JP2022518212A - 操作されたトランスアミナーゼポリペプチド - Google Patents

操作されたトランスアミナーゼポリペプチド Download PDF

Info

Publication number
JP2022518212A
JP2022518212A JP2021540834A JP2021540834A JP2022518212A JP 2022518212 A JP2022518212 A JP 2022518212A JP 2021540834 A JP2021540834 A JP 2021540834A JP 2021540834 A JP2021540834 A JP 2021540834A JP 2022518212 A JP2022518212 A JP 2022518212A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
polypeptide
sequence
engineered
seq
compound
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2021540834A
Other languages
English (en)
Inventor
ジョヴァナ ネイザー，
クリストファー マイケル ミクリッチ，
ダ デュアン，
オーリック アンソニー ソーウェル－カンツ，
スティーブン ミラー，
ビルギット コスジェク，
イマン ファラサット，
ニコラス エム． マーシャル，
Original Assignee
コデクシス， インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by コデクシス， インコーポレイテッド filed Critical コデクシス， インコーポレイテッド
Publication of JP2022518212A publication Critical patent/JP2022518212A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1096—Transferases (2.) transferring nitrogenous groups (2.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/001—Amines; Imines

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本発明は、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドおよびその組成物、ならびに操作されたトランスアミナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。トランスアミナーゼ酵素を生成するための方法も提供される。いくつかの実施形態では、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、湿潤有機溶媒中、最小水性条件下で、改善された酵素特性を提供するように最適化される。特に、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、スキーム２に示されているように、湿潤有機溶媒中の最小水性条件で、基質メチル４－メチル－３－オキソ－ペンタノエート（本明細書では「化合物（２）」と称される）をその対応するキラルアミン生成物メチル（Ｓ）－３－アミノ－４－メチル－ペンタノエート（本明細書では「化合物（１）」と称される）に効率的に変換するために操作されている。

Description

本出願は、２０１９年１月１５日に出願された米国特許出願第６２／７９２，５１８号（これは、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）の優先権を主張する。
発明の分野
本開示は、薬学的およびファインケミカルアミン化合物の生産のための工業プロセス条件下で有用な操作されたトランスアミナーゼポリペプチドに関する。
配列表、表またはコンピュータプログラムの参照
配列表の公式の写しは、「ＣＸ２－１８３ＷＯ１＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」のファイル名、２０２０年１月１０日の作成日および１．７２メガバイトのサイズを有するＡＳＣＩＩフォーマットテキストファイルとしてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して本明細書と併せて提出される。ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出される配列表は本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
背景
トランスアミナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．６．１）は、アミノ供与体化合物からアミノ受容体化合物のケト基へのアミノ基、電子対およびプロトンの転移を触媒する。トランスアミナーゼ反応は、キラルアミン生成物化合物の形成をもたらし得る。スキーム１に示されているように、アミノ受容体化合物（Ｂ）（これは、所望のキラルアミン生成物（Ｄ）のケト基質前駆体である）を、トランスアミナーゼの存在下でアミノ供与体化合物（Ａ）と反応させる。トランスアミナーゼは、アミノ受容体化合物（Ｂ）のケト基へのアミノ供与体化合物（Ａ）の第１級アミン基の転移を触媒する。トランスアミナーゼ反応は、キラルアミン生成物化合物（Ｄ）（Ｒ１はＲ２と同じものではないと想定する）およびケト基を有する新たなアミノ受容体副生成物（または「カルボニル副生成物」）化合物（Ｃ）をもたらす。
スキーム１
Figure 2022518212000001
キラルアミン化合物は、広範囲の商業的に望まれる化合物、例えばセファロスポリンまたはピロリジン誘導体の調製のための中間体またはシントンとして製薬産業、農薬産業および化学産業で頻繁に使用される。典型的には、キラルアミン化合物のこれらの工業的適用は、１つの特定の立体異性型の分子のみを使用することを伴い、例えば、（Ｒ）または（Ｓ）エナンチオマーのみが生理学的に活性である。トランスアミナーゼは高度に立体選択的であり、光学的に純粋なキラルアミン化合物の合成のための多くの潜在的な工業的用途を有する。
キラルアミン化合物を作製するためのトランスアミナーゼの使用の例としては、アミノ酸のエナンチオマー富化（例えば、Ｓｈｉｎら、２００１，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６５：１７８２－１７８８；Ｉｗａｓａｋｉら、２００３，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌｅｔｔ．２５：１８４３－１８４６；Ｉｗａｓａｋｉら、２００４，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．６９：４９９－５０５，Ｙｕｎら、２００４，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０：２５２９－２５３４；およびＨｗａｎｇら、２００４，Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．３４：４２９－４２６を参照のこと）；プレガバリンの中間体および前駆体の調製（例えば、国際公開第２００８／１２７６４６号）；シクロパミン類似体の酵素的アミノ基転移（例えば、国際公開第２０１１／０１７５５１号）；β－アミノ酸の立体特異的合成およびエナンチオマー富化（例えば、国際公開第２００５／００５６３３号）；アミンのエナンチオマー富化（例えば、米国特許第４，９５０，６０６号；米国特許第５，３００，４３７号；および米国特許第５，１６９，７８０号）；アミノ酸および誘導体の生産（例えば、米国特許第５，３１６，９４３号；米国特許第４，５１８，６９２号；米国特許第４，８２６，７６６号；米国特許第６，１９７，５５８号；および米国特許第４，６００，６９２号）；ならびに医薬化合物、シタグリプチン、リバスチグミンおよびベルナカラントの生産（例えば、２０１２年１０月２３日に発行された米国特許第８，２９３，５０７号；Ｓａｖｉｌｅ，ら、２０１０，“Ｂｉｏｃａｔａｌｙｔｉｃ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｃｈｉｒａｌ ａｍｉｎｅｓ ｆｒｏｍ ｋｅｔｏｎｅｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｓｉｔａｇｌｉｐｔｉｎ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２９（５９８９）：３０５－９；２０１１年１２月２２日に公開された国際公開第２０１１／１５９９１０号；および２０１１年２月２３日に公開された国際公開第２０１２／０２４１０４号を参照のこと）が挙げられる。
スキーム１の反応を触媒する能力を有する野生型トランスアミナーゼは、限定されないが、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍａｌｌｅ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ、Ｏｃｅａｎｉｃｏｌａ ｇｒａｎｕｌｏｓｕｓ ＨＴＣＣ２５１６、Ｏｃｅａｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＲＥＤ６５、Ｏｃｅａｎｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｐ．ＭＥＤ９２、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．（株ＮＧＲ２３４）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｅｎｓｉｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ（例えば、Ｓｈｉｎら、２００１，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．６５：１７８２－１７８８を参照のこと）およびＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＫＮＫ１６８（例えば、Ｉｗａｓａｋｉら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００６，６９：４９９－５０５、米国特許第７，１６９，５９２号を参照のこと）を含む様々な微生物から単離されている。例えば、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＹＰ＿００２２５７８１３．１、ＧＩ：２０７７３９４２０）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ １７１０ｂ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＢＡ４７７３８．１、ＧＩ：７６５７８２６３）、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｔｒｉｉ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＭ９０２７１６．１、ＧＩ：１６３２５８０３２）、Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ ＪＳ１７（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＥＡ３９１８３．１、ＧＩ：３２７２０７０６６）およびＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＫＮＫ１６８（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＡＫ３９７５３．１、ＧＩ：３３６０８８３４１）を含むこれらの野生型トランスアミナーゼ遺伝子およびコードされるポリペプチドのいくつかは配列決定されている。クラスＥＣ２．６．１．１８およびＥＣ２．６．１－１９の少なくとも２つの野生型トランスアミナーゼは結晶化され、構造的に特性評価されている（例えば、Ｙｏｎａｈａら、１９８３，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４７（１０）：２２５７－２２６５を参照のこと）。
立体選択的に（Ｒ）－選択的または（Ｓ）－選択的であるトランスアミナーゼが公知である。例えば、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＫＮＫ１６８由来の野生型トランスアミナーゼは（Ｒ）－選択的であると考えられ、ある特定の基質から（Ｒ）－アミン化合物を主に産生するのに対して（例えば、Ｉｗａｓａｋｉら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００６，６９：４９９－５０５、米国特許第７，１６９，５９２号を参照のこと）、Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ ＪＳ１７由来の野生型トランスアミナーゼは（Ｓ）－選択的であると考えられ、ある特定の基質から（Ｓ）－アミン化合物を主に産生する（例えば、Ｓｈｉｎら、“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ａｍｉｎｅ：ｐｙｒｕｖａｔｅ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ ＪＳ１７，”Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６１（５－６），４６３－４７１（２００３）を参照のこと）。
（Ｒ）－選択性、増加した溶媒安定性および熱安定性、ならびに広範囲のアミノ受容体基質の変換のための他の改善された特性を有する天然に存在しないトランスアミナーゼは、野生型および他の操作されたトランスアミナーゼ骨格配列の変異誘発および／または定向進化により生成されている（例えば、２０１２年１０月２３日に発行された米国特許第８，２９３，５０７号；２０１１年１月１３日に公開された国際公開第２０１１／００５４７７Ａ１号；２０１２年２月２３日に公開された国際公開第２０１２／０２４１０４号；およびＳａｖｉｌｅ，ら、２０１０，“Ｂｉｏｃａｔａｌｙｔｉｃ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｃｈｉｒａｌ ａｍｉｎｅｓ ｆｒｏｍ ｋｅｔｏｎｅｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｓｉｔａｇｌｉｐｔｉｎ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２９（５９８９）：３０５－９を参照のこと）。
野生型トランスアミナーゼは、一般に、キラルアミン化合物の調製における商業的適用に望ましくない特性、例えば、工業的に有用なプロセス条件（例えば、溶媒、温度）に対する不安定性、商業的に有用なアミノ受容体および／またはアミノ供与体基質についての不十分な認識および立体選択性、ならびに望ましくない反応平衡による低い生成物収率を有する。
特に、トランスアミナーゼ反応は、一般に、高ｐＨの水性条件下で行われる。典型的な水性反応条件は、多くの場合、低い基質溶解度をもたらし、有機共溶媒を必要とする。水性条件下における反応は、多くの場合、生成物および基質不安定性により複雑化される。多くの場合、反応混合物の塩基性化および有機溶媒によるアミン生成物の抽出などのさらなるプロセス工程が必要とされる。
国際公開第２００８／１２７６４６号 国際公開第２０１１／０１７５５１号
Ｓｈｉｎら、２００１，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６５：１７８２－１７８８ Ｉｗａｓａｋｉら、２００３，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌｅｔｔ．２５：１８４３－１８４６ Ｉｗａｓａｋｉら、２００４，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．６９：４９９－５０５ Ｙｕｎら、２００４，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０：２５２９－２５３４ Ｈｗａｎｇら、２００４，Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．３４：４２９－４２６
本発明は、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドおよびその組成物、ならびに操作されたトランスアミナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。トランスアミナーゼ酵素を生成するための方法も提供される。いくつかの実施形態では、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、湿潤有機溶媒中の最小水性条件下で、改善された酵素特性を提供するように最適化される。本開示のトランスアミナーゼポリペプチドは、（アミノ酸配列番号２の）以前に操作されたトランスアミナーゼポリペプチドと比較して１つまたはそれを超える残基差異を有するように操作されており、以前に操作されたトランスアミナーゼポリペプチドと比べて改善された酵素特性に関連する（例えば、２０１２年１０月２３日に発行された米国特許第８，２９３，５０７号；２０１１年１月１３日に公開されたＰＣＴ公開ＷＯ２０１１００５４７７Ａ１号および２０１２年２月２３日に公開されたＰＣＴ公開ＷＯ２０１２０２４１０４号を参照のこと）。アミノ残基差異は、とりわけ、活性、立体選択性、安定性、発現、生成物耐性および湿潤有機溶媒中の熱活性を含む様々な酵素特性の改善をもたらす残基位置に位置する。
特に、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、スキーム２に示されているように、湿潤有機溶媒中の最小水性条件で、基質メチル４－メチル－３－オキソ－ペンタノエート（本明細書では「化合物（２）」と称される）をその対応するキラルアミン生成物メチル（Ｓ）－３－アミノ－４－メチル－ペンタノエート（本明細書では「化合物（１）」と称される）に効率的に変換するために操作されている。
スキーム２
Figure 2022518212000002
しかしながら、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドの進化した構造特徴はまた、スキーム３に示されているように、一連の式（ＩＩ）のケトエステル基質化合物（化合物（２）以外の化合物を含む）から式（Ｉ）のそれらの対応するキラルアミン生成物化合物（化合物（１）以外の化合物を含む）への生体触媒変換を可能にする。
スキーム３
Figure 2022518212000003
 式中、
Ｚは、１つまたはそれを超えるヒドロキシ、シアノまたはニトロ基で必要に応じて置換された直鎖Ｃ１－６アルキルまたは分枝鎖Ｃ１－６アルキルであり；ならびに
Ｒ１は、Ｃ１－６アルキル、アリール－Ｃ１－２アルキル、ヘテロアリール－Ｃ１－２アルキル、またはＯ、Ｓ、およびＮから選択されるさらなるヘテロ原子を必要に応じて含有する５～６員複素環式環系であり、前記複素環式環は置換されていないか、またはオキソ、ヒドロキシ、ハロゲン、Ｃ１－４アルコキシおよびＣ１－４アルキルから独立して選択される１～３個の置換基で置換されている。
いくつかの実施形態では、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、反対のエナンチオマーに対して少なくとも７０％のエナンチオマー過剰率で、＊でマークされているステレオジェン中心において示されている立体化学的配置を有する式（Ｉ）の化合物への式（ＩＩ）の化合物の生体触媒変換をすることができる。
本発明は、配列番号２、６、３３２、５１８および／または６５６と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含むトランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドまたはその機能的断片であって、前記操作されたポリペプチドが、前記ポリペプチド配列において少なくとも１つの置換または置換セットを含むポリペプチドを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号２、６、３３２、５１８および／または６５６を基準にしてナンバリングされる操作されたポリペプチドまたはその機能的断片を提供する。いくつかの実施形態では、参照配列は配列番号２である。いくつかの実施形態では、参照配列は配列番号６である。いくつかの実施形態では、参照配列は配列番号３３２である。いくつかの実施形態では、参照配列は配列番号５１８である。いくつかの実施形態では、参照配列は配列番号６５６である。
いくつかの実施形態では、ポリペプチド配列は、配列番号２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有し、操作されたポリペプチドは、２８４および２８４／１５５から選択される前記ポリペプチド配列中の１つまたはそれを超える位置において少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２を基準にしてナンバリングされる。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドのポリペプチド配列は、配列番号２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有し、操作されたポリペプチドのポリペプチド配列は、２８４Ａおよび２８４Ａ／１５５Ｗから選択される前記ポリペプチド配列中の１つまたはそれを超える位置において少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２を基準にしてナンバリングされる。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドのポリペプチド配列は、配列番号２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有し、操作されたポリペプチドのポリペプチド配列は、Ｇ２８４ＡおよびＧ２８４Ａ／Ｌ１５５Ｗから選択される前記ポリペプチド配列中の１つまたはそれを超える位置において少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２を基準にしてナンバリングされる。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号２と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号６と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有する操作されたポリペプチドであって、５／３５、９、９／２０／２３／２４／１３４／２４４、９／２０／２３／１０１／２４４、９／２０／２４／１０１／２４４／２４９、９／２３／２４、９／２３／２４／２９／２４４、９／２３／２４／１０１／２６２、９／２３／２４／２４４／２６２、９／２３／２９、９／２４／２４４、９／２４／２４４／２６２、９／２４／２４９、９／４５／８９／９３、９／７９／１０１／２４４、９／８２／８９、９／８９／２４６、９／８９／２７１、９／９３／１４２／２４６、９／１０１／２４４、９／１１０／３０２、９／２４４／２４９、９／２４４／２６２／２６４、９／２４６、９／２６２、１５、１５／１６／１８／２０／８９／９３／１６０、１５／２４／２６／８９／９３／１６０、１５／３５／２７３、１５／２１８／２７３、１５／２４９／２７３、１６、１７／２５、１７／２５／４１、１７／２５／１６０、１７／１６０、１８、１８／２６／２４６／２７３、１８／１４６、１８／１４６／１６８、１８／１４６／２６２、１８／１６８、１８／１６８／２４４、１８／１６８／２６２／３２４、１８／２４４、１８／２４４／２４６、１８／２４４／２４６／２８４、１８／２４４／２４８、１８／２４４／２６２／２７３、１８／２４４／２７３、１８／２６２、１８／２７３、２０、２０／２３／２４／５５／１３４／２４４／２６２、２０／２３／１３４／２４４、２０／２４／８９／１９７、２０／３３／１６０、２０／３２４、２２、２２／１０２、２２／１６０、２３、２３／２５／５５／３２１、２３／２５／１０２／１４２、２３／１０２、２３／３２１、２４、２５、２５／３３、２５／１０４、２５／１６０、２５／３２１、２６、２６／２７３、２９、２９／８９、３２、３３、３５、３５／２１５／２１８／２４９、３５／２１８／２４９／２７３、３５／２２１、４０、４０／１６８／２０８／２４４、４０／２４４／２４８、４１、４１／１０２、４２、４５、４６、５０、５５、５６、７１／１０２、７４、７９、８２、８２／２４４、８９、８９／９３／１５６／３２４、８９／９３／３２１／３２４、９０、９３、９３／３２４、９５、９８、１０１、１０１／１６０／２４４／２４９、１０２、１０４、１０６、１１１、１１４、１１７、１１９、１３４、１３４／２４４、１３４／２６２、１３９、１４０／２６６、１４２、１４２／３２１、１４５、１４６、１４６／２４４、１４６／２７３、１５６、１６０、１６０／２１５／２１６／２１８、１６０／２７３、１６８、１６８／２４４／２７３、１７９、１８６、１８６／２００、１９７、２０３、２０７、２０８、２０８／２４６、２１５、２１５／２１６／２４９、２１６、２１６／２７３、２１８、２１８／２４９、２１８／３１３、２３４、２３６、２４４、２４４／２４８、２４４／２４８／２８４、２４４／２７３、２４６、２４６／２４８／２７３、２４８、２４９、２４９／２７３、２５６、２６２、２６４、２６５、２６６、２７１、２７３、２８４、３０１、３１６、３２０、３２１、３２４、および３２９から選択される前記ポリペプチド配列中の１つまたはそれを超える位置において少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号６を基準にしてナンバリングされる操作されたポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドのポリペプチド配列は、配列番号６と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有し、操作されたポリペプチドのポリペプチド配列は、５Ｔ／３５Ｙ、９Ｈ、９Ｈ／４５Ｌ／８９Ｑ／９３Ｈ、９Ｈ／８２Ｓ／８９Ｑ、９Ｈ／８９Ｑ／２４６Ｌ、９Ｈ／８９Ｑ／２７１Ｃ、９Ｈ／９３Ｈ／１４２Ｍ／２４６Ｌ、９Ｈ／１１０Ｖ／３０２Ｆ、９Ｈ／２４６Ｌ、９Ｔ、９Ｔ／２０Ｔ／２３Ｑ／２４Ｆ／１３４Ｓ／２４４Ｇ、９Ｔ／２０Ｔ／２３Ｑ／１０１Ｓ／２４４Ｌ、９Ｔ／２０Ｔ／２４Ｆ／１０１Ｓ／２４４Ｇ／２４９Ｇ、９Ｔ／２３Ｑ／２４Ｆ、９Ｔ／２３Ｑ／２４Ｆ／２９Ｍ／２４４Ｇ、９Ｔ／２３Ｑ／２４Ｆ／１０１Ｓ／２６２Ｖ、９Ｔ／２３Ｑ／２４Ｆ／２４４Ｌ／２６２Ｔ、９Ｔ／２３Ｑ／２９Ｍ、９Ｔ／２４Ｆ／２４４Ｇ、９Ｔ／２４Ｆ／２４４Ｇ／２６２Ｔ、９Ｔ／２４Ｆ／２４９Ｇ、９Ｔ／７９Ｇ／１０１Ｓ／２４４Ｇ、９Ｔ／１０１Ｓ／２４４Ｇ、９Ｔ／２４４Ｇ／２４９Ｇ、９Ｔ／２４４Ｇ／２６２Ｔ／２６４Ｎ、９Ｔ／２６２Ｔ、１５Ｉ、１５Ｉ／１６Ｉ／１８Ｒ／２０Ｈ／８９Ｍ／９３Ｍ／１６０Ｌ、１５Ｉ／２４Ｐ／２６Ｐ／８９Ｍ／９３Ｍ／１６０Ｌ、１５Ｔ、１５Ｔ／３５Ｇ／２７３Ｋ、１５Ｔ／２１８Ｒ／２７３Ｋ、１５Ｔ／２４９Ｍ／２７３Ｋ、１６Ｉ、１７Ｉ／２５Ｒ、１７Ｉ／２５Ｒ／４１Ｆ、１７Ｉ／２５Ｒ／１６０Ｖ、１７Ｉ／１６０Ｖ、１８Ｇ、１８Ｇ／２６Ｈ／２４６Ｖ／２７３Ｔ、１８Ｇ／１４６Ｌ、１８Ｇ／１４６Ｌ／２６２Ｖ、１８Ｇ／１６８Ｐ、１８Ｇ／２４４Ｇ、１８Ｇ／２４４Ｇ／２４８Ｍ、１８Ｇ／２４４Ｌ／２７３Ｖ、１８Ｇ／２７３Ｔ、１８Ｇ／２７３Ｖ、１８Ｋ、１８Ｋ／１４６Ｌ、１８Ｋ／１４６Ｌ／１６８Ｐ、１８Ｋ／１６８Ｐ、１８Ｋ／１６８Ｐ／２４４Ｌ、１８Ｋ／１６８Ｐ／２６２Ｖ／３２４Ｗ、１８Ｋ／２４４Ｇ／２４６Ｖ、１８Ｋ／２４４Ｇ／２４６Ｖ／２８４Ｇ、１８Ｋ／２４４Ｌ、１８Ｋ／２４４Ｌ／２４６Ｖ、１８Ｋ／２４４Ｔ／２６２Ｖ／２７３Ｔ、１８Ｋ／２６２Ｖ、１８Ｋ／２７３Ｔ、１８Ｒ、２０Ｈ、２０Ｈ／２４Ｐ／８９Ｍ／１９７Ｔ、２０Ｈ／３３Ｌ／１６０Ｌ、２０Ｈ／３２４Ｃ、２０Ｔ、２０Ｔ／２３Ｑ／２４Ｆ／５５Ｆ／１３４Ｇ／２４４Ｇ／２６２Ｔ、２０Ｔ／２３Ｑ／１３４Ｓ／２４４Ｇ、２２Ｈ、２２Ｌ、２２Ｌ／１０２Ｌ、２２Ｌ／１６０Ｖ、２２Ｗ、２３Ｈ、２３Ｈ／２５Ｒ／５５Ｌ／３２１Ｙ、２３Ｈ／２５Ｒ／１０２Ｌ／１４２Ｌ、２３Ｈ／１０２Ｌ、２３Ｈ／３２１Ｙ、２３Ｑ、２４Ｄ、２４Ｆ、２４Ｐ、２５Ｒ、２５Ｒ／３３Ｍ、２５Ｒ／１０４Ｖ、２５Ｒ／１６０Ｖ、２５Ｒ／３２１Ｙ、２６Ｈ／２７３Ｋ、２６Ｐ、２９Ｋ、２９Ｋ／８９Ｑ、２９Ｍ、３２Ｌ、３２Ｓ、３３Ｌ、３３Ｍ、３３Ｓ、３５Ｇ、３５Ｇ／２１５Ｌ／２１８Ｒ／２４９Ｔ、３５Ｇ／２１８Ｒ／２４９Ｔ／２７３Ｋ、３５Ｇ／２２１Ｄ、４０Ｍ、４０Ｍ／１６８Ｐ／２０８Ｌ／２４４Ｇ、４０Ｍ／２４４Ｇ／２４８Ｍ、４１Ｆ／１０２Ｌ、４１Ｋ、４１Ｙ、４２Ｔ、４５Ｌ、４６Ｃ、５０Ｔ、５５Ｆ、５５Ｇ、５５Ｋ、５５Ｓ、５６Ｒ、７１Ｙ／１０２Ｐ、７４Ａ、７９Ｇ、７９Ｈ、８２Ｐ、８２Ｓ／２４４Ｄ、８２Ｔ、８９Ｌ、８９Ｍ、８９Ｍ／９３Ｍ／１５６Ｌ／３２４Ｃ、８９Ｍ／９３Ｍ／３２１Ｖ／３２４Ｃ、８９Ｑ、８９Ｗ、９０Ａ、９０Ｃ、９０Ｓ、９０Ｔ、９３Ｈ、９３Ｍ、９３Ｍ／３２４Ｃ、９３Ｐ、９５Ｐ、９５Ｔ、９８Ｍ、１０１Ｌ、１０１Ｌ／１６０Ｙ／２４４Ｅ／２４９Ｍ、１０１Ｓ、１０２Ｌ、１０４Ｉ、１０４Ｓ、１０６Ｓ、１１１Ｌ、１１１Ｔ、１１４Ｔ、１１７Ｄ、１１９Ａ、１３４Ｇ、１３４Ｇ／２４４Ｌ、１３４Ｇ／２６２Ｖ、１３４Ｓ、１３９Ａ、１４０Ｎ／２６６Ｎ、１４２Ｌ／３２１Ｙ、１４２Ｔ、１４５Ｎ、１４６Ａ、１４６Ａ／２４４Ｄ、１４６Ｈ、１４６Ｉ、１４６Ｌ、１４６Ｌ／２４４Ｌ、１４６Ｌ／２７３Ｖ、１５６Ｅ、１５６Ｌ、１５６Ｔ、１６０Ａ、１６０Ｌ、１６０Ｖ、１６０Ｙ、１６０Ｙ／２１５Ｌ／２１６Ｇ／２１８Ｒ、１６０Ｙ／２７３Ｋ、１６８Ｐ、１６８Ｐ／２４４Ｌ／２７３Ｔ、１７９Ｒ、１８６Ｒ、１８６Ｒ／２００Ｒ、１９７Ｌ、１９７Ｔ、２０３Ｐ、２０７Ｙ、２０８Ｋ、２０８Ｌ、２０８Ｌ／２４６Ｖ、２０８Ｐ、２０８Ｒ、２１５Ｌ、２１５Ｌ／２１６Ｇ／２４９Ｍ、２１６Ｇ、２１６Ｐ、２１６Ｐ／２７３Ｖ、２１６Ｓ、２１８Ｎ／３１３Ｈ、２１８Ｒ、２１８Ｒ／２４９Ｍ、２１８Ｓ、２３４Ｈ、２３６Ｔ、２４４Ｅ、２４４Ｇ、２４４Ｇ／２４８Ｍ、２４４Ｇ／２４８Ｍ／２８４Ｇ、２４４Ｌ、２４４Ｌ／２７３Ｃ、２４４Ｌ／２７３Ｖ、２４４Ｔ、２４６Ａ、２４６Ｌ、２４６Ｖ、２４６Ｖ／２４８Ｍ／２７３Ｖ、２４８Ｍ、２４８Ｖ、２４９Ｇ、２４９Ｍ、２４９Ｍ／２７３Ｋ、２４９Ｔ、２５６Ｃ、２６２Ｌ、２６２Ｐ、２６２Ｔ、２６２Ｖ、２６４Ａ、２６４Ｅ、２６４Ｇ、２６４Ｎ、２６４Ｐ、２６４Ｒ、２６４Ｗ、２６５Ｒ、２６６Ｇ、２６６Ｓ、２７１Ｃ、２７３Ｌ、２７３Ｍ、２７３Ｔ、２７３Ｖ、２８４Ｇ、３０１Ｅ、３０１Ｍ、３１６Ｒ、３２０Ｒ、３２０Ｗ、３２１Ｌ、３２１Ｖ、３２１Ｙ、３２４Ｃ、３２４Ｖ、３２４Ｗ、および３２９Ｒから選択される前記ポリペプチド配列中の１つまたはそれを超える位置において少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号６を基準にしてナンバリングされる。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドのポリペプチド配列は、配列番号６と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有し、操作されたポリペプチドのポリペプチド配列は、Ａ５Ｔ／Ａ３５Ｙ、Ｅ９Ｈ、Ｅ９Ｈ／Ｆ４５Ｌ／Ｓ８９Ｑ／Ｓ９３Ｈ、Ｅ９Ｈ／Ｄ８２Ｓ／Ｓ８９Ｑ、Ｅ９Ｈ／Ｓ８９Ｑ／Ｉ２４６Ｌ、Ｅ９Ｈ／Ｓ８９Ｑ／Ｅ２７１Ｃ、Ｅ９Ｈ／Ｓ９３Ｈ／Ｋ１４２Ｍ／Ｉ２４６Ｌ、Ｅ９Ｈ／Ｌ１１０Ｖ／Ｖ３０２Ｆ、Ｅ９Ｈ／Ｉ２４６Ｌ、Ｅ９Ｔ、Ｅ９Ｔ／Ｙ２０Ｔ／Ｙ２３Ｑ／Ｓ２４Ｆ／Ｔ１３４Ｓ／Ｐ２４４Ｇ、Ｅ９Ｔ／Ｙ２０Ｔ／Ｙ２３Ｑ／Ｔ１０１Ｓ／Ｐ２４４Ｌ、Ｅ９Ｔ／Ｙ２０Ｔ／Ｓ２４Ｆ／Ｔ１０１Ｓ／Ｐ２４４Ｇ／Ｋ２４９Ｇ、Ｅ９Ｔ／Ｙ２３Ｑ／Ｓ２４Ｆ、Ｅ９Ｔ／Ｙ２３Ｑ／Ｓ２４Ｆ／Ｄ２９Ｍ／Ｐ２４４Ｇ、Ｅ９Ｔ／Ｙ２３Ｑ／Ｓ２４Ｆ／Ｔ１０１Ｓ／Ａ２６２Ｖ、Ｅ９Ｔ／Ｙ２３Ｑ／Ｓ２４Ｆ／Ｐ２４４Ｌ／Ａ２６２Ｔ、Ｅ９Ｔ／Ｙ２３Ｑ／Ｄ２９Ｍ、Ｅ９Ｔ／Ｓ２４Ｆ／Ｐ２４４Ｇ、Ｅ９Ｔ／Ｓ２４Ｆ／Ｐ２４４Ｇ／Ａ２６２Ｔ、Ｅ９Ｔ／Ｓ２４Ｆ／Ｋ２４９Ｇ、Ｅ９Ｔ／Ｒ７９Ｇ／Ｔ１０１Ｓ／Ｐ２４４Ｇ、Ｅ９Ｔ／Ｔ１０１Ｓ／Ｐ２４４Ｇ、Ｅ９Ｔ／Ｐ２４４Ｇ／Ｋ２４９Ｇ、Ｅ９Ｔ／Ｐ２４４Ｇ／Ａ２６２Ｔ／Ｌ２６４Ｎ、Ｅ９Ｔ／Ａ２６２Ｔ、Ｄ１５Ｉ、Ｄ１５Ｉ／Ｔ１６Ｉ／Ｌ１８Ｒ／Ｙ２０Ｈ／Ｓ８９Ｍ／Ｓ９３Ｍ／Ｆ１６０Ｌ、Ｄ１５Ｉ／Ｓ２４Ｐ／Ｙ２６Ｐ／Ｓ８９Ｍ／Ｓ９３Ｍ／Ｆ１６０Ｌ、Ｄ１５Ｔ、Ｄ１５Ｔ／Ａ３５Ｇ／Ｙ２７３Ｋ、Ｄ１５Ｔ／Ｌ２１８Ｒ／Ｙ２７３Ｋ、Ｄ１５Ｔ／Ｋ２４９Ｍ／Ｙ２７３Ｋ、Ｔ１６Ｉ、Ｇ１７Ｉ／Ｄ２５Ｒ、Ｇ１７Ｉ／Ｄ２５Ｒ／Ｉ４１Ｆ、Ｇ１７Ｉ／Ｄ２５Ｒ／Ｆ１６０Ｖ、Ｇ１７Ｉ／Ｆ１６０Ｖ、Ｌ１８Ｇ、Ｌ１８Ｇ／Ｙ２６Ｈ／Ｉ２４６Ｖ／Ｙ２７３Ｔ、Ｌ１８Ｇ／Ｑ１４６Ｌ、Ｌ１８Ｇ／Ｑ１４６Ｌ／Ａ２６２Ｖ、Ｌ１８Ｇ／Ｈ１６８Ｐ、Ｌ１８Ｇ／Ｐ２４４Ｇ、Ｌ１８Ｇ／Ｐ２４４Ｇ／Ｒ２４８Ｍ、Ｌ１８Ｇ／Ｐ２４４Ｌ／Ｙ２７３Ｖ、Ｌ１８Ｇ／Ｙ２７３Ｔ、Ｌ１８Ｇ／Ｙ２７３Ｖ、Ｌ１８Ｋ、Ｌ１８Ｋ／Ｑ１４６Ｌ、Ｌ１８Ｋ／Ｑ１４６Ｌ／Ｈ１６８Ｐ、Ｌ１８Ｋ／Ｈ１６８Ｐ、Ｌ１８Ｋ／Ｈ１６８Ｐ／Ｐ２４４Ｌ、Ｌ１８Ｋ／Ｈ１６８Ｐ／Ａ２６２Ｖ／Ｌ３２４Ｗ、Ｌ１８Ｋ／Ｐ２４４Ｇ／Ｉ２４６Ｖ、Ｌ１８Ｋ／Ｐ２４４Ｇ／Ｉ２４６Ｖ／Ａ２８４Ｇ、Ｌ１８Ｋ／Ｐ２４４Ｌ、Ｌ１８Ｋ／Ｐ２４４Ｌ／Ｉ２４６Ｖ、Ｌ１８Ｋ／Ｐ２４４Ｔ／Ａ２６２Ｖ／Ｙ２７３Ｔ、Ｌ１８Ｋ／Ａ２６２Ｖ、Ｌ１８Ｋ／Ｙ２７３Ｔ、Ｌ１８Ｒ、Ｙ２０Ｈ、Ｙ２０Ｈ／Ｓ２４Ｐ／Ｓ８９Ｍ／Ｒ１９７Ｔ、Ｙ２０Ｈ／Ｐ３３Ｌ／Ｆ１６０Ｌ、Ｙ２０Ｈ／Ｌ３２４Ｃ、Ｙ２０Ｔ、Ｙ２０Ｔ／Ｙ２３Ｑ／Ｓ２４Ｆ／Ｉ５５Ｆ／Ｔ１３４Ｇ／Ｐ２４４Ｇ／Ａ２６２Ｔ、Ｙ２０Ｔ／Ｙ２３Ｑ／Ｔ１３４Ｓ／Ｐ２４４Ｇ、Ｔ２２Ｈ、Ｔ２２Ｌ、Ｔ２２Ｌ／Ｑ１０２Ｌ、Ｔ２２Ｌ／Ｆ１６


