위한 방법
100 mL 규모 반응은 다음과 같이 수행하였다. 앵커형 교반 날개가 장착된 250 mL 둥근 바닥 플라스크에 100 mM TEA 완충제 (pH 7) 15 mL를 첨가하였다. 5 M IPM·HCl 원액 40 mL를 둥근 바닥 플라스크에 첨가한 후, 5 mM PLP 원액 20 mL를 첨가하였다. 혼합물을 100 rpm에서 교반하고 (오버헤드 교반), 10 M NaOH를 사용하여 pH를 7.0으로 조정하였다. 이어서, 고체 기질 화합물 IA를 둥근 바닥 플라스크에 ~5 분에 걸쳐 교반하면서 첨가하였다. 이어서 PEG 200 (5 mL)을 첨가하고, 혼합물을 50℃로 가열하였다. 이어서, 효소 원액 (10 g/L) 20 mL를 첨가하여 반응을 출발시켰다. 반응물을 200 rpm에서 교반하였다 (오버헤드 교반). 다양한 시점에 샘플 20 uL를 취하고, 메탄올 750 uL로 희석시키고, HPLC에 의해 분석하였다. 후처리가 추구되지 않는 일부 경우는, 24 h 후에 반응 혼합물을 100 mL 아세토니트릴로 켄칭시키고, 샘플을 HPLC에 의해 분석하여 최종 % 전환을 수득하였다 (도 9). 반응물 중 다양한 성분의 농도: 케톤: 25 g/L (또는 50 또는 100 g/L); PLP: 1 mM; IPM: 2 M; PEG200: 5% v/v; TA 효소: 2 g/L; 완충제: 100 mM TEA, pH 7.0. 기질의 생성물로의 전환은 실시예 3에 기재된 바와 같이 HPLC에 의해 분석하였다.
생성물 후처리: 상기한 조건 하에 24 h 반응 후 (포인트 11까지), 반응 혼합물을 실온으로 냉각시켰다. 혼합물을 한 장의 여과지 (와트만 1, 구멍 크기 11 μm)가 깔린 표준 G4 소결 유리 깔대기를 통해 여과하였다. 둥근 바닥 플라스크를 탈이온수 20 mL로 헹군 후, 이를 동일한 깔대기를 통해 여과하였다. 필터 케이크를 탈이온수 20 mL로 2회 세척하였다. 5 M HCl 용액을 이용하여 여과물의 pH를 6.8 내지 3으로 조정하였다. 이어서, 여과물을 분리 깔대기로 옮기고, 100 mL MTBE로 추출하였다. 2상 혼합물이 분리되게 하였다. 미반응 기질 및 불순물을 함유하는 MTBE 층을 따라내었다. 수성 층을 비커로 옮기고, 100 mL MTBE를 첨가하였다. 이어서, 10 M NaOH 용액을 사용하여 수성 층의 pH를 3 내지 10으로 조정하였다. 혼합물을 분리 깔대기로 옮기고, 상이 분리되게 하였다. 이어서, 수성 층을 100 mL MTBE로 3회 추출하였다 (nb: 생성물이 수성 층에 존재하지 않을 때까지 반복). 3회의 추출로부터의 MTBE 상을 합하고, 회전 증발기를 사용하여 증발 건조시켰다. 조 생성물을 추가로 진공 하에 48 h 동안 건조시켰다.
