JP2022533010A - 操作されたイミンレダクターゼ、ならびにケトンおよびアミン化合物の還元的アミノ化のための方法 - Google Patents
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Abstract
本出願はイミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチド、操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、操作されたポリペプチドを発現することができる宿主細胞、ならびに第二級および第三級アミン生成物化合物を調製するためにこれらの操作されたポリペプチドとさまざまなケトンおよびアミン基質化合物とを使用する方法を提供する。発明は、上述の少なくとも１つの操作されたポリヌクレオチドを含むベクターをさらに提供する。一部の実施形態では、ベクターは、少なくとも１つの制御配列をさらに含む。
Description
本出願は、２０１９年５月１日に出願された米国仮特許出願第６２／８４１，６３３号の優先権を主張するものであり、これはあらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。
本発明は第二級アミンの産生に有用なイミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチド、ならびにこれらの操作されたポリペプチドを利用した組成物および方法を提供する。
配列表、表またはコンピュータプログラムへの参照
配列表の正式な写しは、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式のテキストファイルとして明細書と同時に提出されており、ファイル名「ＣＸ２－１８６ＷＯ１＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」、作成日２０２０年４月２１日、およびサイズ１．７６メガバイトである。ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出された配列表は明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。
配列表の正式な写しは、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式のテキストファイルとして明細書と同時に提出されており、ファイル名「ＣＸ２－１８６ＷＯ１＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」、作成日２０２０年４月２１日、およびサイズ１．７６メガバイトである。ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出された配列表は明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。
キラル第二級アミンは医薬品産業における重要な構成要素である。しかし、このクラスのキラルアミン化合物を生成することが公知の生体触媒経路はほんの一握りである。現存する化学的方法は、キラルホウ素試薬、遷移金属ベースの還元法、またはイミンを全体的に還元するためのマルチステップ合成を必要とする保護基戦略を使用する。
安定な環式アミンの生体触媒合成の文献においていくつかの報告が存在する。イミンレダクターゼまたは「ＩＲＥＤ」はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＧＦ３５８７およびＧＦ３５４６から精製され、特徴付けられており、２－メチル－１－ピロリンを立体選択的に還元することが示されている（Ｍｉｔｓｕｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ７５：１７７８－１７８２ ［２０１１）］；Ｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｃｈｅｍ． Ｃａｔ． Ｃｈｅｍ．， ６：２２４８－２２５２ ［２０１４］を参照のこと）。アルキル基を有する非環式アミンおよびアミノ酸への還元も天然イミンレダクターゼを使用して示されている（Ｇａｎｄ ｅｔ． ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｃａｔａｌ． Ｂ： Ｅｎｚｙｍ．， １１０：１２６－１３２ ［２０１４］）。最近になって、ＩＲＥＤが他の著者らによって報告されており、これは還元性アミン（ＲｅｄＡｍ）とも称され、合成的に興味深い還元的アミノ化を触媒する（Ｇｒｏｇａｎ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．， ２０１８， ４３， １５－２２、Ｆｒａｎｃｅ ｅｔ ａｌ．， ＣｈｅｍＣａｔＣｈｅｍ．， ２０１８， １０（３）， ５１０－５１４、Ａｌｅｋｕ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｃｈｅｍ．， ２０１７，９， ９６１－９６９およびＣｈｅｍＣａｔＣｈｅｍ．， ２０１８， １０（３）， ５１５－５１９、Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．， ＡＣＳ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ ２０１８， ８（１２）， １１５３４－１１５４１およびＡｄｖ． Ｓｙｎｔｈ． Ｃａｔａｌ．， ２０１７， ３５９（１２）， ２０１１－２０１５、Ｒｏｉｂａｎ ｅｔ ａｌ．， ＣｈｅｍＣａｔＣｈｅｍ．， ２０１７， ９（２４）， ４４７５－４４７９）。
安定な環式アミンの生体触媒合成の文献においていくつかの報告が存在する。イミンレダクターゼまたは「ＩＲＥＤ」はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＧＦ３５８７およびＧＦ３５４６から精製され、特徴付けられており、２－メチル－１－ピロリンを立体選択的に還元することが示されている（Ｍｉｔｓｕｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ７５：１７７８－１７８２ ［２０１１）］；Ｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｃｈｅｍ． Ｃａｔ． Ｃｈｅｍ．， ６：２２４８－２２５２ ［２０１４］を参照のこと）。アルキル基を有する非環式アミンおよびアミノ酸への還元も天然イミンレダクターゼを使用して示されている（Ｇａｎｄ ｅｔ． ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｃａｔａｌ． Ｂ： Ｅｎｚｙｍ．， １１０：１２６－１３２ ［２０１４］）。最近になって、ＩＲＥＤが他の著者らによって報告されており、これは還元性アミン（ＲｅｄＡｍ）とも称され、合成的に興味深い還元的アミノ化を触媒する（Ｇｒｏｇａｎ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．， ２０１８， ４３， １５－２２、Ｆｒａｎｃｅ ｅｔ ａｌ．， ＣｈｅｍＣａｔＣｈｅｍ．， ２０１８， １０（３）， ５１０－５１４、Ａｌｅｋｕ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｃｈｅｍ．， ２０１７，９， ９６１－９６９およびＣｈｅｍＣａｔＣｈｅｍ．， ２０１８， １０（３）， ５１５－５１９、Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．， ＡＣＳ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ ２０１８， ８（１２）， １１５３４－１１５４１およびＡｄｖ． Ｓｙｎｔｈ． Ｃａｔａｌ．， ２０１７， ３５９（１２）， ２０１１－２０１５、Ｒｏｉｂａｎ ｅｔ ａｌ．， ＣｈｅｍＣａｔＣｈｅｍ．， ２０１７， ９（２４）， ４４７５－４４７９）。
Ｇｒｏｇａｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．（２０１８）４３、１５～２２
Ｆｒａｎｃｅら、ＣｈｅｍＣａｔＣｈｅｍ．（２０１８）１０（３） ５１０～５１４
Ａｌｅｋｕら、Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．（２０１７）９、９６１～９６９
Ａｌｅｋｕら、ＣｈｅｍＣａｔＣｈｅｍ．（２０１８）１０（３）５１５～５１９
キラル第二級および第三級アミンを合成するために産業的に適用可能な条件下でこれらを使用するための生体触媒およびプロセスが当技術分野において必要とされている。
本発明は、イミン基質を直接還元することによってキラル第二級アミンを合成するための新規な生体触媒および関連する使用方法を提供する。本開示の生体触媒は、配列番号２のアミノ酸配列を有するオパインデヒドロゲナーゼをコードする、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．株１Ｃからの野生型遺伝子由来の操作されたポリペプチドバリアントである。これらの操作されたポリペプチドはイミンレダクターゼ活性を有し、ケトンまたはアルデヒド基質、および第一級または第二級アミン基質の変換を触媒して、第二級または第三級アミン生成物化合物を形成することができる。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号４、１６、５０、３０６、６４８、および７０８からなる群から選択される参照アミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、参照アミノ配列と比較した１つまたは複数の残基の差異をさらに含む、イミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。イミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドの一部の実施形態では、イミンレダクターゼ活性は、スキーム１の活性；必要に応じて、表２で開示される反応；必要に応じて、式（Ｖ）の化合物および式（ＶＩ）の化合物を式（ＩＶ）の生成物化合物に変換する反応；および必要に応じて、化合物（２）および化合物（３）を生成物化合物（１）に変換する反応である。
本発明は、配列番号４の参照配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む操作されたポリペプチドであって、１４５、１４６、１５３、１６０、２２２、２２３、２２６、および２６１から選択される１つまたは複数の位置において少なくとも１つの置換または置換セットを含み、その位置が配列番号４を参照して番号を付されている操作されたポリペプチドを提供する。一部の追加の実施形態では、操作されたポリペプチドは、Ｅ１４５Ｉ、Ｅ１４５Ｖ、Ｒ１４６Ａ、Ｎ１５３Ｌ、Ｎ１５３Ｒ、Ｄ１６０Ｔ、Ｙ２２２Ｆ、Ｙ２２２Ｗ、Ｌ２２３Ａ、Ｌ２２３Ｇ、Ｌ２２３Ｉ、Ｌ２２３Ｓ、Ｌ２２３Ｖ、Ｉ２２６Ｍ、およびＥ２６１Ｔから選択される少なくとも１つの置換を含み、その位置は配列番号４を参照して番号を付されている。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、Ｅ１４５Ｉ、Ｅ１４５Ｖ、Ｒ１４６Ａ、Ｎ１５３Ｌ、Ｎ１５３Ｒ、Ｄ１６０Ｔ、Ｙ２２２Ｆ、Ｙ２２２Ｗ、Ｌ２２３Ａ、Ｌ２２３Ｇ、Ｌ２２３Ｉ、Ｌ２２３Ｓ、Ｌ２２３Ｖ、Ｉ２２６Ｍ、およびＥ２６１Ｔから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、その位置は配列番号４を参照して番号を付されている。一部のさらなる実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号６から配列番号８０２において示す任意の偶数番号の配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本発明は、配列番号１６の参照配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む操作されたポリペプチドであって、２９／９４／１８４／２２３／２３２／２８８／２９３、２９／９４／１８４／２３２／２８７／２８８／２９３／３１１、２９／９４／１８４／２３２／２８７／２８８／３１１、２９／９４／１８４／２３２／２８７／２９３／３３２、２９／９４／１８４／２３２／２８８／２９３／３１１／３２４／３５３、２９／９４／１８４／２３２／２８８／３１１／３２４／３３２、２９／９４／１８４／２３２／２９３、２９／９４／１８４／２３２／３１１、２９／９４／１８４／２８７／２９３、２９／９４／１８４／２８７／２９３／３１１／３５３、２９／９４／１８４／２８７／３１１、２９／９４／１８４／２８８／２９３／３２４、２９／９４／１８４／２８８／２９３／３３２／３５３、２９／９４／１８４／２８８／２９８／３３２、２９／９４／１８４／２８８／３５３、２９／９４／１８４／２９３／３１１、２９／９４／１８４／３２４、２９／９４／２２３／２３２／２８７、２９／９４／２２３／２３２／２９３／３１１／３２４、２９／９４／２２３／２８８／２９３、２９／９４／２３２／２８７／２８８／３１１、２９／９４／２３２／２８８／２９３、２９／９４／２８７／２８８／２９３、２９／９４／２８７／２８８／２９３／３５３、２９／９４／２８７／３１１、２９／９４／２９３／３１１／３２４、２９／９４／２９３／３３２／３５３、２９／９４／３１１、２９／９４／３２４／３５３、２９／１８４、２９／１８４／２２３／２８８／２９３／３２４、２９／１８４／２３２／２８８、２９／１８４／２８７、２９／１８４／２８７／２８８／２９３、２９／１８４／２８７／２８８／２９３／３１１、２９／１８４／２８７／３１１／３３２、２９／１８４／２８８／２９３、２９／１８４／２８８／２９３／３１１、２９／１８４／２９３、２９／１８４／２９３／３１１、２９／１８４／２９３／３２４、２９／１８４／３５３、２９／２２３／２８７／２８８／２９３／３５３、２９／２３２／２８７／２８８／２９３／３３２／３５３、２９／２８７／２８８／２９３、２９／２８７／２８８／２９３／３２４／３５３、２９／２８８／２９３、２９／３１１、２９／３１１／３３２、２９／３５３、７２／９４／１８４／２８８／３１１、８６、９４／９６／２２３／２８７／２８８／２９３／３１１／３２４／３３２、９４／９９／１８４／２９３／３１１／３３２／３５３、９４／１８４／２２３、９４／１８４／２２３／２３２／２８７／３１１、９４／１８４／２２３／２８８／２９３、９４／１８４／２２３／２９３、９４／１８４／２３２／２８７／２８８、９４／１８４／２３２／２８７／２８８／３２４／３３２、９４／１８４／２３２／２８７／２９３、９４／１８４／２３２／２８７／２９３／３３２、９４／１８４／２８７／２８８／２９３、９４／１８４／２８７／２８８／３１１、９４／１８４／２８７／２９３／３１１／３２４／３５３、９４／１８４／２８７／３１１、９４／１８４／２８７／３５３、９４／１８４／２８８／２９３、９４／１８４／２８８／２９３／３１１、９４／１８４／２８８／２９３／３１１／３３２、９４／１８４／２９３、９４／１８４／２９３／３１１、９４／１８４／２９３／３３２／３５３、９４／２２３／２３２／３１１／３５３／３５５／３５６／３５７／３５８／３５９、９４／２２３／２８７／２８８／２９３、９４／２２３／２８８／２９３／３１１、９４／２３２／２８７／２８８／２９３／３５３、９４／２３２／２８８／２９３／３５３、９４／２３２／２９３、９４／２３２／２９３／３２４／３３２、９４／２３２／３１１、９４／２８７／２８８／２９３、９４／２８７／２８８／３１１／３２４、９４／２８８／２９３、９４／２８８／２９３／３２４、９４／２９３／３２４、９４／３１１／３２４、１５３、１８４／２２３、１８４／２２３／２８７／２８８／３５３、１８４／２３２／２８７／２８８／２９３／３１１、１８４／２３２／２８７／２８８／３２４／３５３、１８４／２３２／２８７／２９３／３３２、１８４／２８７／２８８、１８４／２８７／２８８／２９３、１８４／２８７／２８８／２９３／３２４／３５３、１８４／２８７／２９３、１８４／２８７／２９３／３１１、１８４／２８８／２９３／３１１／３２４、１８４／３３２／３５３、２０５、２２３／２３２／２８７／２８８／３３２／３５３、２２３／２８７／２８８、２２３／２８７／２８８／２９３／３１１、２２３／２８７／３１１／３５３、２２３／２８８／２９３、２３２／２８７／２８８／２９３、２３２／２８７／２８８／２９３／３１１、２３２／２８７／２８８／２９３／３２１、２３２／２８７／３１１、２３２／２８８／２９３、２３２／２８８／２９３／３３２、２３４／２８７／２８８／２９３／３１１、２８７／２８８／２９３、２８７／２８８／３１１／３２４、２８７／２９３、２８７／３１１、２８７／３１１／３３２、２８７／３２４、２８８／２９３、２８８／２９３／３１１／３２４／３５３、２８８／２９３／３２４、２９３／３１１、および３１１／３３２から選択される１つまたは複数の位置において少なくとも１つの置換または１つの置換セットを含み、その位置が配列番号１６を参照して番号を付されている操作されたポリペプチドを提供する。一部の追加の実施形態では、操作されたポリペプチドは、２９Ｒ／９４Ｋ／１８４Ｑ／２８８Ｓ／３５３Ｅ、２９Ｒ／９４Ｋ／１８４Ｒ／２３２Ａ／２８８Ｓ／２９３Ｆ／３１１Ｖ／３２４Ｌ／３５３Ｅ、２９Ｒ／９４Ｋ／１８４Ｒ／２８７Ｔ／２９３Ｆ、２９Ｒ／９４Ｋ／１８４Ｒ／２８８Ｓ／２９３Ｑ／３３２Ｖ／３５３Ｅ、２９Ｒ／９４Ｋ／１８４Ｒ／３２４Ｌ、２９Ｒ／９４Ｋ／２２３Ｓ／２３２Ａ／２８７Ｋ、２９Ｒ／９４Ｋ／２３２Ａ／２８７Ｔ／２８８Ｓ／３１１Ｖ、２９Ｒ／９４Ｋ／２３２Ａ／２８８Ｓ／２９３Ｆ、２９Ｒ／９４Ｋ／２８７Ｋ／３１１Ｖ、２９Ｒ／９４Ｋ／２８７Ｔ／２８８Ｓ／２９３Ｆ、２９Ｒ／９４Ｋ／２９３Ｈ／３１１Ｖ／３２４Ｌ、２９Ｒ／９４Ｋ／３２４Ｌ／３５３Ｅ、２９Ｒ／９４Ｒ／１８４Ｑ／２２３Ｓ／２３２Ａ／２８８Ｓ／２９３Ｆ、２９Ｒ／９４Ｒ／１８４Ｑ／２３２Ａ／２８７Ｔ／２９３Ｆ／３３２Ｖ、２９Ｒ／９４Ｒ／１８４Ｑ／２３２Ａ／２８８Ｓ／３１１Ｖ／３２４Ｌ／３３２Ｖ、２９Ｒ／９４Ｒ／１８４Ｑ／２８７Ｋ／２９３Ｆ／３１１Ｖ／３５３Ｅ、２９Ｒ／９４Ｒ／１８４Ｑ／２８７Ｋ／３１１Ｖ、２９Ｒ／９４Ｒ／１８４Ｑ／２８８Ｓ／２９３Ｆ／３２４Ｌ、２９Ｒ／９４Ｒ／１８４Ｒ／２３２Ａ／２８７Ｋ／２８８Ｓ／２９３Ｆ／３１１Ｖ、２９Ｒ／９４Ｒ／１８４Ｒ／２３２Ａ／２８７Ｔ／２８８Ｓ／３１１Ｖ、２９Ｒ／９４Ｒ／１８４Ｒ／２３２Ａ／２９３Ｆ、２９Ｒ／９４Ｒ／１８４Ｒ／２３２Ａ／３１１Ｖ、２９Ｒ／９４Ｒ／１８４Ｒ／２８８Ｓ／２９８Ａ／３３２Ｖ、２９Ｒ／９４Ｒ／１８４Ｒ／２９３Ｆ／３１１Ｖ、２９Ｒ／９４Ｒ／２２３Ｓ／２８８Ｓ／２９３Ｆ、２９Ｒ／９４Ｒ／２２３Ｔ／２３２Ａ／２９３Ｈ／３１１Ｖ／３２４Ｌ、２９Ｒ／９４Ｒ／２８７Ｋ／２８８Ｓ／２９３Ｆ、２９Ｒ／９４Ｒ／２８７Ｔ／２８８Ｓ／２９３Ｆ、２９Ｒ／９４Ｒ／２８７Ｔ／２８８Ｓ／２９３Ｆ／３５３Ｅ、２９Ｒ／９４Ｒ／２９３Ｆ／３３２Ｖ／３５３Ｅ、２９Ｒ／９４Ｒ／３１１Ｖ、２９Ｒ／１８４Ｑ／２２３Ｓ／２８８Ｓ／２９３Ｆ／３２４Ｌ、２９Ｒ／１８４Ｑ／２８７Ｔ／２８８Ｓ／２９３Ｆ、２９Ｒ／１８４Ｒ、２９Ｒ／１８４Ｒ／２３２Ａ／２８８Ｓ、２９Ｒ／１８４Ｒ／２８７Ｋ／２８８Ｓ／２９３Ｆ／３１１Ｖ、２９Ｒ／１８４Ｒ／２８７Ｋ／３１１Ｖ／３３２Ｖ、２９Ｒ／１８４Ｒ／２８７Ｔ、２９Ｒ／１８４Ｒ／２８８Ｓ／２９３Ｆ、２９Ｒ／１８４Ｒ／２８８Ｓ／２９３Ｆ／３１１Ｖ、２９Ｒ／１８４Ｒ／２９３Ｆ、２９Ｒ／１８４Ｒ／２９３Ｆ／３１１Ｖ、２９Ｒ／１８４Ｒ／２９３Ｆ／３２４Ｌ、２９Ｒ／１８４Ｒ／３５３Ｅ、２９Ｒ／２２３Ｔ／２８７Ｔ／２８８Ｓ／２９３Ｆ／３５３Ｅ、２９Ｒ／２３２Ａ／２８７Ｔ／２８８Ｓ／２９３Ｑ／３３２Ｖ／３５３Ｅ、２９Ｒ／２８７Ｔ／２８８Ｓ／２９３Ｆ、２９Ｒ／２８７Ｔ／２８８Ｓ／２９３Ｆ／３２４Ｌ／３５３Ｅ、２９Ｒ／２８８Ｓ／２９３Ｆ、２９Ｒ／３１１Ｖ、２９Ｒ／３１１Ｖ／３３２Ｖ、２９Ｒ／３５３Ｅ、７２Ｖ／９４Ｒ／１８４Ｒ／２８８Ｓ／３１１Ｖ、８６Ｑ、９４Ｋ／９６Ｖ／２２３Ｔ／２８７Ｋ／２８８Ｓ／２９３Ｆ／３１１Ｖ／３２４Ｌ／３３２Ｖ、９４Ｋ／１８４Ｑ／２３２Ａ／２８７Ｔ／２９３Ｆ、９４Ｋ／１８４Ｑ／２３２Ａ／２８７Ｔ／２９３Ｆ／３３２Ｖ、９４Ｋ／１８４Ｑ／２８７Ｔ／２９３Ｆ／３１１Ｖ／３２４Ｌ／３５３Ｅ、９４Ｋ／１８４Ｒ／２２３Ｓ／２８８Ｓ／２９３Ｆ、９４Ｋ／１８４Ｒ／２２３Ｔ／２３２Ａ／２８７Ｋ／３１１Ｖ、９４Ｋ／１８４Ｒ／２３２Ａ／２８７Ｋ／２８８Ｓ、９４Ｋ／１８４Ｒ／２８７Ｔ／３１１Ｖ、９４Ｋ／１８４Ｒ／２８７Ｔ／３５３Ｅ、９４Ｋ／１８４Ｒ／２８８Ｓ／２９３Ｆ／３１１Ｖ、９４Ｋ／１８４Ｒ／２９３Ｈ／３１１Ｖ、９４Ｋ／２８７Ｋ／２８８Ｓ／２９３Ｆ、９４Ｋ／２８７Ｔ／２８８Ｓ／３１１Ｖ／３２４Ｌ、９４Ｋ／２８８Ｓ／２９３Ｆ、９４Ｋ／２８８Ｓ／２９３Ｆ／３２４Ｌ、９４Ｋ／３１１Ｖ／３２４Ｌ、９４Ｒ／９９Ｔ／１８４Ｒ／２９３Ｆ／３１１Ｖ／３３２Ｖ／３５３Ｅ、９４Ｒ／１８４Ｑ／２８７Ｋ／２８８Ｓ／３１１Ｖ、９４Ｒ／１８４Ｑ／２８８Ｓ／２９３Ｆ／３１１Ｖ、９４Ｒ／１８４Ｑ／２９３Ｆ／３３２Ｖ／３５３Ｅ、９４Ｒ／１８４Ｒ／２２３Ｓ、９４Ｒ／１８４Ｒ／２２３Ｓ／２９３Ｆ、９４Ｒ／１８４Ｒ／２３２Ａ／２８７Ｋ／２８８Ｓ／３２４Ｌ／３３２Ｖ、９４Ｒ／１８４Ｒ／２８７Ｋ／２８８Ｓ／２９３Ｆ、９４Ｒ／１８４Ｒ／２８７Ｋ／２８８Ｓ／３１１Ｖ、９４Ｒ／１８４Ｒ／２８８Ｓ／２９３Ｆ、９４Ｒ／１８４Ｒ／２８８Ｓ／２９３Ｆ／３１１Ｖ／３３２Ｖ、９４Ｒ／１８４Ｒ／２９３Ｆ、９４Ｒ／２２３Ｓ／２３２Ａ／３１１Ｖ／３５３Ｅ／３５５Ｋ／３５６Ｋ／３５７Ｃ／３５８Ｃ／３５９－、９４Ｒ／２２３Ｓ／２８７Ｋ／２８８Ｓ／２９３Ｆ、９４Ｒ／２２３Ｓ／２８８Ｓ／２９３Ｆ／３１１Ｖ、９４Ｒ／２３２Ａ／２８７Ｋ／２８８Ｓ／２９３Ｆ／３５３Ｅ、９４Ｒ／２３２Ａ／２８８Ｓ／２９３Ｆ／３５３Ｅ、９４Ｒ／２３２Ａ／２９３Ｆ、９４Ｒ／２３２Ａ／２９３Ｆ／３２４Ｌ／３３２Ｖ、９４Ｒ／２３２Ａ／３１１Ｖ、９４Ｒ／２８７Ｋ／２８８Ｓ／２９３Ｆ、９４Ｒ／２８７Ｔ／２８８Ｓ／２９３Ｆ、９４Ｒ／２９３Ｆ／３２４Ｌ、９４Ｒ／３１１Ｖ／３２４Ｌ、１５３Ｙ、１８４Ｑ／２２３Ｔ／２８７Ｋ／２８８Ｓ／３５３Ｅ、１８４Ｑ／２３２Ａ／２８７Ｋ／２８８Ｓ／２９３Ｆ／３１１Ｖ、１８４Ｑ／２３２Ａ／２８７Ｋ／２８８Ｓ／３２４Ｌ／３５３Ｅ、１８４Ｑ／２８７Ｋ／２９３Ｆ、１８４Ｒ／２２３Ｔ、１８４Ｒ／２３２Ａ／２８７Ｋ／２９３Ｆ／３３２Ｖ、１８４Ｒ／２８７Ｋ／２９３Ｆ／３１１Ｖ、１８４Ｒ／２８７Ｔ／２８８Ｓ、１８４Ｒ／２８７Ｔ／２８８Ｓ／２９３Ｆ、１８４Ｒ／２８７Ｔ／２８８Ｓ／２９３Ｆ／３２４Ｌ／３５３Ｅ、１８４Ｒ／２８７Ｔ／２８８Ｓ／２９３Ｑ、１８４Ｒ／２８８Ｓ／２９３Ｈ／３１１Ｖ／３２４Ｌ、１８４Ｒ／３３２Ｖ／３５３Ｅ、２０５Ｉ、２０５Ｖ、２２３Ｓ／２３２Ａ／２８７Ｋ／２８８Ｓ／３３２Ｖ／３５３Ｅ、２２３Ｓ／２８７Ｋ／２８８Ｓ／２９３Ｆ／３１１Ｖ、２２３Ｓ／２８７Ｋ／３１１Ｖ／３５３Ｅ、２２３Ｓ／２８７Ｔ／２８８Ｓ、２２３Ｓ／２８８Ｓ／２９３Ｆ、２３２Ａ／２８７Ｋ／２８８Ｓ／２９３Ｆ、２３２Ａ／２８７Ｋ／２８８Ｓ／２９３Ｆ／３１１Ｖ、２３２Ａ／２８７Ｋ／３１１Ｖ、２３２Ａ／２８７Ｔ／２８８Ｓ／２９３Ｆ／３２１Ｖ、２３２Ａ／２８８Ｓ／２９３Ｆ、２３２Ａ／２８８Ｓ／２９３Ｆ／３３２Ｖ、２３４Ｖ／２８７Ｋ／２８８Ｓ／２９３Ｆ／３１１Ｖ、２８７Ｋ／２８８Ｓ／２９３Ｆ、２８７Ｋ／
２９３Ｆ、２８７Ｋ／３１１Ｖ／３３２Ｖ、２８７Ｋ／３２４Ｌ、２８７Ｔ／２８８Ｓ／３１１Ｖ／３２４Ｌ、２８７Ｔ／３１１Ｖ、２８８Ｓ／２９３Ｆ、２８８Ｓ／２９３Ｆ／３１１Ｖ／３２４Ｌ／３５３Ｅ、２８８Ｓ／２９３Ｆ／３２４Ｌ、２９３Ｆ／３１１Ｖ、および３１１Ｖ／３３２Ｖから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、その位置は配列番号１６を参照して番号を付されている。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｑ／Ｎ２８８Ｓ／Ｇ３５３Ｅ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ／Ｄ３２４Ｌ／Ｇ３５３Ｅ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｒ／Ｉ２８７Ｔ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｒ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｑ／Ｔ３３２Ｖ／Ｇ３５３Ｅ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｒ／Ｄ３２４Ｌ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｋ／Ｌ２２３Ｓ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｋ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｋ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ａ３１１Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｋ／Ｓ２３２Ａ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｋ／Ｉ２８７Ｋ／Ａ３１１Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｋ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｋ／Ｙ２９３Ｈ／Ａ３１１Ｖ／Ｄ３２４Ｌ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｋ／Ｄ３２４Ｌ／Ｇ３５３Ｅ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｑ／Ｌ２２３Ｓ／Ｓ２３２Ａ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｑ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｔ／Ｙ２９３Ｆ／Ｔ３３２Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｑ／Ｓ２３２Ａ／Ｎ２８８Ｓ／Ａ３１１Ｖ／Ｄ３２４Ｌ／Ｔ３３２Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｑ／Ｉ２８７Ｋ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ／Ｇ３５３Ｅ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｑ／Ｉ２８７Ｋ／Ａ３１１Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｑ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ｄ３２４Ｌ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ａ３１１Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ａ３１１Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｎ２８８Ｓ／Ｖ２９８Ａ／Ｔ３３２Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｌ２２３Ｓ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｌ２２３Ｔ／Ｓ２３２Ａ／Ｙ２９３Ｈ／Ａ３１１Ｖ／Ｄ３２４Ｌ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ｇ３５３Ｅ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｙ２９３Ｆ／Ｔ３３２Ｖ／Ｇ３５３Ｅ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ａ３１１Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｖ１８４Ｑ／Ｌ２２３Ｓ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ｄ３２４Ｌ、Ｓ２９Ｒ／Ｖ１８４Ｑ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２９Ｒ／Ｖ１８４Ｒ、Ｓ２９Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ｎ２８８Ｓ、Ｓ２９Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｉ２８７Ｋ／Ａ３１１Ｖ／Ｔ３３２Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｉ２８７Ｔ、Ｓ２９Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２９Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２９Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｙ２９３Ｆ／Ｄ３２４Ｌ、Ｓ２９Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｇ３５３Ｅ、Ｓ２９Ｒ／Ｌ２２３Ｔ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ｇ３５３Ｅ、Ｓ２９Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｑ／Ｔ３３２Ｖ／Ｇ３５３Ｅ、Ｓ２９Ｒ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２９Ｒ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ｄ３２４Ｌ／Ｇ３５３Ｅ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２９Ｒ／Ａ３１１Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ａ３１１Ｖ／Ｔ３３２Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｇ３５３Ｅ、Ａ７２Ｖ／Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｎ２８８Ｓ／Ａ３１１Ｖ、Ｉ８６Ｑ、Ｎ９４Ｋ／Ａ９６Ｖ／Ｌ２２３Ｔ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ／Ｄ３２４Ｌ／Ｔ３３２Ｖ、Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｑ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｔ／Ｙ２９３Ｆ、Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｑ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｔ／Ｙ２９３Ｆ／Ｔ３３２Ｖ、Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｑ／Ｉ２８７Ｔ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ／Ｄ３２４Ｌ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｒ／Ｌ２２３Ｓ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｒ／Ｌ２２３Ｔ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｋ／Ａ３１１Ｖ、Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ、Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｒ／Ｉ２８７Ｔ／Ａ３１１Ｖ、Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｒ／Ｉ２８７Ｔ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｒ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ、Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｒ／Ｙ２９３Ｈ／Ａ３１１Ｖ、Ｎ９４Ｋ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｎ９４Ｋ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ａ３１１Ｖ／Ｄ３２４Ｌ、Ｎ９４Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｎ９４Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ｄ３２４Ｌ、Ｎ９４Ｋ／Ａ３１１Ｖ／Ｄ３２４Ｌ、Ｎ９４Ｒ／Ｉ９９Ｔ／Ｖ１８４Ｒ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ／Ｔ３３２Ｖ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｑ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ａ３１１Ｖ、Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｑ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ、Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｑ／Ｙ２９３Ｆ／Ｔ３３２Ｖ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｌ２２３Ｓ、Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｌ２２３Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｄ３２４Ｌ／Ｔ３３２Ｖ、Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ａ３１１Ｖ、Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ／Ｔ３３２Ｖ、Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｙ２９３Ｆ、Ｎ９４Ｒ／Ｌ２２３Ｓ／Ｓ２３２Ａ／Ａ３１１Ｖ／Ｇ３５３Ｅ／Ｒ３５５Ｋ／Ｓ３５６Ｋ／Ａ３５７Ｃ／Ｖ３５８Ｃ／Ｅ３５９－、Ｎ９４Ｒ／Ｌ２２３Ｓ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｎ９４Ｒ／Ｌ２２３Ｓ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ、Ｎ９４Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ｙ２９３Ｆ、Ｎ９４Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ｙ２９３Ｆ／Ｄ３２４Ｌ／Ｔ３３２Ｖ、Ｎ９４Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ａ３１１Ｖ、Ｎ９４Ｒ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｎ９４Ｒ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｎ９４Ｒ／Ｙ２９３Ｆ／Ｄ３２４Ｌ、Ｎ９４Ｒ／Ａ３１１Ｖ／Ｄ３２４Ｌ、Ｎ１５３Ｙ、Ｖ１８４Ｑ／Ｌ２２３Ｔ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｇ３５３Ｅ、Ｖ１８４Ｑ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ、Ｖ１８４Ｑ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｄ３２４Ｌ／Ｇ３５３Ｅ、Ｖ１８４Ｑ／Ｉ２８７Ｋ／Ｙ２９３Ｆ、Ｖ１８４Ｒ／Ｌ２２３Ｔ、Ｖ１８４Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｋ／Ｙ２９３Ｆ／Ｔ３３２Ｖ、Ｖ１８４Ｒ／Ｉ２８７Ｋ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ、Ｖ１８４Ｒ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ、Ｖ１８４Ｒ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｖ１８４Ｒ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ｄ３２４Ｌ／Ｇ３５３Ｅ、Ｖ１８４Ｒ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｑ、Ｖ１８４Ｒ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｈ／Ａ３１１Ｖ／Ｄ３２４Ｌ、Ｖ１８４Ｒ／Ｔ３３２Ｖ／Ｇ３５３Ｅ、Ｐ２０５Ｉ、Ｐ２０５Ｖ、Ｌ２２３Ｓ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｔ３３２Ｖ／Ｇ３５３Ｅ、Ｌ２２３Ｓ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ、Ｌ２２３Ｓ／Ｉ２８７Ｋ／Ａ３１１Ｖ／Ｇ３５３Ｅ、Ｌ２２３Ｓ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ、Ｌ２２３Ｓ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ、Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｋ／Ａ３１１Ｖ、Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３２１Ｖ、Ｓ２３２Ａ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２３２Ａ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ｔ３３２Ｖ、Ａ２３４Ｖ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ、Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｉ２８７Ｋ／Ｙ２９３Ｆ、Ｉ２８７Ｋ／Ａ３１１Ｖ／Ｔ３３２Ｖ、Ｉ２８７Ｋ／Ｄ３２４Ｌ、Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ａ３１１Ｖ／Ｄ３２４Ｌ、Ｉ２８７Ｔ／Ａ３１１Ｖ、Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ／Ｄ３２４Ｌ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ｄ３２４Ｌ、Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ、およびＡ３１１Ｖ／Ｔ３３２Ｖから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、その位置は配列番号１６を参照して番号を付されている。