０Ｖ、Ｔ２２Ｗ、Ｙ２３Ｈ、Ｙ２３Ｈ／Ｄ２５Ｒ／Ｉ５５Ｌ／Ｐ３２１Ｙ、Ｙ２３Ｈ／Ｄ２５Ｒ／Ｑ１０２Ｌ／Ｋ１４２Ｌ、Ｙ２３Ｈ／Ｑ１０２Ｌ、Ｙ２３Ｈ／Ｐ３２１Ｙ、Ｙ２３Ｑ、Ｓ２４Ｄ、Ｓ２４Ｆ、Ｓ２４Ｐ、Ｄ２５Ｒ、Ｄ２５Ｒ／Ｐ３３Ｍ、Ｄ２５Ｒ／Ｅ１０４Ｖ、Ｄ２５Ｒ／Ｆ１６０Ｖ、Ｄ２５Ｒ／Ｐ３２１Ｙ、Ｙ２６Ｈ／Ｙ２７３Ｋ、Ｙ２６Ｐ、Ｄ２９Ｋ、Ｄ２９Ｋ／Ｓ８９Ｑ、Ｄ２９Ｍ、Ｎ３２Ｌ、Ｎ３２Ｓ、Ｐ３３Ｌ、Ｐ３３Ｍ、Ｐ３３Ｓ、Ａ３５Ｇ、Ａ３５Ｇ／Ｇ２１５Ｌ／Ｌ２１８Ｒ／Ｋ２４９Ｔ、Ａ３５Ｇ／Ｌ２１８Ｒ／Ｋ２４９Ｔ／Ｙ２７３Ｋ、Ａ３５Ｇ／Ｅ２２１Ｄ、Ｗ４０Ｍ、Ｗ４０Ｍ／Ｈ１６８Ｐ／Ｅ２０８Ｌ／Ｐ２４４Ｇ、Ｗ４０Ｍ／Ｐ２４４Ｇ／Ｒ２４８Ｍ、Ｉ４１Ｆ／Ｑ１０２Ｌ、Ｉ４１Ｋ、Ｉ４１Ｙ、Ｇ４２Ｔ、Ｆ４５Ｌ、Ｖ４６Ｃ、Ｅ５０Ｔ、Ｉ５５Ｆ、Ｉ５５Ｇ、Ｉ５５Ｋ、Ｉ５５Ｓ、Ｆ５６Ｒ、Ｈ７１Ｙ／Ｑ１０２Ｐ、Ｎ７４Ａ、Ｒ７９Ｇ、Ｒ７９Ｈ、Ｄ８２Ｐ、Ｄ８２Ｓ／Ｐ２４４Ｄ、Ｄ８２Ｔ、Ｓ８９Ｌ、Ｓ８９Ｍ、Ｓ８９Ｍ／Ｓ９３Ｍ／Ｑ１５６Ｌ／Ｌ３２４Ｃ、Ｓ８９Ｍ／Ｓ９３Ｍ／Ｐ３２１Ｖ／Ｌ３２４Ｃ、Ｓ８９Ｑ、Ｓ８９Ｗ、Ｎ９０Ａ、Ｎ９０Ｃ、Ｎ９０Ｓ、Ｎ９０Ｔ、Ｓ９３Ｈ、Ｓ９３Ｍ、Ｓ９３Ｍ／Ｌ３２４Ｃ、Ｓ９３Ｐ、Ｒ９５Ｐ、Ｒ９５Ｔ、Ｐ９８Ｍ、Ｔ１０１Ｌ、Ｔ１０１Ｌ／Ｆ１６０Ｙ／Ｐ２４４Ｅ／Ｋ２４９Ｍ、Ｔ１０１Ｓ、Ｑ１０２Ｌ、Ｅ１０４Ｉ、Ｅ１０４Ｓ、Ｋ１０６Ｓ、Ｅ１１１Ｌ、Ｅ１１１Ｔ、Ａ１１４Ｔ、Ｅ１１７Ｄ、Ｒ１１９Ａ、Ｔ１３４Ｇ、Ｔ１３４Ｇ／Ｐ２４４Ｌ、Ｔ１３４Ｇ／Ａ２６２Ｖ、Ｔ１３４Ｓ、Ｄ１３９Ａ、Ｉ１４０Ｎ／Ｄ２６６Ｎ、Ｋ１４２Ｌ／Ｐ３２１Ｙ、Ｋ１４２Ｔ、Ｐ１４５Ｎ、Ｑ１４６Ａ、Ｑ１４６Ａ／Ｐ２４４Ｄ、Ｑ１４６Ｈ、Ｑ１４６Ｉ、Ｑ１４６Ｌ、Ｑ１４６Ｌ／Ｐ２４４Ｌ、Ｑ１４６Ｌ／Ｙ２７３Ｖ、Ｑ１５６Ｅ、Ｑ１５６Ｌ、Ｑ１５６Ｔ、Ｆ１６０Ａ、Ｆ１６０Ｌ、Ｆ１６０Ｖ、Ｆ１６０Ｙ、Ｆ１６０Ｙ／Ｇ２１５Ｌ／Ｄ２１６Ｇ／Ｌ２１８Ｒ、Ｆ１６０Ｙ／Ｙ２７３Ｋ、Ｈ１６８Ｐ、Ｈ１６８Ｐ／Ｐ２４４Ｌ／Ｙ２７３Ｔ、Ｐ１７９Ｒ、Ｑ１８６Ｒ、Ｑ１８６Ｒ／Ｑ２００Ｒ、Ｒ１９７Ｌ、Ｒ１９７Ｔ、Ｈ２０３Ｐ、Ｆ２０７Ｙ、Ｅ２０８Ｋ、Ｅ２０８Ｌ、Ｅ２０８Ｌ／Ｉ２４６Ｖ、Ｅ２０８Ｐ、Ｅ２０８Ｒ、Ｇ２１５Ｌ、Ｇ２１５Ｌ／Ｄ２１６Ｇ／Ｋ２４９Ｍ、Ｄ２１６Ｇ、Ｄ２１６Ｐ、Ｄ２１６Ｐ／Ｙ２７３Ｖ、Ｄ２１６Ｓ、Ｌ２１８Ｎ／Ｒ３１３Ｈ、Ｌ２１８Ｒ、Ｌ２１８Ｒ／Ｋ２４９Ｍ、Ｌ２１８Ｓ、Ｖ２３４Ｈ、Ｒ２３６Ｔ、Ｐ２４４Ｅ、Ｐ２４４Ｇ、Ｐ２４４Ｇ／Ｒ２４８Ｍ、Ｐ２４４Ｇ／Ｒ２４８Ｍ／Ａ２８４Ｇ、Ｐ２４４Ｌ、Ｐ２４４Ｌ／Ｙ２７３Ｃ、Ｐ２４４Ｌ／Ｙ２７３Ｖ、Ｐ２４４Ｔ、Ｉ２４６Ａ、Ｉ２４６Ｌ、Ｉ２４６Ｖ、Ｉ２４６Ｖ／Ｒ２４８Ｍ／Ｙ２７３Ｖ、Ｒ２４８Ｍ、Ｒ２４８Ｖ、Ｋ２４９Ｇ、Ｋ２４９Ｍ、Ｋ２４９Ｍ／Ｙ２７３Ｋ、Ｋ２４９Ｔ、Ｅ２５６Ｃ、Ａ２６２Ｌ、Ａ２６２Ｐ、Ａ２６２Ｔ、Ａ２６２Ｖ、Ｌ２６４Ａ、Ｌ２６４Ｅ、Ｌ２６４Ｇ、Ｌ２６４Ｎ、Ｌ２６４Ｐ、Ｌ２６４Ｒ、Ｌ２６４Ｗ、Ａ２６５Ｒ、Ｄ２６６Ｇ、Ｄ２６６Ｓ、Ｅ２７１Ｃ、Ｙ２７３Ｌ、Ｙ２７３Ｍ、Ｙ２７３Ｔ、Ｙ２７３Ｖ、Ａ２８４Ｇ、Ｇ３０１Ｅ、Ｇ３０１Ｍ、Ｅ３１６Ｒ、Ｅ３２０Ｒ、Ｅ３２０Ｗ、Ｐ３２１Ｌ、Ｐ３２１Ｖ、Ｐ３２１Ｙ、Ｌ３２４Ｃ、Ｌ３２４Ｖ、Ｌ３２４Ｗ、およびＱ３２９Ｒから選択される前記ポリペプチド配列中の１つまたはそれを超える位置において少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号６を基準にしてナンバリングされる。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号６と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号６と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。
いくつかのさらなる実施形態では、本発明は、配列番号３３２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有する操作されたポリペプチドであって、９／８９／９３／１０１／１６０、９／８９／１６０、３３、３５、４４、４９、７４、８９、８９／９３／１６０／２４９、１０７、１０８、１１７、１４０、１４１、１４２、１４４、１５６、１６８、２０３、２０７、２３４、２７０、２７３、２７４、２９２、２９６、２９７、３００、３０２、３０５、３１７、３１９、３２１、３２３、３２７、および３２９から選択される前記ポリペプチド配列中の１つまたはそれを超える位置において少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号３３２を基準にしてナンバリングされる操作されたポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドのポリペプチド配列は、配列番号３３２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有し、操作されたポリペプチドのポリペプチド配列は、９Ｈ／８９Ｍ／９３Ｍ／１０１Ｓ／１６０Ｙ、９Ｈ／８９Ｑ／１６０Ｙ、３３Ｎ、３５Ｈ、３５Ｍ、４４Ｔ、４９Ｐ、７４Ｋ、７４Ｒ、８９Ｌ、８９Ｍ／９３Ｍ／１６０Ｖ／２４９Ｍ、８９Ｖ、８９Ｗ、１０７Ｍ、１０７Ｒ、１０７Ｖ、１０８Ｌ、１１７Ｄ、１４０Ｌ、１４０Ｍ、１４０Ｓ、１４１Ａ、１４１Ｈ、１４２Ｎ、１４２Ｓ、１４４Ａ、１５６Ｃ、１５６Ｔ、１６８Ｐ、１６８Ｒ、２０３Ｌ、２０７Ｇ、２３４Ｉ、２３４Ｔ、２７０Ｒ、２７０Ｓ、２７３Ｌ、２７４Ａ、２７４Ｇ、２９２Ｔ、２９６Ｍ、２９６Ｖ、２９６Ｗ、２９７Ｌ、２９７Ｔ、３００Ｔ、３０２Ｉ、３０２Ｌ、３０２Ｑ、３０５Ｑ、３０５Ｔ、３１７Ｗ、３１９Ｔ、３２１Ａ、３２１Ｓ、３２１Ｔ、３２３Ｒ、３２３Ｖ、３２７Ｈ、３２７Ｑ、３２７Ｓ、３２９Ｒ、および３２９Ｖから選択される前記ポリペプチド配列中の１つまたはそれを超える位置において少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号３３２を基準にしてナンバリングされる。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドのポリペプチド配列は、配列番号３３２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有し、操作されたポリペプチドのポリペプチド配列は、Ｅ９Ｈ／Ｓ８９Ｍ／Ｓ９３Ｍ／Ｔ１０１Ｓ／Ｆ１６０Ｙ、Ｅ９Ｈ／Ｓ８９Ｑ／Ｆ１６０Ｙ、Ｐ３３Ｎ、Ａ３５Ｈ、Ａ３５Ｍ、Ａ４４Ｔ、Ｓ４９Ｐ、Ｎ７４Ｋ、Ｎ７４Ｒ、Ｓ８９Ｌ、Ｓ８９Ｍ／Ｓ９３Ｍ／Ｆ１６０Ｖ／Ｋ２４９Ｍ、Ｓ８９Ｖ、Ｓ８９Ｗ、Ｅ１０７Ｍ、Ｅ１０７Ｒ、Ｅ１０７Ｖ、Ｉ１０８Ｌ、Ｅ１１７Ｄ、Ｉ１４０Ｌ、Ｉ１４０Ｍ、Ｉ１４０Ｓ、Ｔ１４１Ａ、Ｔ１４１Ｈ、Ｋ１４２Ｎ、Ｋ１４２Ｓ、Ｒ１４４Ａ、Ｑ１５６Ｃ、Ｑ１５６Ｔ、Ｈ１６８Ｐ、Ｈ１６８Ｒ、Ｈ２０３Ｌ、Ｆ２０７Ｇ、Ｖ２３４Ｉ、Ｖ２３４Ｔ、Ａ２７０Ｒ、Ａ２７０Ｓ、Ｙ２７３Ｌ、Ｄ２７４Ａ、Ｄ２７４Ｇ、Ｓ２９２Ｔ、Ｎ２９６Ｍ、Ｎ２９６Ｖ、Ｎ２９６Ｗ、Ｓ２９７Ｌ、Ｓ２９７Ｔ、Ｄ３００Ｔ、Ｖ３０２Ｉ、Ｖ３０２Ｌ、Ｖ３０２Ｑ、Ｐ３０５Ｑ、Ｐ３０５Ｔ、Ｌ３１７Ｗ、Ｖ３１９Ｔ、Ｐ３２１Ａ、Ｐ３２１Ｓ、Ｐ３２１Ｔ、Ｓ３２３Ｒ、Ｓ３２３Ｖ、Ｐ３２７Ｈ、Ｐ３２７Ｑ、Ｐ３２７Ｓ、Ｑ３２９Ｒ、およびＱ３２９Ｖから選択される前記ポリペプチド配列中の１つまたはそれを超える位置において少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号３３２を基準にしてナンバリングされる。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号３３２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号３３２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号３３２と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。
いくつかのさらなる実施形態では、本発明は、配列番号５１８と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有する操作されたポリペプチドであって、３５／２７３、４６／２７３、１１１／１５９／２７３、１５９、１５９／２７３、１７４、１９９、２７３および２８７から選択される前記ポリペプチド配列中の１つまたはそれを超える位置において少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号５１８を基準にしてナンバリングされる操作されたポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドのポリペプチド配列は、配列番号５１８と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有し、操作されたポリペプチドのポリペプチド配列は、３５Ｈ／２７３Ｌ、４６Ｌ／２７３Ｌ、１１１Ｑ／１５９Ｄ／２７３Ｌ、１５９Ｄ、１５９Ｄ／２７３Ｌ、１７４Ｇ、１９９Ｌ、２７３Ｌ、および２８７Ｐから選択される前記ポリペプチド配列中の１つまたはそれを超える位置において少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号５１８を基準にしてナンバリングされる。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドのポリペプチド配列は、配列番号５１８と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有し、操作されたポリペプチドのポリペプチド配列は、Ａ３５Ｈ／Ｙ２７３Ｌ、Ｖ４６Ｌ／Ｙ２７３Ｌ、Ｅ１１１Ｑ／Ｐ１５９Ｄ／Ｙ２７３Ｌ、Ｐ１５９Ｄ、Ｐ１５９Ｄ／Ｙ２７３Ｌ、Ｓ１７４Ｇ、Ｉ１９９Ｌ、Ｙ２７３Ｌ、およびＶ２８７Ｐから選択される前記ポリペプチド配列中の１つまたはそれを超える位置において少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号５１８を基準にしてナンバリングされる。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号５１８と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号５１８と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号５１８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。
いくつかのさらなる実施形態では、本発明は、配列番号３３２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有する操作されたポリペプチドであって、前記操作されたポリペプチドは、配列番号３３２の操作されたポリペプチドと比較して湿潤有機溶媒中の熱活性の増加を有し、前記操作されたポリペプチドは、２３／２９／５５、３４、４４、７４、９２、１０８、１１７、１４０、１４１、１４４、１５６、１６０、１６８、２１５、２５６、２６９、２７０、２７４、２９２、２９６、３０２、３１９、３２３、および３２９から選択される前記ポリペプチド配列中の１つまたはそれを超える位置において少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号３３２を基準にしてナンバリングされる操作されたポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドのポリペプチド配列は、配列番号３３２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有し、操作されたポリペプチドのポリペプチド配列は、２３Ｙ／２９Ｙ／５５Ｋ、３４Ｙ、４４Ｎ、７４Ｋ、７４Ｒ、９２Ｄ、１０８Ｌ、１１７Ｒ、１４０Ｌ、１４１Ｈ、１４４Ｖ、１５６Ｔ、１６０Ｖ、１６０Ｗ、１６０Ｙ、１６８Ｑ、２１５Ａ、２１５Ｓ、２１５Ｔ、２５６Ｇ、２６９Ｔ、２７０Ｑ、２７０Ｓ、２７４Ａ、２９２Ｔ、２９６Ｍ、２９６Ｖ、２９６Ｙ、３０２Ｌ、３０２Ｑ、３０２Ｓ、３１９Ｒ、３２３Ｌ、３２９Ｒ、および３２９Ｖから選択される前記ポリペプチド配列中の１つまたはそれを超える位置において少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号３３２を基準にしてナンバリングされる。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドのポリペプチド配列は、配列番号３３２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有し、操作されたポリペプチドのポリペプチド配列は、Ｑ２３Ｙ／Ｄ２９Ｙ／Ｉ５５Ｋ、Ｌ３４Ｙ、Ａ４４Ｎ、Ｎ７４Ｋ、Ｎ７４Ｒ、Ｅ９２Ｄ、Ｉ１０８Ｌ、Ｅ１１７Ｒ、Ｉ１４０Ｌ、Ｔ１４１Ｈ、Ｒ１４４Ｖ、Ｑ１５６Ｔ、Ｆ１６０Ｖ、Ｆ１６０Ｗ、Ｆ１６０Ｙ、Ｈ１６８Ｑ、Ｇ２１５Ａ、Ｇ２１５Ｓ、Ｇ２１５Ｔ、Ｅ２５６Ｇ、Ｐ２６９Ｔ、Ａ２７０Ｑ、Ａ２７０Ｓ、Ｄ２７４Ａ、Ｓ２９２Ｔ、Ｎ２９６Ｍ、Ｎ２９６Ｖ、Ｎ２９６Ｙ、Ｖ３０２Ｌ、Ｖ３０２Ｑ、Ｖ３０２Ｓ、Ｖ３１９Ｒ、Ｓ３２３Ｌ、Ｑ３２９Ｒ、およびＱ３２９Ｖから選択される前記ポリペプチド配列中の１つまたはそれを超える位置において少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号３３２を基準にしてナンバリングされる。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号３３２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号３３２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号３３２と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。
いくつかのさらなる実施形態では、本発明は、配列番号５１８と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有する操作されたポリペプチドであって、前記操作されたポリペプチドは、配列番号５１８の操作されたポリペプチドと比較して湿潤有機溶媒中の熱活性の増加を有し、前記操作されたポリペプチドは、３４／７４／９２、３５／２７３／３２３、３９、４６／２７３、４８、５５、７４／９２、１２６、１３３、１３８、１５０、１６０／２１５／３２９、１７８、１９９、２０７、２７３および２９２から選択される前記ポリペプチド配列中の１つまたはそれを超える位置において少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号５１８を基準にしてナンバリングされる操作されたポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドのポリペプチド配列は、配列番号５１８と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有し、操作されたポリペプチドのポリペプチド配列は、３４Ｙ／７４Ｋ／９２Ｄ、３５Ｈ／２７３Ｌ／３２３Ｒ、３９Ｇ、４６Ｌ／２７３Ｌ、４８Ｇ、５５Ｖ、７４Ｋ／９２Ｄ、１２６Ｌ、１２６Ｖ、１３３Ｔ、１３８Ａ、１５０Ｗ、１６０Ｖ／２１５Ｓ／３２９Ｒ、１７８Ｓ、１９９Ｌ、２０７Ｙ、２７３Ｌ、および２９２Ｔから選択される前記ポリペプチド配列中の１つまたはそれを超える位置において少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号５１８を基準にしてナンバリングされる。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドのポリペプチド配列は、配列番号５１８と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有し、操作されたポリペプチドのポリペプチド配列は、Ｌ３４Ｙ／Ｎ７４Ｋ／Ｅ９２Ｄ、Ａ３５Ｈ／Ｙ２７３Ｌ／Ｓ３２３Ｒ、Ａ３９Ｇ、Ｖ４６Ｌ／Ｙ２７３Ｌ、Ｐ４８Ｇ、Ｉ５５Ｖ、Ｎ７４Ｋ／Ｅ９２Ｄ、Ｔ１２６Ｌ、Ｔ１２６Ｖ、Ｓ１３３Ｔ、Ｒ１３８Ａ、Ｆ１５０Ｗ、Ｙ１６０Ｖ／Ｇ２１５Ｓ／Ｑ３２９Ｒ、Ｔ１７８Ｓ、Ｉ１９９Ｌ、Ｆ２０７Ｙ、Ｙ２７３Ｌ、およびＳ２９２Ｔから選択される前記ポリペプチド配列中の１つまたはそれを超える位置において少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号５１８を基準にしてナンバリングされる。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号５１８と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号５１８と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号５１８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。
いくつかのさらなる実施形態では、本発明は、配列番号６５６と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有する操作されたポリペプチドであって、前記操作されたポリペプチドは、配列番号６５６の操作されたポリペプチドと比較して湿潤有機溶媒中の熱活性の増加を有し、前記操作されたポリペプチドは、１８、３５／３９／５５／１３８／１５０、３５／３９／５５／１５０、３５／３９／１２６／１５０／２７３、３５／３９／１３３、３５／３９／１３３／１５０／２７３、３５／３９／１５０、３５／３９／１５０／２７３、３５／１３３／１７８、３５／１３８／１５０／２７３、３５／１５０／２７３、３５／１７８／２７３、３５／２７３、３９、３９／５５／１５０／１７８／２７３、３９／５５／１５０／２７３、３９／１２６／１５０、３９／１３３／１５０、３９／１３３／１７８／２７３、３９／１３３／２７３、３９／１５０／１７８、３９／１５０／１７８／２０７、３９／１５０／１７８／２０７／２７３、３９／１５０／２７３、３９／１７８、３９／１７８／２７３、３９／２０７、３９／２０７／２７３、３９／２７３、４４、５５、５５／１５０、８８、１２６、１２６／１３３／１７８、１２６／１３８／１７８、１２６／１７８／２０７、１３２、１３８／１５０／１７８、１４１、１５０、１５０／１７８／２７３／３２３、１５０／１７８／３２３、１５０／２０７／２７３、１５０／２７３、１６８、１７８／２７３、２３９、２６１、２６３、２６９、２７３、２９７、および３１２から選択される前記ポリペプチド配列中の１つまたはそれを超える位置において少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号６５６を基準にしてナンバリングされる操作されたポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドのポリペプチド配列は、配列番号６５６と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有し、操作されたポリペプチドのポリペプチド配列は、１８Ｒ、３５Ｈ／３９Ｇ／５５Ｖ／１３８Ａ／１５０Ｗ、３５Ｈ／３９Ｇ／５５Ｖ／１５０Ｗ、３５Ｈ／３９Ｇ／１２６Ｖ／１５０Ｗ／２７３Ｌ、３５Ｈ／３９Ｇ／１３３Ｔ、３５Ｈ／３９Ｇ／１３３Ｔ／１５０Ｗ／２７３Ｌ、３５Ｈ／３９Ｇ／１５０Ｗ、３５Ｈ／３９Ｇ／１５０Ｗ／２７３Ｌ、３５Ｈ／１３３Ｔ／１７８Ｓ、３５Ｈ／１３８Ａ／１５０Ｗ／２７３Ｌ、３５Ｈ／１５０Ｗ／２７３Ｌ、３５Ｈ／１７８Ｓ／２７３Ｌ、３５Ｈ／２７３Ｌ、３９Ｇ、３９Ｇ／５５Ｖ／１５０Ｗ／１７８Ｓ／２７３Ｌ、３９Ｇ／５５Ｖ／１５０Ｗ／２７３Ｌ、３９Ｇ／１２６Ｖ／１５０Ｗ、３９Ｇ／１３３Ｔ／１５０Ｗ、３９Ｇ／１３３Ｔ／１７８Ｓ／２７３Ｌ、３９Ｇ／１３３Ｔ／２７３Ｌ、３９Ｇ／１５０Ｗ／１７８Ｓ、３９Ｇ／１５０Ｗ／１７８Ｓ／２０７Ｙ、３９Ｇ／１５０Ｗ／１７８Ｓ／２０７Ｙ／２７３Ｌ、３９Ｇ／１５０Ｗ／２７３Ｌ、３９Ｇ／１７８Ｓ、３９Ｇ／１７８Ｓ／２７３Ｌ、３９Ｇ／２０７Ｙ、３９Ｇ／２０７Ｙ／２７３Ｌ、３９Ｇ／２７３Ｌ、４４Ｌ、４４Ｑ、５５Ｆ、５５Ｖ、５５Ｖ／１５０Ｗ、８８Ｗ、１２６Ｖ、１２６Ｖ／１３３Ｔ／１７８Ｓ、１２６Ｖ／１３８Ａ／１７８Ｓ、１２６Ｖ／１７８Ｓ／２０７Ｙ、１３２Ｄ、１３２Ｅ、１３８Ａ／１５０Ｗ／１７８Ｓ、１４１Ｓ、１５０Ｗ、１５０Ｗ／１７８Ｓ／２７３Ｌ／３２３Ｒ、１５０Ｗ／１７８Ｓ／３２３Ｒ、１５０Ｗ／２０７Ｙ／２７３Ｌ、１５０Ｗ／２７３Ｌ、１６８Ｄ、１７８Ｓ／２７３Ｌ、２３９Ｎ、２６１Ｒ、２６３Ｅ、２６９Ｖ、２７３Ｌ、２９７Ｅ、２９７Ｒ、および３１２Ａから選択される前記ポリペプチド配列中の１つまたはそれを超える位置において少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号６５６を基準にしてナンバリングされる。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドのポリペプチド配列は、配列番号６５６と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有し、操作されたポリペプチドのポリペプチド配列は、Ｌ１８Ｒ、Ａ３５Ｈ／Ａ３９Ｇ／Ｉ５５Ｖ／Ｒ１３８Ａ／Ｆ１５０Ｗ、Ａ３５Ｈ／Ａ３９Ｇ／Ｉ５５Ｖ／Ｆ１５０Ｗ、Ａ３５Ｈ／Ａ３９Ｇ／Ｔ１２６Ｖ／Ｆ１５０Ｗ／Ｙ２７３Ｌ、Ａ３５Ｈ／Ａ３９Ｇ／Ｓ１３３Ｔ、Ａ３５Ｈ／Ａ３９Ｇ／Ｓ１３３Ｔ／Ｆ１５０Ｗ／Ｙ２７３Ｌ、Ａ３５Ｈ／Ａ３９Ｇ／Ｆ１５０Ｗ、Ａ３５Ｈ／Ａ３９Ｇ／Ｆ１５０Ｗ／Ｙ２７３Ｌ、Ａ３５Ｈ／Ｓ１３３Ｔ／Ｔ１７８Ｓ、Ａ３５Ｈ／Ｒ１３８Ａ／Ｆ１５０Ｗ／Ｙ２７３Ｌ、Ａ３５Ｈ／Ｆ１５０Ｗ／Ｙ２７３Ｌ、Ａ３５Ｈ／Ｔ１７８Ｓ／Ｙ２７３Ｌ、Ａ３５Ｈ／Ｙ２７３Ｌ、Ａ３９Ｇ、Ａ３９Ｇ／Ｉ５５Ｖ／Ｆ１５０Ｗ／Ｔ１７８Ｓ／Ｙ２７３Ｌ、Ａ３９Ｇ／Ｉ５５Ｖ／Ｆ１５０Ｗ／Ｙ２７３Ｌ、Ａ３９Ｇ／Ｔ１２６Ｖ／Ｆ１５０Ｗ、Ａ３９Ｇ／Ｓ１３３Ｔ／Ｆ１５０Ｗ、Ａ３９Ｇ／Ｓ１３３Ｔ／Ｔ１７８Ｓ／Ｙ２７３Ｌ、Ａ３９Ｇ／Ｓ１３３Ｔ／Ｙ２７３Ｌ、Ａ３９Ｇ／Ｆ１５０Ｗ／Ｔ１７８Ｓ、Ａ３９Ｇ／Ｆ１５０Ｗ／Ｔ１７８Ｓ／Ｆ２０７Ｙ、Ａ３９Ｇ／Ｆ１５０Ｗ／Ｔ１７８Ｓ／Ｆ２０７Ｙ／Ｙ２７３Ｌ、Ａ３９Ｇ／Ｆ１５０Ｗ／Ｙ２７３Ｌ、Ａ３９Ｇ／Ｔ１７８Ｓ、Ａ３９Ｇ／Ｔ１７８Ｓ／Ｙ２７３Ｌ、Ａ３９Ｇ／Ｆ２０７Ｙ、Ａ３９Ｇ／Ｆ２０７Ｙ／Ｙ２７３Ｌ、Ａ３９Ｇ／Ｙ２７３Ｌ、Ａ４４Ｌ、Ａ４４Ｑ、Ｉ５５Ｆ、Ｉ５５Ｖ、Ｉ５５Ｖ／Ｆ１５０Ｗ、Ｆ８８Ｗ、Ｔ１２６Ｖ、Ｔ１２６Ｖ／Ｓ１３３Ｔ／Ｔ１７８Ｓ、Ｔ１２６Ｖ／Ｒ１３８Ａ／Ｔ１７８Ｓ、Ｔ１２６Ｖ／Ｔ１７８Ｓ／Ｆ２０７Ｙ、Ｓ１３２Ｄ、Ｓ１３２Ｅ、Ｒ１３８Ａ／Ｆ１５０Ｗ／Ｔ１７８Ｓ、Ｔ１４１Ｓ、Ｆ１５０Ｗ、Ｆ１５０Ｗ／Ｔ１７８Ｓ／Ｙ２７３Ｌ／Ｓ３２３Ｒ、Ｆ１５０Ｗ／Ｔ１７８Ｓ／Ｓ３２３Ｒ、Ｆ１５０Ｗ／Ｆ２０７Ｙ／Ｙ２７３Ｌ、Ｆ１５０Ｗ／Ｙ２７３Ｌ、Ｈ１６８Ｄ、Ｔ１７８Ｓ／Ｙ２７３Ｌ、Ｇ２３９Ｎ、Ｅ２６１Ｒ、Ｉ２６３Ｅ、Ｐ２６９Ｖ、Ｙ２７３Ｌ、Ｓ２９７Ｅ、Ｓ２９７Ｒ、およびＲ３１２Ａから選択される前記ポリペプチド配列中の１つまたはそれを超える位置において少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号６５６を基準にしてナンバリングされる。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号６５６と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号６５６と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号６５６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。
いくつかのさらなる実施形態では、本発明は、配列番号２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有する操作されたポリペプチドであって、前記操作されたポリペプチドは、９／２０／２３／３９／５５／８９／１３４／１５０／１５５／１６０／１７８／１９９／２４４／２７３／２８４、９／２０／２３／８９／１３４／１５５／１６０／１９９／２４４／２８４、９／２０／２３／８９／１３４／１５５／１６０／２４４／２８４、２０／２３／１３４／１５５／２４４／２８４、および１５５／２８４から選択される前記ポリペプチド配列中の１つまたはそれを超える位置において少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号２を基準にしてナンバリングされる操作されたポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドのポリペプチド配列は、配列番号２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有し、操作されたポリペプチドのポリペプチド配列は、９Ｈ／２０Ｔ／２３Ｑ／３９Ｇ／５５Ｖ／８９Ｑ／１３４Ｓ／１５０Ｗ／１５５Ｗ／１６０Ｙ／１７８Ｓ／１９９Ｌ／２４４Ｇ／２７３Ｌ／２８４Ａ、９Ｈ／２０Ｔ／２３Ｑ／８９Ｑ／１３４Ｓ／１５５Ｗ／１６０Ｙ／１９９Ｌ／２４４Ｇ／２８４Ａ、９Ｈ／２０Ｔ／２３Ｑ／８９Ｑ／１３４Ｓ／１５５Ｗ／１６０Ｙ／２４４Ｇ／２８４Ａ、２０Ｔ／２３Ｑ／１３４Ｓ／１５５Ｗ／２４４Ｇ／２８４Ａ、および１５５Ｗ／２８４Ａから選択される前記ポリペプチド配列中の１つまたはそれを超える位置において少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２を基準にしてナンバリングされる。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドのポリペプチド配列は、配列番号２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有し、操作されたポリペプチドのポリペプチド配列は、Ｅ９Ｈ／Ｙ２０Ｔ／Ｙ２３Ｑ／Ａ３９Ｇ／Ｉ５５Ｖ／Ｓ８９Ｑ／Ｔ１３４Ｓ／Ｆ１５０Ｗ／Ｌ１５５Ｗ／Ｆ１６０Ｙ／Ｔ１７８Ｓ／Ｉ１９９Ｌ／Ｐ２４４Ｇ／Ｙ２７３Ｌ／Ｇ２８４Ａ、Ｅ９Ｈ／Ｙ２０Ｔ／Ｙ２３Ｑ／Ｓ８９Ｑ／Ｔ１３４Ｓ／Ｌ１５５Ｗ／Ｆ１６０Ｙ／Ｉ１９９Ｌ／Ｐ２４４Ｇ／Ｇ２８４Ａ、Ｅ９Ｈ／Ｙ２０Ｔ／Ｙ２３Ｑ／Ｓ８９Ｑ／Ｔ１３４Ｓ／Ｌ１５５Ｗ／Ｆ１６０Ｙ／Ｐ２４４Ｇ／Ｇ２８４Ａ、Ｙ２０Ｔ／Ｙ２３Ｑ／Ｔ１３４Ｓ／Ｌ１５５Ｗ／Ｐ２４４Ｇ／Ｇ２８４Ａ、およびＬ１５５Ｗ／Ｇ２８４Ａから選択される前記ポリペプチド配列中の１つまたはそれを超える位置において少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２を基準にしてナンバリングされる。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号２と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。
本開示のトランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドのいくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドは、適切な反応条件下で、化合物（２）の基質を化合物（１）の生成物に変換することができる。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドは、適切な反応条件下で、配列番号２の活性の少なくとも１倍、２倍、３倍、５倍、７倍、１０倍、１２倍、１５倍、２０倍またはそれを超える活性で、化合物（２）を化合物（１）に変換することができる。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドは、適切な反応条件下で、配列番号２と比べて増加した活性で、化合物（２）を化合物（１）に変換することができ、適切な反応条件は、少なくとも２０ｇ／Ｌの負荷での化合物（１）、湿潤酢酸イソプロピル（ＩＰＡｃ）、０．５５Ｍイソプロピルアミン（ＩＰＭ）および５０℃を含む。
本開示のいくつかの実施形態では、トランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは固体支持体に固定され、必要に応じて、固体支持体は、エポキシド官能基を有するポリメタクリレート、アミノエポキシド官能基を有するポリメタクリレート、オクタデシル官能基を有するスチレン／ＤＶＢコポリマーまたはポリメタクリレートを含むビーズまたは樹脂から選択される。
本発明はまた、少なくとも１つの本明細書で提供される操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を提供する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１、５、３３１、５１７および／または６５５と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１、５、３３１、５１７および／または６５５と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含み、前記操作されたポリペプチドのポリヌクレオチド配列は、１つまたはそれを超える位置において少なくとも１つの置換を含む。いくつかのさらなる実施形態では、少なくとも１つの操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１、５、３３１、５１７および／または６５５ならびに／またはそれらの機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を含む。いくつかのさらなる実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号３～８４５の奇数番号配列に記載されているポリヌクレオチド配列を含む。
いくつかのさらなる実施形態では、操作されたポリヌクレオチド配列は、制御配列に作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、制御配列はプロモーターを含む。いくつかのさらなる実施形態では、プロモーターは異種プロモーターである。いくつかのさらなる実施形態では、制御配列は、１つを超える制御配列を含む。いくつかの実施形態では、制御配列の１つはプロモーターを含み、他の制御配列は異なる制御配列を含む。いくつかの実施形態では、操作されたポリヌクレオチド配列はコドン最適化される。本発明はまた、少なくとも１つの本明細書で提供されるポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを提供する。本発明はまた、少なくとも１つの本明細書で提供される発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、少なくとも１つの本明細書で提供されるポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は原核細胞であり、他のいくつかの実施形態では、宿主細胞は真核細胞である。いくつかのさらなる実施形態では、宿主細胞は大腸菌である。
本発明はまた、宿主細胞において操作されたトランスアミナーゼを産生する方法であって、少なくとも１つの本明細書で提供される操作されたトランスアミナーゼが産生されるように、適切な条件下の培養培地中で、本明細書で提供される宿主細胞を培養することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、前記方法は、培養培地および／または宿主細胞から少なくとも１つの操作されたトランスアミナーゼを回収する工程をさらに含む。いくつかのさらなる実施形態では、前記方法は、本発明の方法を使用して得られた少なくとも１つのトランスアミナーゼを精製する工程をさらに含む。
本開示はまた、広範囲のキラルアミン化合物の調製のために本明細書に開示される操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを使用するためのプロセスを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、反対のエナンチオマーに対して少なくとも７０％のエナンチオマー過剰率で、＊でマークされているステレオジェン中心において示されている立体化学的配置を有する構造式（Ｉ）の化合物：
Figure 2022518212000004
 （式中、
Ｚは、１つまたはそれを超えるヒドロキシ、シアノまたはニトロ基で必要に応じて置換された直鎖Ｃ１－６アルキルまたは分枝鎖Ｃ１－６アルキルであり；ならびに
Ｒ１は、Ｃ１－６アルキル、アリール－Ｃ１－２アルキル、ヘテロアリール－Ｃ１－２アルキル、またはＯ、Ｓ、およびＮから選択されるさらなるヘテロ原子を必要に応じて含有する５～６員複素環式環系であり、前記複素環式環は置換されていないか、またはオキソ、ヒドロキシ、ハロゲン、Ｃ１－４アルコキシおよびＣ１－４アルキルから独立して選択される１～３個の置換基で置換されている）
を調製するためのプロセスであって、適切な反応条件下、アミノ基供与体の存在下で、構造式（ＩＩ）のプロキラルケトエステル：
Figure 2022518212000005
 を本明細書に開示される操作されたポリペプチドと接触させる工程を含むプロセスを提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、化合物（１）：
Figure 2022518212000006
 を調製するプロセスであって、適切な反応条件下、アミノ基供与体の存在下で、化合物（２）の基質：
Figure 2022518212000007
 を本明細書に開示される操作されたポリペプチドと接触させる工程を含むプロセスを提供する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される操作されたポリペプチドを使用するプロセスであって、式（Ｉ）のキラルアミン化合物または化合物（１）が、少なくとも７０％、８０％、９０％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えるエナンチオマー過剰率で生成されるプロセスが行われ得る。
式（Ｉ）の化合物または化合物（１）の調製のために操作されたポリペプチドを使用する本明細書に開示されるプロセスはいずれも、限定されないが、ある範囲のアミノ基供与体、温度、湿潤有機溶媒系、基質負荷、ポリペプチド負荷、補因子負荷および反応時間を含む一連の適切な反応条件下で行われ得る。一例において、いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物または化合物（１）の調製であって、適切な反応条件が、（ａ）約１０～２２０ｇ／Ｌの基質化合物（例えば、化合物（２））の基質負荷；（ｂ）約０．５ｇ／Ｌ～２５ｇ／Ｌの操作されたポリペプチド；（ｃ）約０．１～３ＭのＩＰＭ濃度；（ｄ）湿潤有機溶媒；および（ｅ）約３０℃～６０℃の温度を含む調製が行われ得る。いくつかの実施形態では、適切な反応条件は、（ａ）約２０ｇ／Ｌの基質化合物（例えば、化合物（２））；（ｂ）約２０ｇ／Ｌの操作されたポリペプチド；（ｃ）湿潤ＩＰＡｃ；（ｄ）約０．５５Ｍ ＩＰＭ；および（ｅ）約５０℃を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される操作されたポリペプチドを使用するプロセスであって、アミノ基供与体が、ＩＰＭ、アラニン、３－アミノ酪酸またはメチルベンジルアミンから選択されるプロセスが行われ得る。いくつかの実施形態では、アミノ基供与体はＩＰＭである。
いくつかの実施形態では、湿潤有機溶媒は、湿潤ＩＰＡｃ、湿潤トルエン、湿潤メチル第３ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、湿潤アセトニトリル（ＭｅＣＮ）または湿潤イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）から選択される。いくつかの実施形態では、湿潤有機溶媒は湿潤ＩＰＡｃである。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される操作されたポリペプチドを使用するプロセスであって、反応から式（Ｉ）の生成物化合物または化合物（１）を単離するさらなる工程を含むプロセスが行われ得る。
操作されたポリペプチドの選択、それらの調製、基質の選択および前記方法行うためのパラメータに関するさらなる指針は、以下のより詳細な説明および実施例にさらに記載されている。
発明の説明
本発明は、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドおよびその組成物、ならびに操作されたトランスアミナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。トランスアミナーゼ酵素を生成するための方法も提供される。いくつかの実施形態では、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、湿潤有機溶媒中の最小水性条件下で、改善された酵素特性を提供するように最適化される。
特に定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、一般に、本発明が関係する当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書で使用される命名法、ならびに以下に記載される細胞培養、分子遺伝学、微生物学、有機化学、分析化学および核酸化学の実験手順は当技術分野で周知であり、一般的に用いられているものである。このような技術は周知であり、当業者に周知の多数のテキストおよび参考文献に記載されている。標準的な技術またはその改変は、化学合成および化学分析に使用される。したがって、以下の用語は、本明細書で提供される意味を有することを意図する。
本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の適切な方法および材料が本発明の実施において使用されるが、いくつかの方法および材料が本明細書に記載される。記載されている特定の方法論、プロトコールおよび試薬は、それらが当業者により使用される状況に応じて変動し得るので、本発明はこれらに限定されないことを理解すべきである。したがって、直後で定義される用語は、全体として本発明を参照することによってより十分に記載される。
前述の一般的な説明および以下の詳細な説明は両方とも例示的かつ説明的なものにすぎず、本発明を限定するものではないことを理解すべきである。本書で使用されているセクションの見出しは構成目的にすぎず、記載されている主題を制限すると解釈されるべきではない。数値範囲は、範囲を規定する数字を含む。したがって、本明細書に開示されるあらゆる数値範囲は、このようなより狭い数値範囲がすべて本明細書に明記されているかのように、このようなより広い数値範囲内のあらゆるより狭い数値範囲を包含することを意図する。本明細書に開示されるあらゆる最大（または最小）数値限定は、このようなより低い（またはより高い）数値限定が本明細書に明記されているかのように、あらゆるより低い（またはより高い）数値限定を含むことも意図する。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」という単数形は、文脈上特に明確な指示がない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「ポリペプチド」への言及は、１つを超えるポリペプチドを含む。
同様に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｅ）」および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」は互換的であり、限定的であることを意図しない。したがって、本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語およびその同族語は、それらの包括的意味で使用される（すなわち、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語およびその対応する同族語と同等である）。
様々な実施形態の説明が「含む」という用語を使用する場合、当業者は、いくつかの特定の場合では、「から本質的になる」または「からなる」という文言を使用して実施形態を代替的に記載し得ることを理解することをさらに理解すべきである。
上記および下記の両方で本明細書で言及される特許、特許出願、記事および刊行物はすべて、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
定義および略語
遺伝子にコードされたアミノ酸に使用される略語は従来のものであり、以下のとおりである：アラニン（ＡｌａまたはＡ）、アルギニン（ＡｒｅまたはＲ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、リジン（ＬｙｓまたはＫ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）およびバリン（ＶａｌまたはＶ）。
３文字略語が使用される場合、具体的に「Ｌ」もしくは「Ｄ」が先行しないかまたはその略語が使用される文脈から明確ではない限り、アミノ酸は、α－炭素（Ｃα）に関してＬ－またはＤ－配置であり得る。例えば、「Ａｌａ」は、α－炭素に関する配置を明記せずにアラニンを示すのに対して、「Ｄ－Ａｌａ」および「Ｌ－Ａｌａ」は、それぞれＤ－アラニンおよびＬ－アラニンを示す。１文字略語が使用される場合、大文字は、α－炭素に関してＬ－配置のアミノ酸を示し、小文字は、α－炭素に関してＤ－配置のアミノ酸を示す。例えば、「Ａ」はＬ－アラニンを示し、「ａ」はＤ－アラニンを示す。ポリペプチド配列が一連の１文字略語または３文字略語（またはそれらの混合）として示される場合、配列は、一般的な慣行にしたがってアミノ（Ｎ）からカルボキシ（Ｃ）方向で示される。
遺伝子コードヌクレオシドに使用される略語は従来のものであり、以下のとおりである：アデノシン（Ａ）；グアノシン（Ｇ）；シチジン（Ｃ）；チミジン（Ｔ）；およびウリジン（Ｕ）。特に明確な描写がない限り、省略されたヌクレオチドは、リボヌクレオシドまたは２’－デオキシリボヌクレオシドであり得る。ヌクレオシドは、個々にまたは一括でリボヌクレオシドまたは２’－デオキシリボヌクレオシドであると明記され得る。核酸配列が一連の１文字略語として示される場合、配列は、一般的な慣行にしたがって５’から３’方向で示され、リン酸は示されない。
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、特定の値の許容され得る誤差を意味する。いくつかの場合では、「約」は、所定の値の範囲の０．０５％、０．５％、１．０％または２．０％以内を意味する。いくつかの場合では、「約」は、所定の値の１、２、３または４標準偏差以内を意味する。
本明細書で使用される場合、「ＥＣ」番号は、Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＮＣ－ＩＵＢＭＢ）の酵素命名法を指す。ＩＵＢＭＢ生化学分類は、酵素が触媒する化学反応に基づく酵素の数値分類体系である。
本明細書で使用される場合、「ＡＴＣＣ」は、そのバイオリポジトリーコレクションが遺伝子および株を含むＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎを指す。
本明細書で使用される場合、「ＮＣＢＩ」は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎおよびそこで提供される配列データベースを指す。
「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化、脂質化、ミリストイル化、ユビキチン化など）にかかわらず、アミド結合により共有結合的に連結された少なくとも２つのアミノ酸のポリマーを表すために本明細書で互換的に使用される。Ｄ－およびＬ－アミノ酸ならびにＤ－およびＬ－アミノ酸の混合物、ならびにＤ－およびＬ－アミノ酸ならびにＤ－およびＬ－アミノ酸の混合物を含むポリマーがこの定義に含まれる。
「トランスアミナーゼ」または「アミノトランスフェラーゼ」は、アミノ基（－ＮＨ２）、電子対およびプロトンをアミノ基供与体化合物の第１級アミンからアミン受容体化合物のカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）に転移させ、それにより、アミノ基供与体化合物をその対応するカルボニル化合物に変換し、カルボニル受容体化合物をその対応する第１級アミン化合物に変換する（例えば、スキーム１を参照のこと）酵素能力を有するポリペプチドを指すために本明細書で互換的に使用される。本明細書で使用される場合、トランスアミナーゼは、天然に存在する（野生型）トランスアミナーゼ、および人為操作により生成された天然に存在しない操作されたポリペプチドを含む。
「アミノ基供与体」または「アミノ供与体」は、アミノ基を受容体カルボニル化合物（すなわち、アミノ基受容体）に供与することができ、それによりカルボニル副生成物となるアミノ基含有化合物を指すために本明細書で互換的に使用される。アミノ基供与体は、一般構造式
Figure 2022518212000008