실시예
10: 30g 규모에서의 화합물
IA
의 화합물
IIA
로의 전환을 위한 방법
152.48g 이소프로필아민 히드로클로라이드 및 0.204g 피리독살포스페이트 1수화물을 495ml 물 중에 교반하면서 용해시켰다. 이러한 황색 투명한 용액에 85ml 폴리 에틸렌 글리콜 중의 30.0g 케톤 용액 (평균 mol 중량 200)을 15분 이내에 첨가하였다. 첨가시, 케톤은 미립자로서 침전되었고, 반응 매질 중에 고르게 분산되었다. 현탁액에 180ml 트리에탄올아민 완충제 (0.1 mol/l, pH 7)를 첨가하고, 수성 수산화나트륨 용액 (1 mol/l)을 첨가하여 pH를 7로 조정하였다. 반응 혼합물을 50℃로 가열하고, 162ml 트리에탄올아민 완충제 (0.1 mol/l, pH 7) 중에 용해된 트랜스아미나제 서열 134 1.62g의 용액을 첨가하였다. 1 mol/l 수성 수산화나트륨 용액을 첨가하여 반응 혼합물을 계속해서 pH 7로 유지시켰다. 반응 혼합물을 50℃에서 24 h 교반하고, 반응 혼합물 표면 위로 질소 기류를 취입시켜, 형성된 아세톤을 스트리핑 제거하였다. 이어서, 반응 혼합물을 25℃로 냉각시키고, 셀룰로스 플록 층 상에서 여과하였다. 진한 황산을 첨가하여 여과물의 pH를 
1로 조정하였다. 산성화된 여과물을 250 ml 이소-프로필 아세테이트로 추출하였다. 층을 분리시키고, 진한 수성 수산화나트륨 용액을 첨가하여 수성 상의 pH를 
10으로 조정하였다. 염기화된 수성 상을 이소-프로필 아세테이트로 추출하였다. 층을 분리시키고, 유기 상을 100 ml 물로 세척하였다. 유기 상을 증류에 의해 그의 원래 부피의 2/3로 농축시켰다. 제2 반응기에서 33.98g (+)-캄포르 술폰산을 225 ml 이소-프로필 아세테이트에 환류 중 용해시키고, 농축된 유기 상을 10 분 이내에 첨가하였다. 첨가를 완료한 후 형성된 얇은 현탁액을 2시간 이내에 0℃로 냉각시키고, 15시간 동안 0℃로 유지시켰다. 침전된 아민-(+)-캄포르 술포네이트 염을 여과하고, 70 ml 이소-프로필 아세테이트로 세척하고, 40℃에서 진공 중에 건조시켜, 무색 결정 51.57g을 수득하였다 (84.5% 수율 t.q.)
분석 데이터
유리 아민 (염기화된 수성 층을 추출한 후 이소-프로필아세테이트 층을 증발시키는 것에 의해 수득됨):
실시예
11: 화합물
IIA
의 화합물
IVB
로의 전환을 위한 방법
13.62 g 5-클로로이사틴을 35 ml 이소-프로판올 중에 현탁시키고, 2.3 g 트리에틸 아민을 첨가하였다. 현탁액을 환류 하에 가열하고, 300 ml 이소-프로판올 중에 용해된 34.42g 아민-(+)-캄포르 술포네이트 염 용액을 50분 내에 첨가하였다. 반응 혼합물을 환류 하에 17시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 75℃로 냉각시키고, 17.4g (+)-캄포르술폰산을 반응 혼합물에 첨가하였다. 대략 300 ml 이소-프로판올을 진공 증류에 의해 제거하였다. 증류 제거된 이소-프로판올을 이소-프로필 아세테이트로 대체하고, 진공 증류를 계속하였다. 이러한 증류를 2회 반복하였다. 증류 잔류물에 19 ml 에탄올 및 265 ml 에틸 아세테이트를 첨가하고, 혼합물을 환류 하에 가열하였다. 혼합물을 점차적으로 0℃로 냉각시키고, 0℃에서 24 시간 동안 유지시켰다. 베이지색 내지 회백색 결정을 여과하고, 사전에 냉각시킨 (0℃) 에틸아세테이트로 3번 나누어 세척하고 (각각 25 ml), 진공 중에 건조시켜, 40.3 g 베이지색 내지 회백색 결정을 수득하였다. (86.3% 수율 t.q.)