２９３Ｆ、２８７Ｋ／３１１Ｖ／３３２Ｖ、２８７Ｋ／３２４Ｌ、２８７Ｔ／２８８Ｓ／３１１Ｖ／３２４Ｌ、２８７Ｔ／３１１Ｖ、２８８Ｓ／２９３Ｆ、２８８Ｓ／２９３Ｆ／３１１Ｖ／３２４Ｌ／３５３Ｅ、２８８Ｓ／２９３Ｆ／３２４Ｌ、２９３Ｆ／３１１Ｖ、および３１１Ｖ／３３２Ｖから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、その位置は配列番号１６を参照して番号を付されている。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｑ／Ｎ２８８Ｓ／Ｇ３５３Ｅ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ／Ｄ３２４Ｌ／Ｇ３５３Ｅ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｒ／Ｉ２８７Ｔ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｒ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｑ／Ｔ３３２Ｖ／Ｇ３５３Ｅ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｒ／Ｄ３２４Ｌ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｋ／Ｌ２２３Ｓ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｋ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｋ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ａ３１１Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｋ／Ｓ２３２Ａ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｋ／Ｉ２８７Ｋ／Ａ３１１Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｋ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｋ／Ｙ２９３Ｈ／Ａ３１１Ｖ／Ｄ３２４Ｌ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｋ／Ｄ３２４Ｌ／Ｇ３５３Ｅ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｑ／Ｌ２２３Ｓ／Ｓ２３２Ａ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｑ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｔ／Ｙ２９３Ｆ／Ｔ３３２Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｑ／Ｓ２３２Ａ／Ｎ２８８Ｓ／Ａ３１１Ｖ／Ｄ３２４Ｌ／Ｔ３３２Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｑ／Ｉ２８７Ｋ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ／Ｇ３５３Ｅ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｑ／Ｉ２８７Ｋ／Ａ３１１Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｑ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ｄ３２４Ｌ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ａ３１１Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ａ３１１Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｎ２８８Ｓ／Ｖ２９８Ａ／Ｔ３３２Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｌ２２３Ｓ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｌ２２３Ｔ／Ｓ２３２Ａ／Ｙ２９３Ｈ／Ａ３１１Ｖ／Ｄ３２４Ｌ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ｇ３５３Ｅ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｙ２９３Ｆ／Ｔ３３２Ｖ／Ｇ３５３Ｅ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ａ３１１Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｖ１８４Ｑ／Ｌ２２３Ｓ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ｄ３２４Ｌ、Ｓ２９Ｒ／Ｖ１８４Ｑ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２９Ｒ／Ｖ１８４Ｒ、Ｓ２９Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ｎ２８８Ｓ、Ｓ２９Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｉ２８７Ｋ／Ａ３１１Ｖ／Ｔ３３２Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｉ２８７Ｔ、Ｓ２９Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２９Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２９Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｙ２９３Ｆ／Ｄ３２４Ｌ、Ｓ２９Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｇ３５３Ｅ、Ｓ２９Ｒ／Ｌ２２３Ｔ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ｇ３５３Ｅ、Ｓ２９Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｑ／Ｔ３３２Ｖ／Ｇ３５３Ｅ、Ｓ２９Ｒ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２９Ｒ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ｄ３２４Ｌ／Ｇ３５３Ｅ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２９Ｒ／Ａ３１１Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ａ３１１Ｖ／Ｔ３３２Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｇ３５３Ｅ、Ａ７２Ｖ／Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｎ２８８Ｓ／Ａ３１１Ｖ、Ｉ８６Ｑ、Ｎ９４Ｋ／Ａ９６Ｖ／Ｌ２２３Ｔ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ／Ｄ３２４Ｌ／Ｔ３３２Ｖ、Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｑ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｔ／Ｙ２９３Ｆ、Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｑ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｔ／Ｙ２９３Ｆ／Ｔ３３２Ｖ、Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｑ／Ｉ２８７Ｔ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ／Ｄ３２４Ｌ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｒ／Ｌ２２３Ｓ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｒ／Ｌ２２３Ｔ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｋ／Ａ３１１Ｖ、Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ、Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｒ／Ｉ２８７Ｔ／Ａ３１１Ｖ、Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｒ／Ｉ２８７Ｔ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｒ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ、Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｒ／Ｙ２９３Ｈ／Ａ３１１Ｖ、Ｎ９４Ｋ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｎ９４Ｋ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ａ３１１Ｖ／Ｄ３２４Ｌ、Ｎ９４Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｎ９４Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ｄ３２４Ｌ、Ｎ９４Ｋ／Ａ３１１Ｖ／Ｄ３２４Ｌ、Ｎ９４Ｒ／Ｉ９９Ｔ／Ｖ１８４Ｒ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ／Ｔ３３２Ｖ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｑ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ａ３１１Ｖ、Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｑ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ、Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｑ／Ｙ２９３Ｆ／Ｔ３３２Ｖ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｌ２２３Ｓ、Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｌ２２３Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｄ３２４Ｌ／Ｔ３３２Ｖ、Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ａ３１１Ｖ、Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ／Ｔ３３２Ｖ、Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｙ２９３Ｆ、Ｎ９４Ｒ／Ｌ２２３Ｓ／Ｓ２３２Ａ／Ａ３１１Ｖ／Ｇ３５３Ｅ／Ｒ３５５Ｋ／Ｓ３５６Ｋ／Ａ３５７Ｃ／Ｖ３５８Ｃ／Ｅ３５９－、Ｎ９４Ｒ／Ｌ２２３Ｓ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｎ９４Ｒ／Ｌ２２３Ｓ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ、Ｎ９４Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ｙ２９３Ｆ、Ｎ９４Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ｙ２９３Ｆ／Ｄ３２４Ｌ／Ｔ３３２Ｖ、Ｎ９４Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ａ３１１Ｖ、Ｎ９４Ｒ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｎ９４Ｒ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｎ９４Ｒ／Ｙ２９３Ｆ／Ｄ３２４Ｌ、Ｎ９４Ｒ／Ａ３１１Ｖ／Ｄ３２４Ｌ、Ｎ１５３Ｙ、Ｖ１８４Ｑ／Ｌ２２３Ｔ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｇ３５３Ｅ、Ｖ１８４Ｑ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ、Ｖ１８４Ｑ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｄ３２４Ｌ／Ｇ３５３Ｅ、Ｖ１８４Ｑ／Ｉ２８７Ｋ／Ｙ２９３Ｆ、Ｖ１８４Ｒ／Ｌ２２３Ｔ、Ｖ１８４Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｋ／Ｙ２９３Ｆ／Ｔ３３２Ｖ、Ｖ１８４Ｒ／Ｉ２８７Ｋ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ、Ｖ１８４Ｒ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ、Ｖ１８４Ｒ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｖ１８４Ｒ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ｄ３２４Ｌ／Ｇ３５３Ｅ、Ｖ１８４Ｒ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｑ、Ｖ１８４Ｒ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｈ／Ａ３１１Ｖ／Ｄ３２４Ｌ、Ｖ１８４Ｒ／Ｔ３３２Ｖ／Ｇ３５３Ｅ、Ｐ２０５Ｉ、Ｐ２０５Ｖ、Ｌ２２３Ｓ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｔ３３２Ｖ／Ｇ３５３Ｅ、Ｌ２２３Ｓ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ、Ｌ２２３Ｓ／Ｉ２８７Ｋ／Ａ３１１Ｖ／Ｇ３５３Ｅ、Ｌ２２３Ｓ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ、Ｌ２２３Ｓ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ、Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｋ／Ａ３１１Ｖ、Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３２１Ｖ、Ｓ２３２Ａ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２３２Ａ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ｔ３３２Ｖ、Ａ２３４Ｖ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ、Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｉ２８７Ｋ／Ｙ２９３Ｆ、Ｉ２８７Ｋ／Ａ３１１Ｖ／Ｔ３３２Ｖ、Ｉ２８７Ｋ／Ｄ３２４Ｌ、Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ａ３１１Ｖ／Ｄ３２４Ｌ、Ｉ２８７Ｔ／Ａ３１１Ｖ、Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ／Ｄ３２４Ｌ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ｄ３２４Ｌ、Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ、およびＡ３１１Ｖ／Ｔ３３２Ｖから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、その位置は配列番号１６を参照して番号を付されている。
本発明は、配列番号５０の参照配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む操作されたポリペプチドであって、２９／５７／９４／１５３／１８４／２０５／２６１／２６５／２８７、２９／５７／９４／１５３／２０５／２６５、２９／５７／９４／１８４／２０５／２７７／３５３、２９／５７／９４／２０５／２５９／２６１／２６５、２９／５７／９４／２０５／２６１／３５３、２９／５７／１５３／１８４／２０５／２５９／２６１／２６５／２７７、２９／５７／１５３／１８４／２０５／３５３、２９／５７／１５３／２０５／２６１／２６５、２９／５７／１５３／２０５／２６１／２６５／２７７、２９／５７／１５３／２０５／２６５／２７７、２９／５７／１５３／２０５／２７７／３５３、２９／５７／１８４／２０５／２５９／２６１／２６５／２７７／２８７／３５７、２９／５７／１８４／２０５／２５９／２６１／２６５／２８７、２９／５７／２０５／２５９／２６１／２６５、２９／５７／２０５／２５９／２６１／２６５／２８７、２９／５７／２０５／２６１／２６５／３５３、２９／９４／１５３／１８４／２０５、２９／９４／１５３／２０５／２５９／２６１／２６５、２９／９４／１５３／２０５／２５９／２６１／２８７、２９／９４／１５３／２０５／２５９／２６１／２８７／３５３、２９／９４／１８４／２０５／２５９／２６１、２９／９４／１８４／２０５／２６１、２９／９４／２０５、２９／９４／２０５／２５９／２６１／２８７、２９／９４／２０５／２６１、２９／９４／２６１／２６５／２８７／３５３、２９／１５３／１８４／２０５、２９／１５３／２０５、２９／１５３／２０５／２５９／２６１／２６５／２７７／２８７、２９／１５３／２６１／２６５／２８７／３５３、２９／１８４／２０５、２９／１８４／２０５／２５９／２６１／２７７、２９／１８４／２０５／３５３、２９／１８４／２６１／２６５、２９／１８４／２６５、２９／２０５、２９／２０５／２５９／２６１、２９／２０５／２５９／２６１／２６５／２８７、２９／２０５／２５９／２６１／２８７、２９／２０５／２６１、２９／２０５／２６１／２６５、２９／２０５／２６１／２６５／３５３、２９／２０５／２６１／３５３、２９／２０５／２７７、２９／２０５／２８７、２９／２０５／２８７／３５３、２９／２５９／２６１／２６５、２９／２６１／３５３、５７／９４／１５３／１８４／２０５／２５９／２６１、５７／９４／１５３／２０５／２６１／２６５、５７／９４／１５３／２５９／２６１／２６５、５７／９４／１５３／２６１／２６５、５７／９４／１８４／２０５／２６１／２６５／２８７、５７／９４／１８４／２６１／２６５／２８７、５７／９４／２０５／２５９、５７／９４／２０５／２５９／２６１／２６５／２７７／２８７、５７／９４／２０５／２６１／２６５、５７／９４／２０５／２７７、５７／１５３／２０５／２５９／２６１／２６５／２８７、５７／１５３／２０５／２５９／２６５／２７７、５７／１５３／２０５／２６１、５７／１５３／２０５／２６１／２６５、５７／１５３／２０５／２６５、５７／１５３／２６１／２６５、５７／１５３／２６１／２６５／２８７／３５３、５７／２０５、５７／２０５／２５９／２６１、５７／２０５／２５９／２６１／２６５／２７７／２８７／３５３、５７／２０５／２５９／２６１／２８７／３５３、５７／２０５／２５９／２６５、５７／２０５／２６１、５７／２０５／２６１／２６５／２７７／２８７／３５３、５７／２０５／２６１／２７７、５７／２０５／２６１／２７７／３５３、５７／２６１／２６５／３５３、９４／１２６／１８４／２０５／２５９／２６１／２６５、９４／１５３／１８４／２０５、９４／１５３／１８４／２５９／２６１／２６５、９４／１５３／２０５／２５９／２６１／２６５／３５３、９４／１５３／２０５／２８７、９４／１５３／２０５／２８７／３５３、９４／１５３／２０５／３５３、９４／１８４／２０５／２５９／２６１、９４／１８４／２０５／２５９／２６１／２６５／２８７、９４／１８４／２０５／２５９／２６１／３５３、９４／１８４／２０５／２６１／２６５／２８７／３５３、９４／１８４／３５３、９４／２０５、９４／２０５／２５９／２６１／２６５、９４／２０５／２５９／２６１／２６５／２７７／２８７、９４／２０５／２５９／２６１／２６５／３５３、９４／２０５／２５９／２６１／２８７／３５３、９４／２０５／２６１／２６５／２７７、９４／２０５／２６１／２６５／３５３、９４／２０５／２６１／３５３、９４／２０５／２７７、９４／２５９／２６１／２６５、１５３／１８４／２０５／２６１／２７７／２８７、１５３／１８４／２６１／２６５／２８７、１５３／２０５、１５３／２０５／２６１、１５３／２０５／２６１／２６５／２８７、１５３／２５９／２６１／２６５、１５３／２５９／２６５／２８７、１５３／２６１／２６５、１５３／２６１／２６５／２８７／３５３、１５３／２６５、１５３／２６５／２７７／２８７／３５３、１８４／２０５、１８４／２０５／２５９／２６１／２８７、１８４／２０５／２６１、１８４／２０５／２６１／２６５、１８４／２０５／２６１／２８７、１８４／２０５／２７７、１８４／２０５／２８７／３５３、１８４／２６１／２６５／２８７、２０２、２０５、２０５／２５９／２６１、２０５／２５９／２６１／２６５、２０５／２５９／２６１／２６５／２７７／２８７／３５３、２０５／２５９／２６１／２７７／２８７、２０５／２５９／２６５、２０５／２６１、２０５／２６１／２６５、２０５／２６１／２６５／２７４、２０５／２６１／２６５／２８７、２０５／２６１／２６５／２８７／３５３、２０５／２６１／２７７、２０５／２６１／３５３、２０５／２７７／２８７、２０５／２８７、２２３、２２５、２５６、２５９／２６１／２６５、２６１／２６５／２８７、２６５／２８７、２８３、および２９４から選択される１つまたは複数の位置において少なくとも１つの置換または置換セットを含み、その位置が配列番号５０を参照して番号を付されている操作されたポリペプチドを提供する。一部の追加の実施形態では、操作されたポリペプチドは、２９Ｓ／５７Ｇ／９４Ｋ／１５３Ｆ／１８４Ｒ／２０５Ｃ／２６１Ｌ／２６５Ｉ／２８７Ｔ、２９Ｓ／５７Ｇ／９４Ｋ／１５３Ｌ／２０５Ａ／２６５Ｉ、２９Ｓ／５７Ｇ／９４Ｋ／１８４Ｒ／２０５Ｃ／２７７Ｖ／３５３Ｅ、２９Ｓ／５７Ｇ／９４Ｋ／２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｓ／２６５Ｉ、２９Ｓ／５７Ｇ／９４Ｋ／２０５Ｃ／２６１Ｌ／３５３Ｅ、２９Ｓ／５７Ｇ／１５３Ｆ／１８４Ｒ／２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｖ／２６５Ｉ／２７７Ｖ、２９Ｓ／５７Ｇ／１５３Ｆ／２０５Ｃ／２６１Ｌ／２６５Ｉ／２７７Ｖ、２９Ｓ／５７Ｇ／１５３Ｆ／２０５Ｃ／２６１Ｖ／２６５Ｉ、２９Ｓ／５７Ｇ／１５３Ｆ／２０５Ｃ／２７７Ｖ／３５３Ｅ、２９Ｓ／５７Ｇ／１５３Ｌ／１８４Ｒ／２０５Ａ／３５３Ｅ、２９Ｓ／５７Ｇ／１５３Ｌ／２０５Ａ／２６５Ｉ／２７７Ｖ、２９Ｓ／５７Ｇ／１８４Ｒ／２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｌ／２６５Ｉ／２７７Ｖ／２８７Ｋ／３５７Ｓ、２９Ｓ／５７Ｇ／１８４Ｒ／２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｖ／２６５Ｉ／２８７Ｔ、２９Ｓ／５７Ｇ／２０５Ａ／２５９Ｆ／２６１Ｌ／２６５Ｉ／２８７Ｔ、２９Ｓ／５７Ｇ／２０５Ａ／２５９Ｆ／２６１Ｓ／２６５Ｉ、２９Ｓ／５７Ｇ／２０５Ｃ／２６１Ｓ／２６５Ｉ／３５３Ｅ、２９Ｓ／９４Ｋ／１５３Ｆ／２０５Ａ／２５９Ｆ／２６１Ｓ／２８７Ｔ／３５３Ｅ、２９Ｓ／９４Ｋ／１５３Ｆ／２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｌ／２８７Ｋ、２９Ｓ／９４Ｋ／１５３Ｌ／１８４Ｒ／２０５Ｃ、２９Ｓ／９４Ｋ／１５３Ｌ／２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｒ／２６５Ｉ、２９Ｓ／９４Ｋ／１８４Ｒ／２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｓ、２９Ｓ／９４Ｋ／１８４Ｒ／２０５Ｃ／２６１Ｖ、２９Ｓ／９４Ｋ／２０５Ａ、２９Ｓ／９４Ｋ／２０５Ａ／２６１Ｖ、２９Ｓ／９４Ｋ／２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｌ／２８７Ｔ、２９Ｓ／９４Ｋ／２６１Ｒ／２６５Ｉ／２８７Ｔ／３５３Ｅ、２９Ｓ／１５３Ｆ／１８４Ｒ／２０５Ｃ、２９Ｓ／１５３Ｆ／２０５Ａ、２９Ｓ／１５３Ｆ／２６１Ｒ／２６５Ｉ／２８７Ｋ／３５３Ｅ、２９Ｓ／１５３Ｌ／２０５Ａ／２５９Ｆ／２６１Ｌ／２６５Ｉ／２７７Ｖ／２８７Ｔ、２９Ｓ／１８４Ｒ／２０５Ａ、２９Ｓ／１８４Ｒ／２０５Ａ／３５３Ｅ、２９Ｓ／１８４Ｒ／２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｖ／２７７Ｖ、２９Ｓ／１８４Ｒ／２６１Ｌ／２６５Ｉ、２９Ｓ／１８４Ｒ／２６５Ｉ、２９Ｓ／２０５Ａ、２９Ｓ／２０５Ａ／２５９Ｆ／２６１Ｌ／２６５Ｉ／２８７Ｋ、２９Ｓ／２０５Ａ／２５９Ｆ／２６１Ｒ、２９Ｓ／２０５Ａ／２６１Ｖ、２９Ｓ／２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｌ、２９Ｓ／２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｌ／２６５Ｉ／２８７Ｔ、２９Ｓ／２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｌ／２８７Ｋ、２９Ｓ／２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｌ／２８７Ｔ、２９Ｓ／２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｓ、２９Ｓ／２０５Ｃ／２６１Ｌ、２９Ｓ／２０５Ｃ／２６１Ｌ／２６５Ｉ／３５３Ｅ、２９Ｓ／２０５Ｃ／２６１Ｒ／３５３Ｅ、２９Ｓ／２０５Ｃ／２６１Ｓ、２９Ｓ／２０５Ｃ／２６１Ｓ／２６５Ｉ、２９Ｓ／２０５Ｃ／２６１Ｖ／２６５Ｉ、２９Ｓ／２０５Ｃ／２７７Ｖ、２９Ｓ／２０５Ｃ／２８７Ｔ、２９Ｓ／２０５Ｃ／２８７Ｔ／３５３Ｅ、２９Ｓ／２５９Ｆ／２６１Ｌ／２６５Ｉ、２９Ｓ／２６１Ｖ／３５３Ｅ、５７Ｇ／９４Ｋ／１５３Ｆ／１８４Ｒ／２０５Ａ／２５９Ｆ／２６１Ｌ、５７Ｇ／９４Ｋ／１５３Ｆ／２０５Ａ／２６１Ｌ／２６５Ｉ、５７Ｇ／９４Ｋ／１５３Ｆ／２５９Ｆ／２６１Ｖ／２６５Ｉ、５７Ｇ／９４Ｋ／１５３Ｆ／２６１Ｖ／２６５Ｉ、５７Ｇ／９４Ｋ／１８４Ｒ／２０５Ｃ／２６１Ｖ／２６５Ｉ／２８７Ｔ、５７Ｇ／９４Ｋ／１８４Ｒ／２６１Ｓ／２６５Ｉ／２８７Ｔ、５７Ｇ／９４Ｋ／２０５Ａ／２５９Ｆ、５７Ｇ／９４Ｋ／２０５Ａ／２５９Ｆ／２６１Ｖ／２６５Ｉ／２７７Ｖ／２８７Ｔ、５７Ｇ／９４Ｋ／２０５Ａ／２７７Ｖ、５７Ｇ／９４Ｋ／２０５Ｃ／２５９Ｆ、５７Ｇ／９４Ｋ／２０５Ｃ／２６１Ｓ／２６５Ｉ、５７Ｇ／１５３Ｆ／２０５Ａ／２６１Ｌ／２６５Ｉ、５７Ｇ／１５３Ｆ／２０５Ａ／２６１Ｓ、５７Ｇ／１５３Ｆ／２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｌ／２６５Ｉ／２８７Ｔ、５７Ｇ／１５３Ｆ／２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６５Ｉ／２７７Ｖ、５７Ｇ／１５３Ｆ／２０５Ｃ／２６５Ｉ、５７Ｇ／１５３Ｆ／２６１Ｌ／２６５Ｉ／２８７Ｋ／３５３Ｅ、５７Ｇ／１５３Ｆ／２６１Ｒ／２６５Ｉ、５７Ｇ／２０５Ａ、５７Ｇ／２０５Ａ／２５９Ｆ／２６１Ｌ／２６５Ｉ／２７７Ｖ／２８７Ｋ／３５３Ｅ、５７Ｇ／２０５Ａ／２５９Ｆ／２６１Ｌ／２８７Ｔ／３５３Ｅ、５７Ｇ／２０５Ａ／２５９Ｆ／２６１Ｖ、５７Ｇ／２０５Ａ／２６１Ｒ、５７Ｇ／２０５Ｃ、５７Ｇ／２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６５Ｉ、５７Ｇ／２０５Ｃ／２６１Ｌ／２６５Ｉ／２７７Ｖ／２８７Ｔ／３５３Ｅ、５７Ｇ／２０５Ｃ／２６１Ｌ／２７７Ｖ、５７Ｇ／２０５Ｃ／２６１Ｓ／２７７Ｖ／３５３Ｅ、５７Ｇ／２６１Ｌ／２６５Ｉ／３５３Ｅ、９４Ｋ／１２６Ｃ／１８４Ｒ／２０５Ａ／２５９Ｆ／２６１Ｌ／２６５Ｉ、９４Ｋ／１５３Ｆ／１８４Ｒ／２５９Ｆ／２６１Ｓ／２６５Ｉ、９４Ｋ／１５３Ｆ／２０５Ａ／２８７Ｋ／３５３Ｅ、９４Ｋ／１５３Ｆ／２０５Ａ／３５３Ｅ、９４Ｋ／１５３Ｆ／２０５Ｃ／２８７Ｋ、９４Ｋ／１５３Ｆ／２０５Ｃ／２８７Ｔ／３５３Ｅ、９４Ｋ／１５３Ｌ／１８４Ｒ／２０５Ｃ、９４Ｋ／１５３Ｌ／２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｓ／２６５Ｉ／３５３Ｅ、９４Ｋ／１８４Ｒ／２０５Ａ／２５９Ｆ／２６１Ｌ／３５３Ｅ、９４Ｋ／１８４Ｒ／２０５Ａ／２５９Ｆ／２６１Ｓ、９４Ｋ／１８４Ｒ／２０５Ａ／２６１Ｖ／２６５Ｉ／２８７Ｔ／３５３Ｅ、９４Ｋ／１８４Ｒ／２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｓ／２６５Ｉ／２８７Ｋ、９４Ｋ／１８４Ｒ／３５３Ｅ、９４Ｋ／２０５Ａ、９４Ｋ／２０５Ａ／２５９Ｆ／２６１Ｌ／２６５Ｉ、９４Ｋ／２０