 （式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ、独立して採用される場合、非置換であるかまたは１つもしくはそれを超える酵素的に非阻害性の基で置換されたアルキル、アルキルアリール基またはアリール基である）を有する。Ｒ１は、構造またはキラリティの点でＲ２と同じものまたは異なるものであり得る。基Ｒ１およびＲ２は一緒になって、非置換であるか、置換されたかまたは他の環と縮合された環を形成し得る。典型的なアミノ基供与体としては、キラルおよびアキラルアミノ酸、ならびにキラルおよびアキラルアミンが挙げられる。
「キラルアミン」は、一般式Ｒ１－ＣＨ（ＮＨ２）－Ｒ２のアミンを指し、本明細書ではその最も広い意味で使用され、水素原子に加えて、（ｉ）キラル環構造を形成する二価基または（ｉｉ）構造もしくはキラリティの点で互いに異なる２つの置換基（水素以外）を有する第２級炭素原子に結合した第１級アミノ基の存在を特徴とする異なるおよび混合の官能基タイプの多種多様な脂肪族化合物および脂環式化合物を含む。キラル環構造を形成する二価基としては、例えば、２－メチルブタン－１，４－ジイル、ペンタン－１，４－ジイル、ヘキサン－１，４－ジイル、ヘキサン－１，５－ジイル、２－メチルペンタン－１，５－ジイルが挙げられる。第２級炭素原子上の２つの異なる置換基（上記Ｒ１およびＲ２）もまた多種多様であり得、アルキル、アリールアルキル、アリール、ハロ、ヒドロキシ、低級アルキル、低級アルキルオキシ、低級アルキルチオ、シクロアルキル、カルボキシ、カルバルキルオキシ、カルバモイル、モノ－およびジ－（低級アルキル）置換カルバモイル、トリフルオロメチル、フェニル、ニトロ、アミノ、モノ－およびジ－（低級アルキル）置換アミノ、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アルキルカルボキサミド、アリールカルボキサミドなど、ならびに前述のものにより置換されたアルキル、アリールアルキルまたはアリールが挙げられる。
「カルボニル副生成物」は、アミノ基供与体上のアミノ基がアミノ基転移反応でアミノ基受容体に転移されるとアミノ基供与体から形成されるカルボニル化合物を指す。カルボニル副生成物は、一般構造式
Figure 2022518212000009
 （式中、Ｒ１およびＲ２は、アミノ基供与体について上記で定義されるとおりである）を有する。
「アミノ受容体」および「アミン受容体」、「ケト基質」、「ケトエステル基質」は、トランスアミナーゼにより媒介される反応（例えば、スキーム１を参照のこと）でアミノ基供与体からアミノ基を受容するカルボニル基含有化合物を指すために本明細書で互換的に使用される。本開示の文脈では、トランスアミナーゼのためのアミノ受容体化合物としては、とりわけ、本明細書にさらに記載されているように、式（ＩＩ）の化合物および化合物（２）が挙げられ得る。
本明細書で使用される場合、「補因子」は、反応の触媒において酵素と一緒に作用する非タンパク質化合物を指す。本明細書で使用される場合、「補因子」は、補酵素とも称されることがあるビタミンＢ６ファミリー化合物ＰＬＰ、ＰＮ、ＰＬ、ＰＭ、ＰＮＰおよびＰＭＰを包含することを意図する。
「ピリドキサール－リン酸」、「ＰＬＰ」、「ピリドキサール－５’－リン酸」、「ＰＹＰ」および「Ｐ５Ｐ」は、トランスアミナーゼ反応において補因子として作用する化合物を指すために本明細書で互換的に使用される。いくつかの実施形態では、ピリドキサールリン酸は、構造１－（４’－ホルミル－３’－ヒドロキシ－２’－メチル－５’－ピリジル）メトキシホスホン酸、ＣＡＳ番号［５４－４７－７］により定義される。ピリドキサール－５’－リン酸は、ピリドキソール（ビタミンＢ６としても公知）のリン酸化および酸化によりインビボで産生され得る。トランスアミナーゼ酵素を使用するアミノ基転移反応では、アミノ供与体のアミン基は補因子に転移されてケト副生成物を産生し、ピリドキサール－５’－リン酸はピリドキサミンリン酸に変換される。ピリドキサール－５’－リン酸は、異なるケト化合物（アミノ受容体）との反応により再生される。ピリドキサミンリン酸からアミノ受容体へのアミン基の転移はアミンを生じさせ、補因子を再生する。いくつかの実施形態では、ピリドキサール－５’－リン酸は、ピリドキシン（ＰＮ）、ピリドキサール（ＰＬ）、ピリドキサミン（ＰＭ）およびそれらのリン酸化されたカウンターパート；ピリドキシンリン酸（ＰＮＰ）およびピリドキサミンリン酸（ＰＭＰ）を含むビタミンＢ６ファミリーの他のメンバーにより置き換えられ得る。
「アミノ酸」は、本明細書では、それらの一般的に公知の３文字記号により、またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号により言及される。同様に、ヌクレオチドは、一般的に認められている１文字コードにより言及され得る。
本明細書で使用される場合、「親水性アミノ酸または残基」は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら、Ｉ．，１７９：１２５－１４２［１９８４］）の正規化コンセンサス疎水性スケールにしたがって、ゼロ未満の疎水性を示す側鎖を有するアミノ酸または残基を指す。遺伝子にコードされた親水性アミノ酸としては、Ｌ－Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｌ－Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｌ－Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｌ－Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｌ－Ａｓｎ（Ｎ）、Ｌ－Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｌ－Ａｓｐ（Ｄ）、Ｌ－Ｌｙｓ（Ｋ）およびＬ－Ａｒｇ（Ｒ）が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「酸性アミノ酸または残基」は、このアミノ酸がペプチドまたはポリペプチドに含まれる場合に約６未満のｐＫ値を示す側鎖を有する親水性アミノ酸または残基を指す。酸性アミノ酸は、典型的には、水素イオンの喪失により、生理学的ｐＨで負荷電側鎖を有する。遺伝しにコードされた酸性アミノ酸としては、Ｌ－Ｇｌｕ（Ｅ）およびＬ－Ａｓｐ（Ｄ）が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「塩基性アミノ酸または残基」は、このアミノ酸がペプチドまたはポリペプチドに含まれる場合に約６を超えるｐＫ値を示す側鎖を有する親水性アミノ酸または残基を指す。塩基性アミノ酸は、典型的には、ヒドロニウムイオンとの会合により、生理学的ｐＨで正荷電側鎖を有する。遺伝子にコードされた塩基性アミノ酸としては、Ｌ－Ａｒｇ（Ｒ）およびＬ－Ｌｙｓ（Ｋ）が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「極性アミノ酸または残基」は、生理学的ｐＨでは帯電していないが、２つの原子が共通して共有する電子対が、原子の一方によってより密接に保持される少なくとも１つの結合を有する側鎖を有する親水性アミノ酸または残基を指す。遺伝子にコードされた極性アミノ酸としては、Ｌ－Ａｓｎ（Ｎ）、Ｌ－Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｌ－Ｓｅｒ（Ｓ）およびＬ－Ｔｈｒ（Ｔ）が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「疎水性アミノ酸または残基」は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１７９：１２５－１４２［１９８４］）の正規化コンセンサス疎水性スケールにしたがって、ゼロを超える疎水性を示す側鎖を有するアミノ酸または残基を指す。遺伝的子コードされた疎水性アミノ酸としては、Ｌ－Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｌ－Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌ－Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｌ－Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ－Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｌ－Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｌ－Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｌ－Ａｌａ（Ａ）およびＬ－Ｔｙｒ（Ｙ）が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「芳香族アミノ酸または残基」は、少なくとも１つの芳香族環またはヘテロ芳香族環を含む側鎖を有する親水性または疎水性アミノ酸または残基を指す。遺伝子にコードされた芳香族アミノ酸としては、Ｌ－Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｌ－Ｔｙｒ（Ｙ）およびＬ－Ｔｒｐ（Ｗ）が挙げられる。その側鎖はヘテロ芳香族環を含むので、そのヘテロ芳香族窒素原子Ｌ－Ｈｉｓ（Ｈ）のｐＫａにより、それは塩基性残基としてまたは芳香族残基として分類されることもあるが、本明細書では、ヒスチジンは、親水性残基としてまたは「拘束残基」（以下を参照のこと）として分類される。
本明細書で使用される場合、「拘束アミノ酸または残基」は、拘束幾何学形状を有するアミノ酸または残基を指す。本明細書では、拘束残基としては、Ｌ－Ｐｒｏ（Ｐ）およびＬ－Ｈｉｓ（Ｈ）が挙げられる。ヒスチジンは、比較的小さなイミダゾール環を有するので、それは、拘束幾何学形状を有する。プロリンもまた５員環を有するので、それは、拘束幾何学形状を有する。
本明細書で使用される場合、「非極性アミノ酸または残基」は、生理学的ｐＨでは帯電していないが、２つの原子が共通して共有する電子対が、一般に、２つの各原子により均等に保持される結合を有する側鎖（すなわち、側鎖は極性ではない）を有する疎水性アミノ酸または残基を指す。遺伝子にコードされた非極性アミノ酸としては、Ｌ－Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｌ－Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｌ－Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ－Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌ－Ｍｅｔ（Ｍ）およびＬ－Ａｌａ（Ａ）が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「脂肪族アミノ酸または残基」は、脂肪族炭化水素側鎖を有する疎水性アミノ酸または残基を指す。遺伝子にコードされた脂肪族アミノ酸としては、Ｌ－Ａｌａ（Ａ）、Ｌ－Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ－Ｌｅｕ（Ｌ）およびＬ－Ｉｌｅ（Ｉ）が挙げられる。システイン（または「Ｌ－Ｃｙｓ」または「［Ｃ］」）は、それが他のＬ－Ｃｙｓ（Ｃ）アミノ酸または他のスルファニルもしくはスルフヒドリル含有アミノ酸とジスルフィド架橋を形成し得るという点で独特であることに留意する。「システイン様残基」は、システインと、ジスルフィド架橋の形成のために利用可能なスルフヒドリル部分を含有する他のアミノ酸とを含む。還元遊離－ＳＨまたは酸化ジスルフィド架橋形態のいずれかのペプチドに存在するＬ－Ｃｙｓ（Ｃ）（および－ＳＨ含有側鎖を有する他のアミノ酸）の能力は、Ｌ－Ｃｙｓ（Ｃ）がペプチドに対して正味の疎水性または親水性特徴をに与えるかどうかに影響を与える。Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら、１９８４、前掲）の正規化コンセンサススケールにしたがって、Ｌ－Ｃｙｓ（Ｃ）は０．２９の疎水性を示すが、本発明の目的のために、Ｌ－Ｃｙｓ（Ｃ）は、それ自体のユニークなグループに分類されることを理解すべきである。
本明細書で使用される場合、「小さなアミノ酸または残基」は、合計３個またはそれ未満の炭素および／またはヘテロ原子（α炭素および水素を除く）から構成される側鎖を有するアミノ酸または残基を指す。小さなアミノ酸または残基は、上記定義にしたがって、脂肪族、非極性、極性または酸性の小さなアミノ酸または残基としてさらに分類され得る。遺伝子にコードされた小さなアミノ酸としては、Ｌ－Ａｌａ（Ａ）、Ｌ－Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ－Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｌ－Ａｓｎ（Ｎ）、Ｌ－Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｌ－Ｔｈｒ（Ｔ）およびＬ－Ａｓｐ（Ｄ）が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「ヒドロキシル含有アミノ酸または残基」は、ヒドロキシル（－ＯＨ）部分を含有するアミノ酸を指す。遺伝子にコードされたヒドロキシル含有アミノ酸としては、Ｌ－Ｓｅｒ（Ｓ）Ｌ－Ｔｈｒ（Ｔ）およびＬ－Ｔｙｒ（Ｙ）が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、互いに共有結合的に連結された２つまたはそれを超えるヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドは、リボヌクレオチド（すなわち、ＲＮＡ）から全体的に構成され得るか、または２’－デオキシリボヌクレオチド（すなわち、ＤＮＡ）から全体的に構成され得るか、またはリボ－および２’－デオキシリボヌクレオチドの混合物から構成され得る。ヌクレオシドは、典型的には、標準的なホスホジエステル結合を介して互いに連結されるが、ポリヌクレオチドは、１つまたはそれを超える非標準的な結合を含み得る。ポリヌクレオチドは一本鎖もしくは二本鎖であり得るか、または一本鎖領域および二本鎖領域の両方を含み得る。また、ポリヌクレオチドは、典型的には、天然に存在するコード核酸塩基（すなわち、アデニン、グアニン、ウラシル、チミンおよびシトシン）から構成されるが、それは、例えば、１つまたはそれを超える改変および／または合成核酸塩基、例えばイノシン、キサンチン、ヒポキサンチンなどを含み得る。いくつかの実施形態では、このような改変または合成核酸塩基は、アミノ酸配列をコードする核酸塩基である。
本明細書で使用される場合、「ヌクレオシド」は、核酸塩基（すなわち、窒素塩基）および５－炭素糖（例えば、リボースまたはデオキシリボース）を含むグリコシルアミンを指す。ヌクレオシドの非限定的な例としては、シチジン、ウリジン、アデノシン、グアノシン、チミジンおよびイノシンが挙げられる。対照的に、「ヌクレオチド」という用語は、核酸塩基、５－炭素糖および１つまたはそれを超えるリン酸基を含むグリコシルアミンを指す。いくつかの実施形態では、ヌクレオシドは、キナーゼによりリン酸化されてヌクレオチドを産生し得る。
本明細書で使用される場合、「ヌクレオシド二リン酸」は、核酸塩基（すなわち、窒素塩基）、５－炭素糖（例えば、リボースまたはデオキシリボース）および二リン酸（すなわち、ピロリン酸）部分を含むグリコシルアミンを指す。本明細書のいくつかの実施形態では、「ヌクレオシド二リン酸」は「ＮＤＰ」と略される。ヌクレオシド二リン酸の非限定的な例としては、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）およびイノシン二リン酸が挙げられる。「ヌクレオシド」および「ヌクレオチド」という用語は、いくつかの文脈では互換的に使用され得る。
「コード配列」は、タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸（例えば、遺伝子）の一部を指す。
本明細書で使用される場合、「生体触媒作用」、「生体触媒作用の」、「生体内変化」および「生合成」という用語は、有機化合物に対して化学反応を実施するための酵素の使用を指す。
「天然に存在する」または「野生型」は、天然に見られる形態を指す。例えば、天然に存在するまたは野生型ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列は、生物中に存在する配列であって、天然の供給源から単離され得、人為操作により意図的に改変されていない配列である。
本明細書で使用される場合、「組換え」、「操作された」、「天然に存在しない」または「バリアント」は、例えば、細胞、核酸またはポリペプチドに関して使用される場合、他の方法では天然に存在しない方法で改変された材料または天然もしくはネイティブ形態の前記材料に対応する材料を指す。いくつかの実施形態では、細胞、核酸またはポリペプチドは、天然に存在する細胞、核酸またはポリペプチドと同一であるが、合成材料から、および／または組換え技術を使用する操作により産生または誘導される。非限定的な例としては、とりわけ、ネイティブ（非組換え）形態の細胞内に見られないか、または異なるレベルで別様に発現されるネイティブ遺伝子を発現する組換え細胞が挙げられる。
「配列同一性率（％）」という用語は、ポリヌクレオチド間またはポリペプチド間の比較を指すために本明細書で互換的に使用され、最適にアラインメントされた２つの配列を比較領域にわたって比較することにより決定され、比較領域におけるポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の一部は、２つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両配列に存在する位置の数を決定して、マッチした位置の数を求め、マッチした位置の数を比較領域中の位置の総数で割り、その結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを求めることにより計算され得る。あるいは、パーセンテージは、同一の核酸塩基もしくはアミノ酸残基が両配列に存在する位置の数、または核酸塩基もしくはアミノ酸残基がギャップとアラインメントした位置の数を決定して、マッチした位置の数を求め、マッチした位置の数を比較領域中の位置の総数で割り、その結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを求めることにより計算され得る。当業者は、２つの配列をアラインメントするために利用可能な確立された多くのアルゴリズムがあることを認識する。比較のための最適な配列のアラインメントは、限定されないが、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２：４８２［１９８１］）のローカルホモロジーアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３［１９７０］）のホモロジーアラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４［１９８８］）の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実行（例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＰａｃｋａｇｅにおけるＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）または当技術分野で公知のように目視検査を含む任意の適切な方法により実施され得る。配列同一性率および配列類似性率を決定するために適切なアルゴリズムの例としては、限定されないが、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（それぞれＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３－４１０［１９９０］；およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３３８９－３４０２［１９７７］を参照のこと）により記載されている、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムが挙げられる。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトを通じて公的に利用可能である。このアルゴリズムは、最初に、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインメントされた場合にマッチするか、またはいくつかの正値の閾値スコアＴを満たすクエリー配列中の長さＷのショートワードを特定することにより、ハイスコア配列ペア（ＨＳＰ）を特定することを伴う。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前掲を参照のこと）。これらの初期隣接ワードヒットは、それらを含有するより長いＨＳＰを見出すための検索を開始するためのシードとして作用する。次いで、累積アラインメントスコアを増加させ得る限り、ワードヒットを各配列に沿って両方向に伸長する。累積スコアは、ヌクレオチド配列の場合、パラメータＭ（マッチする残基対に対する報酬スコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基に対するペナルティスコア；常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列の場合、スコアリングマトリックスを使用して、累積スコアを計算する。累積アラインメントスコアがその最大達成値から数量Ｘだけ低下した場合；１つもしくはそれを超える負のスコアの残基アラインメントの累積により、累積スコアが０もしくはそれ未満になる場合；またはいずれかの配列の末端に到達した場合、各方向におけるワードヒットの伸長を停止させる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列の場合）は、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝－４および両鎖の比較をデフォルトとして使用する。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスをデフォルトとして使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５［１９８９］を参照のこと）。配列アラインメントおよび配列同一性％の例示的な決定は、提供されるデフォルトのパラメータを使用して、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅパッケージ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）中のＢＥＳＴＦＩＴまたはＧＡＰプログラムを用い得る。
「参照配列」は、配列比較のための基準として使用される規定の配列を指す。参照配列は、より大きな配列のサブセット、例えば、全長遺伝子またはポリペプチド配列のセグメントであり得る。一般に、参照配列は、少なくとも２０ヌクレオチド長またはアミノ酸残基長、少なくとも２５残基長、少なくとも５０残基長、またはその核酸もしくはポリペプチドの全長である。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドはそれぞれ、（１）２つの配列間で類似する配列（すなわち、完全な配列の一部）を含み得、（２）２つの配列間で相違する配列をさらに含み得るので、２つの（またはそれを超える）ポリヌクレオチド間またはポリペプチド間の配列比較は、典型的には、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列を「比較領域」にわたって比較して、配列類似性の局所領域を特定および比較することにより実施される。いくつかの実施形態では、「参照配列」は、参照配列が、一次配列中に１つまたはそれを超える変化を有し得る配列である一次アミノ酸配列に基づき得る。例えば、「Ｘ９に対応する残基においてヒスチジンを有する配列番号２に基づく参照配列」は、配列番号２のＸ９における対応する残基（これはチロシンである）がヒスチジンに変化した参照配列を指す。
「比較領域」は、少なくとも約２０個の連続ヌクレオチド位置またはアミノ酸残基の概念的なセグメントを指し、配列は、少なくとも２０個の連続ヌクレオチドまたはアミノ酸の参照配列と比較され得、比較領域中の配列の一部は、２つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列（これは付加も欠失も含まない）と比較して２０パーセントまたはそれ未満の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。比較領域は、２０個の連続残基よりも長いものであり得、必要に応じて３０、４０、５０、１００またはそれよりも長い領域を含む。
所定のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列のナンバリングの文脈で使用される場合の「に対応する」、「に関して」または「と比べて」は、所定のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列が参照配列と比較される場合の指定の参照配列の残基のナンバリングを指す。換言すれば、所定のポリマーの残基番号または残基位置は、所定のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列内の残基の実際の位置番号ではなく参照配列に関して示される。例えば、操作されたトランスアミナーゼのものなどの所定のアミノ酸配列は、ギャップを導入して２つの配列間の残基マッチを最適化することにより、参照配列とアラインメントされ得る。これらの場合では、ギャップが存在するが、所定のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列中の残基のナンバリングは、それとアラインメントされた参照配列に関して行われる。
本明細書で使用される場合、「アミノ酸差異」および「残基差異」は、参照配列中の対応する位置におけるアミノ酸残基と比べた、ポリペプチド配列の位置におけるアミノ酸残基の差異を指す。いくつかの場合では、参照配列はヒスチジンタグを有するが、ナンバリングは、ヒスチジンタグを有しない同等の参照配列と比べて維持される。アミノ酸差異の位置は、一般に、本明細書では「Ｘｎ」（ｎは、残基差異が基準とする参照配列中の対応する位置を指す）と称される。例えば、「配列番号４と比較した位置Ｘ９３における残基差異」は、配列番号４の位置９３に対応するポリペプチド位置におけるアミノ酸残基の差異を指す。したがって、配列番号４の参照ポリペプチドが位置９３においてセリンを有する場合、「配列番号４と比較した位置Ｘ９３における残基差異」は、配列番号４の位置９３に対応するポリペプチドの位置におけるセリン以外の任意の残基のアミノ酸置換を指す。本明細書におけるほとんどの場合では、ある位置における特定のアミノ酸残基差異は「ＸｎＹ」（「Ｘｎ」は、上記のように対応する位置を指定し、「Ｙ」は、操作されたポリペプチドに見出されるアミノ酸（すなわち、参照ポリペプチドと異なる残基）の１文字識別子である）として示される。いくつかの場合では（例えば、実施例に示されている表では）、本発明はまた、従来の表記「ＡｎＢ」（Ａは、参照配列中の残基の１文字識別子であり、「ｎ」は、参照配列中の残基位置の番号であり、Ｂは、操作されたポリペプチドの配列中の残基置換の１文字識別子である）により表される特定のアミノ酸差異を提供する。いくつかの場合では、本発明のポリペプチドは、参照配列と比べて１つまたはそれを超えるアミノ酸残基差異を含み得、参照配列と比べて残基差異が存在する指定された位置のリストにより示される。いくつかの実施形態では、１つを超えるアミノ酸がポリペプチドの特定の残基位置で使用され得る場合、使用され得る様々なアミノ酸残基は「／」により分けられる（例えば、Ｘ３０７Ｈ／Ｘ３０７ＰまたはＸ３０７Ｈ／Ｐ）。スラッシュはまた、所定のバリアント内の複数の置換を示すために使用され得る（すなわち、所定の配列、例えばコンビナトリアルバリアント中に１個を超える置換がある）。いくつかの実施形態では、本発明は、保存的または非保存的アミノ酸置換を含む１つまたはそれを超えるアミノ酸差異を含む操作されたポリペプチド配列を含む。いくつかのさらなる実施形態では、本発明は、保存的および非保存的アミノ酸置換の両方を含む操作されたポリペプチド配列を提供する。
本明細書で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」は、類似の側鎖を有する異なる残基による残基の置換を指し、したがって典型的には、同一または類似の規定のアミノ酸クラス内のアミノ酸によるポリペプチド中のアミノ酸の置換を伴う。例として、および限定されないが、いくつかの実施形態では、脂肪族側鎖を有するアミノ酸は、別の脂肪族アミノ酸（例えばアラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン）で置換され；ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸は、ヒドロキシル側鎖を有する別のアミノ酸（例えばセリンおよびトレオニン）で置換され；芳香族側鎖を有するアミノ酸は、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸（例えばフェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびヒスチジン）で置換され；塩基性側鎖を有するアミノ酸は、塩基性側鎖を有する別のアミノ酸（例えばリジンおよびアルギニン）で置換され；酸性側鎖を有するアミノ酸は、酸性側鎖を有する別のアミノ酸（例えばアスパラギン酸またはグルタミン酸）で置換され；ならびに／または疎水性アミノ酸または親水性アミノ酸は、それぞれ別の疎水性アミノ酸または親水性アミノ酸で置き換えられる。
「非保存的置換」は、有意に異なる側鎖特性を有するアミノ酸によるポリペプチド中のアミノ酸の置換を指す。非保存的置換は、規定のグループ内ではなく規定のグループ間のアミノ酸を使用し得、（ａ）置換の領域におけるペプチド骨格の構造（例えば、グリシンに代えてプロリン）、（ｂ）電荷もしくは疎水性または（ｃ）側鎖の嵩に影響を与える。例として、および限定されないが、例示的な非保存的置換は、塩基性アミノ酸または脂肪族アミノ酸で置換される酸性アミノ酸；小さなアミノ酸で置換される芳香族アミノ酸；および疎水性アミノ酸で置換される親水性アミノ酸であり得る。
「欠失」は、参照ポリペプチドからの１つまたはそれを超えるアミノ酸の除去によるそのポリペプチドに対する改変を指す。欠失は、操作されたトランスアミナーゼ酵素の酵素活性を保持しおよび／または改善された特性を保持しながら、１個もしくはそれを超えるアミノ酸、２個もしくはそれを超えるアミノ酸、５個もしくはそれを超えるアミノ酸、１０個もしくはそれを超えるアミノ酸、１５個もしくはそれを超えるアミノ酸または２０個もしくはそれを超えるアミノ酸、参照酵素を構成するアミノ酸の総数の最大１０％またはアミノ酸の総数の最大２０％の除去を含み得る。欠失は、ポリペプチドの内部部分および／または末端の部分に対するものであり得る。様々な実施形態では、欠失は連続セグメントを含み得るか、または不連続であり得る。欠失は、典型的には、アミノ酸配列中の「－」により示される。
「挿入」は、参照ポリペプチドからの１つまたはそれを超えるアミノ酸の付加によるポリペプチドに対する改変を指す。いくつかの実施形態では、改善された操作されたトランスアミナーゼ酵素は、天然に存在するトランスアミナーゼポリペプチドへの１つまたはそれを超えるアミノ酸の挿入、および他の改善されたトランスアミナーゼポリペプチドへの１つまたはそれを超えるアミノ酸の挿入を含む。挿入は、ポリペプチドの内部部分、またはカルボキシ末端もしくはアミノ末端におけるものであり得る。本明細書で使用される場合、挿入は、当技術分野で公知のように融合タンパク質を含む。挿入は、天然に存在するポリペプチドにおいて、アミノ酸の連続セグメントであり得るか、または１つもしくはそれを超えるアミノ酸により分離され得る。
「アミノ酸置換セット」または「置換セット」という用語は、参照配列と比較したポリペプチド配列中の一群のアミノ酸置換を指す。置換セットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個またはそれを超えるアミノ酸置換を有し得る。いくつかの実施形態では、置換セットは、実施例で提供されている表に掲載されているバリアントトランスアミナーゼのいずれかに存在するアミノ酸置換のセットを指す。
「機能的断片」および「生物学的に活性な断片」は、アミノ末端および／またはカルボキシ末端欠失（複数可）および／または内部欠失を有するポリペプチドであって、しかし、残りのアミノ酸配列が、それが比較されている配列（例えば、本発明の操作された全長トランスアミナーゼ）中の対応する位置と同一であり、全長ポリペプチドの活性の実質的にすべてを保持するポリペプチドを指すために本明細書で互換的に使用される。
「単離されたポリペプチド」は、それを天然に伴う他の夾雑物、例えばタンパク質、脂質およびポリヌクレオチドから実質的に分離されたポリペプチドを指す。前記用語は、それらの天然に存在する環境または発現系（例えば、宿主細胞またはインビトロ合成）から取り出されたかまたは精製されたポリペプチドを包含する。改善されたトランスアミナーゼ酵素は、細胞内に存在し得るか、細胞培地中に存在し得るか、または溶解物もしくは単離された調製物などの様々な形態で調製され得る。このようなものとして、いくつかの実施形態では、改善されたトランスアミナーゼ酵素は、単離されたポリペプチドであり得る。
「実質的に純粋なポリペプチド」は、ポリペプチド種が、存在する優勢な種である（すなわち、モルまたは重量に基づいて、それが、組成物中の任意の他の個々の高分子種よりも豊富である）組成物を指し、一般に、対象種が、モルまたは重量％で、存在する高分子種の少なくとも約５０パーセントを構成する場合、実質的に精製された組成物である。しかしながら、いくつかの実施形態では、トランスアミナーゼを含む組成物は、５０％未満の純度（例えば、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％または約５０％）のトランスアミナーゼを含む。一般に、実質的に純粋なトランスアミナーゼ組成物は、モルまたは重量％で、組成物中に存在するすべての高分子種の約６０％またはそれよりも多く、約７０％またはそれよりも多く、約８０％またはそれよりも多く、約９０％またはそれよりも多く、約９５％またはそれよりも多くおよび約９８％またはそれよりも多くを構成する。いくつかの実施形態では、対象種は、組成物が単一の高分子種から本質的になる本質的な均一性（すなわち、夾雑物種は、従来の検出方法により組成物中で検出され得ない）に精製される。溶媒種、小分子（＜５００ダルトン）および元素イオン種は、高分子種とみなされない。いくつかの実施形態では、単離された改善されたトランスアミナーゼポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチド組成物である。
「立体選択性」は、一方の立体異性体が別の立体異性体よりも化学反応または酵素反応において優先的に形成されることを指す。立体選択性は、一方の立体異性体の形成が他の立体異性体よりも好都合である部分的なものであり得るか、またはそれは、一方の立体異性体のみが形成される完全なものであり得る。立体異性体がエナンチオマーである場合、立体選択性は、両方の合計における一方のエナンチオマーの割合（典型的には、パーセンテージとして報告される）であるエナンチオ選択性と称される。あるいは、それは、一般的に、式［主要なエナンチオマー－副次的なエナンチオマー］／［主要なエナンチオマー＋副次的なエナンチオマー］にしたがってそれらから計算されるエナンチオマー過剰率（ｅ．ｅ．）として（典型的には、パーセンテージとして）当技術分野で報告される。立体異性体がジアステレオ異性体である場合、立体選択性は、２つのジアステレオマーの混合物中の一方のジアステレオマーの割合（典型的には、パーセンテージとして報告される）であるジアステレオ選択性と称され、あるいは、ジアステレオマー過剰率（ｄ．ｅ．）として一般的に報告される。混合物が２つを超えるジアステレオマーを含有する場合、ジアステレオマー過剰率ではなくジアステレオマーの比または「ジアステレオマー比」を報告することが一般的である。エナンチオマー過剰率およびジアステレオマー過剰率は、立体異性体過剰率の一種である。「高度に立体選択的」は、少なくとも約８５％の立体異性体過剰率で基質を対応するキラルアミン生成物に変換することができるトランスアミナーゼポリペプチドを指す。
本明細書で使用される場合、「位置選択性」および「位置選択的反応」は、ある方向の結合形成または破壊がすべての他の可能な方向よりも優先的に起こる反応を指す。反応は、識別が完全である場合には完全に（１００％）位置選択的であり得、ある位置の反応の生成物が他の位置の反応の生成物よりも優勢である場合には実質的に位置選択的（少なくとも７５％）であるか、または部分的に位置選択的（ｘ％、ここで、パーセンテージは目的の反応に応じて設定される）である。
本明細書で使用される場合、「化学選択性」は、別のものに対するある生成物の化学的または酵素的反応における優先的形成を指す。
本明細書で使用される場合、「改善された酵素特性」は、酵素の少なくとも１つの改善された特性を指す。いくつかの実施形態では、本発明は、参照トランスアミナーゼポリペプチドおよび／または野生型トランスアミナーゼポリペプチドおよび／または別の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドと比較して任意の酵素特性の改善を示す操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを提供する。したがって、「改善」のレベルは、野生型および操作されたトランスアミナーゼを含む様々なトランスアミナーゼポリペプチド間で決定および比較され得る。改善された特性としては、限定されないが、増加したタンパク質発現、増加した熱活性、増加した熱安定性、増加したｐＨ活性、増加した安定性、増加した酵素活性、増加した基質特異性または親和性、増加した特異的活性、基質または末端生成物阻害に対する増加した抵抗性、増加した化学的安定性、改善された化学選択性、改善された溶媒安定性、酸性ｐＨに対する増加した耐性、タンパク質分解活性に対する増加した耐性（すなわち、タンパク質分解に対する減少した感受性）、減少した凝集、増加した溶解性および変化した温度プロファイルなどの特性が挙げられる。さらなる実施形態では、前記用語は、トランスアミナーゼ酵素の少なくとも１つの改善された特性に関して使用される。いくつかの実施形態では、本発明は、参照トランスアミナーゼポリペプチドおよび／または野生型トランスアミナーゼポリペプチドおよび／または別の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドと比較して任意の酵素特性の改善を示す操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを提供する。したがって、「改善」のレベルは、野生型および操作されたトランスアミナーゼを含む様々なトランスアミナーゼポリペプチド間で決定および比較され得る。
「増加した酵素活性」および「増強した触媒活性」は、比活性（例えば、生成した生成物／時間／重量タンパク質）の増加、または参照酵素と比較した生成物への基質の変換率（例えば、指定量の酵素を使用した、指定期間における生成物への出発量の基質の変換率）の増加により表され得る操作されたポリペプチドの改善された特性を指す。いくつかの実施形態では、前記用語は、比活性（例えば、生成した生成物／時間／重量タンパク質）の増加、または参照トランスアミナーゼ酵素と比較した生成物への基質の変換率（例えば、指定量のトランスアミナーゼを使用した、指定期間における生成物への出発量の基質の変換率）の増加により表され得る本明細書で提供される操作されたトランスアミナーゼポリペプチドの改善された特性を指す。いくつかの実施形態では、前記用語は、本明細書で提供される改善されたトランスアミナーゼ酵素に関して使用される。本発明の操作されたトランスアミナーゼの酵素活性を決定するための例示的な方法は、実施例で提供されている。Ｋｍ、Ｖｍａｘまたはｋｃａｔの古典的な酵素特性を含む酵素活性に関連する任意の特性が影響を受け得、これらの変化は、増加した酵素活性につながり得る。例えば、酵素活性の改善は、対応する野生型酵素の酵素活性の約１．１倍から、トランスアミナーゼポリペプチドが由来する天然に存在するトランスアミナーゼまたは別の操作されたトランスアミナーゼの２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍、２００倍またはそれを超える酵素活性までであり得る。
「増加した熱活性」または「改善された熱活性」は、高温条件下で参照または野生型タンパク質と比べて増加した触媒活性を有するポリペプチドを指すために本明細書で使用される。
「変換」は、対応する生成物（複数可）への基質（複数可）の酵素的変換を指す。「変換率」は、指定の条件下で一定期間内に生成物に変換される基質のパーセントを指す。したがって、トランスアミナーゼポリペプチドの「酵素活性」または「活性」は、生成物への基質の「変換率」として表され得る。
「熱安定」は、一定期間（例えば、０．５～２４時間）にわたる高温（例えば、４０～８０℃）への曝露後に、野生型酵素と比較して類似の活性（例えば、６０％超～８０％）を維持するトランスアミナーゼポリペプチドを指す。
「溶媒安定」は、一定期間（例えば、０．５～２４時間）にわたる様々な濃度（例えば、５～９９％）の溶媒（エタノール、ＩＰＡ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、アセトン、トルエン、酢酸ブチル、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルなど）への曝露後に、野生型酵素と比較して類似の活性（例えば、６０％超～８０％）を維持するトランスアミナーゼポリペプチドを指す。
本明細書で使用される場合、「ｐＨ安定」は、一定期間（例えば、０．５～２４時間）にわたる高または低ｐＨ（例えば、４．５～６または８～１２）への曝露後に、未処理酵素と比較して類似の活性（例えば、６０％超～８０％）を維持するトランスアミナーゼポリペプチドを指す。
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語は、核酸ハイブリッドが安定である条件を指すために本明細書で使用される。当業者に公知のように、ハイブリッドの安定性は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）に反映される。一般に、ハイブリッドの安定性は、イオン強度、温度、Ｇ／Ｃ含有量およびカオトロピック剤の存在の関数である。ポリヌクレオチドのＴｍ値は、融解温度を予測するための公知の方法を使用して計算され得る（例えば、Ｂａｌｄｉｎｏら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１６８：７６１－７７７［１９８９］；Ｂｏｌｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４８：１３９０［１９６２］；Ｂｒｅｓｓｌａｕｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：８８９３－８８９７［１９８６］；Ｆｒｅｉｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：９３７３－９３７７［１９８６］；Ｋｉｅｒｚｅｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５：７８４０－７８４６［１９８６］；Ｒｙｃｈｌｉｋら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８：６４０９－６４１２［１９９０］（ｅｒｒａｔｕｍ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９：６９８［１９９１］）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前掲）；Ｓｕｇｇｓら、１９８１，ｉｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｕｓｉｎｇ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｇｅｎｅｓ，Ｂｒｏｗｎら［ｅｄｓ．］，ｐｐ．６８３－６９３，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ［１９８１］；およびＷｅｔｍｕｒ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６：２２７－２５９［１９９１］を参照のこと）。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるポリペプチドをコードし、規定の条件、例えば中ストリンジェントまたは高ストリンジェントな条件下で、本発明の操作されたトランスアミナーゼ酵素をコードする配列の相補体にハイブリダイズする。