실시예
12: 화학식
IVA
의 화합물 ½ 수화물의 제조를 위한 방법
임펠러 교반기가 장착된 750ml 반응기에서, 화합물 IVB 염 50g을 300ml 에탄올 (ALABD) 및 100 ml 탈이온수 (WEM) 중에 용해시켰다. 투명한 황색빛 용액을 58℃ 내부 온도로 가열하였다. 상기 용액에, 10% 수성 탄산나트륨 용액 85 g을 10 분 내에 첨가하였다. 투명한 용액을 제2 반응 용기로 입자 여과하였다. 용기 및 입자 필터를 각각 제2 반응 용기에서 에탄올:물 (3:1 v/v)의 혼합물 25 ml로 헹구었다. 합한 입자 여과된 용액을 58℃ 내부 온도로 가열하고, 200ml 물 (WEM)을 15분 내에 적가하였다. 첨가 말기에 용액이 혼탁해졌다. 혼합물을 10 분 동안 58℃ 내부 온도에서 교반한 다음, 4시간 30분 이내에 실온으로 천천히 냉각시켰고, 진하고 양호하게 교반가능한 백색 현탁액이 형성되었다. 현탁액에 200 ml 물을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 추가로 15시간 20분 동안 교반하였다. 현탁액을 여과하고, 필터 케이크를 에탄올:물 9:1 (v/v) 혼합물의 25 ml 부분으로 2회 세척하였다. 무색 결정을 60℃에서 진공 하에 건조시켜 26.23g을 수득하였다 (=91.2% 수율).
SEQUENCE LISTING
<110> Novartis AG
CROWE, Michael
FOULKES, Michael
FRANCESE, Giancarlo
GRIMLER, Dominique
KUESTERS, Ernst
LAUMEN, Kurt
LI, Yunzhong
LIN, Changxue
NAZOR, Jovana
RUCH, Thomas
SMITH, Derek
SONG, Shiwei
TENG, Shangjun
<120> CHEMICAL PROCESS FOR PREPARING
SPIROINDOLONES AND INTERMEDIATES THEREOF
<130> PAT055051-WO-PCT
<140>
<141>
<150> PCT/CN2012/000359
<151> 2012-03-23
<160> 154
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1362
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Codon optimized transaminase gene from Vibrio fluvialis
<400> 1
atgaacaaac cgcagagctg ggaagcgcgt gcggaaacct atagcctgta tggctttacc 60
gatatgccga gcctgcatca gcgtggcacc gtggtggtga cccatggcga aggcccgtat 120
atcgtggatg tgaacggccg tcgttatctg gatgcgaaca gcggcctgtg gaacatggtg 180
gcgggctttg atcataaagg cctgattgat gcggcgaaag cgcagtatga acgttttccg 240
ggctatcatg cgttttttgg ccgtatgagc gatcagaccg tgatgctgtc tgaaaaactg 300
gtggaagtga gcccgtttga tagcggccgt gtgttttata ccaacagcgg cagcgaagcg 360
aacgatacca tggtgaaaat gctgtggttt ctgcatgcgg cggaaggcaa accgcagaaa 420
cgtaaaattc tgacccgttg gaacgcgtat catggcgtga ccgcggtgag cgcgagcatg 480
accggcaaac cgtataacag cgtgtttggc ctgccgctgc cgggctttgt gcatctgacc 540
tgcccgcatt attggcgtta tggcgaagaa ggcgaaaccg aagaacagtt tgtggcgcgt 600
ctggcccgtg aactggaaga aaccattcag cgtgaaggcg cggataccat tgcgggcttt 660
tttgcggaac cggtgatggg tgcgggcggt gttattccgc cggcgaaagg ctattttcag 720
gcgattctgc cgatcctgcg caaatatgat attccggtga tcagcgatga agtgatttgc 780
ggctttggcc gtaccggcaa cacctggggc tgcgtgacct atgattttac cccggatgcg 840
attattagca gcaaaaacct gaccgcgggt ttttttccga tgggcgcggt gattctgggt 900
ccggaactga gcaaacgtct ggaaaccgcg attgaagcga tcgaagaatt tccgcatggt 960
tttaccgcga gcggccatcc ggtgggttgt gcgattgcgc tgaaagcgat tgatgtggtg 1020
atgaacgaag gcctggccga aaacgtgcgt cgtctggccc cgcgttttga agaacgtctg 1080
aaacatattg cggaacgtcc gaacattggc gaatatcgtg gcattggctt tatgtgggcg 1140
ctggaagcgg tgaaagataa agcgagcaaa accccgtttg atggcaacct gagcgtgagc 1200
gaacgtattg cgaacacctg caccgatctg ggcctgattt gccgtccgct gggccagagc 1260