５Ａ／２５９Ｆ／２６１Ｌ／２６５Ｉ／２７７Ｖ／２８７Ｋ、９４Ｋ／２０５Ａ／２５９Ｆ／２６１Ｒ／２６５Ｉ、９４Ｋ／２０５Ａ／２５９Ｆ／２６１Ｖ／２８７Ｋ／３５３Ｅ、９４Ｋ／２０５Ａ／２７７Ｖ、９４Ｋ／２０５Ｃ、９４Ｋ／２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｓ／２６５Ｉ、９４Ｋ／２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｓ／２６５Ｉ／３５３Ｅ、９４Ｋ／２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｖ／２６５Ｉ／３５３Ｅ、９４Ｋ／２０５Ｃ／２６１Ｌ／３５３Ｅ、９４Ｋ／２０５Ｃ／２６１Ｓ／２６５Ｉ／２７７Ｖ、９４Ｋ／２０５Ｃ／２６１Ｖ／２６５Ｉ／３５３Ｅ、９４Ｋ／２５９Ｆ／２６１Ｓ／２６５Ｉ、９４Ｋ／２５９Ｆ／２６１Ｖ／２６５Ｉ、１５３Ｆ／１８４Ｒ／２０５Ａ／２６１Ｌ／２７７Ｖ／２８７Ｔ、１５３Ｆ／１８４Ｒ／２６１Ｓ／２６５Ｉ／２８７Ｔ、１５３Ｆ／２０５Ａ、１５３Ｆ／２０５Ａ／２６１Ｒ／２６５Ｉ／２８７Ｔ、１５３Ｆ／２０５Ｃ、１５３Ｆ／２０５Ｃ／２６１Ｌ、１５３Ｆ／２０５Ｃ／２６１Ｖ、１５３Ｆ／２５９Ｆ／２６１Ｖ／２６５Ｉ、１５３Ｆ／２５９Ｆ／２６５Ｉ／２８７Ｋ、１５３Ｆ／２６１Ｌ／２６５Ｉ、１５３Ｆ／２６１Ｒ／２６５Ｉ、１５３Ｆ／２６１Ｓ／２６５Ｉ／２８７Ｔ／３５３Ｅ、１５３Ｆ／２６５Ｉ、１５３Ｆ／２６５Ｉ／２７７Ｖ／２８７Ｔ／３５３Ｅ、１８４Ｒ／２０５Ａ／２６１Ｒ／２６５Ｉ、１８４Ｒ／２０５Ａ／２８７Ｔ／３５３Ｅ、１８４Ｒ／２０５Ｃ、１８４Ｒ／２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｌ／２８７Ｋ、１８４Ｒ／２０５Ｃ／２６１Ｌ、１８４Ｒ／２０５Ｃ／２６１Ｒ／２８７Ｋ、１８４Ｒ／２０５Ｃ／２７７Ｖ、１８４Ｒ／２６１Ｌ／２６５Ｉ／２８７Ｔ、２０２Ｌ、２０２Ｍ、２０５Ａ、２０５Ａ／２５９Ｆ／２６１Ｖ／２６５Ｉ、２０５Ａ／２５９Ｆ／２６５Ｉ、２０５Ａ／２６１Ｌ、２０５Ａ／２６１Ｒ／２６５Ｉ／２８７Ｋ、２０５Ｃ、２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｌ、２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｒ／２６５Ｉ／２７７Ｖ／２８７Ｔ／３５３Ｅ、２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｓ、２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｓ／２６５Ｉ、２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｖ／２７７Ｖ／２８７Ｔ、２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６５Ｉ、２０５Ｃ／２６１Ｌ／２６５Ｉ／２７４Ａ、２０５Ｃ／２６１Ｌ／２７７Ｖ、２０５Ｃ／２６１Ｌ／３５３Ｅ、２０５Ｃ／２６１Ｒ、２０５Ｃ／２６１Ｒ／２６５Ｉ／２８７Ｋ／３５３Ｅ、２０５Ｃ／２６１Ｓ、２０５Ｃ／２６１Ｖ／２６５Ｉ、２０５Ｃ／２７７Ｖ／２８７Ｋ、２０５Ｃ／２８７Ｋ、２０５Ｃ／２８７Ｔ、２０５Ｓ、２０５Ｔ、２２３Ｇ、２２５Ｆ、２２５Ｙ、２５６Ｌ、２５６Ｖ、２５９Ｆ／２６１Ｌ／２６５Ｉ、２５９Ｆ／２６１Ｖ／２６５Ｉ、２６１Ｒ／２６５Ｉ／２８７Ｋ、２６１Ｓ／２６５Ｉ／２８７Ｔ、２６５Ｉ／２８７Ｔ、２８３Ｌ、および２９４Ｉから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、その位置は配列番号５０を参照して番号を付されている。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｆ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｌ／Ｐ２０５Ａ／Ｑ２６５Ｉ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ／Ｎ２７７Ｖ／Ｇ３５３Ｅ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｌ／Ｇ３５３Ｅ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｎ１５３Ｆ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ／Ｎ２７７Ｖ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｎ２７７Ｖ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ｃ／Ｎ２７７Ｖ／Ｇ３５３Ｅ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｎ１５３Ｌ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ａ／Ｇ３５３Ｅ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｎ１５３Ｌ／Ｐ２０５Ａ／Ｑ２６５Ｉ／Ｎ２７７Ｖ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｎ２７７Ｖ／Ｉ２８７Ｋ／Ａ３５７Ｓ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ／Ｇ３５３Ｅ、Ｒ２９Ｓ／Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｓ／Ｉ２８７Ｔ／Ｇ３５３Ｅ、Ｒ２９Ｓ／Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｉ２８７Ｋ、Ｒ２９Ｓ／Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｌ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ、Ｒ２９Ｓ／Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｌ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｒ／Ｑ２６５Ｉ、Ｒ２９Ｓ／Ｎ９４Ｋ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｓ、Ｒ２９Ｓ／Ｎ９４Ｋ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｖ、Ｒ２９Ｓ／Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ａ、Ｒ２９Ｓ／Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ａ／Ｅ２６１Ｖ、Ｒ２９Ｓ／Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｉ２８７Ｔ、Ｒ２９Ｓ／Ｎ９４Ｋ／Ｅ２６１Ｒ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ／Ｇ３５３Ｅ、Ｒ２９Ｓ／Ｎ１５３Ｆ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ、Ｒ２９Ｓ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ａ、Ｒ２９Ｓ／Ｎ１５３Ｆ／Ｅ２６１Ｒ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｋ／Ｇ３５３Ｅ、Ｒ２９Ｓ／Ｎ１５３Ｌ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｎ２７７Ｖ／Ｉ２８７Ｔ、Ｒ２９Ｓ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ａ、Ｒ２９Ｓ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ａ／Ｇ３５３Ｅ、Ｒ２９Ｓ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｖ／Ｎ２７７Ｖ、Ｒ２９Ｓ／Ｑ１８４Ｒ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ、Ｒ２９Ｓ／Ｑ１８４Ｒ／Ｑ２６５Ｉ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ａ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｋ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｒ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ａ／Ｅ２６１Ｖ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｉ２８７Ｋ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｉ２８７Ｔ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｓ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｌ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｇ３５３Ｅ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｒ／Ｇ３５３Ｅ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｓ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ｃ／Ｎ２７７Ｖ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ｃ／Ｉ２８７Ｔ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ｃ／Ｉ２８７Ｔ／Ｇ３５３Ｅ、Ｒ２９Ｓ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ、Ｒ２９Ｓ／Ｅ２６１Ｖ／Ｇ３５３Ｅ、Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｆ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ、Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ａ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ、Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｆ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ、Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｆ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ、Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ、Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｑ１８４Ｒ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ、Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ、Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ／Ｎ２７７Ｖ／Ｉ２８７Ｔ、Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ａ／Ｎ２７７Ｖ、Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ、Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ、Ａ５７Ｇ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ａ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ、Ａ５７Ｇ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ａ／Ｅ２６１Ｓ、Ａ５７Ｇ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ、Ａ５７Ｇ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｑ２６５Ｉ／Ｎ２７７Ｖ、Ａ５７Ｇ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ｃ／Ｑ２６５Ｉ、Ａ５７Ｇ／Ｎ１５３Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｋ／Ｇ３５３Ｅ、Ａ５７Ｇ／Ｎ１５３Ｆ／Ｅ２６１Ｒ／Ｑ２６５Ｉ、Ａ５７Ｇ／Ｐ２０５Ａ、Ａ５７Ｇ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｎ２７７Ｖ／Ｉ２８７Ｋ／Ｇ３５３Ｅ、Ａ５７Ｇ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｉ２８７Ｔ／Ｇ３５３Ｅ、Ａ５７Ｇ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｖ、Ａ５７Ｇ／Ｐ２０５Ａ／Ｅ２６１Ｒ、Ａ５７Ｇ／Ｐ２０５Ｃ、Ａ５７Ｇ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｑ２６５Ｉ、Ａ５７Ｇ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｎ２７７Ｖ／Ｉ２８７Ｔ／Ｇ３５３Ｅ、Ａ５７Ｇ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｌ／Ｎ２７７Ｖ、Ａ５７Ｇ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｓ／Ｎ２７７Ｖ／Ｇ３５３Ｅ、Ａ５７Ｇ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｇ１２６Ｃ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ、Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｆ／Ｑ１８４Ｒ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ、Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ａ／Ｉ２８７Ｋ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ａ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ｃ／Ｉ２８７Ｋ、Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ｃ／Ｉ２８７Ｔ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｌ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ、Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｌ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｓ、Ｎ９４Ｋ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ａ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｋ、Ｎ９４Ｋ／Ｑ１８４Ｒ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ａ、Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ、Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｎ２７７Ｖ／Ｉ２８７Ｋ、Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｒ／Ｑ２６５Ｉ、Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｖ／Ｉ２８７Ｋ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ａ／Ｎ２７７Ｖ、Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ｃ、Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ、Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｌ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ／Ｎ２７７Ｖ、Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ、Ｎ９４Ｋ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ、Ｎ１５３Ｆ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ａ／Ｅ２６１Ｌ／Ｎ２７７Ｖ／Ｉ２８７Ｔ、Ｎ１５３Ｆ／Ｑ１８４Ｒ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ、Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ａ、Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ａ／Ｅ２６１Ｒ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ、Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ｃ、Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｌ、Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｖ、Ｎ１５３Ｆ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ、Ｎ１５３Ｆ／Ｙ２５９Ｆ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｋ、Ｎ１５３Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ、Ｎ１５３Ｆ／Ｅ２６１Ｒ／Ｑ２６５Ｉ、Ｎ１５３Ｆ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ１５３Ｆ／Ｑ２６５Ｉ、Ｎ１５３Ｆ／Ｑ２６５Ｉ／Ｎ２７７Ｖ／Ｉ２８７Ｔ／Ｇ３５３Ｅ、Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ａ／Ｅ２６１Ｒ／Ｑ２６５Ｉ、Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ａ／Ｉ２８７Ｔ／Ｇ３５３Ｅ、Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ、Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｉ２８７Ｋ、Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｌ、Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｒ／Ｉ２８７Ｋ、Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ／Ｎ２７７Ｖ、Ｑ１８４Ｒ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ、Ｈ２０２Ｌ、Ｈ２０２Ｍ、Ｐ２０５Ａ、Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ、Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｑ２６５Ｉ、Ｐ２０５Ａ／Ｅ２６１Ｌ、Ｐ２０５Ａ／Ｅ２６１Ｒ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８
７Ｋ、Ｐ２０５Ｃ、Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ、Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｒ／Ｑ２６５Ｉ／Ｎ２７７Ｖ／Ｉ２８７Ｔ／Ｇ３５３Ｅ、Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｓ、Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ、Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｖ／Ｎ２７７Ｖ／Ｉ２８７Ｔ、Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｑ２６５Ｉ、Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｖ２７４Ａ、Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｌ／Ｎ２７７Ｖ、Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｌ／Ｇ３５３Ｅ、Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｒ、Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｒ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｋ／Ｇ３５３Ｅ、Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｓ、Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ、Ｐ２０５Ｃ／Ｎ２７７Ｖ／Ｉ２８７Ｋ、Ｐ２０５Ｃ／Ｉ２８７Ｋ、Ｐ２０５Ｃ／Ｉ２８７Ｔ、Ｐ２０５Ｓ、Ｐ２０５Ｔ、Ｓ２２３Ｇ、Ｇ２２５Ｆ、Ｇ２２５Ｙ、Ｃ２５６Ｌ、Ｃ２５６Ｖ、Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ、Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ、Ｅ２６１Ｒ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｋ、Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ、Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ、Ｉ２８３Ｌ、およびＦ２９４Ｉから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、その位置は配列番号５０を参照して番号を付されている。
５Ａ／２５９Ｆ／２６１Ｌ／２６５Ｉ／２７７Ｖ／２８７Ｋ、９４Ｋ／２０５Ａ／２５９Ｆ／２６１Ｒ／２６５Ｉ、９４Ｋ／２０５Ａ／２５９Ｆ／２６１Ｖ／２８７Ｋ／３５３Ｅ、９４Ｋ／２０５Ａ／２７７Ｖ、９４Ｋ／２０５Ｃ、９４Ｋ／２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｓ／２６５Ｉ、９４Ｋ／２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｓ／２６５Ｉ／３５３Ｅ、９４Ｋ／２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｖ／２６５Ｉ／３５３Ｅ、９４Ｋ／２０５Ｃ／２６１Ｌ／３５３Ｅ、９４Ｋ／２０５Ｃ／２６１Ｓ／２６５Ｉ／２７７Ｖ、９４Ｋ／２０５Ｃ／２６１Ｖ／２６５Ｉ／３５３Ｅ、９４Ｋ／２５９Ｆ／２６１Ｓ／２６５Ｉ、９４Ｋ／２５９Ｆ／２６１Ｖ／２６５Ｉ、１５３Ｆ／１８４Ｒ／２０５Ａ／２６１Ｌ／２７７Ｖ／２８７Ｔ、１５３Ｆ／１８４Ｒ／２６１Ｓ／２６５Ｉ／２８７Ｔ、１５３Ｆ／２０５Ａ、１５３Ｆ／２０５Ａ／２６１Ｒ／２６５Ｉ／２８７Ｔ、１５３Ｆ／２０５Ｃ、１５３Ｆ／２０５Ｃ／２６１Ｌ、１５３Ｆ／２０５Ｃ／２６１Ｖ、１５３Ｆ／２５９Ｆ／２６１Ｖ／２６５Ｉ、１５３Ｆ／２５９Ｆ／２６５Ｉ／２８７Ｋ、１５３Ｆ／２６１Ｌ／２６５Ｉ、１５３Ｆ／２６１Ｒ／２６５Ｉ、１５３Ｆ／２６１Ｓ／２６５Ｉ／２８７Ｔ／３５３Ｅ、１５３Ｆ／２６５Ｉ、１５３Ｆ／２６５Ｉ／２７７Ｖ／２８７Ｔ／３５３Ｅ、１８４Ｒ／２０５Ａ／２６１Ｒ／２６５Ｉ、１８４Ｒ／２０５Ａ／２８７Ｔ／３５３Ｅ、１８４Ｒ／２０５Ｃ、１８４Ｒ／２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｌ／２８７Ｋ、１８４Ｒ／２０５Ｃ／２６１Ｌ、１８４Ｒ／２０５Ｃ／２６１Ｒ／２８７Ｋ、１８４Ｒ／２０５Ｃ／２７７Ｖ、１８４Ｒ／２６１Ｌ／２６５Ｉ／２８７Ｔ、２０２Ｌ、２０２Ｍ、２０５Ａ、２０５Ａ／２５９Ｆ／２６１Ｖ／２６５Ｉ、２０５Ａ／２５９Ｆ／２６５Ｉ、２０５Ａ／２６１Ｌ、２０５Ａ／２６１Ｒ／２６５Ｉ／２８７Ｋ、２０５Ｃ、２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｌ、２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｒ／２６５Ｉ／２７７Ｖ／２８７Ｔ／３５３Ｅ、２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｓ、２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｓ／２６５Ｉ、２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｖ／２７７Ｖ／２８７Ｔ、２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６５Ｉ、２０５Ｃ／２６１Ｌ／２６５Ｉ／２７４Ａ、２０５Ｃ／２６１Ｌ／２７７Ｖ、２０５Ｃ／２６１Ｌ／３５３Ｅ、２０５Ｃ／２６１Ｒ、２０５Ｃ／２６１Ｒ／２６５Ｉ／２８７Ｋ／３５３Ｅ、２０５Ｃ／２６１Ｓ、２０５Ｃ／２６１Ｖ／２６５Ｉ、２０５Ｃ／２７７Ｖ／２８７Ｋ、２０５Ｃ／２８７Ｋ、２０５Ｃ／２８７Ｔ、２０５Ｓ、２０５Ｔ、２２３Ｇ、２２５Ｆ、２２５Ｙ、２５６Ｌ、２５６Ｖ、２５９Ｆ／２６１Ｌ／２６５Ｉ、２５９Ｆ／２６１Ｖ／２６５Ｉ、２６１Ｒ／２６５Ｉ／２８７Ｋ、２６１Ｓ／２６５Ｉ／２８７Ｔ、２６５Ｉ／２８７Ｔ、２８３Ｌ、および２９４Ｉから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、その位置は配列番号５０を参照して番号を付されている。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｆ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｌ／Ｐ２０５Ａ／Ｑ２６５Ｉ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ／Ｎ２７７Ｖ／Ｇ３５３Ｅ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｌ／Ｇ３５３Ｅ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｎ１５３Ｆ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ／Ｎ２７７Ｖ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｎ２７７Ｖ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ｃ／Ｎ２７７Ｖ／Ｇ３５３Ｅ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｎ１５３Ｌ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ａ／Ｇ３５３Ｅ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｎ１５３Ｌ／Ｐ２０５Ａ／Ｑ２６５Ｉ／Ｎ２７７Ｖ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｎ２７７Ｖ／Ｉ２８７Ｋ／Ａ３５７Ｓ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ／Ｇ３５３Ｅ、Ｒ２９Ｓ／Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｓ／Ｉ２８７Ｔ／Ｇ３５３Ｅ、Ｒ２９Ｓ／Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｉ２８７Ｋ、Ｒ２９Ｓ／Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｌ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ、Ｒ２９Ｓ／Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｌ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｒ／Ｑ２６５Ｉ、Ｒ２９Ｓ／Ｎ９４Ｋ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｓ、Ｒ２９Ｓ／Ｎ９４Ｋ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｖ、Ｒ２９Ｓ／Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ａ、Ｒ２９Ｓ／Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ａ／Ｅ２６１Ｖ、Ｒ２９Ｓ／Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｉ２８７Ｔ、Ｒ２９Ｓ／Ｎ９４Ｋ／Ｅ２６１Ｒ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ／Ｇ３５３Ｅ、Ｒ２９Ｓ／Ｎ１５３Ｆ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ、Ｒ２９Ｓ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ａ、Ｒ２９Ｓ／Ｎ１５３Ｆ／Ｅ２６１Ｒ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｋ／Ｇ３５３Ｅ、Ｒ２９Ｓ／Ｎ１５３Ｌ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｎ２７７Ｖ／Ｉ２８７Ｔ、Ｒ２９Ｓ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ａ、Ｒ２９Ｓ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ａ／Ｇ３５３Ｅ、Ｒ２９Ｓ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｖ／Ｎ２７７Ｖ、Ｒ２９Ｓ／Ｑ１８４Ｒ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ、Ｒ２９Ｓ／Ｑ１８４Ｒ／Ｑ２６５Ｉ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ａ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｋ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｒ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ａ／Ｅ２６１Ｖ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｉ２８７Ｋ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｉ２８７Ｔ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｓ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｌ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｇ３５３Ｅ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｒ／Ｇ３５３Ｅ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｓ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ｃ／Ｎ２７７Ｖ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ｃ／Ｉ２８７Ｔ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ｃ／Ｉ２８７Ｔ／Ｇ３５３Ｅ、Ｒ２９Ｓ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ、Ｒ２９Ｓ／Ｅ２６１Ｖ／Ｇ３５３Ｅ、Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｆ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ、Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ａ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ、Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｆ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ、Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｆ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ、Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ、Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｑ１８４Ｒ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ、Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ、Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ／Ｎ２７７Ｖ／Ｉ２８７Ｔ、Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ａ／Ｎ２７７Ｖ、Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ、Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ、Ａ５７Ｇ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ａ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ、Ａ５７Ｇ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ａ／Ｅ２６１Ｓ、Ａ５７Ｇ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ、Ａ５７Ｇ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｑ２６５Ｉ／Ｎ２７７Ｖ、Ａ５７Ｇ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ｃ／Ｑ２６５Ｉ、Ａ５７Ｇ／Ｎ１５３Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｋ／Ｇ３５３Ｅ、Ａ５７Ｇ／Ｎ１５３Ｆ／Ｅ２６１Ｒ／Ｑ２６５Ｉ、Ａ５７Ｇ／Ｐ２０５Ａ、Ａ５７Ｇ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｎ２７７Ｖ／Ｉ２８７Ｋ／Ｇ３５３Ｅ、Ａ５７Ｇ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｉ２８７Ｔ／Ｇ３５３Ｅ、Ａ５７Ｇ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｖ、Ａ５７Ｇ／Ｐ２０５Ａ／Ｅ２６１Ｒ、Ａ５７Ｇ／Ｐ２０５Ｃ、Ａ５７Ｇ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｑ２６５Ｉ、Ａ５７Ｇ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｎ２７７Ｖ／Ｉ２８７Ｔ／Ｇ３５３Ｅ、Ａ５７Ｇ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｌ／Ｎ２７７Ｖ、Ａ５７Ｇ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｓ／Ｎ２７７Ｖ／Ｇ３５３Ｅ、Ａ５７Ｇ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｇ１２６Ｃ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ、Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｆ／Ｑ１８４Ｒ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ、Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ａ／Ｉ２８７Ｋ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ａ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ｃ／Ｉ２８７Ｋ、Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ｃ／Ｉ２８７Ｔ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｌ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ、Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｌ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｓ、Ｎ９４Ｋ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ａ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｋ、Ｎ９４Ｋ／Ｑ１８４Ｒ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ａ、Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ、Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｎ２７７Ｖ／Ｉ２８７Ｋ、Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｒ／Ｑ２６５Ｉ、Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｖ／Ｉ２８７Ｋ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ａ／Ｎ２７７Ｖ、Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ｃ、Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ、Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｌ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ／Ｎ２７７Ｖ、Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ、Ｎ９４Ｋ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ、Ｎ１５３Ｆ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ａ／Ｅ２６１Ｌ／Ｎ２７７Ｖ／Ｉ２８７Ｔ、Ｎ１５３Ｆ／Ｑ１８４Ｒ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ、Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ａ、Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ａ／Ｅ２６１Ｒ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ、Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ｃ、Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｌ、Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｖ、Ｎ１５３Ｆ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ、Ｎ１５３Ｆ／Ｙ２５９Ｆ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｋ、Ｎ１５３Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ、Ｎ１５３Ｆ／Ｅ２６１Ｒ／Ｑ２６５Ｉ、Ｎ１５３Ｆ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ１５３Ｆ／Ｑ２６５Ｉ、Ｎ１５３Ｆ／Ｑ２６５Ｉ／Ｎ２７７Ｖ／Ｉ２８７Ｔ／Ｇ３５３Ｅ、Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ａ／Ｅ２６１Ｒ／Ｑ２６５Ｉ、Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ａ／Ｉ２８７Ｔ／Ｇ３５３Ｅ、Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ、Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｉ２８７Ｋ、Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｌ、Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｒ／Ｉ２８７Ｋ、Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ／Ｎ２７７Ｖ、Ｑ１８４Ｒ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ、Ｈ２０２Ｌ、Ｈ２０２Ｍ、Ｐ２０５Ａ、Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ、Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｑ２６５Ｉ、Ｐ２０５Ａ／Ｅ２６１Ｌ、Ｐ２０５Ａ／Ｅ２６１Ｒ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８
７Ｋ、Ｐ２０５Ｃ、Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ、Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｒ／Ｑ２６５Ｉ／Ｎ２７７Ｖ／Ｉ２８７Ｔ／Ｇ３５３Ｅ、Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｓ、Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ、Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｖ／Ｎ２７７Ｖ／Ｉ２８７Ｔ、Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｑ２６５Ｉ、Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｖ２７４Ａ、Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｌ／Ｎ２７７Ｖ、Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｌ／Ｇ３５３Ｅ、Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｒ、Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｒ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｋ／Ｇ３５３Ｅ、Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｓ、Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ、Ｐ２０５Ｃ／Ｎ２７７Ｖ／Ｉ２８７Ｋ、Ｐ２０５Ｃ／Ｉ２８７Ｋ、Ｐ２０５Ｃ／Ｉ２８７Ｔ、Ｐ２０５Ｓ、Ｐ２０５Ｔ、Ｓ２２３Ｇ、Ｇ２２５Ｆ、Ｇ２２５Ｙ、Ｃ２５６Ｌ、Ｃ２５６Ｖ、Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ、Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ、Ｅ２６１Ｒ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｋ、Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ、Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ、Ｉ２８３Ｌ、およびＦ２９４Ｉから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、その位置は配列番号５０を参照して番号を付されている。
本発明は、配列番号３０６の参照配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む操作されたポリペプチドであって、１９７／１９８／２０１／２５９、１９８／２０１／２５９／２８０、２０２／２０５／２２１／２２３／２２５／２６１、２０２／２０５／２２１／２２３／２６１／２９４、２０２／２２１／２２２／２２５／２５６／２６１／２９４、２０２／２２１／２２３／２２５／２８３／２９４、２０５／２２１／２２２、２０５／２２１／２２３／２２５／２５６／２６１／２８３、２１９、２２１／２２２／２２３／２２５、２２１／２２３、２２１／２２３／２２５、２２１／２２３／２２５／２５６／２６１、２２１／２２３／２２５／２６１、２２１／２２３／２２５／２９４、２２１／２２５、２２１／２２５／２５６、２２１／２２５／２５６／２６１、２２１／２２５／２５６／２６１／２８３／２９４、２２３／２２５／２５６／２６１、２２５／２５６／２６１、２８０、および２８０／３０６から選択される１つまたは複数の位置において少なくとも１つの置換または置換セットを含み、その位置が配列番号３０６を参照して番号を付されている操作されたポリペプチドを提供する。一部の追加の実施形態では、操作されたポリペプチドは、１９７Ｔ／１９８Ｓ／２０１Ｌ／２５９Ｖ、１９８Ａ／２０１Ｌ／２５９Ｖ／２８０Ｌ、２０２Ｌ／２０５Ｓ／２２１Ｓ／２２３Ｇ／２２５Ｙ／２６１Ｙ、２０２Ｌ／２２１Ｈ／２２３Ｇ／２２５Ｆ／２８３Ｍ／２９４Ｉ、２０２Ｍ／２０５Ｓ／２２１Ｈ／２２３Ｇ／２６１Ｙ／２９４Ｉ、２０２Ｍ／２０５Ｔ／２２１Ｌ／２２３Ｇ／２２５Ｙ／２６１Ｒ、２０２Ｍ／２２１Ｓ／２２２Ｉ／２２５Ｙ／２５６Ｌ／２６１Ｒ／２９４Ｉ、２０５Ｓ／２２１Ｓ／２２３Ｇ／２２５Ｆ／２５６Ｌ／２６１Ｔ／２８３Ｍ、２０５Ｔ／２２１Ｈ／２２２Ｉ、２１９Ｌ、２２１Ｈ／２２２Ｉ／２２３Ｇ／２２５Ｙ、２２１Ｈ／２２３Ｇ／２２５Ｌ、２２１Ｈ／２２５Ｆ、２２１Ｌ／２２３Ｇ／２２５Ｌ／２５６Ｔ／２６１Ｒ、２２１Ｌ／２２５Ｆ／２５６Ｖ、２２１Ｓ／２２３Ｇ、２２１Ｓ／２２３Ｇ／２２５Ｌ／２５６Ｌ／２６１Ｒ、２２１Ｓ／２２３Ｇ／２２５Ｌ／２６１Ｒ、２２１Ｓ／２２３Ｇ／２２５Ｌ／２９４Ｉ、２２１Ｓ／２２５Ｆ／２５６Ｔ／２６１Ｒ、２２１Ｓ／２２５Ｙ／２５６Ｔ／２６１Ｙ／２８３Ｍ／２９４Ｉ、２２３Ｇ／２２５Ｌ／２５６Ｖ／２６１Ｒ、２２５Ｆ／２５６Ｔ／２６１Ｔ、２８０Ｄ、２８０Ｅ、２８０Ｉ、２８０Ｖ、２８０Ｖ／３０６Ｆ、および２８０Ｗから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、その位置は配列番号３０６を参照して番号を付されている。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、Ｖ１９７Ｔ／Ｈ１９８Ｓ／Ｍ２０１Ｌ／Ｙ２５９Ｖ、Ｈ１９８Ａ／Ｍ２０１Ｌ／Ｙ２５９Ｖ／Ｙ２８０Ｌ、Ｈ２０２Ｌ／Ａ２０５Ｓ／Ｙ２２１Ｓ／Ｓ２２３Ｇ／Ｇ２２５Ｙ／Ｖ２６１Ｙ、Ｈ２０２Ｌ／Ｙ２２１Ｈ／Ｓ２２３Ｇ／Ｇ２２５Ｆ／Ｉ２８３Ｍ／Ｆ２９４Ｉ、Ｈ２０２Ｍ／Ａ２０５Ｓ／Ｙ２２１Ｈ／Ｓ２２３Ｇ／Ｖ２６１Ｙ／Ｆ２９４Ｉ、Ｈ２０２Ｍ／Ａ２０５Ｔ／Ｙ２２１Ｌ／Ｓ２２３Ｇ／Ｇ２２５Ｙ／Ｖ２６１Ｒ、Ｈ２０２Ｍ／Ｙ２２１Ｓ／Ｆ２２２Ｉ／Ｇ２２５Ｙ／Ｃ２５６Ｌ／Ｖ２６１Ｒ／Ｆ２９４Ｉ、Ａ２０５Ｓ／Ｙ２２１Ｓ／Ｓ２２３Ｇ／Ｇ２２５Ｆ／Ｃ２５６Ｌ／Ｖ２６１Ｔ／Ｉ２８３Ｍ、Ａ２０５Ｔ／Ｙ２２１Ｈ／Ｆ２２２Ｉ、Ｆ２１９Ｌ、Ｙ２２１Ｈ／Ｆ２２２Ｉ／Ｓ２２３Ｇ／Ｇ２２５Ｙ、Ｙ２２１Ｈ／Ｓ２２３Ｇ／Ｇ２２５Ｌ、Ｙ２２１Ｈ／Ｇ２２５Ｆ、Ｙ２２１Ｌ／Ｓ２２３Ｇ／Ｇ２２５Ｌ／Ｃ２５６Ｔ／Ｖ２６１Ｒ、Ｙ２２１Ｌ／Ｇ２２５Ｆ／Ｃ２５６Ｖ、Ｙ２２１Ｓ／Ｓ２２３Ｇ、Ｙ２２１Ｓ／Ｓ２２３Ｇ／Ｇ２２５Ｌ／Ｃ２５６Ｌ／Ｖ２６１Ｒ、Ｙ２２１Ｓ／Ｓ２２３Ｇ／Ｇ２２５Ｌ／Ｖ２６１Ｒ、Ｙ２２１Ｓ／Ｓ２２３Ｇ／Ｇ２２５Ｌ／Ｆ２９４Ｉ、Ｙ２２１Ｓ／Ｇ２２５Ｆ／Ｃ２５６Ｔ／Ｖ２６１Ｒ、Ｙ２２１Ｓ／Ｇ２２５Ｙ／Ｃ２５６Ｔ／Ｖ２６１Ｙ／Ｉ２８３Ｍ／Ｆ２９４Ｉ、Ｓ２２３Ｇ／Ｇ２２５Ｌ／Ｃ２５６Ｖ／Ｖ２６１Ｒ、Ｇ２２５Ｆ／Ｃ２５６Ｔ／Ｖ２６１Ｔ、Ｙ２８０Ｄ、Ｙ２８０Ｅ、Ｙ２８０Ｉ、Ｙ２８０Ｖ、Ｙ２８０Ｖ／Ｓ３０６Ｆ、およびＹ２８０Ｗから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、その位置は配列番号３０６を参照して番号を付されている。
本発明は、配列番号６４８の参照配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む操作されたポリペプチドであって、１７／１９８／２５９／２８０、１９７、１９７／１９８、１９７／１９８／２２３／２５９、１９７／２２３／２７７／２８０、１９７／２５９、１９７／２７７、１９８、１９８／２２３、１９８／２２３／２５９／２７７／２８０、１９８／２５９、１９８／２５９／２７７、１９８／２５９／２７７／２８０、１９８／２７７／２８０、２２３／２５９、２２３／２５９／２８０、２５８、２５９、２５９／２６８／２７７／２８０、２５９／２７７、２５９／２８０、２６３、２７７、および２８０から選択される１つまたは複数の位置において少なくとも１つの置換または置換セットを含み、その位置が配列番号６４８を参照して番号を付されている操作されたポリペプチドを提供する。一部の追加の実施形態では、操作されたポリペプチドは、１７Ｐ／１９８Ｓ／２５９Ｖ／２８０Ｆ、１７Ｐ／１９８Ｓ／２５９Ｗ／２８０Ｗ、１９７Ｌ、１９７Ｌ／１９８Ｓ、１９７Ｌ／１９８Ｓ／２２３Ｇ／２５９Ｗ、１９７Ｌ／２２３Ｇ／２７７Ｔ／２８０Ｋ、１９７Ｌ／２５９Ｗ、１９７Ｌ／２７７Ｆ、１９８Ａ、１９８Ｓ、１９８Ｓ／２２３Ｇ、１９８Ｓ／２２３Ｇ／２５９Ｗ／２７７Ｗ／２８０Ｇ、１９８Ｓ／２５９Ｖ、１９８Ｓ／２５９Ｖ／２７７Ｔ、１９８Ｓ／２５９Ｗ／２７７Ｆ／２８０Ｇ、１９８Ｓ／２５９Ｗ／２７７Ｔ／２８０Ｆ、１９８Ｓ／２７７Ｆ／２８０Ｆ、１９８Ｓ／２７７Ｇ／２８０Ｗ、１９８Ｓ／２７７Ｐ／２８０Ｆ、２２３Ｇ／２５９Ｖ／２８０Ｗ、２２３Ｇ／２５９Ｗ、２５８Ｙ、２５９Ｎ／２８０Ｗ、２５９Ｗ、２５９Ｗ／２６８Ｓ／２７７Ｔ／２８０Ｆ、２５９Ｗ／２７７Ｗ、２６３Ｄ、２６３Ｅ、２６３Ｆ、２６３Ｇ、２６３Ｌ、２６３Ｍ、２６３Ｎ、２６３Ｑ、２６３Ｒ、２６３Ｖ、２６３Ｗ、２７７Ｗ、２８０Ｄ、２８０Ｆ、および２８０Ｗから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、その位置は配列番号６４８を参照して番号を付されている。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、Ｈ１７Ｐ／Ｈ１９８Ｓ／Ｙ２５９Ｖ／Ｙ２８０Ｆ、Ｈ１７Ｐ／Ｈ１９８Ｓ／Ｙ２５９Ｗ／Ｙ２８０Ｗ、Ｖ１９７Ｌ、Ｖ１９７Ｌ／Ｈ１９８Ｓ、Ｖ１９７Ｌ／Ｈ１９８Ｓ／Ｓ２２３Ｇ／Ｙ２５９Ｗ、Ｖ１９７Ｌ／Ｓ２２３Ｇ／Ｎ２７７Ｔ／Ｙ２８０Ｋ、Ｖ１９７Ｌ／Ｙ２５９Ｗ、Ｖ１９７Ｌ／Ｎ２７７Ｆ、Ｈ１９８Ａ、Ｈ１９８Ｓ、Ｈ１９８Ｓ／Ｓ２２３Ｇ、Ｈ１９８Ｓ／Ｓ２２３Ｇ／Ｙ２５９Ｗ／Ｎ２７７Ｗ／Ｙ２８０Ｇ、Ｈ１９８Ｓ／Ｙ２５９Ｖ、Ｈ１９８Ｓ／Ｙ２５９Ｖ／Ｎ２７７Ｔ、Ｈ１９８Ｓ／Ｙ２５９Ｗ／Ｎ２７７Ｆ／Ｙ２８０Ｇ、Ｈ１９８Ｓ／Ｙ２５９Ｗ／Ｎ２７７Ｔ／Ｙ２８０Ｆ、Ｈ１９８Ｓ／Ｎ２７７Ｆ／Ｙ２８０Ｆ、Ｈ１９８Ｓ／Ｎ２７７Ｇ／Ｙ２８０Ｗ、Ｈ１９８Ｓ／Ｎ２７７Ｐ／Ｙ２８０Ｆ、Ｓ２２３Ｇ／Ｙ２５９Ｖ／Ｙ２８０Ｗ、Ｓ２２３Ｇ／Ｙ２５９Ｗ、Ｗ２５８Ｙ、Ｙ２５９Ｎ／Ｙ２８０Ｗ、Ｙ２５９Ｗ、Ｙ２５９Ｗ／Ａ２６８Ｓ／Ｎ２７７Ｔ／Ｙ２８０Ｆ、Ｙ２５９Ｗ／Ｎ２７７Ｗ、Ｙ２６３Ｄ、Ｙ２６３Ｅ、Ｙ２６３Ｆ、Ｙ２６３Ｇ、Ｙ２６３Ｌ、Ｙ２６３Ｍ、Ｙ２６３Ｎ、Ｙ２６３Ｑ、Ｙ２６３Ｒ、Ｙ２６３Ｖ、Ｙ２６３Ｗ、Ｎ２７７Ｗ、Ｙ２８０Ｄ、Ｙ２８０Ｆ、およびＹ２８０Ｗから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、その位置は配列番号６４８を参照して番号を付されている。
本発明は、配列番号７０８の参照配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む操作されたポリペプチドであって、１４１、１５４、１９７、１９７／１９８、および２７８から選択される１つまたは複数の位置において少なくとも１つの置換または置換セットを含み、その位置が配列番号７０８を参照して番号を付されている操作されたポリペプチドを提供する。一部の追加の実施形態では、操作されたポリペプチドは、１４１Ｄ、１５４Ｇ、１５４Ｈ、１９７Ａ、１９７Ｐ／１９８Ａ、２７８Ｅ、および２７８Ｖから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、その位置は配列番号７０８を参照して番号を付されている。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、Ｔ１４１Ｄ、Ａ１５４Ｇ、Ａ１５４Ｈ、Ｖ１９７Ａ、Ｖ１９７Ｐ／Ｓ１９８Ａ、Ｐ２７８Ｅ、およびＰ２７８Ｖから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、その位置は配列番号７０８を参照して番号を付されている。
本発明は、上記段落において記載される少なくとも１つの操作されたポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチドも提供する。一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドは配列番号５から配列番号８０１において示す奇数番号の配列を含む。
本発明は、上述の少なくとも１つの操作されたポリヌクレオチドを含むベクターをさらに提供する。一部の実施形態では、ベクターは、少なくとも１つの制御配列をさらに含む。
本発明は、本明細書において提供されるベクターを含む宿主細胞も提供する。一部の実施形態では、宿主細胞は、本明細書において提供される少なくとも１つの操作されたポリペプチドを産生する。
本発明は、操作されたイミンレダクターゼポリペプチドを産生する方法であって、操作されたポリヌクレオチドが発現され、操作されたポリペプチドが産生されるような条件下、本明細書において提供される宿主細胞を培養するステップを含む方法をさらに提供する。一部の実施形態では、方法は、操作されたポリペプチドを回収するステップをさらに含む。
別段の定義がない限り、本明細書において使用される全ての技術および科学用語は、本発明が関連する当業者によって通常理解されるものと同じ意味を概して有する。概して、本明細書において使用される命名法ならびに以下に記載される細胞培養、分子遺伝学、微生物学、有機化学、分析化学および核酸化学の検査手順は当業者であれば周知であり、当技術分野において通常用いられている。そのような技術は周知であり、当業者であれば周知の多数のテキストおよび参考書において記載されている。標準的な技術またはその改変が化学的合成および化学的分析のために使用される。本明細書において記載される全ての特許、特許出願、論文および刊行物は、上記のものと下記のものの両方が参照により本明細書に明示的に組み込まれるものとする。
本明細書において記載されるものと類似のまたは同等の任意の好適な方法および材料が本発明の実施において使用を見出されるが、一部の方法および材料が本明細書において記載される。本発明は、当業者によって使用される背景に応じて変化する場合があるために、記載される特定の方法論、プロトコール、および試薬に限定されないことを理解されたい。したがって、直下で定義される用語は全体的に本発明に言及することによってより完全に記載される。
前述の一般的な説明と以下の詳細な説明の両方は、例示的で説明的なものにすぎず、本発明を限定するものではないことを理解されたい。本明細書において使用される項の見出しは構成的な目的のためのものにすぎず、記載される主題を限定するものと解釈されるべきではない。数値範囲には範囲を定義する数が含まれる。したがって、本明細書において開示される全ての数値範囲は、その狭い数値範囲が本明細書において全て明示的に記載されたかのように、その広い数値範囲内に入る全ての狭い数値範囲を包含することを意図する。本明細書において開示される全ての最大（または最小）数値の限定は、その低い（または大きい）数値の限定が本明細書において明示的に記載されたかのように、全ての小さい（または大きい）数値の限定を含むことも意図される。
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに別の意味を示さない限り複数形の言及を含む。したがって、例えば、「ポリペプチド（ａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」への言及は１つを超えるポリペプチドを含む。同様に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は交換可能であり、限定することを意図しない。
さまざまな実施形態の説明が「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語を使用する場合、当業者であれば一部の特定の場合で実施形態は、「から実質的になる」または「からなる」という言語を使用して代替的に記載することができることは理解するであろうことを理解されたい。さまざまな実施形態の説明が「必要に応じた」または「必要に応じて」という用語を使用する場合、その後記載される事象または状況は生じても生じなくてもよく、説明は、事象または状況が生じた場合および生じなかった場合を含むこともさらに理解されるべきである。前述の一般的な説明と、以下の詳細な説明の両方は、例示的で説明的なものにすぎず、本開示を制限するものではないことは理解されたい。本明細書において使用される項の見出しは構成的な目的のためのものにすぎず、記載される主題を限定するものと解釈されるべきではない。
略語：
遺伝学的にコードされたアミノ酸に関して使用される略語は従来のものであり、以下のとおりである：
遺伝学的にコードされたアミノ酸に関して使用される略語は従来のものであり、以下のとおりである：
三文字略語が使用される場合、特に「Ｌ」または「Ｄ」が先行するかまたは略語が使用される文脈から明らかではない限り、アミノ酸は、α－炭素（Ｃα）に関してＬ－またはＤ－立体配置のいずれかであってもよい。例えば、「Ａｌａ」はα－炭素に関する立体配置を明記することなくアラニンを示すが、「Ｄ－Ａｌａ」および「Ｌ－Ａｌａ」はＤ－アラニンおよびＬ－アラニンをそれぞれ指定する。
一文字略語が使用される場合、大文字はα－炭素に関するＬ－立体配置のアミノ酸を指定し、小文字はα－炭素に関するＤ－立体配置のアミノ酸を指定する。例えば、「Ａ」はＬ－アラニンを指定し、「ａ」はＤ－アラニンを指定する。ポリペプチド配列が一文字または三文字略語（またはこれらの混合されたもの）の文字列として提示される場合、配列は一般的な慣例に従ってアミノ（Ｎ）からカルボキシ（Ｃ）方向に提示される。
遺伝学的なコードヌクレオシドに関して使用される略語は従来のものであり、以下のとおりである：アデノシン（Ａ）；グアノシン（Ｇ）；シチジン（Ｃ）；チミジン（Ｔ）；およびウリジン（Ｕ）。特に説明がない限り、省略されたヌクレオチドは、リボヌクレオシドまたは２’－デオキシリボヌクレオシドのいずれかであってもよい。ヌクレオシドは、個々のものまたはまとめたもののリボヌクレオシドまたは２’－デオキシリボヌクレオシドのいずれかとして明記してもよい。核酸配列が一文字略語の文字列として提示される場合、配列は、一般的な慣例に従って５’から３’方向に提示され、ホスフェートは示されない。
定義：
本発明に関連して、本明細書の説明において使用される技術および科学用語は、特に定義されない限り、当業者によって通常理解される意味を有する。したがって、以下の用語は以下の意味を有することを意図する。
本発明に関連して、本明細書の説明において使用される技術および科学用語は、特に定義されない限り、当業者によって通常理解される意味を有する。したがって、以下の用語は以下の意味を有することを意図する。
「ＥＣ」番号は、Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＮＣ－ＩＵＢＭＢ）の酵素命名法を指す。ＩＵＢＭＢ生化学的分類は、その触媒する化学反応に基づく酵素に関する数値分類システムである。
「ＡＴＣＣ」は、そのバイオリポジトリコレクションに遺伝子および株が含まれるＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎを指す。
「ＮＣＢＩ」は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎおよびそこで提供される配列データベースを指す。
「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」は本明細書において相互交換可能に使用され、長さまたは翻訳後改変（例えば、グリコシル化、リン酸化、脂質化、ミリスチル化、ユビキチン化など）にかかわらず、アミド結合によって共有結合された少なくとも２つのアミノ酸のポリマーを示す。Ｄ－およびＬ－アミノ酸、およびＤ－およびＬ－アミノ酸の混合物、ならびにＤ－およびＬ－アミノ酸、およびＤ－およびＬ－アミノ酸の混合物を含むポリマーがこの定義の範囲内に含まれる。
「アミノ酸」は、本明細書において、その通常知られている三文字の記号によるものまたはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨される一文字の記号によるものを指す。ヌクレオチドは、同様に、その通常許容される１文字のコードによるものを指す場合がある。
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、互いに共有結合している２つまたはそれを超えるヌクレオシドを指す。ポリヌクレオチドは、リボヌクレオチド（すなわち、ＲＮＡ）から全体的に構成されていても、２’デオキシリボヌクレオチド（すなわち、ＤＮＡ）から全体的に構成されていても、またはリボヌクレオチドおよび２’デオキシリボヌクレオチドの混合物から構成されていてもよい。ヌクレオシドは、典型的には、標準的なホスホジエステル結合を介して互いに結合しているが、ポリヌクレオチドは１つまたは複数の非標準的な結合を含む場合がある。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であっても、一本鎖の領域と二本鎖の領域の両方を含んでいてもよい。さらに、ポリヌクレオチドは、典型的には、天然に存在するコード核酸塩基（すなわち、アデニン、グアニン、ウラシル、チミンおよびシトシン）から構成されるが、１つまたは複数の改変および／または合成された核酸塩基、例えば、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチンなどを含む場合がある。一部の実施形態では、そのような改変または合成された核酸塩基はアミノ酸配列をコードする核酸塩基である。
「オパインデヒドロゲナーゼ活性」は、本明細書で使用される場合、２－ケト酸（例えば、ピルベート）のカルボニル基および中性Ｌ－アミノ酸（例えば、Ｌ－ノルバリン）のアミノ基を第二級アミンジカルボキシレート化合物（例えば、Ｎ－［１－（Ｒ）－（カルボキシ）エチル］－（Ｓ）－ノルバリン）へ変換する酵素活性を指す。
本明細書で使用される場合、「イミン」は、窒素－炭素二重結合を含み、窒素が水素または有機基に結合している有機化合物または官能基を指す。
「イミンレダクターゼ活性」は、本明細書で使用される場合、スキーム１で示されているように、ケトンまたはアルデヒドのカルボニル基ならびに第一級または第二級アミンのアミノ基（カルボニルおよびアミノ基は別個の化合物にあっても同じ化合物にあってもよい）を第二級または第三級アミン生成物化合物へ、補助因子ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの存在下で変換する酵素活性を指す。
「イミンレダクターゼ」または「ＩＲＥＤ」は、本明細書で使用される場合、イミンレダクターゼ活性を有する酵素を指す。イミンレダクターゼとしては、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．株１Ｃからの野生型オパインデヒドロゲナーゼ（ノルバリンデヒドロゲナーゼ、オパインデヒドロゲナーゼの１種）由来の操作されたポリペプチドに限定されるものではなく、他のオパインデヒドロゲナーゼ酵素由来の操作されたポリペプチド、例えば、Ｐｅｃｔｅｎ ｍａｘｉｍｕｓからのオクトピンデヒドロゲナーゼ（ＯｐＤＨ）、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ Ｋ１からのオルニチンシンターゼ（ＣＥＯＳ）、Ｃｅｌｌａｎａ ｇｒａｔａからのβ－アラノピンデヒドロゲナーゼ（ＢＡＤＨ）、Ｓｕｂｅｒｉｔｅｓ ｄｏｍｕｎｃｕｌａからのタウロピンデヒドロゲナーゼ（ＴａｕＤＨ）；およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａからのＮ－メチルＬ－アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＮＭＤＨ）；またはイミンレダクターゼ活性を有する野生型酵素由来の操作された酵素を含む、イミンレダクターゼ活性を有する他の酵素があり得ることを理解されたい。イミンレダクターゼとしては、本明細書で使用される場合、天然に存在する（野生型）イミンレダクターゼおよびヒトの操作によって生成された天然に存在しない操作されたポリペプチドがある。
「コード配列」は、タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸のその部分（例えば、遺伝子）を指す。
「天然に存在する」または「野生型」は、自然において認められる形態を指す。例えば、天然に存在するまたは野生型のポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、自然界の供給源から単離することができ、ヒト操作によって意図的に改変されていない生物に存在する配列である。
本明細書で使用される場合、「組換えの」、「操作された」、および「天然に存在しない」は、細胞、核酸、またはポリペプチドを参照して使用される場合、自然界に別の方法では存在しない様式で改変されている、材料、または材料の天然もしくは自然の形態に対応する材料を指す。一部の実施形態では、細胞、核酸またはポリペプチドは、同一の天然に存在する細胞、核酸またはポリペプチドであるが、合成材料からおよび／または組換え技術を使用して操作することによって産生されるかまたは誘導される。非限定的な例としては、とりわけ、細胞の自然の（非組換え）形態内では認められない遺伝子を発現するか、またはそうでなければ異なるレベルで発現される自然の遺伝子を発現する組換え細胞がある。
「配列同一性パーセンテージ」および「相同性パーセンテージ」は、本明細書において相互交換可能に使用され、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の比較を指し、比較ウインドウにわたる２つの最適にアラインメントされた配列を比較することによって決定され、比較ウインドウにおけるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の一部は、２つの配列の最適なアラインメントに関する参照配列と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでいてもよい。パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列において存在する位置の数を決定して、一致した位置の数を得、一致した位置の数を比較ウインドウにおける位置の総数で割り、結果に１００を掛けて、配列同一性パーセンテージを得ることによって計算してもよい。あるいは、パーセンテージは、同一の核酸塩基もしくはアミノ酸残基のいずれかが両方の配列において存在する位置か、または核酸塩基もしくはアミノ酸残基がギャップを用いてアラインメントされた位置の数を決定して、一致した位置の数を得、一致した位置の数を比較ウインドウにおける位置の合計数で割り、結果に１００を掛けて、配列同一性パーセンテージを得ることによって計算してもよい。当業者であれば、２つの配列をアラインメントするのに利用可能な多くの確立されたアルゴリズムが存在することは理解している。比較のための配列の最適なアラインメントは、当技術分野において公知であるように、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ， Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ．， ２：４８２ ［１９８１］）によって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの相同性アラインメントアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ４８：４４３ ［１９７０］）によって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの類似性探索の方法（Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：２４４４ ［１９８８］）によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（例えば、ＧＣＧ ＷｉｓｃｏｎｓｉｎソフトウェアパッケージにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または目視検査によって行ってもよい。配列同一性および配列類似性パーセントを決定するのに好適なアルゴリズムの例としては、これらに限定されるものではないが、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムがあり、これらはＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２１５： ４０３－４１０ ［１９９０］；およびＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ３３８９－３４０２ ［１９７７］をそれぞれ参照のこと）によって記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎウェブサイトを介して公的に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列における同じ長さのワードとアラインメントされた場合、一部の正の値の閾値スコアＴとマッチするかまたはそれを満たす、クエリ配列における長さＷの短いワードを同定することによって高スコアリング配列ペア（ＨＳＰ）を最初に同定するステップを伴う。Ｔは、近隣のワードスコア閾値と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、上記を参照のこと）。これらの最初の近隣のワードヒットは、検索を開始してそれらを含む長いＨＳＰを見出すためのシードとして作用する。次いで、ワードヒットは、累積アラインメントスコアを増加させることができる限り、各配列に沿って両方向に延長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列に関しては、パラメーターＭ（マッチした残基のペアに関する報酬スコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチの残基に関するペナルティスコア；常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列に関しては、スコアリングマトリックスを使用して、累積スコアを計算する。各方向におけるワードヒットの拡張は、累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ低下した場合；１つまたは複数の負のスコアリング残基アラインメントの蓄積に起因して、累積スコアがゼロまたはそれ未満に低下した場合；またはいずれかの配列の末端に達した場合に停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感度およびスピードを決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列に関する）は、デフォルトとしてワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列に関しては、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとしてワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１０９１５ ［１９８９］を参照のこと）。配列アラインメントおよび配列同一性％の例示的な決定は、提供されるデフォルトパラメーターを使用したＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎソフトウェアパッケージ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）におけるＢＥＳＴＦＩＴまたはＧＡＰプログラムを用いてもよい。