「ハイブリダイゼーションストリンジェンシー」は、核酸のハイブリダイゼーションにおけるハイブリダイゼーション条件、例えば洗浄条件に関する。一般に、ハイブリダイゼーション反応は、より低いストリンジェンシーの条件下で実施され、続いて様々であるがより高いストリンジェンシーの洗浄が実施される。「中ストリンジェントなハイブリダイゼーション」という用語は、標的ＤＮＡが、標的ＤＮＡと約６０％の同一性、好ましくは約７５％の同一性、約８５％の同一性、標的ポリヌクレオチドと約９０％を超える同一性を有する相補的核酸に結合することを可能にする条件を指す。例示的な中ストリンジェントな条件は、４２℃の５０％ホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳのハイブリダイゼーション、続いて、４２℃の０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳの洗浄と同等の条件である。「高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション」は、一般に、規定のポリヌクレオチド配列について溶液条件下で決定された熱融解温度Ｔｍからの約１０℃またはそれ未満の条件を指す。いくつかの実施形態では、高ストリンジェンシー条件は、６５℃の０．０１８Ｍ ＮａＣｌ中で安定なハイブリッドを形成するそれらの核酸配列のみのハイブリダイゼーションを可能にする条件を指す（すなわち、ハイブリッドが、６５℃の０．０１８Ｍ ＮａＣｌ中で安定ではない場合、それは、本明細書で企図されるような高ストリンジェンシー条件下で安定ではない）。高ストリンジェンシー条件は、例えば、４２℃の５０％ホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳと同等の条件におけるハイブリダイゼーション、続いて６５℃の０．１×ＳＳＰＥおよび０．１％ＳＤＳの洗浄により提供され得る。別の高ストリンジェンシー条件は、６５℃の０．１％（ｗ：ｖ）ＳＤＳを含有する５×ＳＳＣ中のハイブリダイズと同等の条件におけるハイブリダイズおよび６５℃の０．１％ＳＤＳを含有する０．１×ＳＳＣの洗浄である。他の高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件および中ストリンジェントな条件は、上記で引用されている参考文献に記載されている。
「コドン最適化された」は、コードされるタンパク質が目的の生物においてより効率的に発現されるように、タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドンを、特定の生物において優先的に使用されるコドンに変化させることを指す。ほとんどのアミノ酸が、「同義語」または「同義」コドンと称されるいくつかのコドンにより表されるという点で遺伝暗号は縮重するが、特定の生物によるコドン使用頻度は非ランダムであり、特定のコドントリプレットに偏っていることが周知である。このコドン使用頻度の偏りは、所定の遺伝子、共通の機能または祖先起源の遺伝子、低コピー数のタンパク質と対比して高発現されるタンパク質、および生物のゲノムの集合タンパク質コード領域に関してより高い場合がある。いくつかの実施形態では、トランスアミナーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドは、発現のために選択された宿主生物からの最適な産生のためにコドン最適化され得る。
本明細書で使用される場合、「好ましい」、「最適な」および「高コドン使用頻度バイアス」コドンは、単独でまたは組み合わせて使用される場合、タンパク質コード領域において、同じアミノ酸をコードする他のコドンよりも高い頻度で使用されるコドンを互換的に指す。好ましいコドンは、単一の遺伝子におけるコドン使用頻度、共通の機能または起源の遺伝子のセット、高発現される遺伝子、全生物の集合タンパク質コード領域におけるコドン頻度、関連生物の集合タンパク質コード領域におけるコドン頻度またはそれらの組み合わせに関して決定され得る。その頻度が遺伝子発現のレベルと共に増加するコドンは、典型的には、発現のための最適なコドンである。例えば、クラスタ分析または対応分析を使用した多変量分析、および遺伝子において使用されるコドンの有効数を含む、特定の生物におけるコドン頻度（例えば、コドン使用頻度、相対的同義コドン使用頻度）およびコドン選択を決定するための様々な方法が公知である（例えば、ＧＣＧ ＣｏｄｏｎＰｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ；ＣｏｄｏｎＷ，Ｐｅｄｅｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ；ＭｃＩｎｅｒｎｅｙ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．，１４：３７２－７３［１９９８］；Ｓｔｅｎｉｃｏら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２２４３７－４６［１９９４］；およびＷｒｉｇｈｔ，Ｇｅｎｅ ８７：２３－２９［１９９０］を参照のこと）。多くの異なる生物について、コドン使用頻度表が利用可能である（例えば、Ｗａｄａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０：２１１１－２１１８［１９９２］；Ｎａｋａｍｕｒａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２８：２９２［２０００］；Ｄｕｒｅｔ，ら、前掲；Ｈｅｎａｕｔ ａｎｄ Ｄａｎｃｈｉｎ，ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，Ｎｅｉｄｈａｒｄｔら（ｅｄｓ．），ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，ｐ．２０４７－２０６６［１９９６］を参照のこと）。コドン使用頻度を得るためのデータソースは、タンパク質をコードすることができる任意の利用可能なヌクレオチド配列に依拠し得る。これらのデータセットは、発現タンパク質をコードすることが実際に公知の核酸配列（例えば、完全なタンパク質コード配列－ＣＤＳ）、発現配列タグ（ＥＳＴＳ）、またはゲノム配列の予測コード領域を含む（例えば、Ｍｏｕｎｔ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ ８，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．［２００１］；Ｕｂｅｒｂａｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２６６：２５９－２８１［１９９６］；およびＴｉｗａｒｉら、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，１３：２６３－２７０［１９９７］を参照のこと）。
「制御配列」は、本明細書では、本開示のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現に必要または有益なすべての成分を含むことを指す。各制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列に対してネイティブまたは外来性であり得る。このような制御配列としては、限定されないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、開始配列および転写ターミネーターが挙げられる。最低でも、制御配列は、プロモーターならびに転写および翻訳の停止シグナルを含む。制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域と制御配列とのライゲーションを容易にする特異的制限部位を導入する目的でリンカーと共に提供され得る。
「作動可能に連結された」は、制御配列が目的のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を指示または調節するように、制御配列が、目的のポリヌクレオチドに対する位置に適切に配置された（すなわち、機能的関係性にある）配置として本明細書で定義される。
「プロモーター配列」は、コード配列などの目的のポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞により認識される核酸配列を指す。プロモーター配列は、目的のポリヌクレオチドの発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモーターは、変異体プロモーター、切断型プロモーターおよびハイブリッドプロモーターを含む、選択した宿主細胞において転写活性を示す任意の核酸配列であり得、宿主細胞と同種または異種である細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られ得る。
「アルキル」は、直鎖または分枝鎖の１～１８個の炭素原子、特に１～８個の炭素原子、より具体的には１～６個の炭素原子の基を指す。指定数の炭素原子を有するアルキルは括弧で示され、例えば、（Ｃ１－Ｃ４）アルキルは、１～４個の炭素原子のアルキルを指す。
「アリール」は、単環（例えば、フェニル）または多重縮合環（例えば、ナフチルまたはアントリル）を有する５～１４個の炭素原子の不飽和芳香族炭素環式基を指す。多重縮合環については、環の少なくとも１つは芳香族である。代表的なアリールとしては、フェニル、ピリジル、ナフチルなどが挙げられる。
「アリールアルキル」は、アリール部分で置換されたアルキルを指す。代表的なアリールアルキル基としては、ベンジル、フェネチルなどが挙げられる。
「ヘテロアリール」は、環内に酸素、窒素および硫黄から選択される１～４個の環ヘテロ原子を有する５～１４個の環原子の芳香族複素環式基を指す。ヘテロアリール基は、単環（例えば、ピリジルまたはフリル）または多重縮合環（例えば、インドリジニルまたはベンゾチエニル）を有し得る。多重縮合環については、環の少なくとも１つは芳香族である。
「ヘテロアリールアルキル」は、本明細書で定義されるヘテロアリール部分で置換されたアルキルを指す。
「複素環」および互換的に「ヘテロシクロアルキル」は、単環または多重縮合環と、環内に窒素、硫黄または酸素から選択される１～４個のヘテロ原子を有する３～１４個の環原子とを有する飽和または不飽和基を指す。複素環式基は、単環（例えば、ピペリジニルまたはテトラヒドロフリル）または多重縮合環（例えば、インドリニル、ジヒドロベンゾフランまたはキヌクリジニル）を有し得る。代表的な複素環およびヘテロアリールとしては、限定されないが、フラン、チオフェン、チアゾール、オキサゾール、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドリジン、イソインドール、インドール、インダゾール、プリン、キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチルピリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、フェナントロリン、イソチアゾール、フェナジン、イソオキサゾール、フェノキサジン、フェノチアジン、イミダゾリジンが挙げられる。
「アルコキシ」または「アルキルオキシ」は、基アルキル－Ｏ－（アルキル基は上記で定義されるとおりであり、同じく上記で定義される必要に応じて置換されたアルキル基を含む）を指す。
「アミノ」は、基－ＮＨ２を指す。置換アミノは、基－ＮＨＲ’、ＮＲ’Ｒ’およびＮＲ’Ｒ’Ｒ’（各Ｒ’は、他とは独立して、置換または非置換アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキルアルキル、アルキルオキシ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、アシル、アルキルオキシカルボニル、スルファニル、スルフィニル、スルホニルなどから選択される）を指す。典型的なアミノ基としては、限定されないが、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、トリメチルアンモニウム、トリエチルアンモニウム、メチルスルホニルアミノ、フラニル－オキシ－スルファミノなどが挙げられる。
「カルボキシ」は、－ＣＯＯＨを指す。
「カルボニル」は、－Ｃ（Ｏ）－（これは、酸、酸ハロゲン化物、アルデヒド、アミド、エステルおよびケトンを含む様々なカルボニル基を形成するための様々な置換基を有し得る）を指す。
「ヒドロキシ」は－ＯＨを指す。
「シアノ」は－ＣＮを指す。
「ハロゲン」または「ハロ」は、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードを指す。
「ニトロ」は、－ＮＯ２を指す
例えば縮合アリールまたは縮合ヘテロアリールにおける「縮合」または「縮合環」は、共通して少なくとも２個の環原子を有するように結合した２つまたはそれを超える環を指す。縮合アリールは、環の少なくとも１つがアリールである縮合環を指す。縮合ヘテロアリールは、環の少なくとも１つがヘテロアリールである縮合環を指す。
特に指定がない限り、「置換された」は、前述の基における水素により占有される位置が、限定されないが、ヒドロキシ、オキソ、ニトロ、メトキシ、エトキシ、アルキルオキシ、置換アルキルオキシ、トリフルオロメトキシ、ハロアルキルオキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、ハロ、メチル、エチル、プロピル、ブチル、アルキル、アルケニル、アルキニル、置換アルキル、トリフルオロメチル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルキルオキシアルキル、チオ、アルキルチオ、アシル、カルボキシ、アルキルオキシカルボニル、カルボキサミド、置換カルボキサミド、アルキルスルホニル、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニルアミノ、スルホンアミド、置換スルホンアミド、シアノ、アミノ、置換アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、アシルアミノ、アミジノ、アミドキシモ（ａｍｉｄｏｘｉｍｏ）、ヒドロキサモイル（ｈｙｄｒｏｘａｍｏｙｌ）、フェニル、アリール、置換アリール、アリールオキシ、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ピリジル、イミダゾリル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルキルオキシ、ピロリジニル、ピペリジニル、モルホリノ、複素環、（複素環）オキシおよび（複素環）アルキルにより例示される置換基で置き換えられることを指し；好ましいヘテロ原子は、酸素、窒素および硫黄である。開放原子価がこれらの置換基上に存在する場合、それらは、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールおよび／または複素環式基でさらに置換され得ること、これらの開放原子価が炭素上に存在する場合、それらは、ハロゲンおよび酸素、窒素または硫黄結合置換基でさらに置換され得ること、ならびに複数のこのような開放原子価が存在する場合、これらの基は結合して、結合の直接形成により、または新たなヘテロ原子、好ましくは酸素、窒素もしくは硫黄への結合の形成により、環を形成し得ることが理解される。置換基による水素の置き換えが、許容され得ない不安定性を本発明の分子に導入せず、他の点で化学的に妥当である限り、上記置換が行われ得るとさらに理解される。
「必要に応じた」または「必要に応じて」は、その後に記載される事象または状況が起こってもよいしまたは起こらなくてもよいこと、ならびに前記記載が、前記事象または状況が起こる場合およびそれが起こらない場合を含むことを意味する。当業者は、１つまたはそれを超える必要に応じた置換基を含有すると記載されている任意の分子に関して、立体的に実際的なおよび／または合成的に実現可能な化合物のみが含まれることを意味することを理解する。
「必要に応じて置換された」は、ある用語または一連の化学基におけるすべてのその後の修飾語句を指す。例えば、「必要に応じて置換されたアリールアルキル」という用語では、分子の「アルキル」部分および「アリール」部分は置換されてもよいしまたは置換されていなくてもよく、一連の「必要に応じて置換されたアルキル、シクロアルキル、アリールおよびヘテロアリール」について、アルキル、シクロアルキル、アリールおよびヘテロアリール基は、他とは独立して、置換されてもよいしまたは置換されていなくてもよい。
「保護基」は、分子中の反応性官能基に結合させると、官能基の反応性を遮蔽し、減少させまたは妨げる原子の基を指す。典型的には、保護基は、合成過程中に所望により選択的に除去され得る。保護基の例は、Ｗｕｔｓ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｅ，Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，４ｔｈ Ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（２００６）およびＨａｒｒｉｓｏｎら、Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌｓ．１－８，１９７１－１９９６，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹに見出され得る。保護基を有し得る官能基としては、限定されないが、ヒドロキシ、アミノおよびカルボキシ基が挙げられる。代表的なアミノ保護基としては、限定されないが、ホルミル、アセチル、トリフルオロアセチル、ベンジル、ベンジルオキシカルボニル（「ＣＢＺ」）、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル（「Ｂｏｃ」）、トリメチルシリル（「ＴＭＳ」）、２－トリメチルシリル－エタンスルホニル（「ＳＥＳ」）、トリチル基および置換トリチル基、アリルオキシカルボニル、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（「ＦＭＯＣ」）、ニトロ－ベラトリルオキシカルボニル（「ＮＶＯＣ」）などが挙げられる。代表的なヒドロキシル保護基としては、限定されないが、ヒドロキシル基がアシル化（例えば、メチルおよびエチルエステル、酢酸基もしくはプロピオン酸基またはグリコールエステル）またはアルキル化されたもの、例えばベンジルおよびトリチルエーテル、ならびにアルキルエーテル、テトラヒドロピラニルエーテル、トリアルキルシリルエーテル（例えば、ＴＭＳまたはＴＩＰＰＳ基）およびアリルエーテルが挙げられる。他の保護基は、本明細書に示されている参考文献に見出され得る。
「脱離基」は、一般に、化学反応において別の原子または部分で置き換えられることができる任意の原子または部分を指す。より具体的には、脱離基は、求核剤（例えば、アミン、チオール、アルコールまたはシアニド）で容易に置き換えられおよび置換される原子または部分を指す。このような脱離基は周知であり、カルボキシレート、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（「ＮＨＳ」）、Ｎ－ヒドロキシベンゾトリアゾール、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素またはヨウ素）およびアルキルオキシ基が挙げられる。脱離基の非限定的な特徴および例は、例えば、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｄ ｅｄ．，Ｆｒａｎｃｉｓ Ｃａｒｅｙ（１９９２），ｐａｇｅｓ ３２８－３３１；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｄ ｅｄ．，Ａｎｄｒｅｗ Ｓｔｒｅｉｔｗｉｅｓｅｒ ａｎｄ Ｃｌａｙｔｏｎ Ｈｅａｔｈｃｏｃｋ（１９８１），ｐａｇｅｓ １６９－１７１；ａｎｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ ＭｃＭｕｒｒｙ，Ｂｒｏｏｋｓ／Ｃｏｌｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００），ｐａｇｅｓ ３９８ ａｎｄ ４０８（これらはすべて、参照により本明細書に組み込まれる）に見出され得る。
「適切な反応条件」は、本開示のトランスアミナーゼポリペプチドが基質を所望のアミノ生成物化合物に変換することができる（例えば、化合物（２）を化合物（１）に変換することができる）生体触媒反応溶液中の条件（例えば、ある範囲の酵素負荷、基質負荷、補因子負荷、温度、ｐＨ、バッファー、共溶媒など）を指す。例示的な「適切な反応条件」は本開示で提供されており、実施例により例証されている。
「化合物負荷」または「酵素負荷」などの「負荷」は、反応開始時における反応混合物中の成分の濃度または量を指す。
生体触媒媒介プロセスの文脈における「基質」は、生体触媒が作用する化合物または分子を指す。
生体触媒媒介プロセスの文脈における「生成物」は、生体触媒の作用から生じる化合物または分子を指す。例えば、本明細書に開示されるプロセスにおけるトランスアミナーゼ生体触媒の例示的な生成物は、化合物（１）である。
「湿潤有機溶媒」は、その有機溶媒に溶解され得る最大量の水を含む有機溶媒として定義される。例えば、ＩＰＡｃ中の水の溶解度は、約１．９ｗｔ％であると当業者により認められており、以下の実施例に記載されているように、または他の適切な方法により、最大約１．９ｗｔ％を含有する湿潤ＩＰＡｃが生成され得る。この用途で使用される場合、湿潤有機溶媒は、実施例に記載されているスクリーニングアッセイ反応などの化学反応へのいかなる水の添加も伴わずに最小水性条件を作り出す。
「最小水性条件」は、余分な水の添加を伴わずに湿潤有機溶媒の使用により作り出された条件である。最小水性条件は、反応条件または溶媒系として、その有機溶媒に溶解され得る最大量の水を含有する有機溶媒を使用する。水性条件と比較して、最小水性条件は、水が反応物または溶媒系に添加される反応条件や溶媒系を含まない。むしろ、最小水性条件は、最初に、有機溶媒に溶解され得る最大量の水に溶解させ、次に、未溶解の水を除去し、次いで、湿潤有機溶剤に溶解されないいかなるさらなる水も含まない溶媒系で湿潤有機溶媒を使用することにより作り出される。
発明の詳細な説明
本発明は、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドおよびその組成物、ならびに操作されたトランスアミナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。トランスアミナーゼ酵素を生成するための方法も提供される。いくつかの実施形態では、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、湿潤有機溶媒中の最小水性条件下で、改善された酵素特性を提供するように最適化される。
対応するＳ－ホモバリンエステル生成物（メチル（Ｓ）－３－アミノ－４－メチル－ペンタノエート）へのメチルケトエステル基質（メチル４－メチル－３－オキソ－ペンタノエート）へのアミノ基転移は、スキーム２に示されている。
スキーム２
Figure 2022518212000010
典型的な水性条件下における生成物収率は、アミノエステル生成物の自然発生的加水分解およびケトエステルの自然発生的加水分解とそれに続く分解により制限される。以下のスキーム４を参照のこと。
スキーム４
Figure 2022518212000011
工業プロセスのための不斉酵素合成の限界を克服するための１つのアプローチは、湿潤有機溶媒の使用である。しかしながら、このアプローチは、有機溶媒中で活性を示す酵素の欠如により制限されている。最近、予備研究は、固定を必要としない、湿潤有機溶媒中でＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ種由来のω－トランスアミナーゼの活性を実証した（Ｍｕｔｔｉ＆Ｋｒｏｕｔｉｌ，Ａｄｖ．Ｓｙｎｔｈ．Ｃａｔａｌ．，２０１２，３５４，３４０９－４３１３）。
本発明のポリペプチドは、高いエナンチオ選択性のために、および湿潤有機溶媒中の最小水性条件下で触媒的に活性であるように操作されている。これは、湿潤有機溶媒中でＳ－ホモバリンエステルへのメチルケトエステルの直接変換を可能にし、メチルケトエステルおよびＳ－ホモバリンエステルの両方の自然発生的加水分解を大きく最小化する。加えて、本発明の操作されたポリペプチドは、増加した熱活性を有するように操作されており、湿潤有機溶媒の存在下、高温における反応を可能にする。
湿潤有機溶媒中の改善された活性および高温における湿潤有機溶媒中の改善された活性を有する操作されたトランスアミナーゼは、光学的に活性な形態のキラルアミン化合物を調製するための工業プロセスにおいて使用され得る。
トランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチド
本発明は、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドおよびその組成物、ならびに操作されたトランスアミナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。トランスアミナーゼ酵素を生成するための方法も提供される。いくつかの実施形態では、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、湿潤有機溶媒中の最小水性条件下で、改善された酵素特性を提供するように最適化される。
本開示の操作されたポリペプチドは、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＫＮＫ１６８（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＢＡＫ３９７５３．１，ＧＩ：３３６０８８３４１）の野生型トランスアミナーゼポリペプチドと比較して、および本開示の操作されたポリペプチドの定向進化のための出発骨格配列として使用した配列番号２の操作された参照トランスアミナーゼポリペプチドと比較して改善された酵素特性（例えば、増加した立体選択性）を有するように操作された天然に存在しないトランスアミナーゼである。配列番号２の操作された参照トランスアミナーゼポリペプチドは、野生型Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＫＮＫ１６８ポリペプチド配列と比べて以下の３０個のアミノ酸差異を有する：Ｓ８Ｐ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｙ６０Ｆ、Ｌ６１Ｙ、Ｈ６２Ｔ、Ｖ６５Ａ、Ｖ６９Ｔ、Ｄ８１Ｇ、Ｍ９４Ｉ、Ｉ９６Ｌ、Ｆ１２２Ｍ、Ｓ１２４Ｔ、Ｓ１２６Ｔ、Ｇ１３６Ｆ、Ｙ１５０Ｆ、Ｖ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、Ａ１６９Ｌ、Ｖ１９９Ｉ、Ａ２０９Ｌ、Ｇ２１７Ｎ、Ｓ２２３Ｐ、Ｌ２６９Ｐ、Ｌ２７３Ｙ、Ｔ２８２Ｓ、Ａ２８４Ｇ、Ｐ２９７ＳおよびＳ３２１Ｐ。
本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、特定の工業的に関連する条件下で化合物（２）から化合物（１）への効率的な変換のために配列番号２の定向進化により生成されたものであり、配列番号２の操作された参照トランスアミナーゼポリペプチドと比較して１つまたはそれを超える残基差異を有する。これらの残基差異は、湿潤有機溶媒中の最小水性条件下における様々な酵素特性の改善、特に増加した活性、増加した立体選択性、増加した安定性、ならびに増加した基質および／または生成物濃度の耐性（例えば、減少した生成物阻害）に関連する。したがって、いくつかの実施形態では、トランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、適切な反応条件下で配列番号２、６、３３２、５１８および／または６５６の参照ポリペプチドの活性と比べて少なくとも約１～２倍、１．５～２．５倍、２～３倍、２．５～３．５倍、３～４倍、３．５～４．５倍、４～５倍、４．５～５倍、５～１０倍、１０～１５倍またはそれを超えて増加した活性で、基質化合物（２）を化合物（１）に変換することができる。いくつかの実施形態では、トランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、適切な反応条件下で、約７２時間、約４８時間、約３６時間、約２４時間、約２０時間またはさらにはそれよりも短い時間の反応時間で、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％または少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％の変換率で、化合物（２）の基質を化合物（１）に変換することができる。いくつかの実施形態では、トランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、適切な反応条件下で、少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えるエナンチオマー過剰率で、化合物（２）を化合物（１）に変換することができる。
適切な反応条件では、操作されたポリペプチドの上記改善された特性は、ポリペプチド、基質、アミノ基供与体、補因子の濃度もしくは量ならびに／または温度および反応時間を含む条件に関して決定され得る。いくつかの実施形態では、適切な反応条件は、湿潤有機溶媒中の最小水性条件を含む。いくつかの実施形態では、適切な反応条件は、以下および実施例に記載されているＨＴＰまたはＳＦＰアッセイ条件を含む。
いくつかの実施形態では、さらなる反応成分またはさらなる技術は、反応条件を補足するために利用される。いくつかの実施形態では、これらは、酵素の不活性化を安定化もしくは防止し、生成物阻害を減少させ、または反応平衡を所望の生成物形成にシフトさせるための措置を取ることを含む。
いくつかのさらなる実施形態では、生成物化合物への基質化合物の変換のための上記プロセスはいずれも、生成物化合物の抽出、単離、精製、結晶化、濾過および／または凍結乾燥から選択される１つまたはそれを超える工程をさらに含み得る。本明細書で提供されるプロセスにより生成される生体触媒反応混合物から生成物を抽出、単離、精製および／または結晶化するための方法、技術およびプロトコールは当業者に公知であり、および／またはルーチンな実験を通じてアクセスされる。加えて、例示的な方法は、以下の実施例で提供されている。
本開示の例示的な天然に存在しない操作されたトランスアミナーゼポリペプチドの構造および機能に関する情報は、上記表１、２、３、４、５、６、７および８に示されている。奇数番号配列識別子（すなわち、配列番号）は、偶数番号配列番号により提供されるアミノ酸（ａａ）配列をコードするヌクレオチド（ｎｔ）配列を指し、配列は、本開示に添付の電子配列表ファイル（これらは、参照により本明細書に組み込まれる）で提供される。アミノ酸残基差異は、配列番号２、６、３３２、５１８および／または６５６の参照ポリペプチド配列との比較に基づく。ハイスループット（ＨＴＰ）アッセイ（一次スクリーニングとして）、ならびにいくつかの場合では、二次的振盪フラスコ粉末（ＳＦＰ）アッセイを使用して、各操作されたポリペプチドの活性を決定した。ＨＴＰおよびＳＦＰ調製ならびにアッセイのさらなる詳細は、実施例に記載されている。
当業者には明らかなように、前述の残基位置および各残基位置の特定のアミノ酸残基は、とりわけ、酵素活性、基質／生成物優先性、立体選択性、基質／生成物の耐性および様々な条件、例えば湿潤有機溶媒中の最小水性条件下における安定性を含む所望の改善された特性を有するトランスアミナーゼポリペプチドを合成するために個々にまたは様々な組み合わせで使用され得る。
本明細書で提供される指針を考慮すると、配列番号４～８４６の偶数番号配列識別子を有する例示的な操作されたポリペプチドはいずれも、例えば、表１、２、３、４、５、６、７および８における他のポリペプチドおよびそこに記載されている他の残基位置からの様々なアミノ酸差異の新たな組み合わせを付加することによるその後の進化ラウンドにより、他の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを合成するための出発アミノ酸配列として使用され得ることがさらに企図される。さらなる改善は、前の進化ラウンドを通して不変に維持された位置においてアミノ酸差異を含ませることにより生成され得る。
いくつかの実施形態では、本開示はまた、機能的トランスアミナーゼ活性および／または操作されたトランスアミナーゼポリペプチドの改善された特性を保持する本明細書に記載される操作されたトランスアミナーゼポリペプチドのいずれかの断片を含む操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを提供する。したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、（例えば、適切な反応条件下で化合物（２）を化合物（１）に変換することができる）トランスアミナーゼ活性を有するポリペプチド断片であって、本開示の操作されたポリペプチド、例えば配列番号４～８４６の偶数番号配列識別子を有する例示的な操作されたポリペプチドの全長アミノ酸配列の少なくとも約８０％、９０％、９５％、９８％または９９％を含むポリペプチド断片を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、本明細書に記載される操作されたトランスアミナーゼポリペプチド配列、例えば配列番号４～８４６の偶数番号配列識別子を有する例示的な操作されたポリペプチド配列のいずれか１つと比較して欠失を含むアミノ酸配列を有し得る。したがって、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドのあらゆる各実施形態について、アミノ酸配列は、トランスアミナーゼポリペプチドのアミノ酸の総数の最大１０％、アミノ酸の総数の最大１０％、アミノ酸の総数の最大２０％、またはアミノ酸の総数の最大３０％である、１個またはそれを超えるアミノ酸、２個またはそれを超えるアミノ酸、３個またはそれを超えるアミノ酸、４個またはそれを超えるアミノ酸、５個またはそれを超えるアミノ酸、６個またはそれを超えるアミノ酸、８個またはそれを超えるアミノ酸、１０個またはそれを超えるアミノ酸、１５個またはそれを超えるアミノ酸、または２０個またはそれを超えるアミノ酸の欠失を含み得、本明細書に記載される操作されたトランスアミナーゼの関連機能活性および／または改善された特性は維持される。いくつかの実施形態では、欠失は、１～２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、１～１０、１～１５、１～２０、１～２１、１～２２、１～２３、１～２４、１～２５、１～３０、１～３５、１～４０、１～４５、１～５０、１～５５または１～６０個のアミノ酸残基を含み得る。いくつかの実施形態では、欠失の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３０、３５、４０、４５、５０、５５または６０個アミノ酸残基であり得る。いくつかの実施形態では、欠失は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、２５または３０個のアミノ酸残基の欠失を含み得る。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載される操作されたトランスアミナーゼポリペプチド配列、例えば配列番号４～８４６の偶数番号配列識別子を有する例示的な操作されたポリペプチド配列のいずれか１つと比較して挿入を含むアミノ酸配列を有する操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを提供する。したがって、本開示のトランスアミナーゼポリペプチドのあらゆる各実施形態について、挿入は、１個またはそれを超えるアミノ酸、２個またはそれを超えるアミノ酸、３個またはそれを超えるアミノ酸、４個またはそれを超えるアミノ酸、５個またはそれを超えるアミノ酸、６個またはそれを超えるアミノ酸、８個またはそれを超えるアミノ酸、１０個またはそれを超えるアミノ酸、１５個またはそれを超えるアミノ酸、または２０個またはそれを超えるアミノ酸を含み得、本明細書に記載される操作されたトランスアミナーゼの関連機能活性および／または改善された特性は維持される。挿入は、トランスアミナーゼポリペプチドのアミノもしくはカルボキシ末端または内部部分に対するものであり得る。
いくつかの実施形態では、本開示は、トランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドであって、配列番号４～８４６の偶数番号配列識別子を有する配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ただし、前記アミノ酸配列が、２０１２年１０月２３日に発行された米国特許第８，２９３，５０７号、２０１１年１月１３日に公開されたＰＣＴ公開ＷＯ２０１１００５４７７Ａ１号、２０１２年２月２３日に公開されたＰＣＴ公開ＷＯ２０１２０２４１０４号および２０１２年９月７日付に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１２／５４３００号（これらはそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている例示的な操作されたトランスアミナーゼポリペプチドのいずれとも同一ではない（すなわち、これらを除外する）操作されたポリペプチドを提供する。
上記実施形態では、操作されたポリペプチドのための適切な反応条件は、表１、２、３、４、５、６、７および８に記載されているものである。したがって、いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物または化合物（１）の調製であって、適切な反応条件が、（ａ）約１０～２２０ｇ／Ｌの基質化合物（例えば、化合物（２））の基質負荷；（ｂ）約０．５ｇ／Ｌ～２５ｇ／Ｌの操作されたポリペプチド；（ｃ）約０．１～３ＭのＩＰＭ濃度；（ｄ）湿潤有機溶媒；および（ｅ）約３０℃～６０℃の温度を含む調製が行われ得る。いくつかの実施形態では、適切な反応条件は、（ａ）約２０ｇ／Ｌの基質化合物（例えば、化合物（２））；（ｂ）約２０ｇ／Ｌの操作されたポリペプチド；（ｃ）湿潤ＩＰＡｃ；（ｄ）約０．５５Ｍ ＩＰＭ；および（ｅ）約５０℃を含む。これらの反応条件およびトランスアミナーゼポリペプチドの使用に関する指針は、とりわけ、表１、２、３、４、５、６、７および８ならびに実施例で提供されている。
いくつかの実施形態では、本開示のポリペプチドは、操作されたポリペプチドが、例えば限定されないが、抗体タグ（例えば、ｍｙｃエピトープ）、精製配列（例えば、金属への結合のためのＨｉｓタグ）および細胞局在化シグナル（例えば、分泌シグナル）などにより他のポリペプチドに融合された融合ポリペプチドの形態であり得る。したがって、本明細書に記載される操作されたポリペプチドは、他のポリペプチドとの融合と共にまたはそれを伴わずに使用され得る。
本明細書に記載される操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、遺伝子にコードされたアミノ酸に限定されない。したがって、遺伝子にコードされたアミノ酸に加えて、本明細書に記載されるポリペプチドは、天然に存在するアミノ酸および／または非コード合成のアミノ酸から全体的にまたは部分的に構成され得る。本明細書に記載されるポリペプチドが構成され得る一般的に遭遇するある特定の非コードアミノ酸としては、限定されないが、遺伝子にコードされたアミノ酸のＤ－立体異性体；２，３－ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）；α－アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）；ε－アミノヘキサン酸（Ａｈａ）；δ－アミノ吉草酸（Ａｖａ）；Ｎ－メチルグリシンまたはサルコシン（ＭｅＧｌｙまたはＳａｒ）；オルニチン（Ｏｒｎ）；シトルリン（Ｃｉｔ）；ｔ－ブチルアラニン（Ｂｕａ）；ｔ－ブチルグリシン（Ｂｕｇ）；Ｎ－メチルイソロイシン（ＭｅＩｌｅ）；フェニルグリシン（Ｐｈｇ）；シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）；ノルロイシン（Ｎｌｅ）；ナフチルアラニン（Ｎａｌ）；２－クロロフェニルアラニン（Ｏｃｆ）；３－クロロフェニルアラニン（Ｍｃｆ）；４－クロロフェニルアラニン（Ｐｃｆ）；２－フルオロフェニルアラニン（Ｏｆｆ）；３－フルオロフェニルアラニン（Ｍｆｆ）；４－フルオロフェニルアラニン（Ｐｆｆ）；２－ブロモフェニルアラニン（Ｏｂｆ）；３－ブロモフェニルアラニン（Ｍｂｆ）；４－ブロモフェニルアラニン（Ｐｂｆ）；２－メチルフェニルアラニン（Ｏｍｆ）；３－メチルフェニルアラニン（Ｍｍｆ）；４－メチルフェニルアラニン（Ｐｍｆ）；２－ニトロフェニルアラニン（Ｏｎｆ）；３－ニトロフェニルアラニン（Ｍｎｆ）；４－ニトロフェニルアラニン（Ｐｎｆ）；２－シアノフェニルアラニン（Ｏｃｆ）；３－シアノフェニルアラニン（Ｍｃｆ）；４－シアノフェニルアラニン（Ｐｃｆ）；２－トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｏｔｆ）；３－トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｍｔｆ）；４－トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｐｔｆ）；４－アミノフェニルアラニン（Ｐａｆ）；４－ヨードフェニルアラニン（Ｐｉｆ）；４－アミノメチルフェニルアラニン（Ｐａｍｆ）；２，４－ジクロロフェニルアラニン（Ｏｐｅｆ）；３，４－ジクロロフェニルアラニン（Ｍｐｃｆ）；２，４－ジフルオロフェニルアラニン（Ｏｐｆｆ）；３，４－ジフルオロフェニルアラニン（Ｍｐｆｆ）；ピリド－２－イルアラニン（２ｐＡｌａ）；ピリド－３－イルアラニン（３ｐＡｌａ）；ピリド－４－イルアラニン（４ｐＡｌａ）；ナフト－１－イルアラニン（１ｎＡｌａ）；ナフト－２－イルアラニン（２ｎＡｌａ）；チアゾリルアラニン（ｔａＡｌａ）；ベンゾチエニルアラニン（ｂＡｌａ）；チエニルアラニン（ｔＡｌａ）；フリルアラニン（ｆＡｌａ）；ホモフェニルアラニン（ｈＰｈｅ）；ホモチロシン（ｈＴｙｒ）；ホモトリプトファン（ｈＴｒｐ）；ペンタフルオロフェニルアラニン（５ｆｆ）；スチリルアラニン（ｓＡｌａ）；アウトリルアラニン（ａｕｔｈｒｙｌａｌａｎｉｎｅ）（ａＡｌａ）；３，３－ジフェニルアラニン（Ｄｆａ）；３－アミノ－５－フェニルペンタン酸（Ａｆｐ）；ペニシラミン（Ｐｅｎ）；１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－３－カルボン酸（Ｔｉｃ）；β－２－チエニルアラニン（Ｔｈｉ）；メチオニンスルホキシド（Ｍｓｏ）；Ｎ（ｗ）－ニトロアルギニン（ｎＡｒｇ）；ホモリジン（ｈＬｙｓ）；ホスホノメチルフェニルアラニン（ｐｍＰｈｅ）；ホスホセリン（ｐＳｅｒ）；ホスホトレオニン（ｐＴｈｒ）；ホモアスパラギン酸（ｈＡｓｐ）；ホモグルタミン酸（ｈＧｌｕ）；１－アミノシクロペンタ－（２または３）－エン－４カルボン酸；ピペコリン酸（ＰＡ）、アゼチジン－３－カルボン酸（ＡＣＡ）；１－アミノシクロペンタン－３－カルボン酸；アリルグリシン（ａＯｌｙ）；プロパルギルグリシン（ｐｇＧｌｙ）；ホモアラニン（ｈＡｌａ）；ノルバリン（ｎＶａｌ）；ホモロイシン（ｈＬｅｕ）、ホモバリン（ｈＶａｌ）；ホモイソロイシン（ｈＩｌｅ）；ホモアルギニン（ｈＡｒｇ）；Ｎ－アセチルリジン（ＡｃＬｙｓ）；２，４－ジアミノ酪酸（Ｄｂｕ）；２，３－ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）；Ｎ－メチルバリン（ＭｅＶａｌ）；ホモシステイン（ｈＣｙｓ）；ホモセリン（ｈＳｅｒ）；ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）およびホモプロリン（ｈＰｒｏ）が挙げられる。本明細書に記載されるポリペプチドが構成され得るさらなる非コードアミノ酸は、当業者には明らかである（例えば、Ｆａｓｍａｎ，１９８９，ＣＲＣ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，ａｔ ｐｐ．３－７０およびそれらの中で引用されている参考文献（これらはすべて、参照により組み込まれる）に提供されている様々なアミノ酸を参照のこと）。これらのアミノ酸は、Ｌ－またはＤ－配置のいずれかであり得る。
当業者は、側鎖保護基を有するアミノ酸または残基もまた、本明細書に記載されるポリペプチドを含み得ることを認識する。このような保護アミノ酸（この場合、これは芳香族のカテゴリーに属する）の非限定的な例としては、限定されないが、Ａｒｇ（ｔｏｓ）、Ｃｙｓ（メチルベンジル）、Ｃｙｓ（ニトロピリジンスルフェニル）、Ｇｌｕ（δ－ベンジルエステル）、Ｇｌｎ（キサンチル）、Ａｓｎ（Ｎ－δ－キサンチル）、Ｈｉｓ（ｂｏｍ）、Ｈｉｓ（ベンジル）、Ｈｉｓ（ｔｏｓ）、Ｌｙｓ（ｆｍｏｃ）、Ｌｙｓ（ｔｏｓ）、Ｓｅｒ（Ｏ－ベンジル）、Ｔｈｒ（Ｏ－ベンジル）およびＴｙｒ（Ｏ－ベンジル）が挙げられる（保護基は括弧内に掲載されている）。
本明細書に記載されるポリペプチドが構成され得る立体構造的に拘束された非コードアミノ酸としては、限定されないが、Ｎ－メチルアミノ酸（Ｌ－配置）；１－アミノシクロペンタ－（２または３）－エン－４－カルボン酸；ピペコリン酸；アゼチジン－３－カルボン酸；ホモプロリン（ｈＰｒｏ）；および１－アミノシクロペンタン－３－カルボン酸が挙げられる。
いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドは、固体支持体、例えば膜、樹脂、固体担体または他の固相材料上に提供され得る。固体支持体は、有機ポリマー（例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシおよびポリアクリルアミド）ならびにそのコポリマーおよびグラフトから構成され得る。固体支持体はまた、無機物、例えばガラス、シリカ、制御細孔ガラス（ＣＰＧ）、逆相シリカまたは金属、例えば金または白金であり得る。固体支持体の形状は、ビーズ、球、粒子、顆粒、ゲル、膜または表面の形態であり得る。表面は、平面、実質的に平面または非平面であり得る。固体支持体は多孔性または非多孔性であり得、膨潤または非膨潤特徴を有し得る。固体支持体は、ウェル、くぼみまたは他の容器、器、特徴もしくは場所の形態で形成され得る。
いくつかの実施形態では、トランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、それらが配列番号２の参照ポリペプチドと比べてそれらの改善された活性、エナンチオ選択性、立体選択性および／または他の改善された特性を保持するように、固体支持体に結合または固定される。このような実施形態では、固定されたポリペプチドは、式（Ｉ）の対応するアミン生成物化合物または化合物（１）への式（ＩＩ）の基質化合物または化合物（２）の生体触媒変換を促進し得、反応完了後に（例えば、ポリペプチドが固定されたビーズを保持することにより）容易に保持され、次いでその後の反応で再使用または再循環される。このような固定化酵素プロセスは、さらなる効率およびコスト削減を可能にする。したがって、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを使用する方法はいずれも、固体支持体に結合または固定された同じトランスアミナーゼポリペプチドを使用して行われ得ることがさらに企図される。
操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、非共有結合的または共有結合的に結合され得る。固体支持体（例えば、樹脂、膜、ビーズ、ガラスなど）への酵素のコンジュゲーションおよび固定のための様々な方法は当技術分野で周知である。特に、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１２／１７７５２７Ａ１号は、化合物（２）を化合物（１）に変換することができる操作されたトランスアミナーゼポリペプチド（配列番号２の参照ポリペプチドを含む）を固定し、かつ固定されたポリペプチドを調製する方法であって、前記ポリペプチドが疎水性相互作用または共有結合のいずれかにより樹脂に物理的に結合され、少なくとも最大１００％の有機溶媒を含む溶媒系で安定である、方法。固体支持体（例えば、樹脂、膜、ビーズ、ガラスなど）への酵素のコンジュゲーションおよび固定のための他の方法は当技術分野で周知であり、例えば、Ｙｉら、“Ｃｏｖａｌｅｎｔ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ω－ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ ＪＳ１７ ｏｎ ｃｈｉｔｏｓａｎ ｂｅａｄｓ，”Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２（５）：８９５－８９８（Ｍａｙ ２００７）；Ｍａｒｔｉｎら、“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｒｅｅ ａｎｄ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ（Ｓ）－ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｆｏｒ ａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７６（４）：８４３－８５１（Ｓｅｐｔ．２００７）；Ｋｏｓｚｅｌｅｗｓｋｉら、“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ω－ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅｓ ｂｙ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｓｏｌ－ｇｅｌ／ｃｅｌｉｔｅ ｍａｔｒｉｘ，” Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ，６３：３９－４４（Ａｐｒ．２０１０）；Ｔｒｕｐｐｏら、“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ＣＡＬ－Ｂ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｋｅｙ Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｔｏ Ｏｄａｎａｃａｔｉｂ，”Ｏｒｇａｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ：ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ｏｐ２００１５７ｃ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（２００８）；Ｍａｔｅｏら、“Ｅｐｏｘｙ ｓｅｐａｂｅａｄｓ：ａ ｎｏｖｅｌ ｅｐｏｘｙ ｓｕｐｐｏｒｔ ｆｏｒ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｅｎｚｙｍｅｓ ｖｉａ ｖｅｒｙ ｉｎｔｅｎｓｅ ｍｕｌｔｉｐｏｉｎｔ ｃｏｖａｌｅｎｔ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ，”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ １８（３）：６２９－３４（２００２）；およびＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃ．Ｍ．Ｎｉｅｍｅｙｅｒ ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２００４）（これらの開示はそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを固定するために有用な固体支持体としては、限定されないが、エポキシド官能基を有するポリメタクリレート、アミノエポキシド官能基を有するポリメタクリレート、オクタデシル官能基を有するスチレン／ＤＶＢコポリマーまたはポリメタクリレートを含むビーズまたは樹脂が挙げられる。本開示の操作されたトランスアミナーゼを固定するために有用な例示的な固体支持体としては、限定されないが、キトサンビーズ、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ ＣおよびＳＥＰＡＢＥＡＤ（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ）（以下の異なるタイプのＳＥＰＡＢＥＡＤ：ＥＣ－ＥＰ、ＥＣ－ＨＦＡ／Ｓ、ＥＸＡ２５２、ＥＸＥ１１９およびＥＸＥ１２０を含む）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、ポリペプチドが位置的に異なる場所に配置されたアレイの形態で提供され得る。いくつかの実施形態では、位置的に異なる場所は、９６ウェルプレートなどの固体支持体におけるウェルである。複数の支持体は、試薬のロボット送達のために、または検出方法および／もしくは機器により処理可能な様々な場所でアレイ上に構成され得る。このようなアレイは、ポリペプチドによる変換について様々な基質化合物を試験するために使用され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作されたポリペプチドは、キットの形態で提供され得る。キット中のポリペプチドは個々に存在し得るか、または複数のポリペプチドとして存在し得る。キットは、酵素反応を行うための試薬と、ポリペプチドの活性を評価するための基質と、生成物を検出するための試薬とをさらに含み得る。キットはまた、試薬ディスペンサーと、キットの使用のための指示とを含み得る。いくつかの実施形態では、本開示のキットは、異なる処理可能な位置において複数の異なる操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを含むアレイを含み、異なるポリペプチドは、それぞれが少なくとも１つの異なる改善された酵素特性を有する参照配列の異なるバリアントである。複数の操作されたポリペプチドを含む上記アレイおよびそれらの使用方法は公知である（例えば、国際公開第２００９／００８９０８Ａ２号を参照のこと）。
操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを調製するために有用なポリヌクレオチド、制御配列、発現ベクターおよび宿主細胞
別の実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるトランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドを、遺伝子発現を制御する１つまたはそれを超える異種調節配列に作動可能に連結して、ポリペプチドを発現することができる組換えポリヌクレオチドを作り得る。操作されたトランスアミナーゼをコードする異種ポリヌクレオチドを含む発現構築物を適切な宿主細胞に導入して、対応する操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを発現させ得る。
当業者には明らかなように、タンパク質配列のアベイラビリティおよび様々なアミノ酸に対応するコドンの知識は、対象のタンパク質配列をコードすることができるすべてのポリヌクレオチドの説明を提供する。同じアミノ酸が代替コドンまたは同義コドンによりコードされる遺伝暗号の縮重は、極めて多数の核酸の作製を可能にし、これらはすべて、本明細書に開示される改善されたトランスアミナーゼ酵素をコードする。したがって、特定のアミノ酸配列が同定されていれば、当業者は、タンパク質のアミノ酸配列を変化させない方法で１つまたはそれを超えるコドンの配列を単に改変することにより、任意の数の異なる核酸を作製し得る。これに関して、本開示は、可能なコドン選択に基づいて組み合わせを選択することにより作製され得るポリヌクレオチドのあらゆる可能な各バリエーションを具体的に企図し、このようなバリエーションはすべて、表１、２、３、４、５、６、７および８に提供されており、配列番号４～８４６の偶数番号配列識別子の配列として参照により本明細書に組み込まれる配列表に開示されている例示的な操作されたポリペプチドのアミノ酸配列を含む本明細書に開示される任意のポリペプチドについて具体的に開示されていると考えられるべきものである。
様々な実施形態では、コドンは、好ましくは、タンパク質が産生されている宿主細胞に適合するように選択される。例えば、細菌において使用される好ましいコドンは、細菌において遺伝子を発現させるために使用され；酵母において使用される好ましいコドンは、酵母における発現のために使用され；哺乳動物において使用される好ましいコドンは、哺乳動物細胞における発現のために使用される。いくつかの実施形態では、天然配列は好ましいコドンを含み得るので、および好ましいコドンの使用は、すべてのアミノ酸残基に必要ではない場合があるので、トランスアミナーゼのコドン使用頻度を最適化するためにすべてのコドンを置き換える必要はない。その結果として、トランスアミナーゼ酵素をコードするコドン最適化されたポリヌクレオチドは、全長コード領域のコドン位置の約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％超において好ましいコドンを含み得る。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４～８４６の偶数番号配列識別子から選択される参照配列と少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えて同一のアミノ酸配列を含むトランスアミナーゼポリペプチドをコードし、ポリペプチドは、トランスアミナーゼ活性および１つまたはそれを超える本明細書に記載される改善された特性、例えば配列番号２のポリペプチドと比較して増加した活性で化合物（２）を生成物化合物（１）に変換する能力を有する。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号６、３３２、５１８および６５６から選択される。
いくつかの実施形態では、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号３～８４５の奇数番号配列識別子から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号５、３３１、５１７および６５５から選択される。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、高ストリンジェントな条件下で、本明細書で提供される任意のポリヌクレオチド配列もしくはその相補体、または本明細書で提供されるバリアント酵素ポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチド配列から選択される参照ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができる。いくつかの実施形態では、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、参照配列と比較して１つまたはそれを超える残基差異を有するアミノ酸配列を含む酵素ポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるポリペプチドをコードするが、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドをコードする参照ポリヌクレオチドとヌクレオチドレベルで約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％またはそれを超える配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、参照ポリヌクレオチド配列は、配列番号３～８４５の奇数番号配列識別子を有する配列から選択される。
いくつかの実施形態では、本明細書の操作された酵素ポリペプチドのいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチドは、酵素ポリペプチドの発現を容易にするための様々な方法で操作される。いくつかの実施形態では、酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、酵素ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を調節するために１つまたはそれを超える制御配列が存在する発現ベクターを含む。利用される発現ベクターに応じて、ベクターへのその挿入前の単離されたポリヌクレオチドの操作が望ましいかまたは必要な場合がある。組換えＤＮＡ法を利用してポリヌクレオチドおよび核酸配列を改変するための技術は、当技術分野で周知である。いくつかの実施形態では、制御配列としては、とりわけ、プロモーター、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、シグナルペプチド配列および転写ターミネーターが挙げられる。いくつかの実施形態では、適切なプロモーターは、宿主細胞選択に基づいて選択される。細菌宿主細胞の場合、本開示の核酸構築物の転写を誘導するために適切なプロモーターとしては、限定されないが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｌａｃオペロン、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのアガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓのレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのアルファ－アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのマルトース生成アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓのアルファ－アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓのｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子、ならびに原核生物のベータ－ラクタマーゼ遺伝子（例えば、Ｖｉｌｌａ－Ｋａｍａｒｏｆｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：３７２７－３７３１［１９７８］）から得られるプロモーター、ならびにｔａｃプロモーター（例えば、ＤｅＢｏｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２１－２５［１９８３］）が挙げられる。糸状菌宿主細胞のための例示的なプロモーターとしては、限定されないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのＴＡＫＡアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉのアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒの中性アルファ－アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒの酸安定性アルファ－アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉのグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉのリパーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのアルカリプロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのトリオースホスフェートイソメラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓのアセトアミダーゼおよびＦｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍのトリプシン様プロテアーゼ（例えば、国際公開第９６／００７８７号を参照のこと）の遺伝子から得られるプロモーター、ならびにＮＡ２－ｔｐｉプロモーター（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒの中性アルファ－アミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのトリオースホスフェートイソメラーゼの遺伝子由来のプロモーターのハイブリッド）、ならびにそれらの変異体プロモーター、切断型プロモーターおよびハイブリッドプロモーターが挙げられる。例示的な酵母細胞プロモーターは、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のエノラーゼ（ＥＮＯ－１）、出芽酵母のガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、出芽酵母のアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド－３－リン酸脱水素酵素（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）および出芽酵母の３－ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子に由来し得る。酵母宿主細胞のための他の有用なプロモーターは当技術分野で公知である（例えば、Ｒｏｍａｎｏｓら、Ｙｅａｓｔ ８：４２３－４８８［１９９２］を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、制御配列はまた、適切な転写ターミネーター配列（すなわち、転写を終結するための、宿主細胞により認識される配列）である。いくつかの実施形態では、ターミネーター配列は、酵素ポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端に作動可能に連結される。選択した宿主細胞において機能的な任意の適切なターミネーターが本発明において使用される。糸状菌宿主細胞のための例示的な転写ターミネーターは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒのグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓのアントラニル酸シンターゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒのアルファ－グルコシダーゼおよびＦｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍのトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られ得る。酵母宿主細胞のための例示的なターミネーターは、出芽酵母のエノラーゼ、出芽酵母のシトクロムＣ（ＣＹＣ１）および出芽酵母のグリセルアルデヒド－３－リン酸脱水素酵素の遺伝子から得られ得る。酵母宿主細胞のための他の有用なターミネーターは当技術分野で公知である（例えば、Ｒｏｍａｎｏｓら、前掲を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、制御配列はまた、適切なリーダー配列（すなわち、宿主細胞による翻訳に重要なｍＲＮＡの非翻訳領域）である。いくつかの実施形態では、リーダー配列は、酵素ポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端に作動可能に連結される。選択した宿主細胞において機能的な任意の適切なリーダー配列が本発明において使用される。糸状菌宿主細胞のための例示的なリーダー配列は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのＴＡＫＡアミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓのトリオースホスフェートイソメラーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための適切なリーダーは、出芽酵母のエノラーゼ（ＥＮＯ－１）、出芽酵母の３－ホスホグリセリン酸キナーゼ、出芽酵母のアルファ－因子および出芽酵母のアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド－３－リン酸脱水素酵素（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から得られる。
いくつかの実施形態では、制御配列はまた、ポリアデニル化配列（すなわち、核酸配列の３’末端に作動可能に連結された配列であり、転写されると、ポリアデノシン残基を転写ｍＲＮＡに付加するシグナルとして宿主細胞により認識される配列）である。選択した宿主細胞において機能的な任意の適切なポリアデニル化配列が本発明において使用される。糸状菌宿主細胞のための例示的なポリアデニル化配列としては、限定されないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒのグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓのアントラニル酸シンターゼ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍのトリプシン様プロテアーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒのアルファ－グルコシダーゼの遺伝子が挙げられる。酵母宿主細胞のための有用なポリアデニル化配列は当技術分野で公知である（例えば、Ｇｕｏ ａｎｄ Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．，１５：５９８３－５９９０［１９９５］を参照のこと）。例示的な哺乳動物ポリアデニル化配列は、Ｚｈａｎｇら、２００５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３：Ｄ１１６－Ｄ１２０に見出され得る。
いくつかの実施形態では、制御配列はまた、シグナルペプチド（すなわち、ポリペプチドのアミノ末端に連結されたアミノ酸配列をコードし、コードされたポリペプチドを細胞の分泌経路に誘導するコード領域）である。いくつかの実施形態では、核酸配列のコード配列の５’末端は、分泌されるポリペプチドをコードするコード領域のセグメントと翻訳リーディングフレームで天然に連結されたシグナルペプチドコード領域を本質的に含有し得る。あるいは、いくつかの実施形態では、コード配列の５’末端は、コード配列に対して外来のシグナルペプチドコード領域を含有する。発現されたポリペプチドを選択した宿主細胞の分泌経路に誘導する任意の適切なシグナルペプチドコード領域が、操作されたポリペプチドの発現に使用される。細菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード領域としては、限定されないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ＮＣｌＢ１１８３７のマルトース生成アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのアルファ－アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのサブチリシン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのベータ－ラクタマーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓのｐｒｓＡの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域が挙げられる。さらなるシグナルペプチドは当技術分野で公知である（例えば、Ｓｉｍｏｎｅｎ ａｎｄ Ｐａｌｖａ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，５７：１０９－１３７［１９９３］を参照のこと）。いくつかの実施形態では、糸状菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード領域としては、限定されないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒの中性アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒのグルコアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉのアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓのセルラーゼおよびＨｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａのリパーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域が挙げられる。酵母宿主細胞のための有用なシグナルペプチドとしては、限定されないが、出芽酵母のアルファ－因子および出芽酵母のインベルターゼの遺伝子に由来するものが挙げられる。
いくつかの実施形態では、制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端に配置されたアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード領域である。得られるポリペプチドは、「プロ酵素」、「プロポリペプチド」または「チモーゲン」と称される。プロポリペプチドは、プロポリペプチド由来のプロペプチドの触媒的切断または自己触媒的切断により、成熟活性ポリペプチドに変換され得る。プロペプチドコード領域は、限定されないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓのアルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓの中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、出芽酵母のアルファ－因子、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉのアスパラギン酸プロテイナーゼおよびＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａのラクターゼ（例えば、国際公開第９５／３３８３６号を参照のこと）の遺伝子を含む任意の適切な供給源から得られ得る。シグナルペプチド領域およびプロペプチド領域の両方がポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、プロペプチド領域はポリペプチドのアミノ末端の隣に配置され、シグナルペプチド領域はプロペプチド領域のアミノ末端の隣に配置される。いくつかの実施形態では、調節配列も利用される。これらの配列は、宿主細胞の成長に関連してポリペプチドの発現の調節を容易にする。調節系の例は、調節化合物の存在を含む化学的刺激または物理的刺激に応答して遺伝子の発現のオンまたはオフを引き起こすものである。原核生物宿主細胞では、適切な調節配列としては、限定されないが、ｌａｃ、ｔａｃおよびｔｒｐオペレーター系が挙げられる。酵母宿主細胞では、適切な調節系としては、限定されないが、ＡＤＨ２系またはＧＡＬ１系が挙げられる。糸状菌では、適切な調節配列としては、限定されないが、ＴＡＫＡアルファ－アミラーゼプロモーター、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒのグルコアミラーゼプロモーターおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのグルコアミラーゼプロモーターが挙げられる。
別の態様では、本発明は、操作された酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、それらが導入される宿主タイプに応じた１つまたはそれを超える発現調節領域、例えばプロモーターおよびターミネーター、複製起点などとを含む組換え発現ベクターを対象とする。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される様々な核酸配列および制御配列を一緒に結合して、好都合な制限部位における酵素ポリペプチドをコードする核酸配列の挿入または置換を可能にする１つまたはそれを超えるこのような部位を含む組換え発現ベクターを生成する。あるいは、いくつかの実施形態では、本発明の核酸配列は、核酸配列または配列を含む核酸構築物を発現のための適切なベクターに挿入することにより発現される。発現ベクターの作製を伴ういくつかの実施形態では、コード配列が、発現のための適切な制御配列と作動可能に連結されるように、コード配列はベクター中に配置される。
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ手順に好都合に供され得る任意の好適なベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であり得、酵素ポリヌクレオチド配列の発現をもたらし得る。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入される宿主細胞とベクターの適合性に依存する。ベクターは、線状または閉環状プラスミドであり得る。
いくつかの実施形態では、発現ベクターは、自己複製ベクター（すなわち、染色体外実体として存在するベクターであって、その複製が染色体複製と独立したベクター、例えばプラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体または人工染色体）である。ベクターは、自己複製を保証するための任意の手段を含有し得る。いくつかの代替的な実施形態では、ベクターは、宿主細胞に導入されるとゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであり得る。さらに、いくつかの実施形態では、単一のベクターもしくはプラスミドまたは２つもしくはそれを超えるベクターもしくはプラスミド（これらは、宿主細胞のゲノムに導入すべき全ＤＮＡおよび／またはトランスポゾンを一緒に含有する）が利用される。
いくつかの実施形態では、発現ベクターは、形質転換細胞の容易な選択を可能にする１つまたはそれを超える選択マーカーを含有する。「選択マーカー」は、その産物が、殺生物剤抵抗性またはウイルス抵抗性、重金属に対する抵抗性、栄養素要求株に対する原栄養性などを提供する遺伝子である。細菌選択マーカーの例としては、限定されないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓもしくはＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のｄａｌ遺伝子または抗生物質抵抗性（例えば、アンピシリン抵抗性、カナマイシン抵抗性、クロラムフェニコール抵抗性またはテトラサイクリン抵抗性）を付与するマーカーが挙げられる。酵母宿主細胞のための適切なマーカーとしては、限定されないが、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１およびＵＲＡ３が挙げられる。糸状菌宿主細胞において使用するための選択マーカーとしては、限定されないが、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ；例えば、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓまたはＡ．ｏｒｚｙａｅ由来）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ；例えば、Ｓ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ由来）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン－５’－リン酸デカルボキシラーゼ；例えば、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓまたはＡ．ｏｒｚｙａｅ由来）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ（ｓｕｌｆａｔｅ ａｄｅｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ））およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ならびにそれらの等価物が挙げられる。
本開示の発現ベクターはまた、宿主細胞ゲノムへのベクターの組み込みまたはゲノムと独立した細胞におけるベクターの自律複製を可能にするエレメント（複数可）を含み得る。宿主細胞ゲノムへの組み込みのために、ベクターは、ポリペプチドをコードする核酸配列、または相同もしくは非相同組換えによるゲノムへのベクター組み込みのためのベクターの任意の他のエレメントに依拠し得る。
あるいは、発現ベクターは、宿主細胞のゲノムへの相同組換えによる組み込みを誘導するためのさらなる核酸配列を含有し得る。さらなる核酸配列は、染色体中の正確な場所における宿主細胞ゲノムへのベクターの組み込みを可能にする。正確な場所への組み込みの尤度を増加させるために、組み込みエレメントは、好ましくは、相同組換えの確率を高めるための対応する標的配列と高度に相同な十分な数、例えば１００～１００００塩基対、好ましくは４００～１００００塩基対、最も好ましくは８００～１００００塩基対の核酸を含むべきである。組み込みエレメントは、宿主細胞のゲノムにおける標的配列と相同な任意の配列であり得る。さらに、組み込みエレメントは、非コード核酸配列またはコード核酸配列であり得る。他方、ベクターは、非相同組換えにより宿主細胞のゲノムに組み込まれ得る。
自律複製のために、ベクターは、問題の宿主細胞においてベクターを自律複製させ得る複製起点をさらに含み得る。細菌複製起点の例は、Ｐ１５Ａ ｏｒｉまたはプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣｌ７７（このプラスミドはＰ１５Ａ ｏｒｉを有する）または大腸菌における複製を可能にするｐＡＣＹＣ１８４、およびＢａｃｉｌｌｕｓにおける複製を可能にするｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＴＡ１０６０またはｐＡＭβ１の複製起点である。酵母宿主細胞において使用するための複製起点の例は、２ミクロン複製起点、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１とＣＥＮ３の組み合わせ、およびＡＲＳ４とＣＥＮ６の組み合わせである。複製起点は、宿主細胞において温度感受性の様式でそれを機能させる変異を有するものであり得る（例えば、Ｅｈｒｌｉｃｈ，１９７８，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１４３３を参照のこと）。
遺伝子産物の産生を増加させるために、１コピーを超える本開示の核酸配列が宿主細胞に挿入され得る。核酸配列のコピー数の増加は、少なくとも１つのさらなるコピーの配列を宿主細胞ゲノムへ組み込むことにより、または核酸配列と共に増幅可能な選択マーカー遺伝子を含ませることにより達成され得、選択マーカー遺伝子の増幅されたコピーおよびそれによる核酸配列のさらなるコピーを含有する細胞は、適切な選択剤の存在下で細胞を培養することにより選択され得る。
本開示の実施形態で有用な多くの発現ベクターは市販されている。適切な商業的発現ベクターとしては、哺乳類宿主細胞における発現のためのＣＭＶプロモーターおよびｈＧＨポリアデニル化部位と、大腸菌における増幅のためのｐＢＲ３２２複製起点およびアンピシリン抵抗性マーカーとを含むＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓからのｐ３ｘＦＬＡＧＴＭ（商標）発現ベクターが挙げられる。他の適切な発現ベクターは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ ＣＡから市販されているｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（－）およびｐＢＫ－ＣＭＶおよびｐＢＲ３２２（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、ｐＵＣ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはｐＰｏｌｙから誘導されるプラスミドである（Ｌａｔｈｅら、１９８７，Ｇｅｎｅ ５７：１９３－２０１）。
例示的な発現ベクターは、改善されたトランスアミナーゼをコードするポリヌクレオチドを、ｌａｃＩレプレッサーの制御下のｌａｃプロモーターを含有するプラスミドｐＣＫ１１０９００Ｉに作動可能に連結することにより調製され得る。発現ベクターはまた、Ｐ１５ａ複製起点およびクロラムフェニコール抵抗性遺伝子を含有する。
別の実施形態では、本開示は、本開示の改善されたトランスアミナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞であって、前記ポリヌクレオチドが、前記宿主細胞におけるトランスアミナーゼ酵素発現のための１つまたはそれを超える制御配列に作動可能に連結された宿主細胞を提供する。本開示の発現ベクターによりコードされるポリペプチドの発現において使用するための宿主細胞は当技術分野で周知であり、限定されないが、細菌細胞（例えば、大腸菌、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＫＮＫ１６８、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの細胞）；真菌細胞、例えば、酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（出芽酵母）またはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＡＴＣＣ受託番号２０１１７８））；昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、２９３およびＢｏｗｅｓメラノーマ細胞）；および植物細胞が挙げられる。例示的な宿主細胞は、大腸菌Ｗ３１１０（ΔｆｈｕＡ）である。上記宿主細胞に適切な培養培地および成長条件は当技術分野で周知である。
トランスアミナーゼの発現のためのポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の様々な方法により細胞に導入され得る。技術としては、とりわけ、エレクトロポレーション、パーティクルガン法、リポソーム媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクションおよびプロトプラスト融合が挙げられる。ポリヌクレオチドを細胞に導入するための様々な方法は当業者には明らかである。
操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを生成する方法
いくつかの実施形態では、本開示の改善された操作されたポリヌクレオチドおよび操作されたポリペプチドを作製するために、アミノ基転移反応を触媒する天然に存在するトランスアミナーゼ酵素はＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＫＮＫ１６８から得られるものである（由来する）。いくつかの実施形態では、親ポリヌクレオチド配列は、指定の宿主細胞におけるトランスアミナーゼの発現を増強するようにコドン最適化される。Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＫＮＫ１６８の野生型ポリペプチドをコードする親ポリヌクレオチド配列が記載されている（例えば、Ｉｗａｓａｋｉら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００６，６９：４９９－５０５を参照のこと）。この親配列に基づく操作されたトランスアミナーゼの調製もまた、米国特許出願公開第２０１０／０２８５５４１Ａ１号および公開された国際出願ＷＯ２０１０／０９９５０１号に記載されている。