gtggttctgt gcccgccgtt tattctgacc gaagcgcaga tggatgaaat gttcgataaa 1320
ctggaaaaag cgctggataa agtgtttgcg gaagtggcgt aa 1362
<210> 2
<211> 453
<212> PRT
<213> Vibrio fluvialis
<400> 2
Met Asn Lys Pro Gln Ser Trp Glu Ala Arg Ala Glu Thr Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Tyr Gly Phe Thr Asp Met Pro Ser Leu His Gln Arg Gly Thr Val Val
20 25 30
Val Thr His Gly Glu Gly Pro Tyr Ile Val Asp Val Asn Gly Arg Arg
35 40 45
Tyr Leu Asp Ala Asn Ser Gly Leu Trp Asn Met Val Ala Gly Phe Asp
50 55 60
His Lys Gly Leu Ile Asp Ala Ala Lys Ala Gln Tyr Glu Arg Phe Pro
65 70 75 80
Gly Tyr His Ala Phe Phe Gly Arg Met Ser Asp Gln Thr Val Met Leu
85 90 95
Ser Glu Lys Leu Val Glu Val Ser Pro Phe Asp Ser Gly Arg Val Phe
100 105 110
Tyr Thr Asn Ser Gly Ser Glu Ala Asn Asp Thr Met Val Lys Met Leu
115 120 125
Trp Phe Leu His Ala Ala Glu Gly Lys Pro Gln Lys Arg Lys Ile Leu
130 135 140
Thr Arg Trp Asn Ala Tyr His Gly Val Thr Ala Val Ser Ala Ser Met
145 150 155 160
Thr Gly Lys Pro Tyr Asn Ser Val Phe Gly Leu Pro Leu Pro Gly Phe
165 170 175
Val His Leu Thr Cys Pro His Tyr Trp Arg Tyr Gly Glu Glu Gly Glu
180 185 190
Thr Glu Glu Gln Phe Val Ala Arg Leu Ala Arg Glu Leu Glu Glu Thr
195 200 205
Ile Gln Arg Glu Gly Ala Asp Thr Ile Ala Gly Phe Phe Ala Glu Pro
210 215 220
Val Met Gly Ala Gly Gly Val Ile Pro Pro Ala Lys Gly Tyr Phe Gln
225 230 235 240
Ala Ile Leu Pro Ile Leu Arg Lys Tyr Asp Ile Pro Val Ile Ser Asp
245 250 255
Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr Gly Asn Thr Trp Gly Cys Val
260 265 270
Thr Tyr Asp Phe Thr Pro Asp Ala Ile Ile Ser Ser Lys Asn Leu Thr
275 280 285
Ala Gly Phe Phe Pro Met Gly Ala Val Ile Leu Gly Pro Glu Leu Ser
290 295 300
Lys Arg Leu Glu Thr Ala Ile Glu Ala Ile Glu Glu Phe Pro His Gly
305 310 315 320
Phe Thr Ala Ser Gly His Pro Val Gly Cys Ala Ile Ala Leu Lys Ala
325 330 335
Ile Asp Val Val Met Asn Glu Gly Leu Ala Glu Asn Val Arg Arg Leu
340 345 350
Ala Pro Arg Phe Glu Glu Arg Leu Lys His Ile Ala Glu Arg Pro Asn
355 360 365
Ile Gly Glu Tyr Arg Gly Ile Gly Phe Met Trp Ala Leu Glu Ala Val
370 375 380
Lys Asp Lys Ala Ser Lys Thr Pro Phe Asp Gly Asn Leu Ser Val Ser
385 390 395 400
Glu Arg Ile Ala Asn Thr Cys Thr Asp Leu Gly Leu Ile Cys Arg Pro
405 410 415
Leu Gly Gln Ser Val Val Leu Cys Pro Pro Phe Ile Leu Thr Glu Ala
420 425 430
Gln Met Asp Glu Met Phe Asp Lys Leu Glu Lys Ala Leu Asp Lys Val
435 440 445
Phe Ala Glu Val Ala
450
<210> 3
<211> 1362
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Engineered variant of V. fluvialis transaminase
<400> 3
atgaacaaac cgcagagctg ggaaacgcgt gcggaaacct atagcctgta tgcctttacc 60
cacatgccga gcctacatca gcgtggcacc atggtggtga cccatggcga aggcccgtat 120
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<220>