「参照配列」は、配列を比較するための基準として使用される規定の配列を指す。参照配列は、長い配列のサブセット、例えば、完全長遺伝子またはポリペプチド配列のセグメントであってもよい。一般的に、参照配列は、少なくとも２０ヌクレオチドまたはアミノ酸残基長、少なくとも２５残基長、少なくとも５０残基長、または完全長の核酸またはポリペプチドである。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、それぞれ（１）２つの配列間で類似している配列（すなわち、完全配列の一部）を含んでいてもよく、（２）２つの配列間で異なる配列をさらに含んでいてもよいため、２つ（またはそれを超える）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの間の配列比較は、典型的には、「比較ウインドウ」にわたる２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列を比較して配列類似性の局所領域を同定し、比較することによって行われる。一部の実施形態では、「参照配列」は一次アミノ酸配列に基づいてもよく、一次配列において１つまたは複数の変化を有していてもよい配列である。例えば、「Ｘ１４に対応する残基においてバリンを有する配列番号４に基づく参照配列」またはＸ１４Ｖは、チロシンである、配列番号４のＸ１４における対応する残基が、バリンに変更されている参照配列を指す。
「比較ウインドウ」は、少なくとも約２０個の連続するヌクレオチド位置またはアミノ酸残基の概念的なセグメントを指し、配列は、少なくとも２０個の連続するヌクレオチドまたはアミノ酸の参照配列と比較してもよく、比較ウインドウにおける配列の一部は、２つの配列の最適なアラインメントに関して、参照配列（付加も欠失も含まない）と比較して２０パーセントまたはそれ未満の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでいてもよい。比較ウインドウは２０個の連続する残基よりも長くてもよく、必要に応じて３０、４０、５０、１００個、またはこれらより長いウインドウを含む。
本明細書で使用される場合、「実質的な同一性」は、少なくとも２０個の残基位置の比較ウインドウにわたる、高頻度には少なくとも３０～５０残基のウインドウにわたる参照配列と比較して、少なくとも８０パーセントの配列同一性、少なくとも８５パーセントの同一性、少なくとも８９パーセントから９５パーセントの間の配列同一性、またはさらに通常、少なくとも９９パーセントの配列同一性を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を指し、配列同一性パーセンテージは、参照配列を、合計で比較ウインドウにわたる参照配列の２０パーセントまたはそれ未満である欠失または付加を含む配列と比較することによって計算される。ポリペプチドに適用される一部の特定の実施形態では、「実質的な同一性」という用語は、２つのポリペプチド配列が、例えばデフォルトギャップ重みを使用したプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴによって最適にアラインメントされた場合、少なくとも８０パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも８９パーセントの配列同一性、少なくとも９５パーセントの配列同一性またはこれらを超える配列同一性（例えば、９９パーセントの配列同一性）を共有することを意味する。一部の実施形態では、比較される配列において同一ではない残基位置は、保存的なアミノ酸置換によって異なる。
「に対応すること」、「を参照する」、および「と比較する」は、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列の番号付けの文脈において使用される場合、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列を参照配列と比較した場合の特定の参照配列の残基の番号付けを指す。言い換えれば、所与のポリマーの残基番号または残基位置は、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列内の残基の実際の数値位置によってではなく、参照配列に関して指定される。例えば、所与のアミノ酸配列、例えば、操作されたイミンレダクターゼのものは、ギャップを導入して２つの配列間で残基のマッチを最適化することによって参照配列に対してアラインメントしてもよい。これらの場合ギャップが存在するが、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列における残基の番号付けは、アラインメントされた参照配列に対して行われる。
「アミノ酸の差異」または「残基の差異」は、参照配列の対応する位置におけるアミノ酸残基と比べた、ポリペプチド配列の位置のアミノ酸残基における変化を指す。アミノ酸の差異の位置は、「Ｘｎ」として本明細書において概して称し、ここで、ｎは、残基の差異が基づく参照配列における対応する位置を指す。例えば、「配列番号２と比較した位置Ｘ２５における残基の差異」は、配列番号２の位置２５に対応するポリペプチド位置におけるアミノ酸残基の変化を指す。したがって、配列番号２の参照ポリペプチドが、位置２５においてバリンを有する場合、「配列番号２と比較した位置Ｘ２５における残基の差異」は、配列番号２の位置２５に対応するポリペプチドの位置における、バリン以外の任意の残基のアミノ酸置換である。本明細書におけるほとんどの場合では、位置における具体的なアミノ酸残基の差異は、「ＸｎＹ」として示され、ここで、「Ｘｎ」は、上述のような対応する位置を指定し、「Ｙ」は、操作されたポリペプチドで見出されるアミノ酸の１文字の識別子（すなわち、参照ポリペプチドにおけるものとは異なる残基）である。一部の実施形態では、１つを超えるアミノ酸は、特定の残基位置において出現してもよい（すなわち、代替のアミノ酸をＸｎＹ／Ｚの形態で列挙してもよく、ここで、ＹおよびＺは、代替のアミノ酸残基を表す）。一部の場合では（例えば、表５．１、６．１、７．１、８．１、９．１および１０．１において）、本発明は、従来の表記法「ＡｎＢ」によって示される具体的なアミノ酸の差異も提供し、ここで、Ａは、参照配列における残基の１文字の識別子であり、「ｎ」は参照配列における残基位置の番号であり、Ｂは操作されたポリペプチドの配列における残基置換の１文字の識別子である。さらに、一部の場合では、本発明のポリペプチドは、参照配列に対して１つまたは複数のアミノ酸残基の差異を含んでいてもよく、これは、変化が参照配列に対して行われる特定の位置のリストによって示される。一部の追加の実施形態では、本発明は、保存的なアミノ酸置換と非保存的なアミノ酸置換の両方を含む操作されたポリペプチド配列を提供する。
本明細書で使用される場合、「保存的なアミノ酸置換」は、類似している側鎖を有する異なる残基での残基の置換を指し、したがって典型的には、同じかまたは類似している規定のクラスのアミノ酸の範囲内のアミノ酸でのポリペプチドにおけるアミノ酸の置換を伴う。例として、限定ではないが、脂肪族側鎖を有するアミノ酸は、別の脂肪族アミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン）で置換されており；ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸は、ヒドロキシル側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、セリンおよびスレオニン）で置換されており；芳香族側鎖を有するアミノ酸は、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、およびヒスチジン）で置換されており；塩基性側鎖を有するアミノ酸は、塩基性側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、リシンおよびアルギニン）で置換されており；酸性側鎖を有するアミノ酸は、酸性側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）で置換されており；および／または疎水性または親水性アミノ酸は、別の疎水性または親水性アミノ酸でそれぞれ置き換えられている。例示的な保存的置換は、以下の表１において提供される。
「非保存的置換」は、顕著に異なる側鎖特性を有するアミノ酸でのポリペプチドにおけるアミノ酸の置換を指す。非保存的な置換は、規定の群の範囲内ではなく、群間でアミノ酸を使用してもよく、（ａ）置換領域におけるペプチド骨格の構造（例えば、グリシンに対するプロリン）、（ｂ）電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩に影響を与える。例として、限定ではないが、例示的な非保存的な置換は、塩基性または脂肪族アミノ酸で置換された酸性アミノ酸；小さなアミノ酸で置換された芳香族アミノ酸；および疎水性アミノ酸で置換された親水性アミノ酸であってもよい。
「欠失」は、参照ポリペプチドから１つまたは複数のアミノ酸を除去することによるポリペプチドに対する改変を指す。欠失は、１個もしくはそれを超えるアミノ酸、２個もしくはそれを超えるアミノ酸、５個もしくはそれを超えるアミノ酸、１０個もしくはそれを超えるアミノ酸、１５個もしくはそれを超えるアミノ酸、または２０個もしくはそれを超えるアミノ酸、参照酵素を構成するアミノ酸の総数の最大１０％、またはアミノ酸の総数の最大２０％を除去すると同時に酵素活性を保持すること、および／または操作されたイミンレダクターゼ酵素の改善された特性を保持することを含んでいてもよい。欠失は、ポリペプチドの内部部分および／または末端部分を対象としてもよい。さまざまな実施形態において、欠失は連続的なセグメントを含んでいても、不連続であってもよい。
「挿入」は、１つまたは複数のアミノ酸を添加することによる、参照ポリペプチドからのポリペプチドに対する改変を指す。一部の実施形態では、改善され操作されたイミンレダクターゼ酵素は、イミンレダクターゼ活性を有する天然に存在するポリペプチドに対する１つまたは複数のアミノ酸の挿入、ならびに他の改善されたイミンレダクターゼポリペプチドに対する１つまたは複数のアミノ酸の挿入を含む。挿入は、ポリペプチドの内部部分またはカルボキシまたはアミノ末端におけるものであってもよい。挿入物は、本明細書で使用される場合、当技術分野において公知の融合タンパク質を含む。挿入物は、アミノ酸の連続するセグメントであっても、天然に存在するポリペプチドにおいてアミノ酸のうちの１つまたは複数によって分離されていてもよい。
「断片」は、本明細書で使用される場合、アミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失を有するが、残りのアミノ酸配列は、配列において対応する位置と同一であるポリペプチドを指す。断片は、少なくとも１４アミノ酸長、少なくとも２０アミノ酸長、少なくとも５０アミノ酸長またはこれらを超える長さ、および完全長イミンレダクターゼポリペプチド、例えば配列番号２のポリペプチド、または配列番号６から８０２の偶数番号の配列で提供される操作されたイミンレダクターゼの最大７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、および９９％であってもよい。
「単離されたポリペプチド」は、それに自然に付随している他の混入物質、例えば、タンパク質、脂質、およびポリヌクレオチドから実質的に分離されたポリペプチドを指す。その用語は、その天然に存在する環境または発現系（例えば、宿主細胞またはｉｎ ｖｉｔｒｏ合成）から取り出されたまたは精製されたポリペプチドを包含する。操作されたイミンレダクターゼ酵素は、細胞内に存在しても、細胞培地に存在しても、さまざまな形態、例えば、溶解産物または単離された調製物に調製してもよい。したがって、一部の実施形態では、操作されたイミンレダクターゼ酵素は単離されたポリペプチドであってもよい。
「実質的に純粋なポリペプチド」は、ポリペプチド種が、存在する優勢な（すなわち、モルまたは重量ベースで、組成物中のあらゆる他の個々の個体高分子種よりも豊富である）種である組成物を指し、目的の種が、モルまたは重量％で、存在する高分子種の少なくとも約５０パーセントを占める場合に一般的に実質的に精製された組成物である。一般的に、実質的に純粋なイミンレダクターゼ組成物は、モルまたは重量％で、組成物に存在する全ての高分子種のうちの約６０％またはそれを超える、約７０％またはそれを超える、約８０％またはそれを超える、約９０％またはそれを超える、約９５％またはそれを超える、および約９８％またはそれを超える％を占める。一部の実施形態では、目的の種は本質的に均一になるまでに精製されており（すなわち、混入物質種は、従来の検出方法によって組成物中に検出することができない）、組成物は、単一の高分子種から実質的になる。溶媒種、小分子（＜５００ダルトン）、および元素イオン種は高分子種とはみなされない。一部の実施形態では、単離された操作されたイミンレダクターゼポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチド組成物である。
「立体選択的」は、化学的または酵素的反応において、一方の立体異性体の形成がもう一方のものを上回ることに関する優先性を指す。１つの立体異性体の形成が他のものよりも好まれる場合、立体選択性は部分的であってもよく、または１つの立体異性体のみが形成される場合、それは完全であってもよい。立体異性体がエナンチオマーである場合、立体選択性はエナンチオ選択性と称され、これは両方の合計における１つのエナンチオマーの割合（典型的には、パーセンテージとして報告される）である。それは通常、式［主要なエナンチオマー－少量のエナンチオマー］／［主要なエナンチオマー＋少量のエナンチオマー］に従って、そこから計算されたエナンチオマー過剰（ｅ．ｅ．）として（典型的には、パーセンテージとして）当技術分野において代替的に報告される。立体異性体がジアステレオ異性体である場合、立体選択性はジアステレオ選択性と称され、これは２つのジアステレオマーの混合物中の１つのジアステレオマーの割合（典型的には、パーセンテージとして報告される）であり、ジアステレオマー過剰（ｄ．ｅ．）として通常代替的に報告される。エナンチオマー過剰およびジアステレオマー過剰はある種の立体異性体過剰（ｓｔｅｒｅｏｍｅｒｉｃ ｅｘｃｅｓｓ）である。
「高度に立体選択的」は、基質（複数可）（例えば、基質化合物（２）および（３））を対応するアミン生成物（例えば、化合物（１））に、少なくとも約８５％の立体異性体過剰で変換することができる化学的または酵素的反応を指す。
本明細書で使用される場合、「改善された酵素特性」は、酵素の少なくとも１つの改善された特性を指す。一部の実施形態では、本発明は、参照イミンレダクターゼポリペプチドおよび／または野生型イミンレダクターゼポリペプチド、および／または別の操作されたイミンレダクターゼポリペプチドと比較して、任意の酵素特性における改善を示す操作されたイミンレダクターゼポリペプチドを提供する。本明細書において記載される操作されたイミンレダクターゼポリペプチドに関しては、比較は、イミンレダクターゼが由来する野生型酵素に対して一般的に行われるが、一部の実施形態では、参照酵素は、別の改善された操作されたイミンレダクターゼであってもよい。したがって、「改善」のレベルは、野生型を含むさまざまなイミンレダクターゼポリペプチドと、操作されたイミンレダクターゼとの間で決定し、比較してもよい。改善された特性としては、これらに限定されるものではないが、酵素活性（基質の変換パーセントに換算して示してもよい）、熱安定性、溶媒安定性、ｐＨ活性プロファイル、補助因子の要件、阻害剤（例えば、基質または生成物阻害）に対する不応性、立体特異性、および／または立体選択性（エナンチオ選択性を含む）などの特性がある。
「酵素活性の増加」は、操作されたイミンレダクターゼポリペプチドの改善された特性を指し、これは、参照イミンレダクターゼ酵素と比較した、比活性（例えば、タンパク質重量あたりの産生される生成物／時間）における増加または基質の生成物への変換パーセントにおける増加（例えば、特定の量のイミンレダクターゼを使用した、特定の時間における出発量の基質から生成物への変換パーセント）によって表すことができる。酵素活性を決定するための例示的な方法は実施例において提供される。Ｋｍ、Ｖｍａｘまたはｋｃａｔの古典的酵素特性を含む酵素活性に関連する任意の特性が影響を受ける場合があり、その変化が酵素活性の増加につながる場合がある。酵素活性における改善は、対応する野生型酵素の約１．２倍の酵素活性から、イミンレダクターゼポリペプチドが由来する天然に存在するイミンレダクターゼまたは別の操作されたイミンレダクターゼの２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍のまたはこれらを超える酵素活性までであってもよい。イミンレダクターゼ活性は、標準アッセイのうちのいずれか１つによって、例えば、基質、補助因子、または生成物の特性における変化をモニタリングすることによって測定してもよい。一部の実施形態では、生成された生成物の量は、液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）によって測定してもよい。酵素活性の比較は、本明細書においてさらに詳細に説明されるように酵素の規定の調製物、設定条件下での規定のアッセイ、および１つまたは複数の規定の基質を使用して行われる。一般的に、溶解産物を比較する場合、細胞数およびアッセイされたタンパク質の量が決定され、ならびに宿主細胞によって産生され、溶解産物に存在する酵素の量の変動を最小限にするために、同一の発現系および同一の宿主細胞が使用される。
「変換」は、基質（複数可）の対応する生成物（複数可）への酵素的変換を指す。「変換パーセント」は、特定の条件下で一定期間内に生成物に変換される基質のパーセントを指す。したがって、イミンレダクターゼポリペプチドの「酵素活性」または「活性」は、基質の生成物への「変換パーセント」として表現され得る。
「熱安定の」は、高温（例えば、４０～８０℃）に一定期間（例えば、０．５～２４時間）曝露した後に、同じ高温に曝露された野生型酵素と比較して、同様の（例えば、６０％から８０％を超える）活性を維持するイミンレダクターゼポリペプチドを指す。
「溶媒安定の」は、異なる濃度（例えば、５～９９％）の溶媒（エタノール、イソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、アセトン、トルエン、酢酸ブチル、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルなど）に一定期間（例えば、０．５～２４時間）曝露された後に、同じ濃度の同じ溶媒に曝露された野生型酵素と比較して、同様の（例えば、６０％から８０％を超える）活性を維持するイミンレダクターゼポリペプチドを指す。
「熱安定性かつ溶媒安定性の」は、熱安定性と溶媒安定性の両方であるイミンレダクターゼポリペプチドを指す。
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語は、核酸ハイブリッドが安定である条件を指すために本明細書において使用される。当業者にとっては公知のように、ハイブリッドの安定性は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）において反映される。一般的に、ハイブリッドの安定性は、イオン強度、温度、Ｇ／Ｃ含有量、およびカオトロピック剤の存在の関数である。ポリヌクレオチドに関するＴｍ値は融解温度を予測するための公知の方法を使用して計算してもよい（例えば、Ｂａｌｄｉｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １６８：７６１－７７７ ［１９８９］；Ｂｏｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ４８：１３９０ ［１９６２］；Ｂｒｅｓｓｌａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：８８９３－８８９７ ［１９８６］；Ｆｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：９３７３－９３７７ ［１９８６］；Ｋｉｅｒｚｅｋ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２５：７８４０－７８４６ ［１９８６］；Ｒｙｃｈｌｉｋ ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １８：６４０９－６４１２ ［１９９０］ （正誤表はＮｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９：６９８ ［１９９１］）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，上記を参照のこと）；Ｓｕｇｇｓ ｅｔ ａｌ．， １９８１， ｉｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｕｓｉｎｇ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｇｅｎｅｓ， Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ． ［ｅｄｓ．］， ｐｐ． ６８３－６９３， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ ［１９８１］；およびＷｅｔｍｕｒ， Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２６：２２７－２５９ ［１９９１］を参照のこと）。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書において開示されるポリペプチドをコードし、定義される条件、例えば、中程度にストリンジェントなまたは高度にストリンジェントな条件下で、本発明の操作されたイミンレダクターゼ酵素をコードする配列の相補鎖にハイブリダイズする。
「ハイブリダイゼーションストリンジェンシー」は、ハイブリダイゼーション条件、例えば、核酸のハイブリダイゼーションにおける洗浄条件に関連する。一般的に、ハイブリダイゼーション反応は、低ストリンジェンシーの条件下で行われ、続いてさまざまではあるが高ストリンジェンシーの洗浄が行われる。「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション」という用語は、標的ＤＮＡが、標的ＤＮＡに対して約６０％の同一性、好ましくは約７５％の同一性、約８５％の同一性を有し、標的ポリヌクレオチドに対して約９０％超の同一性を有する相補的核酸に結合するのを可能にする条件を指す。例示的な中程度にストリンジェントな条件は、５０％ホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中、４２℃でのハイブリダイゼーション、続いて０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中、４２℃での洗浄と同等の条件である。「高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション」は、規定のポリヌクレオチド配列に関する溶液条件下で決定される熱融解温度Ｔｍから約１０℃またはそれ未満の条件を一般的に指す。一部の実施形態では、高ストリンジェンシー条件は、０．０１８Ｍ ＮａＣｌ中、６５℃で安定ハイブリッドを形成するこれらの核酸配列のみのハイブリダイゼーションを可能にする条件を指す（すなわち、ハイブリッドが０．０１８Ｍ ＮａＣｌ中６５℃で安定ではない場合、本明細書において企図されるように、高ストリンジェンシー条件下で安定ではない）。高ストリンジェンシー条件は、例えば、５０％ホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中、４２℃と同等の条件においてハイブリダイゼーションし、続いて０．１×ＳＳＰＥ、および０．１％ＳＤＳ中、６５℃で洗浄することによって提供してもよい。別の高ストリンジェンシー条件は、０．１％（ｗ：ｖ）ＳＤＳを含む５×ＳＳＣ中、６５℃でハイブリダイズするのと同等の条件においてハイブリダイズし、０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中、６５℃で洗浄することである。他の高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、および中程度にストリンジェントな条件は、上記の引用文献において記載される。
「異種の」ポリヌクレオチドは、実験室技術によって宿主細胞中に導入される任意のポリヌクレオチドを指し、宿主細胞から取り出され、実験室操作が行われ、次いで宿主細胞中に再導入されるポリヌクレオチドを含む。
「コドン最適化」は、コードされたタンパク質が目的の生物において効率的に発現するように、タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドンにおける、特定の生物において優先的に使用されるものへの変化を指す。大部分のアミノ酸は、「同義（ｓｙｎｏｎｙｍ）」または「同義（ｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ）」コドンと称されるいくつかのコドンによって表されるという点において遺伝的コードは縮重するが、特定の生物によるコドンの使用はランダムではなく、特定のコドントリプレットに片寄っていることは周知である。このコドン使用バイアスは、所与の遺伝子、共通の機能的または祖先起源の遺伝子、高発現タンパク質対低コピー数タンパク質、および生物のゲノムの総タンパク質コード領域に関連して高い場合がある。一部の実施形態では、イミンレダクターゼ酵素をコードするポリヌクレオチドは、発現のために選択された宿主生物からの最適な産生のために最適化されたコドンであってもよい。
本明細書で使用される場合、「好ましい最適な高コドン使用バイアスコドン」は、同じアミノ酸をコードする他のコドンよりもタンパク質コード領域において高頻度で使用されるコドンを同じ意味で指す。好ましいコドンは、単一の遺伝子、共通の機能または起源の一連の遺伝子、高度に発現された遺伝子におけるコドン使用、生物全体の総タンパク質コード領域におけるコドン頻度、関連する生物の総タンパク質コード領域におけるコドン頻度、またはこれらの組合せに関連して決定してもよい。その頻度が、遺伝子発現のレベルに伴って増加するコドンは、典型的には発現に最適なコドンである。例えば、クラスター分析または対応分析を使用した多変量分析、および遺伝子において使用されるコドンの有効数を含む、特定の生物におけるコドン頻度（例えば、コドンの使用、相対的同義コドンの使用）およびコドン優先性を決定するためのさまざまな方法が公知である（例えば、ＧＣＧ ＣｏｄｏｎＰｒｅｆｅｒｅｎｃｅ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ；ＣｏｄｏｎＷ， Ｐｅｄｅｎ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ； ＭｃＩｎｅｒｎｅｙ， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．， １４：３７２－７３ ［１９９８］；Ｓｔｅｎｉｃｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２２２４３７－４６ ［１９９４］；Ｗｒｉｇｈｔ， Ｇｅｎｅ ８７：２３－２９ ［１９９０］を参照のこと）。コドン使用表が多くの異なる生物に関して利用可能である（例えば、Ｗａｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２０：２１１１－２１１８ ［１９９２］；Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２８：２９２ ［２０００］；Ｄｕｒｅｔ， ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ；Ｈｅｎａｕｔ ａｎｄ Ｄａｎｃｈｉｎ， ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ， Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ， ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．）， ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．， ｐ． ２０４７－２０６６ ［１９９６］を参照のこと）。コドン使用を得るためのデータ源は、タンパク質をコードすることができる任意の利用可能なヌクレオチド配列に依存する場合がある。これらのデータセットとしては、発現タンパク質をコードすることが実際に既知の核酸配列（例えば、完全なタンパク質コード配列－ＣＤＳ）、発現配列タグ（ＥＳＴＳ）、またはゲノム配列の予測コード領域がある（例えば、Ｍｏｕｎｔ， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ： Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｃｈａｐｔｅｒ ８， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ． ［２００１］；Ｕｂｅｒｂａｃｈｅｒ， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．， ２６６：２５９－２８１ ［１９９６］；およびＴｉｗａｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｍｐｕｔ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｓｃｉ．， １３：２６３－２７０ ［１９９７］を参照のこと）。
「制御配列」は、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現に必要なまたは有利な全ての構成要素を含むことが本明細書において定義される。各制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列に対して自然のまたは外来性のものであってもよい。そのような制御配列としては、これらに限定されるものではないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、および転写ターミネーターがある。少なくとも、制御配列は、プロモーター、ならびに転写および翻訳停止シグナルを含む。制御配列は、制御配列とポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域とのライゲーションを促進する特定の制限部位を導入する目的でリンカーとともに提供される場合がある。
「操作可能に連結された」は、制御配列が目的のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を指示または調節するように、制御配列が目的のポリヌクレオチドと相対的な位置において適切に配置された（すなわち、機能的な関係の状態にある）構成として本明細書において定義される。
「プロモーター配列」は、宿主細胞によって認識されて目的のポリヌクレオチドを発現する核酸配列、例えばコード配列を指す。プロモーター配列は、目的のポリヌクレオチドの発現を媒介する転写制御配列を含む。プロモーターは、変異体、短縮、およびハイブリッドプロモーターを含む選択した宿主細胞において転写活性を示す任意の核酸配列であってもよく、宿主細胞に対して同種または異種のいずれかの細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得てもよい。
「好適な反応条件」は、本発明のイミンレダクターゼポリペプチドが、基質化合物を生成物化合物に変換すること（例えば、化合物（２）を化合物（１）へ変換すること）ができる生体触媒反応溶液における条件（例えば、酵素負荷、基質負荷、補助因子負荷、温度、ｐＨ、緩衝液、共溶媒の範囲など）を指す。例示的な「好適な反応条件」が本発明において提供され、実施例によって示される。
「補助因子再生系」または「補助因子リサイクリング系」は、補助因子の酸化型を還元する（例えば、ＮＡＤＰ＋をＮＡＤＰＨにする）反応に関与する一連の反応物を指す。イミンレダクターゼが触媒するケトン基質の還元的アミノ化によって酸化された補助因子は、補助因子再生系によって還元型に再生される。補助因子再生系は、還元水素当量の供給源であり、補助因子の酸化型を還元することができる化学量論の還元剤を含む。補助因子再生系は、触媒、例えば、還元剤による補助因子の酸化型の還元を触媒する酵素触媒をさらに含んでいてもよい。ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋からＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨをそれぞれ再生するための補助因子再生系は、当技術分野において公知であり、本明細書において記載される方法を使用してもよい。
「リン酸デヒドロゲナーゼ」および「ＰＤＨ」は本明細書において相互交換可能に使用され、ホスファイトおよびＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋の、二酸化炭素およびＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨへの変換をそれぞれ触媒するＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋依存性酵素を指す。
例えば「化合物負荷」または「酵素負荷」または「補助因子負荷」における「負荷」は、反応開始時の反応混合物における構成要素の濃度または量を指す。