操作されたトランスアミナーゼは、当技術分野で公知の任意の適切な方法を使用して産生され得る。目的の野生型ポリペプチドをコードする遺伝子は、プラスミドなどのベクターにクローニングされ、大腸菌などの所望の宿主において発現され得る。組換えポリペプチドのバリアントは、当技術分野で公知の様々な方法により生成され得る。実際、当業者に周知の多種多様な異なる変異誘発技術がある。加えて、変異誘発キットもまた、多くの商業的分子生物学供給業者からも入手可能である。規定のアミノ酸における特異的置換（部位特異的）、遺伝子の局所領域における特異的もしくはランダム変異（位置特異的）、または遺伝子全体にわたるランダム変異誘発（例えば、飽和変異誘発）を行うための方法が利用可能である。限定されないが、ＰＣＲ、カセット変異誘発、遺伝子合成、エラープローンＰＣＲ、シャッフリングおよび化学飽和変異誘発または当技術分野で公知の任意の他の適切な方法を使用した一本鎖ＤＮＡもしくは二本鎖ＤＮＡの部位特異的変異誘発を含む、酵素バリアントを生成するための多数の適切な方法が当業者に公知である。変異誘発および定向進化法を酵素コードポリヌクレオチドに容易に適用して、バリアントライブラリーを生成し得、これを発現させ、スクリーニングし、アッセイし得る。任意の適切な変異誘発および定向進化法が本発明において使用され、当技術分野で周知である（例えば、米国特許５，６０５，７９３、５，８１１，２３８、５，８３０，７２１、５，８３４，２５２、５，８３７，４５８、５，９２８，９０５、６，０９６，５４８、６，１１７，６７９、６，１３２，９７０、６，１６５，７９３、６，１８０，４０６、６，２５１，６７４、６，２６５，２０１、６，２７７，６３８、６，２８７，８６１、６，２８７，８６２、６，２９１，２４２、６，２９７，０５３、６，３０３，３４４、６，３０９，８８３、６，３１９，７１３、６，３１９，７１４、６，３２３，０３０、６，３２６，２０４、６，３３５，１６０、６，３３５，１９８、６，３４４，３５６、６，３５２，８５９、６，３５５，４８４、６，３５８，７４０、６，３５８，７４２、６，３６５，３７７、６，３６５，４０８、６，３６８，８６１、６，３７２，４９７、６，３３７，１８６、６，３７６，２４６、６，３７９，９６４、６，３８７，７０２、６，３９１，５５２、６，３９１，６４０、６，３９５，５４７、６，４０６，８５５、６，４０６，９１０、６，４１３，７４５、６，４１３，７７４、６，４２０，１７５、６，４２３，５４２、６，４２６，２２４、６，４３６，６７５、６，４４４，４６８、６，４５５，２５３、６，４７９，６５２、６，４８２，６４７、６，４８３，０１１、６，４８４，１０５、６，４８９，１４６、６，５００，６１７、６，５００，６３９、６，５０６，６０２、６，５０６，６０３、６，５１８，０６５、６，５１９，０６５、６，５２１，４５３、６，５２８，３１１、６，５３７，７４６、６，５７３，０９８、６，５７６，４６７、６，５７９，６７８、６，５８６，１８２、６，６０２，９８６、６，６０５，４３０、６，６１３，５１４、６，６５３，０７２、６，６８６，５１５、６，７０３，２４０、６，７１６，６３１、６，８２５，００１、６，９０２，９２２、６，９１７，８８２、６，９４６，２９６、６，９６１，６６４、６，９９５，０１７、７，０２４，３１２、７，０５８，５１５、７，１０５，２９７、７，１４８，０５４、７，２２０，５６６、７，２８８，３７５、７，３８４，３８７、７，４２１，３４７、７，４３０，４７７、７，４６２，４６９、７，５３４，５６４、７，６２０，５００、７，６２０，５０２、７，６２９，１７０、７，７０２，４６４、７，７４７，３９１、７，７４７，３９３、７，７５１，９８６、７，７７６，５９８、７，７８３，４２８、７，７９５，０３０、７，８５３，４１０、７，８６８，１３８、７，７８３，４２８、７，８７３，４７７、７，８７３，４９９、７，９０４，２４９、７，９５７，９１２、７，９８１，６１４、８，０１４，９６１、８，０２９，９８８、８，０４８，６７４、８，０５８，００１、８，０７６，１３８、８，１０８，１５０、８，１７０，８０６、８，２２４，５８０、８，３７７，６８１、８，３８３，３４６、８，４５７，９０３、８，５０４，４９８、８，５８９，０８５、８，７６２，０６６、８，７６８，８７１、９，５９３，３２６および関連USならびにPCTおよび非US対応出願； Ｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５４（２）：１５７－７８ ［１９９７］； Ｄａｌｅ ｅｔ ａｌ．、Ｍｅｔｈ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、５７：３６９－７４ ［１９９６］； Ｓｍｉｔｈ、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ．、１９：４２３－４６２ ［１９８５］； Ｂｏｔｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：１１９３－１２０１ ［１９８５］； Ｃａｒｔｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．、２３７：１－７ ［１９８６］； Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ、３８：８７９－８８７ ［１９８４］； Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅ、３４：３１５－３２３ ［１９８５］； Ｍｉｎｓｈｕｌｌ ｅｔ ａｌ．、Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．、３：２８４－２９０ ［１９９９］； Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１７：２５９－２６４ ［１９９９］； Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３９１：２８８－２９１ ［１９９８］； Ｃｒａｍｅｒｉ、ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１５：４３６－４３８ ［１９９７］； Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．、９４：４５０４－４５０９ ［１９９７］； Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１４：３１５－３１９ ［１９９６］； Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ、３７０：３８９－３９１ ［１９９４］； Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９１：１０７４７－１０７５１ ［１９９４］； ＷＯ ９５／２２６２５； ＷＯ ９７／００７８； ＷＯ ９７／３５９６６； ＷＯ ９８／２７２３０； ＷＯ ００／４２６５１； ＷＯ ０１／７５７６７；およびＷＯ ２００９／１５２３３６（これらはずべて、参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。
変異誘発処理後に得られたクローンは、所望の改善された酵素特性を有する操作されたトランスアミナーゼについてスクリーニングされ得る。発現ライブラリーからの酵素活性の測定は、標準的生化学技術、例えば生成物アミンのＯＰＡ誘導体化後のＨＰＬＣ分析などを使用して実施され得る。
例えば、所望の改善された酵素特性が熱安定性である場合、酵素調製物を規定の温度に供した後に、熱処理の後に残った酵素活性の量を測定して、酵素活性が測定され得る。次いで、トランスアミナーゼをコードするポリヌクレオチドを含有するクローンが単離され、配列決定されて、ヌクレオチド配列変化（もしあれば）が同定され、宿主細胞において酵素を発現させるために使用される。
操作されたポリペプチドの配列が公知である場合、酵素をコードするポリヌクレオチドは、公知の合成方法にしたがって、標準的な固相法により調製され得る。いくつかの実施形態では、最大約１００塩基の断片が個々に合成され、次いで、（例えば、酵素的もしくは化学的なライゲーション法（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｏｒ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｉｔｉｇａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ）またはポリメラーゼ媒介方法により）結合されて、任意の所望の連続配列が形成され得る。例えば、本開示のポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、例えば、典型的に、自動合成方法で実施されるように、例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅら、１９８１，Ｔｅｔ Ｌｅｔｔ ２２：１８５９－６９により記載されている従来のホスホルアミダイト法、またはＭａｔｔｈｅｓら、１９８４，ＥＭＢＯ Ｊ．３：８０１－０５により記載されている方法を使用して化学合成により調製され得る。ホスホルアミダイト法によれば、オリゴヌクレオチドは、例えば、自動ＤＮＡ合成装置において合成され、精製され、アニーリングされ、ライゲーションされ、適切なベクターにクローニングされる。加えて、本質的に任意の核酸が、様々な商業的供給源のいずれかから得られ得る。
いくつかの実施形態では、本開示はまた、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを調製または製造するための方法であって、ポリペプチドの発現に適切な培養条件下で、前記操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現することができる宿主細胞を培養することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドの調製のための方法は、ポリペプチドを単離することをさらに含む。操作されたポリペプチドは、（上記のように）適切な細胞において発現され、とりわけ、リゾチーム処理、音波処理、濾過、塩析、超遠心分離およびクロマトグラフィーを含むタンパク質精製に使用される周知の技術のいずれか１つまたはそれよりも多くを使用して、宿主細胞および／または培養培地から単離（または回収）され得る。ポリペプチドの単離のためのクロマトグラフィー技術としては、とりわけ、逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動およびアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。特定の操作されたポリペプチドを精製するための条件は、正味電荷、疎水性、親水性、分子量、分子形状などの因子に部分的に依存し、当業者には明らかである。単離されたポリペプチドは、精製後に凍結乾燥されなければならない。
操作されたトランスアミナーゼ酵素の使用方法およびそれにより調製された化合物
別の態様では、本明細書に開示される操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、化合物（１）の生成物または対応する構造類似体への基質化合物（２）またはその構造類似体の変換のためのプロセスにおいて使用され得る。一般に、化合物（１）の構造類似体は、構造式（Ｉ）内に包含される。
いくつかの実施形態では、本開示は、反対のエナンチオマーに対して少なくとも７０％のエナンチオマー過剰率で、＊でマークされているステレオジェン中心において示されている立体化学的配置を有する構造式（Ｉ）の化合物：
Figure 2022518212000012
 （式中、
Ｚは、１つまたはそれを超えるヒドロキシ、シアノまたはニトロ基で必要に応じて置換された直鎖Ｃ１－６アルキルまたは分枝鎖Ｃ１－６アルキルであり；ならびに
Ｒ１は、Ｃ１－６アルキル、アリール－Ｃ１－２アルキル、ヘテロアリール－Ｃ１－２アルキル、またはＯ、Ｓ、およびＮから選択されるさらなるヘテロ原子を必要に応じて含有する５～６員複素環式環系であり、前記複素環式環は置換されていないか、またはオキソ、ヒドロキシ、ハロゲン、Ｃ１－４アルコキシおよびＣ１－４アルキルから独立して選択される１～３個の置換基で置換されている）
を調製するためのプロセスであって、適切な反応条件下、適切な有機溶媒中、アミノ基供与体の存在下で、構造式（ＩＩ）のプロキラルケトエステル：
Figure 2022518212000013
 を本明細書に開示される操作されたポリペプチドと接触させる工程を含むプロセスを提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、化合物（１）：
Figure 2022518212000014
 を調製するプロセスであって、適切な反応条件下、アミノ基供与体の存在下で、化合物（２）の基質：
Figure 2022518212000015
 を本明細書に開示される操作されたポリペプチドと接触させる工程を含むプロセスを提供する。
構造式（Ｉ）の化合物を調製するためのプロセスのいくつかの実施形態では、式（ＩＩ）の化合物は化合物（２）を具体的に除外し、前記方法により調製された式（Ｉ）の化合物は化合物（１）を具体的に除外する。
本明細書に記載され実施例で例証されているように、本開示は、限定されないが、温度、湿潤有機溶媒系、基質負荷、基質化合物立体異性体の混合物、ポリペプチド負荷、補因子負荷、圧力および反応時間の範囲を含む本明細書のプロセスにおいて使用され得るある範囲の適切な反応条件を企図する。本明細書に記載される操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを使用して生成物化合物への基質化合物の生体触媒変換のためのプロセスを行うためのさらなる適切な反応条件は、限定されないが、濃度、温度、湿潤有機溶媒条件の実験反応条件下で操作されたトランスアミナーゼポリペプチドおよび基質化合物を接触させること、ならびに例えば本明細書で提供される実施例に記載されている方法を使用して生成物化合物を検出することを含むルーチンな実験により容易に最適化され得る。
上記のように、本開示のプロセスにおいて使用されるトランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、一般に、配列番号４～８４６の偶数番号配列のいずれか１つから選択される参照アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ａ）を有するアミノ酸配列を含む操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、配列番号２と比較して１つまたはそれを超えるアミノ酸残基差異を有する。いくつかの実施形態では、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、上記同一性率および配列番号２と比較して１つまたはそれを超える残基差異を有するトランスアミナーゼポリペプチドをコードする。
反応混合物中の基質化合物は、例えば、生成物化合物の所望の量、酵素活性に対する基質濃度の効果、反応条件下における酵素の安定性、および生成物への基質の変換率を考慮して変動し得る。前記方法のいくつかの実施形態では、適切な反応条件は、少なくとも約０．５～約２００ｇ／Ｌ、１～約２００ｇ／Ｌ、５～約１５０ｇ／Ｌ、約１０～約１００ｇ／Ｌまたは約５０～約１００ｇ／Ｌの基質化合物負荷を含む。いくつかの実施形態では、適切な反応条件は、少なくとも約０．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１ｇ／Ｌ、少なくとも約５ｇ／Ｌ、少なくとも約１０ｇ／Ｌ、少なくとも約１５ｇ／Ｌ、少なくとも約２０ｇ／Ｌ、少なくとも約３０ｇ／Ｌ、少なくとも約５０ｇ／Ｌ、少なくとも約７５ｇ／Ｌ、少なくとも約１００ｇ／Ｌ、少なくとも約１５０ｇ／Ｌもしくは少なくとも約２００ｇ／Ｌまたはさらにそれを超える基質化合物負荷を含む。本明細書で提供される基質負荷の値は化合物（２）の分子量に基づくが、しかしながら、等モル量の化合物（２）の様々な水和物および塩も前記プロセスにおいて使用され得ることも企図される。加えて、式（ＩＩ）によりカバーされる基質化合物もまた、化合物（２）について使用される量を考慮して、適切な量で使用され得る。
本明細書に記載されるプロセスでは、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、生成物化合物を形成するためにアミノ供与体を使用する。いくつかの実施形態では、反応条件におけるアミノ供与体は、ＩＰＭ、プトレシン、Ｌ－リジン、α－フェネチルアミン、Ｄ－アラニン、Ｌ－アラニン、Ｄ，Ｌ－アラニン、Ｄ，Ｌ－オルニチン、３－アミノ酪酸またはメチルベンジルアミンから選択される化合物を含む。いくつかの実施形態では、アミノ供与体は、イソプロピルアミン、アラニン、３－アミノ酪酸、またはメチルベンジルアミンからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、アミノ供与体はＩＰＭである。いくつかの実施形態では、適切な反応条件は、少なくとも約０．１～約３．０Ｍ、０．２～約２．５Ｍ、約０．５～約２Ｍまたは約１～約２Ｍの濃度で存在するアミノ供与体、特にＩＰＭを含む。いくつかの実施形態では、アミノ供与体は、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、１、１．５、２、２．５または３Ｍの濃度で存在する。
前記プロセスのための適切な反応条件はまた、典型的には補因子の存在を含む。操作されたトランスアミナーゼは、典型的には、ビタミンＢ６ファミリーのメンバーを使用するので、反応条件は、ピリドキサール－５’－リン酸（ピリドキサール－リン酸、ＰＬＰ、Ｐ５Ｐとしても公知）、ピリドキシン（ＰＮ）、ピリドキサール（ＰＬ）、ピリドキサミン（ＰＭ）、ならびにそれらのリン酸化されたカウンターパート；ピリドキシンリン酸（ＰＮＰ）およびピリドキサミンリン酸（ＰＭＰ）から選択される補因子を含み得る。いくつかの実施形態では、適切な反応条件は、約０．１ｇ／Ｌ～約１０ｇ／Ｌ、約０．２ｇ／Ｌ～約５ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ～約２．５ｇ／Ｌの濃度のＰＬＰ、ＰＮ、ＰＬ、ＰＭ、ＰＮＰおよびＰＭＰから選択される補因子の存在を含み得る。いくつかの実施形態では、補因子はＰＬＰである。したがって、いくつかの実施形態では、適切な反応条件は、約０．１ｇ／Ｌ～約１０ｇ／Ｌ、約０．２ｇ／Ｌ～約５ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ～約２．５ｇ／Ｌの濃度の補因子ＰＬＰの存在を含み得る。いくつかの実施形態では、反応条件は、約１０ｇ／Ｌもしくはそれ未満、約５ｇ／Ｌもしくはそれ未満、約２．５ｇ／Ｌもしくはそれ未満、約１．０ｇ／Ｌもしくはそれ未満、約０．５ｇ／Ｌもしくはそれ未満または約０．２ｇ／Ｌもしくはそれ未満のＰＬＰ濃度を含む。いくつかの実施形態では、補因子は、反応混合物ではなく細胞溶解物に添加される。いくつかの実施形態では、補因子は、凍結乾燥前に細胞溶解物に添加される。いくつかの実施形態では、補因子ＰＬＰは、凍結乾燥前に約０．１ｇ／Ｌ～約１０ｇ／Ｌ、約０．２ｇ／Ｌ～約５ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ～約２．５ｇ／Ｌの濃度で細胞溶解物に添加される。
（例えば、全細胞または溶解物が使用される）前記プロセスのいくつかの実施形態では、補因子は細胞抽出物中に天然に存在し、補充される必要はない。（例えば、部分精製トランスアミナーゼ酵素または精製トランスアミナーゼ酵素を使用する）前記プロセスのいくつかの実施形態では、前記プロセスは、酵素反応混合物に補因子を添加する工程をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、補因子は反応の開始時に添加され、および／またはさらなる補因子は反応中に添加される。
いくつかの実施形態では、反応混合物は湿潤有機溶媒を含む。したがって、いくつかの実施形態では、反応混合物のｐＨはモニタリングまたは維持されない。いくつかの実施形態では、湿潤有機溶媒は、湿潤ＩＰＡｃ、湿潤トルエン、湿潤ＭＴＢＥ、湿潤ＭｅＣＮまたは湿潤ＩＰＡである。
本明細書のプロセスの実施形態では、例えば、より高い温度における反応速度の増加、十分な反応持続時間のための酵素の活性、および本明細書にさらに記載されるように、湿潤有機溶媒中の最小水性条件の使用を考慮して、適切な温度が反応条件に使用され得る。例えば、本開示の操作されたポリペプチドは、天然に存在するトランスアミナーゼポリペプチドおよび配列番号２の操作されたポリペプチドと比べて湿潤有機溶媒中の熱活性の増加（これは、変換率の増加のために、本開示の操作されたポリペプチドをより高い温度で使用することを可能にする）を有する。したがって、いくつかの実施形態では、適切な反応条件は、約１０℃～約７０℃、約１０℃～約６５℃、約１５℃～約６０℃、約２０℃～約６０℃、約２０℃～約５５℃、約３０℃～約５５℃または約４０℃～約５０℃の温度を含む。いくつかの実施形態では、適切な反応条件は、約１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃または７０℃の温度を含む。いくつかの実施形態では、酵素反応中の温度は、反応過程にわたってある温度で維持され得る。いくつかの実施形態では、酵素反応中の温度は、反応過程中に温度プロファイルに対して調整され得る。
前記プロセスのいくつかの実施形態では、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを使用するプロセスは、水性成分を含まない湿潤有機溶媒中で行われる。前記プロセスのいくつかの実施形態では、湿潤有機溶媒は、上部で２００ｍＬの水を８００ｍＬの乾燥湿潤有機溶媒と混合し、次いで、マグネチックスターラーで一晩混合し、有機層から取り出す前に分離させることにより調製される。
適切な反応条件は、その対応する生成物化合物への基質化合物の生体触媒変換を提供する反応パラメータの組み合わせを含み得る。したがって、前記プロセスのいくつかの実施形態では、反応パラメータの組み合わせは、（ａ）約１０～２２０ｇ／Ｌの基質化合物（例えば、化合物（２））の基質負荷；（ｂ）約０．５ｇ／Ｌ～２５ｇ／Ｌの操作されたポリペプチド；（ｃ）約０．１～３ＭのＩＰＭ濃度；（ｄ）湿潤有機溶媒；および（ｅ）約３０℃～６０℃の温度を含む。
いくつかの実施形態では、反応パラメータの組み合わせは、（ａ）約２０ｇ／Ｌの基質化合物（例えば、化合物（２））；（ｂ）約２０ｇ／Ｌの操作されたポリペプチド；（ｃ）湿潤ＩＰＡｃ；（ｄ）約０．５５Ｍ ＩＰＭ；および（ｅ）約５０℃を含む。
さらなる例示的な反応条件としては、表１、２、３、４、５、６、７および８ならびに実施例で提供されているアッセイ条件が挙げられる。
本明細書に記載されるアミノ基転移反応の実施では、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、部分精製酵素もしくは精製酵素、酵素をコードする遺伝子（複数可）で形質転換された全細胞、ならびに／またはこのような細胞の細胞抽出物および／もしくは溶解物の反応混合物に添加され得る。操作されたトランスアミナーゼ酵素をコードする遺伝子（複数可）で形質転換された全細胞またはその細胞抽出物、その溶解物および単離された酵素は、固体（例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥されたものなど）または半固体（例えば、粗ペースト）を含む様々な異なる形態で用いられ得る。細胞抽出物または細胞溶解物は、凍結乾燥の前に沈殿（例えば、硫酸アンモニウム、ポリエチレンイミン、熱処理）、続いて脱塩手順（例えば、限外濾過、透析など）により部分的に精製され得る。細胞調製物はいずれも、公知の架橋剤、例えばグルタルアルデヒドを使用して架橋により安定化され得るか、または固相材料（例えば、樹脂、ビーズ、例えばキトサン、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ Ｃ、ＳＥＰＡＢＥＡＤなど）に固定され得る。
本明細書に記載されるアミノ基転移反応のいくつかの実施形態では、反応は、本明細書に記載される適切な反応条件下で行われ、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは固体支持体に固定される。アミノ基転移反応を行うために操作されたトランスアミナーゼを固定するために有用な固体支持体としては、限定されないが、エポキシド官能基を有するポリメタクリレート、アミノエポキシド官能基を有するポリメタクリレート、オクタデシル官能基を有するスチレン／ＤＶＢコポリマーまたはポリメタクリレートを含むビーズまたは樹脂が挙げられる。例示的な固体支持体としては、限定されないが、以下の異なるタイプのＳＥＰＡＢＥＡＤ：ＥＣ－ＥＰ、ＥＣ－ＨＦＡ／Ｓ、ＥＸＡ２５２、ＥＸＥ１１９およびＥＸＥ１２０を含むキトサンビーズ、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ ＣおよびＳＥＰＡＢＥＡＤ（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、固体反応物質（例えば、酵素、塩など）は、粉末（例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥されたものなど）を含む様々な異なる形態で反応に提供され得る。反応物質は、当業者に公知の方法および装置を使用して、容易に凍結乾燥または噴霧乾燥され得る。例えば、タンパク質溶液は少量のアリコートで－８０℃で凍結され、次いで、予冷凍結乾燥チャンバーに添加され、続いて真空が適用され得る。
いくつかの実施形態では、本開示のトランスアミナーゼポリペプチドを使用したキラルアミン生成物化合物へのアミノ受容体基質化合物の生体触媒変換を含む前記プロセスは、薬学的に許容され得る塩もしくは酸、薬学的に許容され得る製剤の形成、生成物の後処理、抽出、単離、精製および／または結晶化の工程（これらはそれぞれ、ある範囲の条件下で行われ得る）をさらに含み得ることも企図される。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される操作されたポリペプチドを使用するプロセスであって、反応物から式（Ｉ）の化合物または化合物（１）を単離する工程をさらに含むプロセスが行われ得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される操作されたポリペプチドを使用するプロセスであって、アミノ基供与体が、ＩＰＭ、アラニン、３－アミノ酪酸またはメチルベンジルアミンから選択されるプロセスが行われ得る。いくつかの実施形態では、アミノ基供与体はＩＰＭである。
上記で開示されるプロセスにより生成された生体触媒反応混合物からアミノ化生成物化合物または閉環化合物を抽出し、単離し、それらの塩を形成し、精製しおよび／または結晶化するための方法、技術およびプロトコールは当業者に公知であり、および／またはルーチンな実験により達成される。加えて、例示的な方法は以下の実施例で提供される。
本開示の様々な特徴および実施形態は以下の代表的な実施例に例示されており、これらは、限定的ではなく例示的であることを意図する。
実施例１：組換えトランスアミナーゼ遺伝子を含有する大腸菌発現宿主
配列番号２の操作された参照ポリペプチドをコードするコドン最適化および操作されたトランスアミナーゼ遺伝子（配列番号１）を定向進化のための開始骨格として使用して、配列番号４～８４６の偶数番号配列識別子のトランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチド（これらはそれぞれ、それおよび／または配列番号２の参照ポリペプチドと比べて改善された酵素特性で、基質化合物（２）を生成物化合物（１）に変換することができる）をコードする遺伝子を生成した。本開示の配列番号１の遺伝子および配列番号２のポリペプチドは、米国特許第９，６１７，５７３号の配列番号１２９および１３０に対応する。配列番号２の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、野生型Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＫＮＫ１６８ポリペプチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託：ＢＡＫ３９７５３．１；ＧＩ：３３６０８８３４１）と比べて以下の３０個のアミノ酸差異を有する：Ｓ８Ｐ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｙ６０Ｆ、Ｌ６１Ｙ、Ｈ６２Ｔ、Ｖ６５Ａ、Ｖ６９Ｔ、Ｄ８１Ｇ、Ｍ９４Ｉ、Ｉ９６Ｌ、Ｆ１２２Ｍ、Ｓ１２４Ｔ、Ｓ１２６Ｔ、Ｇ１３６Ｆ、Ｙ１５０Ｆ、Ｖ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、Ａ１６９Ｌ、Ｖ１９９Ｉ、Ａ２０９Ｌ、Ｇ２１７Ｎ、Ｓ２２３Ｐ、Ｌ２６９Ｐ、Ｌ２７３Ｙ、Ｔ２８２Ｓ、Ａ２８４Ｇ、Ｐ２９７ＳおよびＳ３２１Ｐ。ｐＣＫ１１０９００ベクター系への配列番号１のクローニング（例えば、米国特許出願公開２００６／０１９５９４７Ａ１号を参照のこと）および大腸菌Ｗ３１１０ｆｈｕＡにおけるその後の発現は、米国特許第８，２９３，５０７Ｂ２号に記載されているとおりであった。簡潔に言えば、大腸菌Ｗ３１１０は、ｌａｃプロモーターの制御下で細胞内タンパク質としてトランスアミナーゼポリペプチドを発現する。ポリペプチドは、可溶性細胞質ゾルの活性酵素として蓄積する。遺伝子合成による反復バリアントライブラリー生成とそれに続くヒットのスクリーニングおよび配列決定を介した標準的な定向進化法により、本明細書に開示される配列番号１の遺伝子配列の操作された誘導体を生成する。
実施例２：湿潤細胞ペレットを含有するＨＴＰトランスアミナーゼの調製
モノクローナルコロニー由来の組換えトランスアミナーゼコード遺伝子を含有する大腸菌細胞を、９６ウェルシャローウェルマイクロタイタープレートのウェル中、１％グルコースおよび３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコール（ＣＡＭ）を含有する１８０μｌのルリアブロス（ＬＢ）に接種した。プレートをＯ２透過性シールでシールし、培養物を３０℃、２００ｒｐｍおよび湿度８５％で一晩成長させた。次いで、１０μｌの各細胞培養物を、３９０μｌのテリフィックブロス（ＴＢ）および３０μｇ／ｍＬ ＣＡＭを含有する９６ウェルディープウェルプレートのウェルに移した。ディープウェルプレートをＯ２透過性シールでシールし、ＯＤ６０００．６～０．８に達するまで３０℃、２５０ｒｐｍおよび湿度８５％でインキュベートした。次いで、１ｍＭの最終濃度までのイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）によって細胞培養物を誘導し、最初に使用したのと同じ条件下で一晩インキュベートした。プレートを４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を廃棄し、ペレットを－８０℃で凍結してから、実施例３に記載されているように溶解させた。あるいは、ワイドボアチップを使用して、２つの同一プレートからの細胞をプールし、４０００ｒｐｍの遠心分離を１０分間使用してペレット化した。上清を廃棄し、二重ペレットを－８０℃で凍結してから、実施例５に記載されているように溶解させた。
実施例３：ＨＴＰトランスアミナーゼ含有細胞溶解物の調製
最初に、１００ｍＭトリエタノールアミンバッファー、ｐＨ７．５、０．２５ｍｇ／ｍＬリゾチーム、０．２ｍｇ／ｍＬ硫酸ポリミキシンｂ（ＰＭＢＳ）および１００ｕＭピロドキサール－５－リン酸（ｐｙｒｏｄｏｘａｌ－５－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（ＰＬＰ）を含有する２００μｌの溶解バッファーを、実施例２に記載されているように産生した各ウェル中の細胞ペーストに添加した。細胞を、ベンチトップシェーカー上で振盪しながら室温で２時間溶解させた。次いで、プレートを４，０００ｒｐｍおよび４℃で１０分間遠心分離した。次いで、透明な上清を生体触媒反応で使用して、実施例４に記載されているようにそれらの立体選択性を決定した。
実施例４：配列番号２に対する立体選択性の改善
親酵素として配列番号２を選択した。十分に確立された技術（例えば、飽和変異誘発および以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して、操作された遺伝子のライブラリーを生成した。実施例２に記載されているように、各遺伝子によりコードされるポリペプチドをＨＴＰで生成し、実施例３に記載されているように可溶性溶解物を生成した。各反応ウェルは、１ウェル当たり２００μＬ容量で、実施例３で説明されているように調製した８０μＬのＨＴＰ溶解物および以下の最終条件を含有していた：２０ｇ／Ｌ基質化合物（２）、ＤＭＳＯ４０ｖｏｌ％、１．５Ｍ ＩＰＭ ５０ ｖｏｌ％を含む０．２Ｍホウ酸塩および１ｇ／Ｌ ＰＬＰ；ｐＨをｐＨ＝８．５に調整した。プレートをヒートシールし、６０℃で一晩（１８～２２時間）振盪した。２００μＬ／ウェルのアセトニトリルを添加することにより、反応をクエンチした。プレートをヒートシールし、１，０００ｒｐｍで１５分間振盪し、次いで、４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。２００μＬ／ウェルの清澄化上清をフィルタプレートに移した。フィルタプレートを９６ウェル丸底Ｃｏｓｔａｒプレート上に置き、４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。９６ウェル丸底Ｃｏｓｔａｒプレートをヒートシールし、キラルＬＣ－ＭＳを使用して分析した（方法３、実施例１０）。
％エナンチオマー過剰率（％ｅｅ）として立体選択性を計算する：所望の（Ｓ）生成物のピーク面積－望ましくない（Ｒ）生成物のピーク面積／所望の（Ｓ）生成物のピーク面積＋望ましくない（Ｒ）生成物のピーク面積×１００。
表１：ＨＴＰ立体選択性
Figure 2022518212000016
実施例５：湿潤細胞溶解物を含有するトランスアミナーゼからの凍結乾燥ＨＴＰ溶解物の調製
ＨＴＰ溶解およびＨＴＰ溶解物の凍結乾燥：（実施例２に記載されているように二重ペレットとして生成した）湿潤細胞ペレットを含有するトランスアミナーゼのＨＴＰ溶解および生成したＨＴＰ溶解物の凍結乾燥のための３つの条件を使用した：Ａ、ＢおよびＣ。
条件Ａ：最初に、０．２５ｍｇ／ｍＬ（１ｍｇ／ｍＬ条件ＢおよびＣ）リゾチーム；０．２ｍｇ／ｍＬ（０．５ｍｇ／ｍＬ条件ＢおよびＣ）ＰＭＢＳ；１００ｍＭ（２５ｍＭ条件ＢおよびＣ）トリエタノールアミンバッファーｐＨ７．５；１０μｌの２，０００Ｕ／ｍＬエンドヌクレアーゼ／プレートを含有する３００μｌの溶解バッファーを、実施例２に記載されているように生成した各ウェル中の二重ペレット細胞ペーストに添加した。細胞を、ベンチトップシェーカー上で振盪しながら室温で２時間溶解させた。次いで、プレートを４，０００ｒｐｍおよび４℃で２０分間遠心分離した。２２０μｌ（１５０μｌ条件Ｃ）の清澄化溶解物を９６ウェルガラスコーティングディープウェルプレートに移した。予備実験では、ガラスコーティングディープウェルおよびポリプロピレンプレートは、ある特定の反応条件下でワープした（ｗａｒｐｅｄ）。したがって、ガラスプレートまたはバイアルが条件ＢおよびＣ（Ｆｒｅｅｓｌａｔｅ／Ｃｈｅｍｇｌａｓｓガラスバイアルプレート）に必要であった。プレートをエアポアシールで覆い、９６ウェルサンプルを冷凍庫棚に２時間直接接触させて－８０℃に置いた。プレートを凍結乾燥機に入れた。凍結乾燥機の真空を２００ｂａｒに下げ、以下のプログラムを実行した：－４０℃で予冷、－４０℃で１２０分間の熱処理、１００ｍＴｏｒｒ；乾燥工程：１０℃、１００ｍＴｏｒｒ １，０００～１，２００分間。プレートを凍結乾燥機から取り出し、ほぼ直ぐにアッセイした。条件ＢおよびＣの場合：フロストシールを約６００～７００ｍＴｏｒｒに設定して、プレートを凍結乾燥機中、－４０℃で約２時間凍結させた。凍結乾燥機の真空を２００ｍＴｏｒｒにし、以下のプログラムを実行した：予冷：－４０℃；熱処理：－４０℃、１００分間、１００ｍＴｏｒｒ；乾燥工程：１．－４０～－１５℃（１℃／分）、１００ｍＴｏｒｒ；２．－１５℃、６００分間、１００ｍＴｏｒｒ；３．－１５～０℃（１℃／分）、１００ｍＴｏｒｒ、０℃、９００分間、１００ｍＴｏｒｒ（方法は一晩で完了し、工程４の１，０００～１，２００分後に停止した）。
実施例６：振盪フラスコ（ＳＦ）培養物からの凍結乾燥溶解物の調製
上記のように成長させた選択ＨＴＰ培養物を、１％グルコースおよび３０μｇ／ｍｌ ＣＡＭを含むＬＢ寒天プレートにプレーティングし、３７℃で一晩成長させた。各培養物由来の単一コロニーを、１％グルコースおよび３０μｇ／ｍｌ ＣＡＭを含む６ｍｌのＬＢに移した。培養物を３０℃、２５０ｒｐｍで１８時間成長させ、３０μｇ／ｍｌ ＣＡＭを含有する２５０ｍｌのＴＢに約１：５０で継代培養して、０．０５の最終ＯＤ６００にした。培養物を３０℃、２５０ｒｐｍで約１９５分間成長させて０．６～０．８のＯＤ６００にし、１ｍＭ ＩＰＴＧにより誘導した。次いで、培養物を３０℃、２５０ｒｐｍで２０時間成長させた。培養物を４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを３０ｍｌの２５ｍＭトリエタノールアミンｐＨ７．５に再懸濁し、１８，０００ｐｓｉでＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒシステム（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）を使用して溶解させた。溶解物をペレット化し（１０，０００ｒｐｍで６０分間）、上清を凍結および凍結乾燥させて、シェイクフレーク（ＳＦ）酵素を生成した。
実施例７：活性改善のＨＴＰスクリーニング
ＨＴＰスクリーニング、変換アッセイ：上部で２００ｍＬの水を８００ｍＬの乾燥ＩＰＡｃと混合し、これをマグネチックスターラーで一晩混合し、有機層から取り出す前に分離させることにより、湿潤ＩＰＡｃを調製した。エステル基質を、湿潤ＩＰＡｃ中で、基質濃度に対して４当量のＩＰＭと予混合した。変換ＨＴＰアッセイにおける最終反応パラメータは、２０ｇ／Ｌエステル基質（２）、４当量のＩＰＭ、および実施例５の条件Ａ～Ｃで説明されているように調製したＨＴＰ凍結乾燥ケーキであった。最初に、湿潤ＩＰＡｃ中２００μｌ／ウェルの２０ｇ／Ｌエステル基質および４当量のＩＰＭを９６ウェルガラスコーティングウェルプレートに添加した。ガラスコーティングプレートをヒートシールし、３０℃、４００ｒｐｍで２４時間インキュベートした。１０００μｌ／ウェルの乾燥ＩＰＡｃを添加することにより、９６ウェルガラスコーティングプレートにおける反応をクエンチした。プレートをヒートシールし、１分間振盪し、次いで、４℃、４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ＧＣ－ＦＩＤ分析のために、６倍ＩＰＡｃ希釈サンプルを９６ウェルＣｏｓｔａｒ丸底プレートに移した。あるいは、５０μｌの６倍ＩＰＡｃ希釈サンプルをディープウェルプレート中の９５０μｌの水に移した。次いで、ＲａｐｉｄＦｉｒｅ ＭＳ分析のために、５μｌの２０倍水希釈ＩＰＡｃクエンチ反応物を９６ウェルＣｏｓｔａｒ丸底プレート中の１９５μｌの水に添加した。
Figure 2022518212000017
 表２：条件Ａ、実施例５で産生したＨＴＰ凍結乾燥粉末の有機溶媒中のＨＴＰ活性
Figure 2022518212000018
Figure 2022518212000019
Figure 2022518212000020
Figure 2022518212000021
Figure 2022518212000022
Figure 2022518212000023
 １（実施例７に示されている）活性アッセイ反応条件下で指定の操作されたポリペプチドにより産生された生成物化合物（１）／同じ反応条件下で配列番号６の操作されたポリペプチドにより産生された生成物の比として、活性改善倍率を計算した。実施例１０に示されているように調製したクエンチアッセイサンプルのＧＣ－ＦＩＤまたはＲａｐｉｄＦｉｅｒ－ＭＳ分析により、産生された生成物の量を決定した。
表３：条件Ａ、実施例５で産生したＨＴＰ凍結乾燥粉末の有機溶媒中のＨＴＰ活性
Figure 2022518212000024
Figure 2022518212000025
 １（実施例７に示されている）活性アッセイ反応条件下で指定の操作されたポリペプチドにより産生された生成物化合物（１）／同じ反応条件下で配列番号３３２の操作されたポリペプチドにより産生された生成物の比として、活性改善倍率を計算した。実施例１０に示されているように調製したクエンチアッセイサンプルのＧＣ－ＦＩＤまたはＲａｐｉｄＦｉｅｒ－ＭＳ分析により、産生された生成物の量を決定した。
表４：条件Ｂ、実施例５で産生したＨＴＰ凍結乾燥粉末の有機溶媒中のＨＴＰ活性
Figure 2022518212000026
 １（実施例７に示されている）活性アッセイ反応条件下で指定の操作されたポリペプチドにより産生された生成物化合物（１）／同じ反応条件下で配列番号５１８の操作されたポリペプチドにより産生された生成物の比として、活性改善倍率を計算した。実施例１０に示されているように調製したクエンチアッセイサンプルのＧＣ－ＦＩＤまたはＲａｐｉｄＦｉｅｒ－ＭＳ分析により、産生された生成物の量を決定した。
実施例８：熱活性改善のＨＴＰスクリーニング
ＨＴＰスクリーニング、熱活性アッセイ：上部で２００ｍＬの水を８００ｍＬの乾燥ＩＰＡｃと混合し、これをマグネチックスターラーで一晩混合し、有機層から取り出す前に分離させることにより、湿潤ＩＰＡｃを調製した。エステル基質を、湿潤ＩＰＡｃ中で、基質濃度に対して４当量のＩＰＭと予混合した。変換ＨＴＰアッセイにおける最終反応パラメータは、２０ｇ／Ｌエステル基質（２）、４当量のＩＰＭ、および実施例５の条件Ａ～Ｃで説明されているように調製したＨＴＰ凍結乾燥ケーキであった。最初に、湿潤ＩＰＡｃ中２００μｌ／ウェルの２０ｇ／Ｌエステル基質および４当量のＩＰＭをＦｒｅｅｓｌａｔｅガラスバイアルプレートに添加した。Ｆｒｅｅｓｌａｔｅガラスバイアルプレートをネジで均等にトルクダウンし、５０℃、４００ｒｐｍで２４時間インキュベートした。４００μｌ／ウェルの乾燥ＩＰＡｃを添加することにより、Ｆｒｅｅｓｌａｔｅ９６ガラスバイアルプレートにおける反応をクエンチした。次に、Ｆｒｅｅｓｌａｔｅ９６ガラスバイアルプレートから、１００μｌ／ウェルの乾燥ＩＰＡｃを含有する９６ウェルＣｏｓｔａｒプレートに１ウェル当たり１００μｌを移し、ＧＣ－ＦＩＤ分析のために提出した。
表５：条件Ａ、実施例５で生成したＨＴＰ凍結乾燥粉末の有機溶媒中のＨＴＰ熱活性
Figure 2022518212000027
Figure 2022518212000028
 １（実施例８に示されている）活性アッセイ反応条件下で指定の操作されたポリペプチドにより産生された生成物化合物（１）／同じ反応条件下で配列番号３３２の操作されたポリペプチドにより産生された生成物の比として、活性改善倍率を計算した。実施例１０に示されているように調製したクエンチアッセイサンプルのＧＣ－ＦＩＤ分析により、産生された生成物の量を決定した。
表６：条件Ｂ、実施例５で産生したＨＴＰ凍結乾燥粉末の有機溶媒中のＨＴＰ熱活性
Figure 2022518212000029
Figure 2022518212000030
 １（実施例８に示されている）活性アッセイ反応条件下で指定の操作されたポリペプチドにより産生された生成物化合物（１）／同じ反応条件下で配列番号５１８の操作されたポリペプチドにより産生された生成物の比として、活性改善倍率を計算した。実施例１０に示されているように調製したクエンチアッセイサンプルのＧＣ－ＦＩＤ分析により、産生された生成物の量を決定した。
表７：条件Ｃ、実施例５で産生したＨＴＰ凍結乾燥粉末の有機溶媒中のＨＴＰ熱活性
Figure 2022518212000031
Figure 2022518212000032
 １（実施例８に示されている）活性アッセイ反応条件下で指定の操作されたポリペプチドにより産生された生成物化合物（１）／同じ反応条件下で配列番号６５６の操作されたポリペプチドにより産生された生成物の比として、活性改善倍率を計算した。実施例１０に示されているように調製したクエンチアッセイサンプルのＧＣ－ＦＩＤ分析により、産生された生成物の量を決定した。
実施例９：振盪フラスコ粉末試験
上部で２００ｍＬの水を８００ｍＬの乾燥ＩＰＡｃと混合し、これをマグネチックスターラーで一晩混合し、有機層から取り出す前に分離させることにより、湿潤ＩＰＡｃ（またはＭＴＢＥもしくはトルエン）を調製した。エステル基質を、湿潤ＩＰＡｃ（またはＭＴＢＥもしくはトルエン）中で、基質濃度に対して４当量のＩＰＭと予混合した。最終反応パラメータは、２０ｇ／Ｌエステル基質、４当量のＩＰＭ、実施例６で説明されているように調製した２０ｍｇの凍結乾燥振盪フラスコ粉末であった。次に、２０ｍｇの凍結乾燥振盪フラスコ粉末を４ｍＬガラスバイアルに計量した。次いで、１ｍＬの反応混合物をバイアルに添加し、バイアルをテフロン（登録商標）シールでシールした。バイアルを５０℃で２４時間インキュベートした。２ｍＬの乾燥ＩＰＡｃを添加することにより、反応をクエンチした。次いで、５００μＬのクエンチ反応物を、ＧＣガラスバイアル中で５００μＬの乾燥ＩＰＡｃに希釈した。バイアルをＧＣ－ＦＩＤ分析のために提出した。
表８：実施例６に記載されているように産生した振盪フラスコ粉末の有機溶媒中の熱活性
Figure 2022518212000033
 １（実施例９に示されている）活性アッセイ反応条件下で指定の操作されたポリペプチドにより産生された生成物化合物（１）／同じ反応条件下で配列番号６の操作されたポリペプチドにより産生された生成物の比として、湿潤ＩＰＡｃ中の活性改善倍率を計算した。実施例１０に示されているように調製したクエンチアッセイサンプルのＧＣ－ＦＩＤ分析により、産生された生成物の量を決定した。
２（実施例９に示されている）活性アッセイ反応条件下で指定の操作されたポリペプチドにより産生された生成物化合物（１）／同じ反応条件下で配列番号６の操作されたポリペプチドにより産生された生成物の比として、湿潤ＭＴＢＥ中の活性改善倍率を計算した。実施例１０に示されているように調製したクエンチアッセイサンプルのＧＣ－ＦＩＤ分析により、産生された生成物の量を決定した。
３（実施例９に示されている）活性アッセイ反応条件下で指定の操作されたポリペプチドにより産生された生成物化合物（１）／同じ反応条件下で配列番号６の操作されたポリペプチドにより産生された生成物の比として、湿潤トルエン中の活性改善倍率を計算した。実施例１０に示されているように調製したクエンチアッセイサンプルのＧＣ－ＦＩＤ分析により、産生された生成物の量を決定した。
実施例１０：分析方法
方法１－アキラルＧＣ－ＦＩＤ法
実施例７、８および９で説明されているように調製したクエンチ反応物を、以下の条件下でＧＣ－ＦＩＤ分析に供した：
Figure 2022518212000034
方法２－アキラルＲａｐｉｄＦｉｒｅ－ＭＳ法
実施例７で説明されているように調製したクエンチ反応物を、以下の条件下でＲａｐｉｄＦｉｒｅ－ＭＳ分析に供した
Figure 2022518212000035
Figure 2022518212000036
方法３－キラルＬＣ－ＭＳ法
実施例４で説明されているように調製したクエンチ反応物を、以下の条件下でキラルＬＣ－ＭＳ分析に供した：
Figure 2022518212000037