<223> Engineered variant of V. fluvialis transaminase
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Engineered variant of V. fluvialis transaminase
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<223> Engineered variant of V. fluvialis transaminase
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Engineered variant of V. fluvialis transaminase
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Leu Gly Gln Ser Val Val Leu Ala Pro Pro Tyr Ile Leu Thr Glu Ala
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<223> Engineered variant of V. fluvialis transaminase
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ccggaactga gcaaacgtct ggaaaccgcg attgaagcga tcgaagaatt tgatcatggt 960
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<223> Engineered variant of V. fluvialis transaminase
<400> 74
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1 5 10 15
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His Lys Gly Leu Ile Asp Ala Ala Lys Ala Gln Tyr Glu Arg Phe Pro
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Engineered variant of V. fluvialis transaminase
<400> 76
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<220>
<223> Engineered variant of V. fluvialis transaminase
<400> 78
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 79
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<220>
<223> Engineered variant of V. fluvialis transaminase
<400> 128
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ggctttggtc gtaccggcaa cacctggggc tgcgtgacct atgattttac cccggatgcg 840
attattagcg ccaaaaacct aaccgcgggt ttttttccag taggagcggt gattttgggg 900
ccggaactga gcaaacgtct ggaaaccgcg attgaagcga tcgaagaatt tgatcatggt 960
tttaccacac acggccatcc ggtgggttgt gcgattgcgc tgaaagcgat tgatgtggtg 1020
atgaacgaag gcctggccga aaacgtgcgt cgtctggccc cgcgttttga agaacgtctg 1080
aaacatattg cggaacgtcc gaacattggc gaatatcgtg gtattggctt tatgtgggcg 1140
ctggaagtgg tgaaagataa agcgagcaaa gccccgtttg atggcaacct gagcgtgggt 1200
gaacgtattg cgaacacctg caccgatctg ggactgattt gccgaccgtt gggccagagc 1260
gtggttctgg caccgccgta cattctgacc gaagcgcaga tggatgaaat gttcgataaa 1320
ctggaaaaag cgctggataa agtgtttgcg gaagtggcgt aa 1362
<210> 154
<211> 453
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Engineered variant of V. fluvialis transaminase
<400> 154
Met Asn Lys Pro Gln Ser Trp Glu Thr Arg Ala Glu Thr Val Ser Leu
1 5 10 15
Tyr Ala Phe Thr His Met Pro Ser Leu Arg Gln Arg Gly Thr Met Val
20 25 30
Val Thr His Gly Glu Gly Pro Tyr Ile Val Asp Val His Gly Arg Arg
35 40 45
Tyr Leu Asp Ala Asn Ser Gly Leu Trp Asn Met Val Ala Gly Phe Asp
50 55 60
His Lys Gly Leu Ile Asp Ala Ala Lys Ala Gln Tyr Glu Arg Phe Pro
65 70 75 80
Gly Tyr His Ala Phe Tyr Gly Arg Met Ser Asp Gln Thr Val Met Leu
85 90 95