生体触媒を介在するプロセスの文脈における「基質」は、生体触媒によって作用を受ける化合物または分子を指す。例えば、本明細書において開示される還元的アミノ化プロセスにおいて使用されるイミンレダクターゼ生体触媒は、式（ＩＩ）のケトン（またはアルデヒド）基質、例えばシクロヘキサノン、および式（ＩＩＩ）のアミン基質、例えばブチルアミンである。
生体触媒を介在するプロセスの文脈における「生成物」は、生体触媒の作用から生じる化合物または分子を指す。例えば、本明細書において開示されるプロセスにおいて使用されるイミンレダクターゼ生体触媒に関する例示的な生成物は、第二級または第三級アミン化合物、例えば式（Ｉ）の化合物である。
「アルキル」は、１から１８個（両端を含む）の炭素原子、より好ましくは１から８個（両端を含む）の炭素原子、最も好ましくは１から６個（両端を含む）の炭素原子の直鎖状または分岐状飽和炭化水素基を指す。指定された数の炭素原子を有するアルキルは括弧内に示される（例えば、（Ｃ１～Ｃ６）アルキルは１から６個の炭素原子のアルキルを指す）。
「アルケニル」は、少なくとも１つの二重結合を含むが、１つを超える二重結合を必要に応じて含む、２から１２個（両端を含む）の炭素原子の直鎖状または分岐状炭化水素基を指す。
「アルキニル」は、少なくとも１つの三重結合を含むが、１つを超える三重結合を必要に応じて含み、さらに１つまたは複数の二重結合部分を必要に応じて含む、２から１２個（両端を含む）の炭素原子の直鎖状または分岐状炭化水素基を指す。
「アルキレン」は、１から１８個（両端を含む）の炭素原子、より好ましくは１から８個（両端を含む）の炭素原子、最も好ましくは１から６個（両端を含む）の炭素原子を有し、１つまたは複数の好適な置換基で必要に応じて置換された、直鎖状または分岐鎖状二価炭化水素ラジカルを指す。例示的な「アルキレン」としては、これらに限定されるものではないが、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレンなどがある。
「アルケニレン」は、２から１２個（両端を含む）の炭素原子、より好ましくは２から８個（両端を含む）の炭素原子、最も好ましくは２から６個（両端を含む）の炭素原子を有し、１つまたは複数の炭素－炭素二重結合を有し、１つまたは複数の好適な置換基で必要に応じて置換された、直鎖状または分岐鎖状二価炭化水素ラジカルを指す。
「ヘテロアルキル」、「ヘテロアルケニル」、および「ヘテロアルキニル」は、炭素原子のうちの１つまたは複数が、それぞれ独立して、同じまたは異なるヘテロ原子またはヘテロ原子基で置き換えられている、本明細書において定義されるようなアルキル、アルケニルおよびアルキニルをそれぞれ指す。炭素原子と置き換えてもよいヘテロ原子および／またはヘテロ原子基としては、これらに限定されるものではないが、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ－Ｏ－、－ＮＲγ－、－ＰＨ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）ＮＲγ－、－Ｓ（Ｏ）２ＮＲγ－、これらの組合せを含む同類のものがあり、ここで、各Ｒγは、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、およびヘテロアリールから独立して選択される。
「アリール」は、単一の環（例えば、フェニル）または複数の縮合環（例えば、ナフチルまたはアントリル）を有する、６から１２個（両端を含む）の炭素原子の不飽和芳香族炭素環式基を指す。例示的なアリールとしては、フェニル、ピリジル、ナフチルなどがある。
「アリールアルキル」は、アルキル部分において１から６個（両端を含む）の炭素原子、アリール部分において６から１２個（両端を含む）の炭素原子を好ましくは有する、アリールで置換されたアルキル（すなわち、アリール－アルキル基）を指す。そのようなアリールアルキル基は、ベンジル、フェネチルなどによって例示される。
「アリールオキシ」は、－ＯＲλ基を指し、ここで、Ｒλは、必要に応じて置換されていてもよいアリール基である。
「シクロアルキル」は、１から３個のアルキル基で必要に応じて置換されていてもよい単一の環式環または複数の縮合環を有する、３から１２個（両端を含む）の炭素原子の環式アルキル基を指す。例示的なシクロアルキル基としては、これらに限定されるものではないが、単一の環構造、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロオクチル、１－メチルシクロプロピル、２－メチルシクロペンチル、２－メチルシクロオクチルなど、または橋掛け環系を含む複数の環構造、例えば、アダマンチルなどがある。
「シクロアルキルアルキル」は、アルキル部分において１から６個（両端を含む）の炭素原子、およびシクロアルキル部分において３から１２個（両端を含む）の炭素原子を好ましくは有する、シクロアルキルで置換されたアルキル（すなわち、シクロアルキル－アルキル基）を指す。そのようなシクロアルキルアルキル基は、シクロプロピルメチル、シクロヘキシルエチルなどによって例示される。
「アミノ」は、－ＮＨ２基を指す。置換アミノは、－ＮＨＲη、ＮＲηＲη、およびＮＲηＲηＲη基を指し、ここで、各Ｒηは、置換または非置換のアルキル、シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アシル、アルコキシカルボニル、スルファニル、スルフィニル、スルホニルなどから独立して選択される。典型的なアミノ基としては、これらに限定されるものではないが、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、トリメチルアンモニウム、トリエチルアンモニウム、メチルスルホニルアミノ、フラニル－オキシ－スルファミノなどがある。
「アミノアルキル」は、水素原子のうちの１つまたは複数が、置換アミノ基を含む１つまたは複数のアミノ基で置き換えられているアルキル基を指す。
「アミノカルボニル」は、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ２を指す。置換アミノカルボニルは、－Ｃ（Ｏ）ＮＲηＲηを指し、ここで、アミノ基ＮＲηＲηは本明細書において定義されるとおりである。
「オキシ」は、エーテルおよびエステルを含む異なるオキシ基を形成するためのさまざまな置換基を有していてもよい二価基－Ｏ－を指す。
「アルコキシ」または「アルキルオキシ」は本明細書において相互交換可能に使用され、－ＯＲζ基を指し、ここでＲζは、必要に応じて置換されたアルキル基を含むアルキル基を指す。
「カルボキシ」は－ＣＯＯＨを指す。
「カルボニル」は、酸、酸ハロゲン化物、アルデヒド、アミド、エステル、およびケトンを含む異なるカルボニル基を形成するためのさまざまな置換基を有していてもよい－Ｃ（Ｏ）－を指す。
「カルボキシアルキル」は、水素原子のうちの１つまたは複数が１つまたは複数のカルボキシ基で置き換えられているアルキルを指す。
「アミノカルボニルアルキル」は、本明細書において定義されるようなアミノカルボニル基で置換されたアルキルを指す。
「ハロゲン」または「ハロ」は、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードを指す。
「ハロアルキル」は、水素原子のうちの１つまたは複数がハロゲンで置き換えられているアルキル基を指す。したがって、「ハロアルキル」という用語は、モノハロアルキル、ジハロアルキル、トリハロアルキルなどからペルハロアルキルまでを含むことを意味する。例えば、「（Ｃ１～Ｃ２）ハロアルキル」という表現は、１－フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、１－フルオロエチル、１，１－ジフルオロエチル、１，２－ジフルオロエチル、１，１，１トリフルオロエチル、ペルフルオロエチルなどを含む。
「ヒドロキシ」は－ＯＨを指す。
「ヒドロキシアルキル」は、水素原子のうちの１つまたは複数が１つまたは複数のヒドロキシ基で置き換えられているアルキル基を指す。
「チオール」または「スルファニル」は、－ＳＨを指す。置換チオールまたはスルファニルは－Ｓ－Ｒηを指し、ここで、Ｒηはアルキル、アリールまたは他の好適な置換基である。
「アルキルチオ」は－ＳＲζを指し、ここで、Ｒζは、必要に応じて置換されていてもよいアルキルである。典型的なアルキルチオ基としては、これらに限定されるものではないが、メチルチオ、エチルチオ、ｎ－プロピルチオなどがある。
「アルキルチオアルキル」は、アルキルチオ基、－ＳＲζで置換されたアルキルを指し、ここで、Ｒζは、必要に応じて置換されていてもよいアルキルである。
「スルホニル」は－ＳＯ２－を指す。置換スルホニルは－ＳＯ２－Ｒηを指し、ここで、Ｒηは、アルキル、アリールまたは他の好適な置換基である。
「アルキルスルホニル」は－ＳＯ２－Ｒζを指し、ここで、Ｒζは、必要に応じて置換されていてもよいアルキルである。典型的なアルキルスルホニル基としては、これらに限定されるものではないが、メチルスルホニル、エチルスルホニル、ｎ－プロピルスルホニルなどがある。
「アルキルスルホニルアルキル」は、アルキルスルホニル基で置換されたアルキル、－ＳＯ２－Ｒζを指し、ここで、Ｒζは、必要に応じて置換されていてもよいアルキルである。
「ヘテロアリール」は、環内で、１から１０個（両端を含む）の炭素原子、ならびに酸素、窒素および硫黄から選択される１から４個（両端を含む）のヘテロ原子の芳香族複素環式基を指す。そのようなヘテロアリール基は、単一の環（例えば、ピリジルまたはフリル）または複数の縮合環（例えば、インドリジニルまたはベンゾチエニル）を有していてもよい。
「ヘテロアリールアルキル」は、アルキル部分において１から６個（両端を含む）の炭素原子、およびヘテロアリール部分において５から１２個（両端を含む）の環原子を好ましくは有する、ヘテロアリールで置換されたアルキル（すなわち、ヘテロアリール－アルキル基）を指す。そのようなヘテロアリールアルキル基はピリジルメチルなどによって例示される。
「複素環」、「複素環式」および同じ意味で「ヘテロシクロアルキル」は、単一の環または複数の縮合環、環内で２から１０個（両端を含む）の炭素環原子および窒素、硫黄または酸素から選択される１から４個（両端を含む）のヘテロ環原子を有する、飽和または不飽和基を指す。そのような複素環式基は、単一の環（例えば、ピペリジニルまたはテトラヒドロフリル）または複数の縮合環（例えば、インドリニル、ジヒドロベンゾフランまたはキヌクリジニル）を有していてもよい。複素環の例としては、これらに限定されるものではないが、フラン、チオフェン、チアゾール、オキサゾール、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドリジン、イソインドール、インドール、インダゾール、プリン、キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチルピリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、フェナントロリン、イソチアゾール、フェナジン、イソオキサゾール、フェノキサジン、フェノチアジン、イミダゾリジン、イミダゾリン、ピペリジン、ピペラジン、ピロリジン、インドリンなどがある。
「ヘテロシクロアルキルアルキル」は、アルキル部分において１から６個（両端を含む）の炭素原子およびヘテロシクロアルキル部分において３から１２個（両端を含む）の環原子を好ましくは有する、ヘテロシクロアルキルで置換されたアルキル（すなわち、ヘテロシクロアルキル－アルキル基）を指す。
「員環」は、任意の環式構造を包含することを意味する。「員」という用語に先行する数は、環を構成する骨格原子の数を示す。したがって、例えば、シクロヘキシル、ピリジン、ピランおよびチオピランは６員環であり、シクロペンチル、ピロール、フラン、およびチオフェンは５員環である。
「融合された二環式環」は、本明細書で使用される場合、各環において５から８個の原子を有し、それらの環が２個の共通の原子を有する、置換されていない炭素環式および／または複素環式環部分と置換された炭素環式および／または複素環式環部分の両方を指す。
「必要に応じて置換されていてもよい」は、前述の化学基に関連して本明細書で使用される場合、水素が占有する化学基の位置が、これらに限定されないが、炭素、酸素、窒素、または硫黄によって例示される別の原子（特に規定がない限り）、またはこれらに限定されないが、ヒドロキシ、オキソ、ニトロ、メトキシ、エトキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、トリフルオロメトキシ、ハロアルコキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、ハロ、メチル、エチル、プロピル、ブチル、アルキル、アルケニル、アルキニル、置換アルキル、トリフルオロメチル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、チオ、アルキルチオ、アシル、カルボキシ、アルコキシカルボニル、カルボキサミド、置換カルボキサミド、アルキルスルホニル、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニルアミノ、スルホンアミド、置換スルホンアミド、シアノ、アミノ、置換アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、アシルアミノ、アミジノ、アミドキシモ、ヒドロキサモイル、フェニル、アリール、置換アリール、アリールオキシ、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ピリジル、イミダゾリル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルキルオキシ、ピロリジニル、ピペリジニル、モルホリノ、複素環、（複素環）オキシ、および（複素環）アルキルによって例示される化学基で置換されていてもよく；ここで、好ましいヘテロ原子は、酸素、窒素、および硫黄であることを意味する。さらに、オープン原子価（ｏｐｅｎ ｖａｌｅｎｃｅｓ）がこれらの置換の化学基に存在する場合、これらはアルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、および／または複素環基でさらに置換されていてもよく、これらのオープン原子価が炭素に存在する場合、これらはハロゲンで、および酸素、窒素、または硫黄が結合した置換基でさらに置換されていてもよく、複数のそのようなオープン原子価が存在する場合、これらの基は、結合を直接形成することによってまたは新規のヘテロ原子、好ましくは酸素、窒素、または硫黄に結合を形成することによって接合して環を形成する。上記置換は、水素の置換基での置き換えが、本発明の分子に許容できない不安定性を導入することがなく、そうでなければ化学的に妥当であるという条件で行うことができることがさらに企図される。当業者であれば、必要に応じて置換されていてもよいと記載された任意の化学基に関しては、立体的に実用的なおよび／または合成的に実現可能な化学基のみが含まれることを意味することを理解するであろう。「必要に応じて置換されていてもよい」は、本明細書で使用される場合、用語または一連の化学基における全ての後続の修飾語句を指す。例えば、「必要に応じて置換されていてもよいアリールアルキル」という用語において、分子の「アルキル」部分および「アリール」部分は、置換されていてもされていなくてもよく、一連の「必要に応じて置換されたアルキル、シクロアルキル、アリールおよびヘテロアリール」に関しては、アルキル、シクロアルキル、アリール、およびヘテロアリール基は、他とは独立して、置換されていてもされていなくてもよい。
イミンの第二級アミンへの変換
本発明は、カルボニルおよびアミン含有基質に直接的還元的アミノ化を行うことによってキラル第二級アミンを合成するための新規な生体触媒および関連する使用方法を提供する。本開示の生体触媒は、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．株１Ｃからの野生型遺伝子の操作されたポリペプチドバリアントであって、配列番号２のアミノ酸配列を有するイミンレダクターゼをコードする操作されたポリペプチドバリアントである。配列番号２と比較した以下の残基の差異：Ｎ１９８Ｈを含む野生型イミンレダクターゼのバリアント（配列番号４）（米国特許第９，４８７，７６０号、同第９，６９５，４５１号）をタンパク質操作のための開始点として使用した。これらの操作されたポリペプチドは、カルボニル化合物およびアミンの第二級アミンへの変換を触媒することができる。ＩＲＥＤの一般的なイミンレダクターゼ活性は以下のスキーム１に示される。
本発明は、カルボニルおよびアミン含有基質に直接的還元的アミノ化を行うことによってキラル第二級アミンを合成するための新規な生体触媒および関連する使用方法を提供する。本開示の生体触媒は、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．株１Ｃからの野生型遺伝子の操作されたポリペプチドバリアントであって、配列番号２のアミノ酸配列を有するイミンレダクターゼをコードする操作されたポリペプチドバリアントである。配列番号２と比較した以下の残基の差異：Ｎ１９８Ｈを含む野生型イミンレダクターゼのバリアント（配列番号４）（米国特許第９，４８７，７６０号、同第９，６９５，４５１号）をタンパク質操作のための開始点として使用した。これらの操作されたポリペプチドは、カルボニル化合物およびアミンの第二級アミンへの変換を触媒することができる。ＩＲＥＤの一般的なイミンレダクターゼ活性は以下のスキーム１に示される。
本発明のイミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、さまざまな基質を受け入れることができる。したがって、スキーム２の生体触媒反応において、基質のＲ１基は、水素原子、または必要に応じて置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アリールアルコキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、ハロアルキル、アルキルチオアルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、およびヘテロアリールアルキルから選択され；基質のＲ２基は、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシアルキル、カルボキシ、アミノカルボニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボキシアルキル、アルキルアミノ、ハロアルキル、アルキルチオアルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、およびヘテロアリールアルキルから独立して選択され；基質のＲ３基は、メチル、ｄ３－メチルおよびエチルから独立して選択される。
本明細書においてさらに記載されるように、イミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドは立体選択性を示し；したがって、スキーム２のイミンレダクターゼ反応を使用して、単一の生体触媒反応において生成物の１つまたはそれを超えるキラル中心を確立することができる。
一部の実施形態では、本発明は、配列番号４のアミノ酸参照配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、参照アミノ酸配列と比較した１つまたは複数のアミノ酸残基の差異をさらに含む操作されたポリペプチドであって、イミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。操作されたポリペプチドの一部の実施形態では、イミンレダクターゼ活性は、スキーム２の活性である。
特に、本開示の操作されたイミンレダクターゼポリペプチドは、スキーム３で示すように水性条件におけるケト－エステル基質、３－［４－（３－クロロフェニル）フェニル］－２－オキソ－プロパン酸（本明細書においてクロロ－ビフェニルピルベートおよび「化合物（２）」と称される）およびアミン基質、Ｌ－アラニンエチルエステル（本明細書において「化合物（３）」と称される）の、対応するキラルアミン生成物化合物、３－［４－（３－クロロフェニル）フェニル］－２－［（２－エトキシ－１－メチル－２－オキソ－エチル）アミノ］プロパン酸（本明細書において「化合物（１）」と称される）への効率的な変換のために操作されている。
置換されたカルバモイルメチルアミノ酢酸誘導体である化合物（１）の化学的合成は、マルチステッププロセスである。低収率であるこのマルチステップの化学的プロセスにとって、いくつかのステップが合成順序から除かれ得るため、イミンレダクターゼ活性を有する酵素の使用は魅力的な代替手段となる。
操作されたイミンレダクターゼポリペプチド
本発明は、イミンレダクターゼ活性を有するポリペプチド、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ポリペプチドを調製する方法、およびポリペプチドを使用するための方法を提供する。説明がポリペプチドに関連する場合、それは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを記載する場合があることを理解されたい。
本発明は、イミンレダクターゼ活性を有するポリペプチド、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ポリペプチドを調製する方法、およびポリペプチドを使用するための方法を提供する。説明がポリペプチドに関連する場合、それは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを記載する場合があることを理解されたい。
操作されたポリペプチドの上述の改善された特性が所望の反応を行う好適な反応条件は、以下でおよび実施例でさらに記載されるように、ポリペプチド、基質、補基質、緩衝液、溶媒の濃度もしくは量、ｐＨ、温度および反応時間を含む条件、ならびに／または固体支持体に固定化されたポリペプチドを用いた条件に関連して決定してもよい。
一部の実施形態では、特に式（ＩＩ）の化合物および式（ＩＩＩ）の化合物の式（Ｉ）の化合物への変換において改善された特性を有するイミンレダクターゼ活性を有する例示的な操作されたポリペプチドは、表５．１で示される残基位置において配列番号４と比較した１つまたは複数の残基の差異を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、特に式（ＩＩ）の化合物および式（ＩＩＩ）の化合物の式（Ｉ）の化合物への変換において改善された特性を有するイミンレダクターゼ活性を有する例示的な操作されたポリペプチドは、表６．１で示される残基位置において配列番号１６と比較した１つまたは複数の残基の差異を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、特に式（ＩＩ）の化合物および式（ＩＩＩ）の化合物の式（Ｉ）の化合物への変換において改善された特性を有するイミンレダクターゼ活性を有する例示的な操作されたポリペプチドは、表７．１で示される残基位置において配列番号５０と比較した１つまたは複数の残基の差異を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、特に式（ＩＩ）の化合物および式（ＩＩＩ）の化合物の式（Ｉ）の化合物への変換において改善された特性を有するイミンレダクターゼ活性を有する例示的な操作されたポリペプチドは、表８．１で示される残基位置において配列番号３０６と比較した１つまたは複数の残基の差異を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、特に式（ＩＩ）の化合物および式（ＩＩＩ）の化合物の式（Ｉ）の化合物への変換において改善された特性を有するイミンレダクターゼ活性を有する例示的な操作されたポリペプチドは、表９．１で示される残基位置において配列番号６４８と比較した１つまたは複数の残基の差異を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、特に式（ＩＩ）の化合物および式（ＩＩＩ）の化合物の式（Ｉ）の化合物への変換において改善された特性を有するイミンレダクターゼ活性を有する例示的な操作されたポリペプチドは、表１０．１で示される残基位置において配列番号７０８と比較した１つまたは複数の残基の差異を有するアミノ酸配列を含む。
本発明の例示的な天然に存在しない（または操作された）ポリペプチドに関する構造および機能の情報は、式（ＩＩ）の化合物および式（ＩＩＩ）の化合物の式（Ｉ）の化合物への変換に基づいており、その結果は、以下の表５．１、６．１、７．１、８．１、９．１、および１０．１に示され、実施例においてさらに記載される。これらの表における奇数番号の配列識別子（すなわち、配列番号）は、これらの表において偶数番号の配列番号によって提供されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を指す。例示的な配列は、本発明に添付される電子配列表ファイルにおいて提供され、これは参照により本明細書に組み込まれるものとする。アミノ酸残基の差異は、示されているように、配列番号４、１６、５０、３０６、６４８、および７０８の参照配列に対する比較に基づく。
配列番号２に対してＮ１９８Ｈ置換を含む配列番号４のバリアントは、野生型Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．株１Ｃ（ＣＥＮＤＨ）酵素を使用して産生された（米国特許第９，４８７，７６０号、同第９，６９５，４５１号）。配列番号４を開始配列として使用して、本発明のバリアントを産生した。イミンレダクターゼのアミノ酸配列（配列番号４）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおける発現のためにコドン最適化し、合成した（配列番号３）。
配列番号４、１６、５０、３０６、６４８、または７０８の参照ポリペプチドに対する、各操作されたポリペプチドの活性を、本明細書における実施例に記載される基質の変換として決定した。一部の実施形態では、振とうフラスコ粉末（ｓｈａｋｅ ｆｌａｓｋ ｐｏｗｄｅｒ）（ＳＦＰ）を二次スクリーニングとして使用して、操作されたイミンレダクターゼの特性を評価し、その結果を実施例において提供する。一部の実施形態では、ＳＦＰ形態は、操作されたポリペプチドのより精製された粉末調製物を提供し、最大で総タンパク質の約３０％である操作されたポリペプチドを含んでいてもよい。
一部の実施形態では、特異的酵素特性は、本明細書において示される残基位置における配列番号４、１６、５０、３０６、６４８、または７０８と比較した場合の残基の差異に関連する。一部の実施形態では、ポリペプチド発現に影響を与える残基の差異を使用して、操作されたイミンレダクターゼの発現を増加させることができる。
本明細書において提供されるガイダンスを考慮すると、配列番号６～８０２の偶数番号の配列を含む例示的な操作されたポリペプチドのいずれかが、例えば、表５．１、６．１、７．１、８．１、９．１、および１０．１における他のポリペプチドとの、ならびに本明細書において記載される他の残基位置におけるさまざまなアミノ酸の差異の新規の組合せを組み込むその後のラウンドの進化によって、他の操作されたイミンレダクターゼポリペプチドを合成するための開始アミノ酸配列としての使用を見出されることがさらに企図される。初期のラウンドの進化全体にわたって不変のまま維持されてきた残基位置におけるアミノ酸の差異を含めることによってさらなる改善が生じる場合がある。
一部の実施形態では、イミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、参照配列配列番号４に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに配列番号４と比較した１４５、１４６、１５３、１６０、２２２、２２３、２２６、および２６１から選択される１つまたは複数の残基の差異を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、イミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、参照配列配列番号４に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに配列番号４と比較した１４５Ｉ、１４５Ｖ、１４６Ａ、１５３Ｌ、１５３Ｒ、１６０Ｔ、２２２Ｆ、２２２Ｗ、２２３Ａ、２２３Ｇ、２２３Ｉ、２２３Ｓ、２２３Ｖ、２２６Ｍ、および２６１Ｔから選択される１つまたは複数の残基の差異を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、イミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、参照配列配列番号４に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに、配列番号４と比較したＥ１４５Ｉ、Ｅ１４５Ｖ、Ｒ１４６Ａ、Ｎ１５３Ｌ、Ｎ１５３Ｒ、Ｄ１６０Ｔ、Ｙ２２２Ｆ、Ｙ２２２Ｗ、Ｌ２２３Ａ、Ｌ２２３Ｇ、Ｌ２２３Ｉ、Ｌ２２３Ｓ、Ｌ２２３Ｖ、Ｉ２２６Ｍ、およびＥ２６１Ｔから選択される１つまたは複数の残基の差異を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、イミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、参照配列配列番号１６に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに配列番号１６と比較した２９／９４／１８４／２２３／２３２／２８８／２９３、２９／９４／１８４／２３２／２８７／２８８／２９３／３１１、２９／９４／１８４／２３２／２８７／２８８／３１１、２９／９４／１８４／２３２／２８７／２９３／３３２、２９／９４／１８４／２３２／２８８／２９３／３１１／３２４／３５３、２９／９４／１８４／２３２／２８８／３１１／３２４／３３２、２９／９４／１８４／２３２／２９３、２９／９４／１８４／２３２／３１１、２９／９４／１８４／２８７／２９３、２９／９４／１８４／２８７／２９３／３１１／３５３、２９／９４／１８４／２８７／３１１、２９／９４／１８４／２８８／２９３／３２４、２９／９４／１８４／２８８／２９３／３３２／３５３、２９／９４／１８４／２８８／２９８／３３２、２９／９４／１８４／２８８／３５３、２９／９４／１８４／２９３／３１１、２９／９４／１８４／３２４、２９／９４／２２３／２３２／２８７、２９／９４／２２３／２３２／２９３／３１１／３２４、２９／９４／２２３／２８８／２９３、２９／９４／２３２／２８７／２８８／３１１、２９／９４／２３２／２８８／２９３、２９／９４／２８７／２８８／２９３、２９／９４／２８７／２８８／２９３／３５３、２９／９４／２８７／３１１、２９／９４／２９３／３１１／３２４、２９／９４／２９３／３３２／３５３、２９／９４／３１１、２９／９４／３２４／３５３、２９／１８４、２９／１８４／２２３／２８８／２９３／３２４、２９／１８４／２３２／２８８、２９／１８４／２８７、２９／１８４／２８７／２８８／２９３、２９／１８４／２８７／２８８／２９３／３１１、２９／１８４／２８７／３１１／３３２、２９／１８４／２８８／２９３、２９／１８４／２８８／２９３／３１１、２９／１８４／２９３、２９／１８４／２９３／３１１、２９／１８４／２９３／３２４、２９／１８４／３５３、２９／２２３／２８７／２８８／２９３／３５３、２９／２３２／２８７／２８８／２９３／３３２／３５３、２９／２８７／２８８／２９３、２９／２８７／２８８／２９３／３２４／３５３、２９／２８８／２９３、２９／３１１、２９／３１１／３３２、２９／３５３、７２／９４／１８４／２８８／３１１、８６、９４／９６／２２３／２８７／２８８／２９３／３１１／３２４／３３２、９４／９９／１８４／２９３／３１１／３３２／３５３、９４／１８４／２２３、９４／１８４／２２３／２３２／２８７／３１１、９４／１８４／２２３／２８８／２９３、９４／１８４／２２３／２９３、９４／１８４／２３２／２８７／２８８、９４／１８４／２３２／２８７／２８８／３２４／３３２、９４／１８４／２３２／２８７／２９３、９４／１８４／２３２／２８７／２９３／３３２、９４／１８４／２８７／２８８／２９３、９４／１８４／２８７／２８８／３１１、９４／１８４／２８７／２９３／３１１／３２４／３５３、９４／１８４／２８７／３１１、９４／１８４／２８７／３５３、９４／１８４／２８８／２９３、９４／１８４／２８８／２９３／３１１、９４／１８４／２８８／２９３／３１１／３３２、９４／１８４／２９３、９４／１８４／２９３／３１１、９４／１８４／２９３／３３２／３５３、９４／２２３／２３２／３１１／３５３／３５５／３５６／３５７／３５８／３５９、９４／２２３／２８７／２８８／２９３、９４／２２３／２８８／２９３／３１１、９４／２３２／２８７／２８８／２９３／３５３、９４／２３２／２８８／２９３／３５３、９４／２３２／２９３、９４／２３２／２９３／３２４／３３２、９４／２３２／３１１、９４／２８７／２８８／２９３、９４／２８７／２８８／３１１／３２４、９４／２８８／２９３、９４／２８８／２９３／３２４、９４／２９３／３２４、９４／３１１／３２４、１５３、１８４／２２３、１８４／２２３／２８７／２８８／３５３、１８４／２３２／２８７／２８８／２９３／３１１、１８４／２３２／２８７／２８８／３２４／３５３、１８４／２３２／２８７／２９３／３３２、１８４／２８７／２８８、１８４／２８７／２８８／２９３、１８４／２８７／２８８／２９３／３２４／３５３、１８４／２８７／２９３、１８４／２８７／２９３／３１１、１８４／２８８／２９３／３１１／３２４、１８４／３３２／３５３、２０５、２２３／２３２／２８７／２８８／３３２／３５３、２２３／２８７／２８８、２２３／２８７／２８８／２９３／３１１、２２３／２８７／３１１／３５３、２２３／２８８／２９３、２３２／２８７／２８８／２９３、２３２／２８７／２８８／２９３／３１１、２３２／２８７／２８８／２９３／３２１、２３２／２８７／３１１、２３２／２８８／２９３、２３２／２８８／２９３／３３２、２３４／２８７／２８８／２９３／３１１、２８７／２８８／２９３、２８７／２８８／３１１／３２４、２８７／２９３、２８７／３１１、２８７／３１１／３３２、２８７／３２４、２８８／２９３、２８８／２９３／３１１／３２４／３５３、２８８／２９３／３２４、２９３／３１１、および３１１／３３２から選択される１つまたは複数の残基の差異を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、イミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、参照配列配列番号１６に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに配列番号１６と比較した２９Ｒ／９４Ｋ／１８４Ｑ／２８８Ｓ／３５３Ｅ、２９Ｒ／９４Ｋ／１８４Ｒ／２３２Ａ／２８８Ｓ／２９３Ｆ／３１１Ｖ／３２４Ｌ／３５３Ｅ、２９Ｒ／９４Ｋ／１８４Ｒ／２８７Ｔ／２９３Ｆ、２９Ｒ／９４Ｋ／１８４Ｒ／２８８Ｓ／２９３Ｑ／３３２Ｖ／３５３Ｅ、２９Ｒ／９４Ｋ／１８４Ｒ／３２４Ｌ、２９Ｒ／９４Ｋ／２２３Ｓ／２３２Ａ／２８７Ｋ、２９Ｒ／９４Ｋ／２３２Ａ／２８７Ｔ／２８８Ｓ／３１１Ｖ、２９Ｒ／９４Ｋ／２３２Ａ／２８８Ｓ／２９３Ｆ、２９Ｒ／９４Ｋ／２８７Ｋ／３１１Ｖ、２９Ｒ／９４Ｋ／２８７Ｔ／２８８Ｓ／２９３Ｆ、２９Ｒ／９４Ｋ／２９３Ｈ／３１１Ｖ／３２４Ｌ、２９Ｒ／９４Ｋ／３２４Ｌ／３５３Ｅ、２９Ｒ／９４Ｒ／１８４Ｑ／２２３Ｓ／２３２Ａ／２８８Ｓ／２９３Ｆ、２９Ｒ／９４Ｒ／１８４Ｑ／２３２Ａ／２８７Ｔ／２９３Ｆ／３３２Ｖ、２９Ｒ／９４Ｒ／１８４Ｑ／２３２Ａ／２８８Ｓ／３１１Ｖ／３２４Ｌ／３３２Ｖ、２９Ｒ／９４Ｒ／１８４Ｑ／２８７Ｋ／２９３Ｆ／３１１Ｖ／３５３Ｅ、２９Ｒ／９４Ｒ／１８４Ｑ／２８７Ｋ／３１１Ｖ、２９Ｒ／９４Ｒ／１８４Ｑ／２８８Ｓ／２９３Ｆ／３２４Ｌ、２９Ｒ／９４Ｒ／１８４Ｒ／２３２Ａ／２８７Ｋ／２８８Ｓ／２９３Ｆ／３１１Ｖ、２９Ｒ／９４Ｒ／１８４Ｒ／２３２Ａ／２８７Ｔ／２８８Ｓ／３１１Ｖ、２９Ｒ／９４Ｒ／１８４Ｒ／２３２Ａ／２９３Ｆ、２９Ｒ／９４Ｒ／１８４Ｒ／２３２Ａ／３１１Ｖ、２９Ｒ／９４Ｒ／１８４Ｒ／２８８Ｓ／２９８Ａ／３３２Ｖ、２９Ｒ／９４Ｒ／１８４Ｒ／２９３Ｆ／３１１Ｖ、２９Ｒ／９４Ｒ／２２３Ｓ／２８８Ｓ／２９３Ｆ、２９Ｒ／９４Ｒ／２２３Ｔ／２３２Ａ／２９３Ｈ／３１１Ｖ／３２４Ｌ、２９Ｒ／９４Ｒ／２８７Ｋ／２８８Ｓ／２９３Ｆ、２９Ｒ／９４Ｒ／２８７Ｔ／２８８Ｓ／２９３Ｆ、２９Ｒ／９４Ｒ／２８７Ｔ／２８８Ｓ／２９３Ｆ／３５３Ｅ、２９Ｒ／９４Ｒ／２９３Ｆ／３３２Ｖ／３５３Ｅ、２９Ｒ／９４Ｒ／３１１Ｖ、２９Ｒ／１８４Ｑ／２２３Ｓ／２８８Ｓ／２９３Ｆ／３２４Ｌ、２９Ｒ／１８４Ｑ／２８７Ｔ／２８８Ｓ／２９３Ｆ、２９Ｒ／１８４Ｒ、２９Ｒ／１８４Ｒ／２３２Ａ／２８８Ｓ、２９Ｒ／１８４Ｒ／２８７Ｋ／２８８Ｓ／２９３Ｆ／３１１Ｖ、２９Ｒ／１８４Ｒ／２８７Ｋ／３１１Ｖ／３３２Ｖ、２９Ｒ／１８４Ｒ／２８７Ｔ、２９Ｒ／１８４Ｒ／２８８Ｓ／２９３Ｆ、２９Ｒ／１８４Ｒ／２８８Ｓ／２９３Ｆ／３１１Ｖ、２９Ｒ／１８４Ｒ／２９３Ｆ、２９Ｒ／１８４Ｒ／２９３Ｆ／３１１Ｖ、２９Ｒ／１８４Ｒ／２９３Ｆ／３２４Ｌ、２９Ｒ／１８４Ｒ／３５３Ｅ、２９Ｒ／２２３Ｔ／２８７Ｔ／２８８Ｓ／２９３Ｆ／３５３Ｅ、２９Ｒ／２３２Ａ／２８７Ｔ／２８８Ｓ／２９３Ｑ／３３２Ｖ／３５３Ｅ、２９Ｒ／２８７Ｔ／２８８Ｓ／２９３Ｆ、２９Ｒ／２８７Ｔ／２８８Ｓ／２９３Ｆ／３２４Ｌ／３５３Ｅ、２９Ｒ／２８８Ｓ／２９３Ｆ、２９Ｒ／３１１Ｖ、２９Ｒ／３１１Ｖ／３３２Ｖ、２９Ｒ／３５３Ｅ、７２Ｖ／９４Ｒ／１８４Ｒ／２８８Ｓ／３１１Ｖ、８６Ｑ、９４Ｋ／９６Ｖ／２２３Ｔ／２８７Ｋ／２８８Ｓ／２９３Ｆ／３１１Ｖ／３２４Ｌ／３３２Ｖ、９４Ｋ／１８４Ｑ／２３２Ａ／２８７Ｔ／２９３Ｆ、９４Ｋ／１８４Ｑ／２３２Ａ／２８７Ｔ／２９３Ｆ／３３２Ｖ、９４Ｋ／１８４Ｑ／２８７Ｔ／２９３Ｆ／３１１Ｖ／３２４Ｌ／３５３Ｅ、９４Ｋ／１８４Ｒ／２２３Ｓ／２８８Ｓ／２９３Ｆ、９４Ｋ／１８４Ｒ／２２３Ｔ／２３２Ａ／２８７Ｋ／３１１Ｖ、９４Ｋ／１８４Ｒ／２３２Ａ／２８７Ｋ／２８８Ｓ、９４Ｋ／１８４Ｒ／２８７Ｔ／３１１Ｖ、９４Ｋ／１８４Ｒ／２８７Ｔ／３５３Ｅ、９４Ｋ／１８４Ｒ／２８８Ｓ／２９３Ｆ／３１１Ｖ、９４Ｋ／１８４Ｒ／２９３Ｈ／３１１Ｖ、９４Ｋ／２８７Ｋ／２８８Ｓ／２９３Ｆ、９４Ｋ／２８７Ｔ／２８８Ｓ／３１１Ｖ／３２４Ｌ、９４Ｋ／２８８Ｓ／２９３Ｆ、９４Ｋ／２８８Ｓ／２９３Ｆ／３２４Ｌ、９４Ｋ／３１１Ｖ／３２４Ｌ、９４Ｒ／９９Ｔ／１８４Ｒ／２９３Ｆ／３１１Ｖ／３３２Ｖ／３５３Ｅ、９４Ｒ／１８４Ｑ／２８７Ｋ／２８８Ｓ／３１１Ｖ、９４Ｒ／１８４Ｑ／２８８Ｓ／２９３Ｆ／３１１Ｖ、９４Ｒ／１８４Ｑ／２９３Ｆ／３３２Ｖ／３５３Ｅ、９４Ｒ／１８４Ｒ／２２３Ｓ、９４Ｒ／１８４Ｒ／２２３Ｓ／２９３Ｆ、９４Ｒ／１８４Ｒ／２３２Ａ／２８７Ｋ／２８８Ｓ／３２４Ｌ／３３２Ｖ、９４Ｒ／１８４Ｒ／２８７Ｋ／２８８Ｓ／２９３Ｆ、９４Ｒ／１８４Ｒ／２８７Ｋ／２８８Ｓ／３１１Ｖ、９４Ｒ／１８４Ｒ／２８８Ｓ／２９３Ｆ、９４Ｒ／１８４Ｒ／２８８Ｓ／２９３Ｆ／３１１Ｖ／３３２Ｖ、９４Ｒ／１８４Ｒ／２９３Ｆ、９４Ｒ／２２３Ｓ／２３２Ａ／３１１Ｖ／３５３Ｅ／３５５Ｋ／３５６Ｋ／３５７Ｃ／３５８Ｃ／３５９－、９４Ｒ／２２３Ｓ／２８７Ｋ／２８８Ｓ／２９３Ｆ、９４Ｒ／２２３Ｓ／２８８Ｓ／２９３Ｆ／３１１Ｖ、９４Ｒ／２３２Ａ／２８７Ｋ／２８８Ｓ／２９３Ｆ／３５３Ｅ、９４Ｒ／２３２Ａ／２８８Ｓ／２９３Ｆ／３５３Ｅ、９４Ｒ／２３２Ａ／２９３Ｆ、９４Ｒ／２３２Ａ／２９３Ｆ／３２４Ｌ／３３２Ｖ、９４Ｒ／２３２Ａ／３１１Ｖ、９４Ｒ／２８７Ｋ／２８８Ｓ／２９３Ｆ、９４Ｒ／２８７Ｔ／２８８Ｓ／２９３Ｆ、９４Ｒ／２９３Ｆ／３２４Ｌ、９４Ｒ／３１１Ｖ／３２４Ｌ、１５３Ｙ、１８４Ｑ／２２３Ｔ／２８７Ｋ／２８８Ｓ／３５３Ｅ、１８４Ｑ／２３２Ａ／２８７Ｋ／２８８Ｓ／２９３Ｆ／３１１Ｖ、１８４Ｑ／２３２Ａ／２８７Ｋ／２８８Ｓ／３２４Ｌ／３５３Ｅ、１８４Ｑ／２８７Ｋ／２９３Ｆ、１８４Ｒ／２２３Ｔ、１８４Ｒ／２３２Ａ／２８７Ｋ／２９３Ｆ／３３２Ｖ、１８４Ｒ／２８７Ｋ／２９３Ｆ／３１１Ｖ、１８４Ｒ／２８７Ｔ／２８８Ｓ、１８４Ｒ／２８７Ｔ／２８８Ｓ／２９３Ｆ、１８４Ｒ／２８７Ｔ／２８８Ｓ／２９３Ｆ／３２４Ｌ／３５３Ｅ、１８４Ｒ／２８７Ｔ／２８８Ｓ／２９３Ｑ、１８４Ｒ／２８８Ｓ／２９３Ｈ／３１１Ｖ／３２４Ｌ、１８４Ｒ／３３２Ｖ／３５３Ｅ、２０５Ｉ、２０５Ｖ、２２３Ｓ／２３２Ａ／２８７Ｋ／２８８Ｓ／３３２Ｖ／３５３Ｅ、２２３Ｓ／２８７Ｋ／２８８Ｓ／２９３Ｆ／３１１Ｖ、２２３Ｓ／２８７Ｋ／３１１Ｖ／３５３Ｅ、２２３Ｓ／２８７Ｔ／２８８Ｓ、２２３Ｓ／２８８Ｓ／２９３Ｆ、２３２Ａ／２８７Ｋ／２８８Ｓ／２９３Ｆ、２３２Ａ／２８７Ｋ／２８８Ｓ／２９３Ｆ／３１１Ｖ、２３２Ａ／２８