Claims (42)

  1. 配列番号２、６、３３２、５１８および／または６５６と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含むトランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドまたはその機能的断片であって、前記操作されたポリペプチドの前記ポリペプチド配列が少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号８０８、２、６、３３２、５１８および／または６５６を基準にしてナンバリングされる、操作されたポリペプチドまたはその機能的断片。
  2. 前記ポリペプチド配列が、配列番号２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有し、前記操作されたポリペプチドの前記ポリペプチド配列が、２０、２３、２４４、２８４および２８４／１５５から選択される前記ポリペプチド配列中の１つまたはそれを超える位置において少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号２を基準にしてナンバリングされる、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
  3. 前記ポリペプチド配列が、配列番号６と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有し、前記操作されたポリペプチドの前記ポリペプチド配列が、５／３５、９、９／２０／２３／２４／１３４／２４４、９／２０／２３／１０１／２４４、９／２０／２４／１０１／２４４／２４９、９／２３／２４、９／２３／２４／２９／２４４、９／２３／２４／１０１／２６２、９／２３／２４／２４４／２６２、９／２３／２９、９／２４／２４４、９／２４／２４４／２６２、９／２４／２４９、９／４５／８９／９３、９／７９／１０１／２４４、９／８２／８９、９／８９／２４６、９／８９／２７１、９／９３／１４２／２４６、９／１０１／２４４、９／１１０／３０２、９／２４４／２４９、９／２４４／２６２／２６４、９／２４６、９／２６２、１５、１５／１６／１８／２０／８９／９３／１６０、１５／２４／２６／８９／９３／１６０、１５／３５／２７３、１５／２１８／２７３、１５／２４９／２７３、１６、１７／２５、１７／２５／４１、１７／２５／１６０、１７／１６０、１８、１８／２６／２４６／２７３、１８／１４６、１８／１４６／１６８、１８／１４６／２６２、１８／１６８、１８／１６８／２４４、１８／１６８／２６２／３２４、１８／２４４、１８／２４４／２４６、１８／２４４／２４６／２８４、１８／２４４／２４８、１８／２４４／２６２／２７３、１８／２４４／２７３、１８／２６２、１８／２７３、２０、２０／２３／２４／５５／１３４／２４４／２６２、２０／２３／１３４／２４４、２０／２４／８９／１９７、２０／３３／１６０、２０／３２４、２２、２２／１０２、２２／１６０、２３、２３／２５／５５／３２１、２３／２５／１０２／１４２、２３／１０２、２３／３２１、２４、２５、２５／３３、２５／１０４、２５／１６０、２５／３２１、２６、２６／２７３、２９、２９／８９、３２、３３、３５、３５／２１５／２１８／２４９、３５／２１８／２４９／２７３、３５／２２１、４０、４０／１６８／２０８／２４４、４０／２４４／２４８、４１、４１／１０２、４２、４５、４６、５０、５５、５６、７１／１０２、７４、７９、８２、８２／２４４、８９、８９／９３／１５６／３２４、８９／９３／３２１／３２４、９０、９３、９３／３２４、９５、９８、１０１、１０１／１６０／２４４／２４９、１０２、１０４、１０６、１１１、１１４、１１７、１１９、１３４、１３４／２４４、１３４／２６２、１３９、１４０／２６６、１４２、１４２／３２１、１４５、１４６、１４６／２４４、１４６／２７３、１５６、１６０、１６０／２１５／２１６／２１８、１６０／２７３、１６８、１６８／２４４／２７３、１７９、１８６、１８６／２００、１９７、２０３、２０７、２０８、２０８／２４６、２１５、２１５／２１６／２４９、２１６、２１６／２７３、２１８、２１８／２４９、２１８／３１３、２３４、２３６、２４４、２４４／２４８、２４４／２４８／２８４、２４４／２７３、２４６、２４６／２４８／２７３、２４８、２４９、２４９／２７３、２５６、２６２、２６４、２６５、２６６、２７１、２７３、２８４、３０１、３１６、３２０、３２１、３２４、および３２９から選択される前記ポリペプチド配列中の１つまたはそれを超える位置において少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号６を基準にしてナンバリングされる、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
  4. 前記ポリペプチド配列が、配列番号３３２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有し、前記操作されたポリペプチドが、９／８９／９３／１０１／１６０、９／８９／１６０、３３、３５、４４、４９、７４、８９、８９／９３／１６０／２４９、１０７、１０８、１１７、１４０、１４１、１４２、１４４、１５６、１６８、２０３、２０７、２３４、２７０、２７３、２７４、２９２、２９６、２９７、３００、３０２、３０５、３１７、３１９、３２１、３２３、３２７、および３２９から選択される前記ポリペプチド配列中の１つまたはそれを超える位置において少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号３３２を基準にしてナンバリングされる、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
  5. 前記ポリペプチド配列が、配列番号５１８と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有し、前記操作されたポリペプチドが、３５／２７３、４６／２７３、１１１／１５９／２７３、１５９、１５９／２７３、１７４、１９９、２７３および２８７から選択される前記ポリペプチド配列中の１つまたはそれを超える位置において少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号５１８を基準にしてナンバリングされる、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
  6. 前記ポリペプチド配列が、配列番号３３２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有し、前記操作されたポリペプチドが、配列番号３３２の操作されたポリペプチドと比較して湿潤有機溶媒中の熱活性の増加を有し、前記操作されたポリペプチドが、２３／２９／５５、３４、４４、７４、９２、１０８、１１７、１４０、１４１、１４４、１５６、１６０、１６８、２１５、２５６、２６９、２７０、２７４、２９２、２９６、３０２、３１９、３２３および３２９から選択される前記ポリペプチド配列中の１つまたはそれを超える位置において少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号３３２を基準にしてナンバリングされる、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
  7. 前記ポリペプチド配列が、配列番号５１８と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有し、前記操作されたポリペプチドが、配列番号５１８の操作されたポリペプチドと比較して湿潤有機溶媒中の熱活性の増加を有し、前記操作されたポリペプチドが、３４／７４／９２、３５／２７３／３２３、３９、４６／２７３、４８、５５、７４／９２、１２６、１３３、１３８、１５０、１６０／２１５／３２９、１７８、１９９、２０７、２７３および２９２から選択される前記ポリペプチド配列中の１つまたはそれを超える位置において少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号５１８を基準にしてナンバリングされる、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
  8. 前記ポリペプチド配列が、配列番号６５６と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有し、前記操作されたポリペプチドが、配列番号６５６の操作されたポリペプチドと比較して湿潤有機溶媒中の熱活性の増加を有し、前記操作されたポリペプチドが、１８、３５／３９／５５／１３８／１５０、３５／３９／５５／１５０、３５／３９／１２６／１５０／２７３、３５／３９／１３３、３５／３９／１３３／１５０／２７３、３５／３９／１５０、３５／３９／１５０／２７３、３５／１３３／１７８、３５／１３８／１５０／２７３、３５／１５０／２７３、３５／１７８／２７３、３５／２７３、３９、３９／５５／１５０／１７８／２７３、３９／５５／１５０／２７３、３９／１２６／１５０、３９／１３３／１５０、３９／１３３／１７８／２７３、３９／１３３／２７３、３９／１５０／１７８、３９／１５０／１７８／２０７、３９／１５０／１７８／２０７／２７３、３９／１５０／２７３、３９／１７８、３９／１７８／２７３、３９／２０７、３９／２０７／２７３、３９／２７３、４４、５５、５５／１５０、８８、１２６、１２６／１３３／１７８、１２６／１３８／１７８、１２６／１７８／２０７、１３２、１３８／１５０／１７８、１４１、１５０、１５０／１７８／２７３／３２３、１５０／１７８／３２３、１５０／２０７／２７３、１５０／２７３、１６８、１７８／２７３、２３９、２６１、２６３、２６９、２７３、２９７、および３１２から選択される前記ポリペプチド配列中の１つまたはそれを超える位置において少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号６５６を基準にしてナンバリングされる、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
  9. 配列番号６の操作されたポリペプチドと比べて湿潤有機溶媒中の熱活性の増加を有する、請求項６～８のいずれかに記載の操作されたポリペプチド。
  10. 表１、２、３、４、５、６、７および／または８に記載されている少なくとも１つの操作されたポリペプチドバリアントの配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えて同一のポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
  11. 配列番号２、６、３３２、５１８および／または６５６と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えて同一のポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
  12. 配列番号６、３３２、５１８および／または６５６に記載されている操作されたポリペプチドバリアントを含む、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
  13. 配列番号４～８４６の偶数番号配列に記載されている少なくとも１つの操作されたポリペプチドバリアントの配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えて同一のポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
  14. 配列番号４～８４６の偶数番号配列の少なくとも１つに記載されているポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
  15. 少なくとも１つの請求項１～１４のいずれかに記載の操作されたポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド配列。
  16. 少なくとも１つの操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列であって、配列番号１、５、３３１、５１７および／または６５５と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を含み、前記操作されたポリペプチドの前記ポリヌクレオチド配列が、１つまたはそれを超える位置において少なくとも１つの置換を含む、ポリヌクレオチド配列。
  17. 少なくとも１つの操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列であって、配列番号１、５、３３１、５１７および／または６５５と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を含むポリヌクレオチド配列またはその機能的断片。
  18. 制御配列に作動可能に連結されている、請求項１５～１７のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列。
  19. コドン最適化されている、請求項１５～１７のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列。
  20. 配列番号３～８４５の奇数番号配列に記載されているポリヌクレオチド配列を含む、請求項１５～１７のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列。
  21. 少なくとも１つの請求項１５～２０のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列を含む、発現ベクター。
  22. 少なくとも１つの請求項２１に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
  23. 少なくとも１つの請求項１５～２０のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列を含む、宿主細胞。
  24. 宿主細胞において操作されたポリペプチドを産生する方法であって、少なくとも１つの操作されたポリペプチドが産生されるように、適切な条件下で、請求項２２および／または２３に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
  25. 前記培養物および／または宿主細胞から少なくとも１つの操作されたポリペプチドを回収することをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記少なくとも１つの操作されたポリペプチドを精製する工程をさらに含む、請求項２４および／または２５に記載の方法。
  27. 反対のエナンチオマーに対して少なくとも７０％のエナンチオマー過剰率で、＊でマークされているステレオジェン中心において示されている立体化学的配置を有する構造式（Ｉ）の化合物：
    Figure 2022518212000038
     （式中、
    Ｚは、１つまたはそれを超えるヒドロキシ、シアノまたはニトロ基で必要に応じて置換された直鎖Ｃ１－６アルキルまたは分枝鎖Ｃ１－６アルキルであり；ならびに
    Ｒ１は、Ｃ１－６アルキル、アリール－Ｃ１－２アルキル、ヘテロアリール－Ｃ１－２アルキル、またはＯ、Ｓ、およびＮから選択されるさらなるヘテロ原子を必要に応じて含有する５～６員複素環式環系であり、前記複素環式環は置換されていないか、またはオキソ、ヒドロキシ、ハロゲン、Ｃ１－４アルコキシおよびＣ１－４アルキルから独立して選択される１～３個の置換基で置換されている）
    を調製するためのプロセスであって、適切な反応条件下、アミノ基供与体の存在下で、構造式（ＩＩ）の化合物：
    Figure 2022518212000039
     を請求項１～１４のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチドと接触させる工程を含む、プロセス。
  28. 構造式（ＩＩ）の前記化合物が化合物（２）を除外し、構造式（Ｉ）の前記化合物が化合物（１）を除外する、請求項２７に記載のプロセス。
  29. 化合物（１）：
    Figure 2022518212000040
     を調製するプロセスであって、適切な反応条件下、アミノ基供与体の存在下で、化合物（２）の基質：
    Figure 2022518212000041
     を請求項１～１４のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチドと接触させる工程を含む、プロセス。
  30. 式（Ｉ）の前記化合物または前記化合物（１）が、少なくとも９０％のエナンチオマー過剰率で生成される、請求項２７～２９のいずれか一項に記載のプロセス。
  31. 式（Ｉ）の前記化合物または前記化合物（１）が、少なくとも９９％のエナンチオマー過剰率で生成される、請求項２７～２９のいずれか一項に記載のプロセス。
  32. 前記アミノ基供与体が、イソプロピルアミン、アラニン、３－アミノ酪酸またはメチルベンジルアミンから選択される、請求項２７～２９のいずれか一項に記載のプロセス。
  33. 前記アミノ基供与体が、必要に応じて約０．１～約３．０Ｍ、０．２～約２．５Ｍ、約０．５～約２Ｍまたは約１～約２Ｍの濃度のイソプロピルアミンである、請求項２７～２９のいずれか一項に記載のプロセス。
  34. 前記適切な反応条件が約４５℃～約６０℃の温度を含む、請求項２７～２９のいずれか一項に記載のプロセス。
  35. 適切な反応条件が湿潤有機溶媒を含む、請求項２７～２９のいずれか一項に記載のプロセス。
  36. 前記湿潤有機溶媒が、湿潤酢酸イソプロピル、湿潤トルエン、湿潤メチル第３ブチルエーテル、湿潤アセトニトリルまたは湿潤イソプロピルアルコールから選択される、請求項３５に記載のプロセス。
  37. 前記湿潤有機溶媒が酢酸イソプロピルである、請求項３６に記載のプロセス。
  38. 前記適切な反応条件が、約５ｇ／Ｌ～約２００ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ～約１５０ｇ／Ｌまたは約５０ｇ／Ｌ～約１００ｇ／Ｌの負荷での前記基質化合物を含む、請求項２７～２９のいずれか一項に記載のプロセス。
  39. 前記適切な反応条件が、約０．５ｇ／Ｌ～約５ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ～約３ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ～約２ｇ／Ｌまたは約０．５ｇ／Ｌ～約１ｇ／Ｌの濃度の前記操作されたポリペプチドを含む、請求項２７～２９のいずれか一項に記載のプロセス。
  40. 前記適切な反応条件が、（ａ）約１０～２２０ｇ／Ｌの基質化合物の基質負荷（２）；（ｂ）約０．５ｇ／Ｌ～２５ｇ／Ｌの操作されたポリペプチド濃度；（ｃ）約０．１～３Ｍのイソプロピルアミン濃度；（ｄ）湿潤有機溶媒；および（ｅ）約３０℃～６０℃の温度を含む、請求項２９に記載のプロセス。
  41. 前記適切な反応条件が、（ａ）約２０ｇ／Ｌの基質化合物（２）；（ｂ）約２０ｇ／Ｌの操作されたポリペプチド；（ｃ）湿潤酢酸イソプロピル；（ｄ）約０．５５Ｍイソプロピルアミン；および（ｅ）約５０℃を含む、請求項２９に記載のプロセス。
  42. 前記反応から式（Ｉ）の前記化合物または前記化合物（１）を単離する工程をさらに含む、請求項２７～２９のいずれか一項に記載のプロセス。
JP2021540834A 2019-01-15 2020-01-13 操作されたトランスアミナーゼポリペプチド Pending JP2022518212A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962792518P 2019-01-15 2019-01-15
US62/792,518 2019-01-15
PCT/US2020/013288 WO2020150125A1 (en) 2019-01-15 2020-01-13 Engineered transaminase polypeptides