Ser Glu Lys Leu Val Glu Val Ser Pro Phe Asp Ser Gly Arg Val Phe
100 105 110
Tyr Thr Asn Ser Gly Ser Glu Ala Asn Asp Thr Met Val Lys Met Leu
115 120 125
Trp Phe Leu His Arg Ala Glu Gly Lys Pro Gln Lys Arg Lys Ile Leu
130 135 140
Thr Leu Lys Asn Ala Tyr His Gly Ser Thr Ala Val Ser Ala Ser Met
145 150 155 160
Thr Gly Leu Pro Tyr Asn Ser Val Phe Gly Leu Pro Leu Pro Gly Phe
165 170 175
Leu His Leu Thr Cys Pro His Tyr Trp Arg Tyr Gly Glu Glu Gly Glu
180 185 190
Thr Glu Glu Gln Phe Val Ala Arg Leu Ala Arg Glu Leu Glu Glu Thr
195 200 205
Ile Gln Lys Glu Gly Ala Asp Thr Ile Ala Gly Phe Phe Ala Glu Pro
210 215 220
Val Met Gly Ala Gly Gly Val Ile Thr Pro Pro Lys Gly Tyr Phe Gln
225 230 235 240
Ala Ile Leu Thr Ile Leu Arg Lys Tyr Asp Ile Pro Val Ile Ser Asp
245 250 255
Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr Gly Asn Thr Trp Gly Cys Val
260 265 270
Thr Tyr Asp Phe Thr Pro Asp Ala Ile Ile Ser Ala Lys Asn Leu Thr
275 280 285
Ala Gly Phe Phe Pro Val Gly Ala Val Ile Leu Gly Pro Glu Leu Ser
290 295 300
Lys Arg Leu Glu Thr Ala Ile Glu Ala Ile Glu Glu Phe Asp His Gly
305 310 315 320
Phe Thr Thr His Gly His Pro Val Gly Cys Ala Ile Ala Leu Lys Ala
325 330 335
Ile Asp Val Val Met Asn Glu Gly Leu Ala Glu Asn Val Arg Arg Leu
340 345 350
Ala Pro Arg Phe Glu Glu Arg Leu Lys His Ile Ala Glu Arg Pro Asn
355 360 365
Ile Gly Glu Tyr Arg Gly Ile Gly Phe Met Trp Ala Leu Glu Val Val
370 375 380
Lys Asp Lys Ala Ser Lys Ala Pro Phe Asp Gly Asn Leu Ser Val Gly
385 390 395 400
Glu Arg Ile Ala Asn Thr Cys Thr Asp Leu Gly Leu Ile Cys Arg Pro
405 410 415
Leu Gly Gln Ser Val Val Leu Ala Pro Pro Tyr Ile Leu Thr Glu Ala
420 425 430
Gln Met Asp Glu Met Phe Asp Lys Leu Glu Lys Ala Leu Asp Lys Val
435 440 445
Phe Ala Glu Val Ala
450
Claims (40)
- 하기 화학식 I의 화합물을 하기 화학식 II의 화합물 또는 그의 염, 용매화물 또는 수화물로 효소적으로 전환시키는 것을 포함하는, 화학식 II의 화합물 또는 그의 염 또는 용매화물 또는 수화물을 제조하는 방법이며,
상기 효소적으로 전환시키는 것은 서열 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 및 154로부터 선택된 서열에 대해 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 효소를 사용하는 것인, 방법.
<화학식 II>
<화학식 I>
상기 식에서,
파선은 결합이거나 또는 부재하고;
A는 C=O 및 C=NH로부터 선택되거나; 또는 파선이 이중 결합인 경우에, A-R8은
이고;
Ra는 C1-6 알킬이고;
R1은 H, -CH3,
이고;
R4 및 R7은 각각, 독립적으로, H 또는 -Cl이고;
R5는 H, -OH, -CH3, -OCH3, -F, -Cl, -CF3 또는 -CN이고;
R6은 H, -OH, -OCH3, -F 또는 -Cl이고;
R8은 H, -CH3, -CH2CH3, -CH2OH, -CO2H, -CO2CH3, -CO2CH2CH3 또는 -CF3이고;
n은 1 또는 2이다. - 제1항에 있어서, R8이 -CH3인 경우에 R5 및 R6이 플루오로이고, n이 1인 방법.
- 제1항에 있어서, R8이 -CH3인 경우에 R5 및 R6이 플루오로 및 클로로이고, n이 1인 방법.
- 제1항에 있어서, R8이 -CH3인 경우에 R5 및 R6이 수소이고, n이 1인 방법.
- 제1항에 있어서, n이 1인 경우에 R5가 플루오로이고, R6이 수소인 방법.
- 제1항에 있어서, 화학식 II의 화합물이 하기 화학식 IIA의 화합물 또는 그의 염 또는 용매화물 또는 수화물인 방법.
<화학식 IIA>
- 삭제
- 제1항에 있어서, A가 C=O인 방법.
- 제1항에 있어서, 화학식 I의 화합물이 하기 화학식 IA의 화합물 또는 그의 염 또는 수화물 또는 용매화물인 방법.