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2022518212A true JP2022518212A (ja) 2022-03-14

Family

ID=71613997

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021540834A Pending JP2022518212A (ja) 2019-01-15 2020-01-13 操作されたトランスアミナーゼポリペプチド

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20220090033A1 (ja)
EP (1) EP3911738A4 (ja)
JP (1) JP2022518212A (ja)
CN (1) CN113396218A (ja)
CA (1) CA3126671A1 (ja)
IL (1) IL284588A (ja)
SG (1) SG11202106617VA (ja)
WO (1) WO2020150125A1 (ja)

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008127646A2 (en) * 2007-04-11 2008-10-23 Dsm Ip Assets B.V. Transaminase-based processes for preparation of pregabalin
JP5707344B2 (ja) * 2009-02-26 2015-04-30 コデクシス， インコーポレイテッド トランスアミナーゼ生体触媒
CN102597226B (zh) * 2009-06-22 2015-08-19 科德克希思公司 转氨酶反应
WO2011159910A2 (en) * 2010-06-17 2011-12-22 Codexis, Inc. Biocatalysts and methods for the synthesis of (s)-3-(1-aminoethyl)-phenol
EP2606139B1 (en) * 2010-08-16 2015-07-15 Codexis, Inc. Biocatalysts and methods for the synthesis of (1r,2r)-2-(3,4-dimethoxyphenethoxy)cyclohexanamine
CN103998461B (zh) * 2011-09-08 2018-02-02 科德克希思公司 用于合成取代的内酰胺的生物催化剂和方法
EP2935572B1 (en) * 2012-12-21 2020-09-30 Codexis, Inc. Engineered biocatalysts and methods for synthesizing chiral amines
SI2961844T1 (sl) * 2013-02-28 2018-11-30 Codexis, Inc. Spremenjeni polipeptidi transaminaze za industrijsko biokatalizo

Also Published As

Publication number Publication date
EP3911738A1 (en) 2021-11-24
US20220090033A1 (en) 2022-03-24
EP3911738A4 (en) 2023-03-01
IL284588A (en) 2021-08-31
CN113396218A (zh) 2021-09-14
WO2020150125A1 (en) 2020-07-23
SG11202106617VA (en) 2021-07-29
CA3126671A1 (en) 2020-07-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11034939B2 (en) Engineered biocatalysts and methods for synthesizing chiral amines
JP7212972B2 (ja) 産業上の生体触媒作用のための操作されたトランスアミナーゼポリペプチド
JP7462969B2 (ja) 操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼ
JP2022065092A (ja) 操作されたイミンレダクターゼ、ならびにケトン化合物およびアミン化合物の還元的アミノ化のための方法
JP2022533010A (ja) 操作されたイミンレダクターゼ、ならびにケトンおよびアミン化合物の還元的アミノ化のための方法
EP4133064A2 (en) Engineered transaminase polypeptides
JP2022518212A (ja) 操作されたトランスアミナーゼポリペプチド
WO2022066534A1 (en) Engineered biocatalysts and methods for synthesizing chiral amines
WO2023173058A2 (en) Engineered monoamine oxidases for the preparation of stereomerically pure fused bicyclic proline compounds
KR20240045297A (ko) 조작된 뉴클레오시드 데옥시리보실트랜스퍼라제 변이체 효소

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20221222

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20231127

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20240221

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20240426