<화학식 IA>
- 하기 화학식 IA의 화합물 또는 그의 염 또는 용매화물 또는 수화물을 효소적으로 아미노교환시켜 하기 화학식 IIA의 화합물을 제공하는 것을 포함하는, 화학식 IIA의 화합물 또는 그의 염 또는 수화물 또는 용매화물을 제조하는 방법이며,
상기 효소적으로 아미노교환시키는 것은, 서열 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 및 154로부터 선택된 서열에 대해 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 효소를 사용하는 것인, 방법.
<화학식 IIA>
<화학식 IA>
- 제1항 내지 제6항 및 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 효소가 서열 134인 방법.
- 하기 화학식 III의 화합물 또는 그의 염 또는 수화물 또는 용매화물을 하기 화학식 II의 화합물 또는 그의 염 또는 수화물 또는 용매화물과 반응시키는 것을 포함하며, 여기서 화학식 II의 화합물 또는 그의 염 또는 수화물 또는 용매화물은 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 염 또는 수화물 또는 용매화물을 효소적으로 전환시켜 제조되는 것인, 하기 화학식 IV의 화합물 또는 그의 염 또는 수화물 또는 용매화물을 제조하는 방법이며,
상기 효소적으로 전환시키는 것은 서열 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 및 154로부터 선택된 서열에 대해 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 효소를 사용하는 것인, 방법.
<화학식 IV>
<화학식 III>
<화학식 II>
<화학식 I>
상기 식에서,
파선은 결합이거나 또는 부재하고;
A는 C=O 및 C=NH로부터 선택되거나; 또는 파선이 이중 결합인 경우에, A-R8은
이고;
Ra는 C1-6 알킬이고;
R1은 아미노, (C1-C6) 알킬 아미노, (C1-C6) 알킬 디-알킬 아미노 또는 (C1-C6) 알킬 C(O)NH (C1-6) 알킬로 임의로 치환된 (C1-C6) 알킬, H, -CH3,
이고;
R4 및 R7은 각각, 독립적으로, H 또는 할로이고;
R5 및 R6은 각각, 독립적으로, 수소, 할로, 히드록실, (C1-C6) 알킬, 트리할로 (C1) 알킬, 시아노 또는 (C1-C6) 알콕시이고;
R8은 히드록실로 임의로 치환된 (C1-C6) 알킬, H, -CH3, -CH2CH3, -CH2OH, -CO2H, -CO2CH3, -CO2CH2CH3 또는 -CF3이고;
n은 1 또는 2이고;
R1'는 수소 또는 (C1-C6)알킬이고;
R4', R5', R6' 및 R7'는 각각, 독립적으로, 수소, 할로, 히드록시, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, (C1-C6)알킬, 및 (C1-C6)알킬옥시이다. - 제12항에 있어서, R8이 -CH3인 경우에 R5 및 R6이 플루오로이고, n이 1인 방법.
- 제12항에 있어서, R8이 -CH3인 경우에 R5 및 R6이 플루오로 및 클로로이고, n이 1인 방법.
- 제12항에 있어서, R8이 -CH3인 경우에 R5 및 R6이 수소이고, n이 1인 방법.
- 제12항에 있어서, n이 1인 경우에 R5가 플루오로이고, R6이 수소인 방법.
- 제12항에 있어서, R1이 H, -CH3,
이고;
R4 및 R7이 각각, 독립적으로, H 또는 -Cl이고; R5가 H, -OH, -CH3, -OCH3, -F, -Cl, -CF3 또는 -CN이고; R6이 H, -OH, -OCH3, -F 또는 -Cl이고;
R8이 H, -CH3, -CH2CH3, -CH2OH, -CO2H, -CO2CH3, -CO2CH2CH3 또는 -CF3이고;
n이 1 또는 2인
방법. - 제12항에 있어서, 화학식 II의 화합물이 하기 화학식 IIA의 화합물 또는 그의 염 또는 용매화물 또는 수화물인 방법.
<화학식 IIA>
- 제12항에 있어서, R5'가 할로인 방법.
- 제12항에 있어서, R5'가 클로로이고, R1', R4', R6' 및 R7'가 각각 수소인 방법.
- 제12항에 있어서, 화학식 III의 화합물이 하기 화학식 IIIA의 화합물 또는 그의 염 또는 수화물 또는 용매화물인 방법.
<화학식 IIIA>
- 하기 화학식 IIIA의 화합물 또는 그의 염 또는 용매화물 또는 수화물을 하기 화학식 IIA의 화합물 또는 그의 염 또는 용매화물 또는 수화물과 반응시켜 하기 화학식 IVA의 화합물 또는 그의 염 또는 용매화물 또는 수화물을 제공하는 것을 포함하며, 여기서 화학식 IIA의 화합물은 하기 화학식 IA의 화합물 또는 그의 염 또는 수화물 또는 용매화물로부터 효소적으로 제조되는 것인, 화학식 IVA의 화합물 또는 그의 염 또는 용매화물 또는 수화물을 제조하는 방법이며,
상기 효소적으로 제조되는 것은 서열 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 및 154로부터 선택된 서열에 대해 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 효소를 사용하는 것인, 방법.
<화학식 IVA>
<화학식 IIIA>
<화학식 IIA>
<화학식 IA>
- 제12항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 효소가 서열 134인 방법.
- 제22항에 있어서, 화학식 IIA의 화합물을 화학식 IIIA의 화합물과의 반응 전에 하기 화학식 IIB의 염으로 전환시키는 것인 방법.
<화학식 IIB>
- 제22항에 있어서, 반응을 염기성 조건 하에 수행하는 것인 방법.
- 제22항에 있어서, 반응을 트리에틸 아민의 존재 하에 수행하는 것인 방법.
- 제22항에 있어서, 화학식 IVA의 화합물을 하기 화학식 IVB의 염으로서 단리하는 것인 방법.
<화학식 IVB>
- 제22항에 있어서, 화학식 IVB의 염을 유리 염기의 화학식 IVA의 화합물로 전환시키는 것인 방법.
- 제28항에 있어서, 전환을 탄산나트륨을 사용하여 수행하는 것인 방법.
- 제22항에 있어서, 화학식 IVA의 화합물이 수화물인 방법.
- 제22항에 있어서, 화학식 IVA의 화합물이 ½ 수화물인 방법.
- 제22항에 있어서, 화학식 IVA의 화합물을 단리 후에 분쇄하는 것인 방법.
- 하기 화학식 IC의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 수화물 또는 용매화물.
<화학식 IC>
상기 식에서,
R1은 아미노, (C1-C6) 알킬 아미노, (C1-C6) 알킬 디-알킬 아미노 또는 (C1-C6) 알킬 C(O)NH (C1-6) 알킬로 임의로 치환된 (C1-C6) 알킬, H, -CH3,
이고;
R5 및 R6은 각각, 독립적으로, 수소, 할로, 히드록실, (C1-C6) 알킬, 트리할로 (C1) 알킬, 시아노 또는 (C1-C6) 알콕시이고;
R8은 히드록실로 임의로 치환된 (C1-C6) 알킬, H, -CH3, -CH2CH3, -CH2OH, -CO2H, -CO2CH3, -CO2CH2CH3 또는 -CF3이고;
n은 1 또는 2이다. - 제33항에 있어서, R8이 -CH3인 경우에 R5 및 R6이 플루오로이고, n이 1인 화합물.
- 제33항에 있어서, R8이 -CH3인 경우에 R5 및 R6이 플루오로 및 클로로이고, n이 1인 화합물.
- 제33항에 있어서, R8이 -CH3인 경우에 R5 및 R6이 수소이고, n이 1인 화합물.
- 제33항에 있어서, n이 1인 경우에 R5가 플루오로이고, R6이 수소인 화합물.
- 제33항에 있어서, R1이 H, -CH3,
이고;
R5가 H, -OH, -CH3, -OCH3, -F, -Cl, -CF3 또는 -CN이고;
R6이 H, -OH, -OCH3, -F 또는 -Cl이고;
R8이 H, -CH3, -CH2CH3, -CH2OH, -CO2H, -CO2CH3, -CO2CH2CH3 또는 -CF3이고;
n이 1 또는 2인
화합물. - 제33항에 있어서, 하기 화학식 IA의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 수화물 또는 용매화물인 화합물.
<화학식 IA>
-
로부터 선택된 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 수화물.
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