７Ｋ／３１１Ｖ、２３２Ａ／２８７Ｔ／２８８Ｓ／２９３Ｆ／３２１Ｖ、２３２Ａ／２８８Ｓ／２９３Ｆ、２３２Ａ／２８８Ｓ／２９３Ｆ／３３２Ｖ、２３４Ｖ／２８７Ｋ／２８８Ｓ／２９３Ｆ／３１１Ｖ、２８７Ｋ／２８８Ｓ／２９３Ｆ、２８７Ｋ／２９３Ｆ、２８７Ｋ／３１１Ｖ／３３２Ｖ、２８７Ｋ／３２４Ｌ、２８７Ｔ／２８８Ｓ／３１１Ｖ／３２４Ｌ、２８７Ｔ／３１１Ｖ、２８８Ｓ／２９３Ｆ、２８８Ｓ／２９３Ｆ／３１１Ｖ／３２４Ｌ／３５３Ｅ、２８８Ｓ／２９３Ｆ／３２４Ｌ、２９３Ｆ／３１１Ｖ、および３１１Ｖ／３３２Ｖから選択される１つまたは複数の残基の差異を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、イミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、参照配列配列番号１６に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに配列番号１６と比較したＳ２９Ｒ／Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｑ／Ｎ２８８Ｓ／Ｇ３５３Ｅ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ／Ｄ３２４Ｌ／Ｇ３５３Ｅ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｒ／Ｉ２８７Ｔ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｒ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｑ／Ｔ３３２Ｖ／Ｇ３５３Ｅ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｒ／Ｄ３２４Ｌ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｋ／Ｌ２２３Ｓ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｋ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｋ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ａ３１１Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｋ／Ｓ２３２Ａ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｋ／Ｉ２８７Ｋ／Ａ３１１Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｋ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｋ／Ｙ２９３Ｈ／Ａ３１１Ｖ／Ｄ３２４Ｌ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｋ／Ｄ３２４Ｌ／Ｇ３５３Ｅ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｑ／Ｌ２２３Ｓ／Ｓ２３２Ａ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｑ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｔ／Ｙ２９３Ｆ／Ｔ３３２Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｑ／Ｓ２３２Ａ／Ｎ２８８Ｓ／Ａ３１１Ｖ／Ｄ３２４Ｌ／Ｔ３３２Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｑ／Ｉ２８７Ｋ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ／Ｇ３５３Ｅ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｑ／Ｉ２８７Ｋ／Ａ３１１Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｑ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ｄ３２４Ｌ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ａ３１１Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ａ３１１Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｎ２８８Ｓ／Ｖ２９８Ａ／Ｔ３３２Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｌ２２３Ｓ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｌ２２３Ｔ／Ｓ２３２Ａ／Ｙ２９３Ｈ／Ａ３１１Ｖ／Ｄ３２４Ｌ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ｇ３５３Ｅ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｙ２９３Ｆ／Ｔ３３２Ｖ／Ｇ３５３Ｅ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ａ３１１Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｖ１８４Ｑ／Ｌ２２３Ｓ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ｄ３２４Ｌ、Ｓ２９Ｒ／Ｖ１８４Ｑ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２９Ｒ／Ｖ１８４Ｒ、Ｓ２９Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ｎ２８８Ｓ、Ｓ２９Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｉ２８７Ｋ／Ａ３１１Ｖ／Ｔ３３２Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｉ２８７Ｔ、Ｓ２９Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２９Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２９Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｙ２９３Ｆ／Ｄ３２４Ｌ、Ｓ２９Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｇ３５３Ｅ、Ｓ２９Ｒ／Ｌ２２３Ｔ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ｇ３５３Ｅ、Ｓ２９Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｑ／Ｔ３３２Ｖ／Ｇ３５３Ｅ、Ｓ２９Ｒ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２９Ｒ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ｄ３２４Ｌ／Ｇ３５３Ｅ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２９Ｒ／Ａ３１１Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ａ３１１Ｖ／Ｔ３３２Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｇ３５３Ｅ、Ａ７２Ｖ／Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｎ２８８Ｓ／Ａ３１１Ｖ、Ｉ８６Ｑ、Ｎ９４Ｋ／Ａ９６Ｖ／Ｌ２２３Ｔ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ／Ｄ３２４Ｌ／Ｔ３３２Ｖ、Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｑ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｔ／Ｙ２９３Ｆ、Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｑ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｔ／Ｙ２９３Ｆ／Ｔ３３２Ｖ、Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｑ／Ｉ２８７Ｔ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ／Ｄ３２４Ｌ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｒ／Ｌ２２３Ｓ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｒ／Ｌ２２３Ｔ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｋ／Ａ３１１Ｖ、Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ、Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｒ／Ｉ２８７Ｔ／Ａ３１１Ｖ、Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｒ／Ｉ２８７Ｔ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｒ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ、Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｒ／Ｙ２９３Ｈ／Ａ３１１Ｖ、Ｎ９４Ｋ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｎ９４Ｋ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ａ３１１Ｖ／Ｄ３２４Ｌ、Ｎ９４Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｎ９４Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ｄ３２４Ｌ、Ｎ９４Ｋ／Ａ３１１Ｖ／Ｄ３２４Ｌ、Ｎ９４Ｒ／Ｉ９９Ｔ／Ｖ１８４Ｒ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ／Ｔ３３２Ｖ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｑ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ａ３１１Ｖ、Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｑ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ、Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｑ／Ｙ２９３Ｆ／Ｔ３３２Ｖ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｌ２２３Ｓ、Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｌ２２３Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｄ３２４Ｌ／Ｔ３３２Ｖ、Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ａ３１１Ｖ、Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ／Ｔ３３２Ｖ、Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｙ２９３Ｆ、Ｎ９４Ｒ／Ｌ２２３Ｓ／Ｓ２３２Ａ／Ａ３１１Ｖ／Ｇ３５３Ｅ／Ｒ３５５Ｋ／Ｓ３５６Ｋ／Ａ３５７Ｃ／Ｖ３５８Ｃ／Ｅ３５９－、Ｎ９４Ｒ／Ｌ２２３Ｓ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｎ９４Ｒ／Ｌ２２３Ｓ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ、Ｎ９４Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ｙ２９３Ｆ、Ｎ９４Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ｙ２９３Ｆ／Ｄ３２４Ｌ／Ｔ３３２Ｖ、Ｎ９４Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ａ３１１Ｖ、Ｎ９４Ｒ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｎ９４Ｒ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｎ９４Ｒ／Ｙ２９３Ｆ／Ｄ３２４Ｌ、Ｎ９４Ｒ／Ａ３１１Ｖ／Ｄ３２４Ｌ、Ｎ１５３Ｙ、Ｖ１８４Ｑ／Ｌ２２３Ｔ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｇ３５３Ｅ、Ｖ１８４Ｑ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ、Ｖ１８４Ｑ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｄ３２４Ｌ／Ｇ３５３Ｅ、Ｖ１８４Ｑ／Ｉ２８７Ｋ／Ｙ２９３Ｆ、Ｖ１８４Ｒ／Ｌ２２３Ｔ、Ｖ１８４Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｋ／Ｙ２９３Ｆ／Ｔ３３２Ｖ、Ｖ１８４Ｒ／Ｉ２８７Ｋ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ、Ｖ１８４Ｒ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ、Ｖ１８４Ｒ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｖ１８４Ｒ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ｄ３２４Ｌ／Ｇ３５３Ｅ、Ｖ１８４Ｒ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｑ、Ｖ１８４Ｒ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｈ／Ａ３１１Ｖ／Ｄ３２４Ｌ、Ｖ１８４Ｒ／Ｔ３３２Ｖ／Ｇ３５３Ｅ、Ｐ２０５Ｉ、Ｐ２０５Ｖ、Ｌ２２３Ｓ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｔ３３２Ｖ／Ｇ３５３Ｅ、Ｌ２２３Ｓ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ、Ｌ２２３Ｓ／Ｉ２８７Ｋ／Ａ３１１Ｖ／Ｇ３５３Ｅ、Ｌ２２３Ｓ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ、Ｌ２２３Ｓ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ、Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｋ／Ａ３１１Ｖ、Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３２１Ｖ、Ｓ２３２Ａ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２３２Ａ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ｔ３３２Ｖ、Ａ２３４Ｖ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ、Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｉ２８７Ｋ／Ｙ２９３Ｆ、Ｉ２８７Ｋ／Ａ３１１Ｖ／Ｔ３３２Ｖ、Ｉ２８７Ｋ／Ｄ３２４Ｌ、Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ａ３１１Ｖ／Ｄ３２４Ｌ、Ｉ２８７Ｔ／Ａ３１１Ｖ、Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ／Ｄ３２４Ｌ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ｄ３２４Ｌ、Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ、およびＡ３１１Ｖ／Ｔ３３２Ｖから選択される１つまたは複数の残基の差異を有するアミノ酸配列を含む。
７Ｋ／３１１Ｖ、２３２Ａ／２８７Ｔ／２８８Ｓ／２９３Ｆ／３２１Ｖ、２３２Ａ／２８８Ｓ／２９３Ｆ、２３２Ａ／２８８Ｓ／２９３Ｆ／３３２Ｖ、２３４Ｖ／２８７Ｋ／２８８Ｓ／２９３Ｆ／３１１Ｖ、２８７Ｋ／２８８Ｓ／２９３Ｆ、２８７Ｋ／２９３Ｆ、２８７Ｋ／３１１Ｖ／３３２Ｖ、２８７Ｋ／３２４Ｌ、２８７Ｔ／２８８Ｓ／３１１Ｖ／３２４Ｌ、２８７Ｔ／３１１Ｖ、２８８Ｓ／２９３Ｆ、２８８Ｓ／２９３Ｆ／３１１Ｖ／３２４Ｌ／３５３Ｅ、２８８Ｓ／２９３Ｆ／３２４Ｌ、２９３Ｆ／３１１Ｖ、および３１１Ｖ／３３２Ｖから選択される１つまたは複数の残基の差異を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、イミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、参照配列配列番号１６に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに配列番号１６と比較したＳ２９Ｒ／Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｑ／Ｎ２８８Ｓ／Ｇ３５３Ｅ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ／Ｄ３２４Ｌ／Ｇ３５３Ｅ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｒ／Ｉ２８７Ｔ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｒ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｑ／Ｔ３３２Ｖ／Ｇ３５３Ｅ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｒ／Ｄ３２４Ｌ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｋ／Ｌ２２３Ｓ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｋ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｋ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ａ３１１Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｋ／Ｓ２３２Ａ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｋ／Ｉ２８７Ｋ／Ａ３１１Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｋ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｋ／Ｙ２９３Ｈ／Ａ３１１Ｖ／Ｄ３２４Ｌ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｋ／Ｄ３２４Ｌ／Ｇ３５３Ｅ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｑ／Ｌ２２３Ｓ／Ｓ２３２Ａ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｑ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｔ／Ｙ２９３Ｆ／Ｔ３３２Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｑ／Ｓ２３２Ａ／Ｎ２８８Ｓ／Ａ３１１Ｖ／Ｄ３２４Ｌ／Ｔ３３２Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｑ／Ｉ２８７Ｋ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ／Ｇ３５３Ｅ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｑ／Ｉ２８７Ｋ／Ａ３１１Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｑ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ｄ３２４Ｌ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ａ３１１Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ａ３１１Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｎ２８８Ｓ／Ｖ２９８Ａ／Ｔ３３２Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｌ２２３Ｓ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｌ２２３Ｔ／Ｓ２３２Ａ／Ｙ２９３Ｈ／Ａ３１１Ｖ／Ｄ３２４Ｌ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ｇ３５３Ｅ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ｙ２９３Ｆ／Ｔ３３２Ｖ／Ｇ３５３Ｅ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ９４Ｒ／Ａ３１１Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｖ１８４Ｑ／Ｌ２２３Ｓ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ｄ３２４Ｌ、Ｓ２９Ｒ／Ｖ１８４Ｑ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２９Ｒ／Ｖ１８４Ｒ、Ｓ２９Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ｎ２８８Ｓ、Ｓ２９Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｉ２８７Ｋ／Ａ３１１Ｖ／Ｔ３３２Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｉ２８７Ｔ、Ｓ２９Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２９Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２９Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｙ２９３Ｆ／Ｄ３２４Ｌ、Ｓ２９Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｇ３５３Ｅ、Ｓ２９Ｒ／Ｌ２２３Ｔ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ｇ３５３Ｅ、Ｓ２９Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｑ／Ｔ３３２Ｖ／Ｇ３５３Ｅ、Ｓ２９Ｒ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２９Ｒ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ｄ３２４Ｌ／Ｇ３５３Ｅ、Ｓ２９Ｒ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２９Ｒ／Ａ３１１Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ａ３１１Ｖ／Ｔ３３２Ｖ、Ｓ２９Ｒ／Ｇ３５３Ｅ、Ａ７２Ｖ／Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｎ２８８Ｓ／Ａ３１１Ｖ、Ｉ８６Ｑ、Ｎ９４Ｋ／Ａ９６Ｖ／Ｌ２２３Ｔ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ／Ｄ３２４Ｌ／Ｔ３３２Ｖ、Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｑ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｔ／Ｙ２９３Ｆ、Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｑ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｔ／Ｙ２９３Ｆ／Ｔ３３２Ｖ、Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｑ／Ｉ２８７Ｔ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ／Ｄ３２４Ｌ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｒ／Ｌ２２３Ｓ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｒ／Ｌ２２３Ｔ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｋ／Ａ３１１Ｖ、Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ、Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｒ／Ｉ２８７Ｔ／Ａ３１１Ｖ、Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｒ／Ｉ２８７Ｔ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｒ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ、Ｎ９４Ｋ／Ｖ１８４Ｒ／Ｙ２９３Ｈ／Ａ３１１Ｖ、Ｎ９４Ｋ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｎ９４Ｋ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ａ３１１Ｖ／Ｄ３２４Ｌ、Ｎ９４Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｎ９４Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ｄ３２４Ｌ、Ｎ９４Ｋ／Ａ３１１Ｖ／Ｄ３２４Ｌ、Ｎ９４Ｒ／Ｉ９９Ｔ／Ｖ１８４Ｒ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ／Ｔ３３２Ｖ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｑ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ａ３１１Ｖ、Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｑ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ、Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｑ／Ｙ２９３Ｆ／Ｔ３３２Ｖ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｌ２２３Ｓ、Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｌ２２３Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｄ３２４Ｌ／Ｔ３３２Ｖ、Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ａ３１１Ｖ、Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ／Ｔ３３２Ｖ、Ｎ９４Ｒ／Ｖ１８４Ｒ／Ｙ２９３Ｆ、Ｎ９４Ｒ／Ｌ２２３Ｓ／Ｓ２３２Ａ／Ａ３１１Ｖ／Ｇ３５３Ｅ／Ｒ３５５Ｋ／Ｓ３５６Ｋ／Ａ３５７Ｃ／Ｖ３５８Ｃ／Ｅ３５９－、Ｎ９４Ｒ／Ｌ２２３Ｓ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｎ９４Ｒ／Ｌ２２３Ｓ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ、Ｎ９４Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ｙ２９３Ｆ、Ｎ９４Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ｙ２９３Ｆ／Ｄ３２４Ｌ／Ｔ３３２Ｖ、Ｎ９４Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ａ３１１Ｖ、Ｎ９４Ｒ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｎ９４Ｒ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｎ９４Ｒ／Ｙ２９３Ｆ／Ｄ３２４Ｌ、Ｎ９４Ｒ／Ａ３１１Ｖ／Ｄ３２４Ｌ、Ｎ１５３Ｙ、Ｖ１８４Ｑ／Ｌ２２３Ｔ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｇ３５３Ｅ、Ｖ１８４Ｑ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ、Ｖ１８４Ｑ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｄ３２４Ｌ／Ｇ３５３Ｅ、Ｖ１８４Ｑ／Ｉ２８７Ｋ／Ｙ２９３Ｆ、Ｖ１８４Ｒ／Ｌ２２３Ｔ、Ｖ１８４Ｒ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｋ／Ｙ２９３Ｆ／Ｔ３３２Ｖ、Ｖ１８４Ｒ／Ｉ２８７Ｋ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ、Ｖ１８４Ｒ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ、Ｖ１８４Ｒ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｖ１８４Ｒ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ｄ３２４Ｌ／Ｇ３５３Ｅ、Ｖ１８４Ｒ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｑ、Ｖ１８４Ｒ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｈ／Ａ３１１Ｖ／Ｄ３２４Ｌ、Ｖ１８４Ｒ／Ｔ３３２Ｖ／Ｇ３５３Ｅ、Ｐ２０５Ｉ、Ｐ２０５Ｖ、Ｌ２２３Ｓ／Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｔ３３２Ｖ／Ｇ３５３Ｅ、Ｌ２２３Ｓ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ、Ｌ２２３Ｓ／Ｉ２８７Ｋ／Ａ３１１Ｖ／Ｇ３５３Ｅ、Ｌ２２３Ｓ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ、Ｌ２２３Ｓ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ、Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｋ／Ａ３１１Ｖ、Ｓ２３２Ａ／Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３２１Ｖ、Ｓ２３２Ａ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｓ２３２Ａ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ｔ３３２Ｖ、Ａ２３４Ｖ／Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ、Ｉ２８７Ｋ／Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｉ２８７Ｋ／Ｙ２９３Ｆ、Ｉ２８７Ｋ／Ａ３１１Ｖ／Ｔ３３２Ｖ、Ｉ２８７Ｋ／Ｄ３２４Ｌ、Ｉ２８７Ｔ／Ｎ２８８Ｓ／Ａ３１１Ｖ／Ｄ３２４Ｌ、Ｉ２８７Ｔ／Ａ３１１Ｖ、Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ、Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ／Ｄ３２４Ｌ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ２８８Ｓ／Ｙ２９３Ｆ／Ｄ３２４Ｌ、Ｙ２９３Ｆ／Ａ３１１Ｖ、およびＡ３１１Ｖ／Ｔ３３２Ｖから選択される１つまたは複数の残基の差異を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、イミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、参照配列配列番号５０に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに配列番号５０と比較した２９／５７／９４／１５３／１８４／２０５／２６１／２６５／２８７、２９／５７／９４／１５３／２０５／２６５、２９／５７／９４／１８４／２０５／２７７／３５３、２９／５７／９４／２０５／２５９／２６１／２６５、２９／５７／９４／２０５／２６１／３５３、２９／５７／１５３／１８４／２０５／２５９／２６１／２６５／２７７、２９／５７／１５３／１８４／２０５／３５３、２９／５７／１５３／２０５／２６１／２６５、２９／５７／１５３／２０５／２６１／２６５／２７７、２９／５７／１５３／２０５／２６５／２７７、２９／５７／１５３／２０５／２７７／３５３、２９／５７／１８４／２０５／２５９／２６１／２６５／２７７／２８７／３５７、２９／５７／１８４／２０５／２５９／２６１／２６５／２８７、２９／５７／２０５／２５９／２６１／２６５、２９／５７／２０５／２５９／２６１／２６５／２８７、２９／５７／２０５／２６１／２６５／３５３、２９／９４／１５３／１８４／２０５、２９／９４／１５３／２０５／２５９／２６１／２６５、２９／９４／１５３／２０５／２５９／２６１／２８７、２９／９４／１５３／２０５／２５９／２６１／２８７／３５３、２９／９４／１８４／２０５／２５９／２６１、２９／９４／１８４／２０５／２６１、２９／９４／２０５、２９／９４／２０５／２５９／２６１／２８７、２９／９４／２０５／２６１、２９／９４／２６１／２６５／２８７／３５３、２９／１５３／１８４／２０５、２９／１５３／２０５、２９／１５３／２０５／２５９／２６１／２６５／２７７／２８７、２９／１５３／２６１／２６５／２８７／３５３、２９／１８４／２０５、２９／１８４／２０５／２５９／２６１／２７７、２９／１８４／２０５／３５３、２９／１８４／２６１／２６５、２９／１８４／２６５、２９／２０５、２９／２０５／２５９／２６１、２９／２０５／２５９／２６１／２６５／２８７、２９／２０５／２５９／２６１／２８７、２９／２０５／２６１、２９／２０５／２６１／２６５、２９／２０５／２６１／２６５／３５３、２９／２０５／２６１／３５３、２９／２０５／２７７、２９／２０５／２８７、２９／２０５／２８７／３５３、２９／２５９／２６１／２６５、２９／２６１／３５３、５７／９４／１５３／１８４／２０５／２５９／２６１、５７／９４／１５３／２０５／２６１／２６５、５７／９４／１５３／２５９／２６１／２６５、５７／９４／１５３／２６１／２６５、５７／９４／１８４／２０５／２６１／２６５／２８７、５７／９４／１８４／２６１／２６５／２８７、５７／９４／２０５／２５９、５７／９４／２０５／２５９／２６１／２６５／２７７／２８７、５７／９４／２０５／２６１／２６５、５７／９４／２０５／２７７、５７／１５３／２０５／２５９／２６１／２６５／２８７、５７／１５３／２０５／２５９／２６５／２７７、５７／１５３／２０５／２６１、５７／１５３／２０５／２６１／２６５、５７／１５３／２０５／２６５、５７／１５３／２６１／２６５、５７／１５３／２６１／２６５／２８７／３５３、５７／２０５、５７／２０５／２５９／２６１、５７／２０５／２５９／２６１／２６５／２７７／２８７／３５３、５７／２０５／２５９／２６１／２８７／３５３、５７／２０５／２５９／２６５、５７／２０５／２６１、５７／２０５／２６１／２６５／２７７／２８７／３５３、５７／２０５／２６１／２７７、５７／２０５／２６１／２７７／３５３、５７／２６１／２６５／３５３、９４／１２６／１８４／２０５／２５９／２６１／２６５、９４／１５３／１８４／２０５、９４／１５３／１８４／２５９／２６１／２６５、９４／１５３／２０５／２５９／２６１／２６５／３５３、９４／１５３／２０５／２８７、９４／１５３／２０５／２８７／３５３、９４／１５３／２０５／３５３、９４／１８４／２０５／２５９／２６１、９４／１８４／２０５／２５９／２６１／２６５／２８７、９４／１８４／２０５／２５９／２６１／３５３、９４／１８４／２０５／２６１／２６５／２８７／３５３、９４／１８４／３５３、９４／２０５、９４／２０５／２５９／２６１／２６５、９４／２０５／２５９／２６１／２６５／２７７／２８７、９４／２０５／２５９／２６１／２６５／３５３、９４／２０５／２５９／２６１／２８７／３５３、９４／２０５／２６１／２６５／２７７、９４／２０５／２６１／２６５／３５３、９４／２０５／２６１／３５３、９４／２０５／２７７、９４／２５９／２６１／２６５、１５３／１８４／２０５／２６１／２７７／２８７、１５３／１８４／２６１／２６５／２８７、１５３／２０５、１５３／２０５／２６１、１５３／２０５／２６１／２６５／２８７、１５３／２５９／２６１／２６５、１５３／２５９／２６５／２８７、１５３／２６１／２６５、１５３／２６１／２６５／２８７／３５３、１５３／２６５、１５３／２６５／２７７／２８７／３５３、１８４／２０５、１８４／２０５／２５９／２６１／２８７、１８４／２０５／２６１、１８４／２０５／２６１／２６５、１８４／２０５／２６１／２８７、１８４／２０５／２７７、１８４／２０５／２８７／３５３、１８４／２６１／２６５／２８７、２０２、２０５、２０５／２５９／２６１、２０５／２５９／２６１／２６５、２０５／２５９／２６１／２６５／２７７／２８７／３５３、２０５／２５９／２６１／２７７／２８７、２０５／２５９／２６５、２０５／２６１、２０５／２６１／２６５、２０５／２６１／２６５／２７４、２０５／２６１／２６５／２８７、２０５／２６１／２６５／２８７／３５３、２０５／２６１／２７７、２０５／２６１／３５３、２０５／２７７／２８７、２０５／２８７、２２３、２２５、２５６、２５９／２６１／２６５、２６１／２６５／２８７、２６５／２８７、２８３、および２９４から選択される１つまたは複数の残基の差異を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、イミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、参照配列配列番号５０に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに配列番号５０と比較した２９Ｓ／５７Ｇ／９４Ｋ／１５３Ｆ／１８４Ｒ／２０５Ｃ／２６１Ｌ／２６５Ｉ／２８７Ｔ、２９Ｓ／５７Ｇ／９４Ｋ／１５３Ｌ／２０５Ａ／２６５Ｉ、２９Ｓ／５７Ｇ／９４Ｋ／１８４Ｒ／２０５Ｃ／２７７Ｖ／３５３Ｅ、２９Ｓ／５７Ｇ／９４Ｋ／２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｓ／２６５Ｉ、２９Ｓ／５７Ｇ／９４Ｋ／２０５Ｃ／２６１Ｌ／３５３Ｅ、２９Ｓ／５７Ｇ／１５３Ｆ／１８４Ｒ／２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｖ／２６５Ｉ／２７７Ｖ、２９Ｓ／５７Ｇ／１５３Ｆ／２０５Ｃ／２６１Ｌ／２６５Ｉ／２７７Ｖ、２９Ｓ／５７Ｇ／１５３Ｆ／２０５Ｃ／２６１Ｖ／２６５Ｉ、２９Ｓ／５７Ｇ／１５３Ｆ／２０５Ｃ／２７７Ｖ／３５３Ｅ、２９Ｓ／５７Ｇ／１５３Ｌ／１８４Ｒ／２０５Ａ／３５３Ｅ、２９Ｓ／５７Ｇ／１５３Ｌ／２０５Ａ／２６５Ｉ／２７７Ｖ、２９Ｓ／５７Ｇ／１８４Ｒ／２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｌ／２６５Ｉ／２７７Ｖ／２８７Ｋ／３５７Ｓ、２９Ｓ／５７Ｇ／１８４Ｒ／２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｖ／２６５Ｉ／２８７Ｔ、２９Ｓ／５７Ｇ／２０５Ａ／２５９Ｆ／２６１Ｌ／２６５Ｉ／２８７Ｔ、２９Ｓ／５７Ｇ／２０５Ａ／２５９Ｆ／２６１Ｓ／２６５Ｉ、２９Ｓ／５７Ｇ／２０５Ｃ／２６１Ｓ／２６５Ｉ／３５３Ｅ、２９Ｓ／９４Ｋ／１５３Ｆ／２０５Ａ／２５９Ｆ／２６１Ｓ／２８７Ｔ／３５３Ｅ、２９Ｓ／９４Ｋ／１５３Ｆ／２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｌ／２８７Ｋ、２９Ｓ／９４Ｋ／１５３Ｌ／１８４Ｒ／２０５Ｃ、２９Ｓ／９４Ｋ／１５３Ｌ／２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｒ／２６５Ｉ、２９Ｓ／９４Ｋ／１８４Ｒ／２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｓ、２９Ｓ／９４Ｋ／１８４Ｒ／２０５Ｃ／２６１Ｖ、２９Ｓ／９４Ｋ／２０５Ａ、２９Ｓ／９４Ｋ／２０５Ａ／２６１Ｖ、２９Ｓ／９４Ｋ／２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｌ／２８７Ｔ、２９Ｓ／９４Ｋ／２６１Ｒ／２６５Ｉ／２８７Ｔ／３５３Ｅ、２９Ｓ／１５３Ｆ／１８４Ｒ／２０５Ｃ、２９Ｓ／１５３Ｆ／２０５Ａ、２９Ｓ／１５３Ｆ／２６１Ｒ／２６５Ｉ／２８７Ｋ／３５３Ｅ、２９Ｓ／１５３Ｌ／２０５Ａ／２５９Ｆ／２６１Ｌ／２６５Ｉ／２７７Ｖ／２８７Ｔ、２９Ｓ／１８４Ｒ／２０５Ａ、２９Ｓ／１８４Ｒ／２０５Ａ／３５３Ｅ、２９Ｓ／１８４Ｒ／２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｖ／２７７Ｖ、２９Ｓ／１８４Ｒ／２６１Ｌ／２６５Ｉ、２９Ｓ／１８４Ｒ／２６５Ｉ、２９Ｓ／２０５Ａ、２９Ｓ／２０５Ａ／２５９Ｆ／２６１Ｌ／２６５Ｉ／２８７Ｋ、２９Ｓ／２０５Ａ／２５９Ｆ／２６１Ｒ、２９Ｓ／２０５Ａ／２６１Ｖ、２９Ｓ／２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｌ、２９Ｓ／２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｌ／２６５Ｉ／２８７Ｔ、２９Ｓ／２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｌ／２８７Ｋ、２９Ｓ／２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｌ／２８７Ｔ、２９Ｓ／２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｓ、２９Ｓ／２０５Ｃ／２６１Ｌ、２９Ｓ／２０５Ｃ／２６１Ｌ／２６５Ｉ／３５３Ｅ、２９Ｓ／２０５Ｃ／２６１Ｒ／３５３Ｅ、２９Ｓ／２０５Ｃ／２６１Ｓ、２９Ｓ／２０５Ｃ／２６１Ｓ／２６５Ｉ、２９Ｓ／２０５Ｃ／２６１Ｖ／２６５Ｉ、２９Ｓ／２０５Ｃ／２７７Ｖ、２９Ｓ／２０５Ｃ／２８７Ｔ、２９Ｓ／２０５Ｃ／２８７Ｔ／３５３Ｅ、２９Ｓ／２５９Ｆ／２６１Ｌ／２６５Ｉ、２９Ｓ／２６１Ｖ／３５３Ｅ、５７Ｇ／９４Ｋ／１５３Ｆ／１８４Ｒ／２０５Ａ／２５９Ｆ／２６１Ｌ、５７Ｇ／９４Ｋ／１５３Ｆ／２０５Ａ／２６１Ｌ／２６５Ｉ、５７Ｇ／９４Ｋ／１５３Ｆ／２５９Ｆ／２６１Ｖ／２６５Ｉ、５７Ｇ／９４Ｋ／１５３Ｆ／２６１Ｖ／２６５Ｉ、５７Ｇ／９４Ｋ／１８４Ｒ／２０５Ｃ／２６１Ｖ／２６５Ｉ／２８７Ｔ、５７Ｇ／９４Ｋ／１８４Ｒ／２６１Ｓ／２６５Ｉ／２８７Ｔ、５７Ｇ／９４Ｋ／２０５Ａ／２５９Ｆ、５７Ｇ／９４Ｋ／２０５Ａ／２５９Ｆ／２６１Ｖ／２６５Ｉ／２７７Ｖ／２８７Ｔ、５７Ｇ／９４Ｋ／２０５Ａ／２７７Ｖ、５７Ｇ／９４Ｋ／２０５Ｃ／２５９Ｆ、５７Ｇ／９４Ｋ／２０５Ｃ／２６１Ｓ／２６５Ｉ、５７Ｇ／１５３Ｆ／２０５Ａ／２６１Ｌ／２６５Ｉ、５７Ｇ／１５３Ｆ／２０５Ａ／２６１Ｓ、５７Ｇ／１５３Ｆ／２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｌ／２６５Ｉ／２８７Ｔ、５７Ｇ／１５３Ｆ／２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６５Ｉ／２７７Ｖ、５７Ｇ／１５３Ｆ／２０５Ｃ／２６５Ｉ、５７Ｇ／１５３Ｆ／２６１Ｌ／２６５Ｉ／２８７Ｋ／３５３Ｅ、５７Ｇ／１５３Ｆ／２６１Ｒ／２６５Ｉ、５７Ｇ／２０５Ａ、５７Ｇ／２０５Ａ／２５９Ｆ／２６１Ｌ／２６５Ｉ／２７７Ｖ／２８７Ｋ／３５３Ｅ、５７Ｇ／２０５Ａ／２５９Ｆ／２６１Ｌ／２８７Ｔ／３５３Ｅ、５７Ｇ／２０５Ａ／２５９Ｆ／２６１Ｖ、５７Ｇ／２０５Ａ／２６１Ｒ、５７Ｇ／２０５Ｃ、５７Ｇ／２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６５Ｉ、５７Ｇ／２０５Ｃ／２６１Ｌ／２６５Ｉ／２７７Ｖ／２８７Ｔ／３５３Ｅ、５７Ｇ／２０５Ｃ／２６１Ｌ／２７７Ｖ、５７Ｇ／２０５Ｃ／２６１Ｓ／２７７Ｖ／３５３Ｅ、５７Ｇ／２６１Ｌ／２６５Ｉ／３５３Ｅ、９４Ｋ／１２６Ｃ／１８４Ｒ／２０５Ａ／２５９Ｆ／２６１Ｌ／２６５Ｉ、９４Ｋ／１５３Ｆ／１８４Ｒ／２５９Ｆ／２６１Ｓ／２６５Ｉ、９４Ｋ／１５３Ｆ／２０５Ａ／２８７Ｋ／３５３Ｅ、９４Ｋ／１５３Ｆ／２０５Ａ／３５３Ｅ、９４Ｋ／１５３Ｆ／２０５Ｃ／２８７Ｋ、９４Ｋ／１５３Ｆ／２０５Ｃ／２８７Ｔ／３５３Ｅ、９４Ｋ／１５３Ｌ／１８４Ｒ／２０５Ｃ、９４Ｋ／１５３Ｌ／２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｓ／２６５Ｉ／３５３Ｅ、９４Ｋ／１８４Ｒ／２０５Ａ／２５９Ｆ／２６１Ｌ／３５３Ｅ、９４Ｋ／１８４Ｒ／２０５Ａ／２５９Ｆ／２６１Ｓ、９４Ｋ／１
８４Ｒ／２０５Ａ／２６１Ｖ／２６５Ｉ／２８７Ｔ／３５３Ｅ、９４Ｋ／１８４Ｒ／２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｓ／２６５Ｉ／２８７Ｋ、９４Ｋ／１８４Ｒ／３５３Ｅ、９４Ｋ／２０５Ａ、９４Ｋ／２０５Ａ／２５９Ｆ／２６１Ｌ／２６５Ｉ、９４Ｋ／２０５Ａ／２５９Ｆ／２６１Ｌ／２６５Ｉ／２７７Ｖ／２８７Ｋ、９４Ｋ／２０５Ａ／２５９Ｆ／２６１Ｒ／２６５Ｉ、９４Ｋ／２０５Ａ／２５９Ｆ／２６１Ｖ／２８７Ｋ／３５３Ｅ、９４Ｋ／２０５Ａ／２７７Ｖ、９４Ｋ／２０５Ｃ、９４Ｋ／２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｓ／２６５Ｉ、９４Ｋ／２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｓ／２６５Ｉ／３５３Ｅ、９４Ｋ／２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｖ／２６５Ｉ／３５３Ｅ、９４Ｋ／２０５Ｃ／２６１Ｌ／３５３Ｅ、９４Ｋ／２０５Ｃ／２６１Ｓ／２６５Ｉ／２７７Ｖ、９４Ｋ／２０５Ｃ／２６１Ｖ／２６５Ｉ／３５３Ｅ、９４Ｋ／２５９Ｆ／２６１Ｓ／２６５Ｉ、９４Ｋ／２５９Ｆ／２６１Ｖ／２６５Ｉ、１５３Ｆ／１８４Ｒ／２０５Ａ／２６１Ｌ／２７７Ｖ／２８７Ｔ、１５３Ｆ／１８４Ｒ／２６１Ｓ／２６５Ｉ／２８７Ｔ、１５３Ｆ／２０５Ａ、１５３Ｆ／２０５Ａ／２６１Ｒ／２６５Ｉ／２８７Ｔ、１５３Ｆ／２０５Ｃ、１５３Ｆ／２０５Ｃ／２６１Ｌ、１５３Ｆ／２０５Ｃ／２６１Ｖ、１５３Ｆ／２５９Ｆ／２６１Ｖ／２６５Ｉ、１５３Ｆ／２５９Ｆ／２６５Ｉ／２８７Ｋ、１５３Ｆ／２６１Ｌ／２６５Ｉ、１５３Ｆ／２６１Ｒ／２６５Ｉ、１５３Ｆ／２６１Ｓ／２６５Ｉ／２８７Ｔ／３５３Ｅ、１５３Ｆ／２６５Ｉ、１５３Ｆ／２６５Ｉ／２７７Ｖ／２８７Ｔ／３５３Ｅ、１８４Ｒ／２０５Ａ／２６１Ｒ／２６５Ｉ、１８４Ｒ／２０５Ａ／２８７Ｔ／３５３Ｅ、１８４Ｒ／２０５Ｃ、１８４Ｒ／２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｌ／２８７Ｋ、１８４Ｒ／２０５Ｃ／２６１Ｌ、１８４Ｒ／２０５Ｃ／２６１Ｒ／２８７Ｋ、１８４Ｒ／２０５Ｃ／２７７Ｖ、１８４Ｒ／２６１Ｌ／２６５Ｉ／２８７Ｔ、２０２Ｌ、２０２Ｍ、２０５Ａ、２０５Ａ／２５９Ｆ／２６１Ｖ／２６５Ｉ、２０５Ａ／２５９Ｆ／２６５Ｉ、２０５Ａ／２６１Ｌ、２０５Ａ／２６１Ｒ／２６５Ｉ／２８７Ｋ、２０５Ｃ、２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｌ、２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｒ／２６５Ｉ／２７７Ｖ／２８７Ｔ／３５３Ｅ、２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｓ、２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｓ／２６５Ｉ、２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｖ／２７７Ｖ／２８７Ｔ、２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６５Ｉ、２０５Ｃ／２６１Ｌ／２６５Ｉ／２７４Ａ、２０５Ｃ／２６１Ｌ／２７７Ｖ、２０５Ｃ／２６１Ｌ／３５３Ｅ、２０５Ｃ／２６１Ｒ、２０５Ｃ／２６１Ｒ／２６５Ｉ／２８７Ｋ／３５３Ｅ、２０５Ｃ／２６１Ｓ、２０５Ｃ／２６１Ｖ／２６５Ｉ、２０５Ｃ／２７７Ｖ／２８７Ｋ、２０５Ｃ／２８７Ｋ、２０５Ｃ／２８７Ｔ、２０５Ｓ、２０５Ｔ、２２３Ｇ、２２５Ｆ、２２５Ｙ、２５６Ｌ、２５６Ｖ、２５９Ｆ／２６１Ｌ／２６５Ｉ、２５９Ｆ／２６１Ｖ／２６５Ｉ、２６１Ｒ／２６５Ｉ／２８７Ｋ、２６１Ｓ／２６５Ｉ／２８７Ｔ、２６５Ｉ／２８７Ｔ、２８３Ｌ、および２９４Ｉから選択される１つまたは複数の残基の差異を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、イミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、参照配列配列番号５０に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに配列番号５０と比較したＲ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｆ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｌ／Ｐ２０５Ａ／Ｑ２６５Ｉ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ／Ｎ２７７Ｖ／Ｇ３５３Ｅ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｌ／Ｇ３５３Ｅ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｎ１５３Ｆ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ／Ｎ２７７Ｖ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｎ２７７Ｖ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ｃ／Ｎ２７７Ｖ／Ｇ３５３Ｅ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｎ１５３Ｌ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ａ／Ｇ３５３Ｅ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｎ１５３Ｌ／Ｐ２０５Ａ／Ｑ２６５Ｉ／Ｎ２７７Ｖ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｎ２７７Ｖ／Ｉ２８７Ｋ／Ａ３５７Ｓ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ／Ｇ３５３Ｅ、Ｒ２９Ｓ／Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｓ／Ｉ２８７Ｔ／Ｇ３５３Ｅ、Ｒ２９Ｓ／Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｉ２８７Ｋ、Ｒ２９Ｓ／Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｌ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ、Ｒ２９Ｓ／Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｌ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｒ／Ｑ２６５Ｉ、Ｒ２９Ｓ／Ｎ９４Ｋ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｓ、Ｒ２９Ｓ／Ｎ９４Ｋ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｖ、Ｒ２９Ｓ／Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ａ、Ｒ２９Ｓ／Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ａ／Ｅ２６１Ｖ、Ｒ２９Ｓ／Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｉ２８７Ｔ、Ｒ２９Ｓ／Ｎ９４Ｋ／Ｅ２６１Ｒ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ／Ｇ３５３Ｅ、Ｒ２９Ｓ／Ｎ１５３Ｆ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ、Ｒ２９Ｓ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ａ、Ｒ２９Ｓ／Ｎ１５３Ｆ／Ｅ２６１Ｒ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｋ／Ｇ３５３Ｅ、Ｒ２９Ｓ／Ｎ１５３Ｌ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｎ２７７Ｖ／Ｉ２８７Ｔ、Ｒ２９Ｓ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ａ、Ｒ２９Ｓ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ａ／Ｇ３５３Ｅ、Ｒ２９Ｓ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｖ／Ｎ２７７Ｖ、Ｒ２９Ｓ／Ｑ１８４Ｒ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ、Ｒ２９Ｓ／Ｑ１８４Ｒ／Ｑ２６５Ｉ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ａ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｋ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｒ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ａ／Ｅ２６１Ｖ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｉ２８７Ｋ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｉ２８７Ｔ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｓ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｌ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｇ３５３Ｅ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｒ／Ｇ３５３Ｅ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｓ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ｃ／Ｎ２７７Ｖ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ｃ／Ｉ２８７Ｔ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ｃ／Ｉ２８７Ｔ／Ｇ３５３Ｅ、Ｒ２９Ｓ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ、Ｒ２９Ｓ／Ｅ２６１Ｖ／Ｇ３５３Ｅ、Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｆ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ、Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ａ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ、Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｆ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ、Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｆ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ、Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ、Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｑ１８４Ｒ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ、Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ、Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ／Ｎ２７７Ｖ／Ｉ２８７Ｔ、Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ａ／Ｎ２７７Ｖ、Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ、Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ、Ａ５７Ｇ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ａ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ、Ａ５７Ｇ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ａ／Ｅ２６１Ｓ、Ａ５７Ｇ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ、Ａ５７Ｇ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｑ２６５Ｉ／Ｎ２７７Ｖ、Ａ５７Ｇ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ｃ／Ｑ２６５Ｉ、Ａ５７Ｇ／Ｎ１５３Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｋ／Ｇ３５３Ｅ、Ａ５７Ｇ／Ｎ１５３Ｆ／Ｅ２６１Ｒ／Ｑ２６５Ｉ、Ａ５７Ｇ／Ｐ２０５Ａ、Ａ５７Ｇ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｎ２７７Ｖ／Ｉ２８７Ｋ／Ｇ３５３Ｅ、Ａ５７Ｇ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｉ２８７Ｔ／Ｇ３５３Ｅ、Ａ５７Ｇ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｖ、Ａ５７Ｇ／Ｐ２０５Ａ／Ｅ２６１Ｒ、Ａ５７Ｇ／Ｐ２０５Ｃ、Ａ５７Ｇ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｑ２６５Ｉ、Ａ５７Ｇ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｎ２７７Ｖ／Ｉ２８７Ｔ／Ｇ３５３Ｅ、Ａ５７Ｇ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｌ／Ｎ２７７Ｖ、Ａ５７Ｇ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｓ／Ｎ２７７Ｖ／Ｇ３５３Ｅ、Ａ５７Ｇ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｇ１２６Ｃ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ、Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｆ／Ｑ１８４Ｒ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ、Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ａ／Ｉ２８７Ｋ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ａ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ｃ／Ｉ２８７Ｋ、Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ｃ／Ｉ２８７Ｔ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｌ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ、Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｌ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｓ、Ｎ９４Ｋ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ａ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｋ、Ｎ９４Ｋ／Ｑ１８４Ｒ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ａ、Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ、Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｎ２７７Ｖ／Ｉ２８７Ｋ、Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｒ／Ｑ２６５Ｉ、Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｖ／Ｉ２８７Ｋ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ａ／Ｎ２７７Ｖ、Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ｃ、Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ、Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｌ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ／Ｎ２７７Ｖ、Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ、Ｎ９４Ｋ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ、Ｎ１５３Ｆ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ａ／Ｅ２６１Ｌ／Ｎ２７７Ｖ／Ｉ２８７Ｔ、Ｎ１５３Ｆ／Ｑ１８４Ｒ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ、Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ａ、Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ａ／Ｅ２６１Ｒ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ、Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ｃ、Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｌ、Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｖ、Ｎ１５３Ｆ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ、Ｎ１５３Ｆ／Ｙ２５９Ｆ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｋ、Ｎ１５３Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ、Ｎ１５３Ｆ／Ｅ２６１Ｒ／Ｑ２６５Ｉ、Ｎ１５３Ｆ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ１５３Ｆ／Ｑ２６５Ｉ、Ｎ１５３Ｆ／Ｑ２６５Ｉ／Ｎ２７７Ｖ／Ｉ２８７Ｔ／Ｇ３５３Ｅ、Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ａ／Ｅ２６１Ｒ／Ｑ２６５Ｉ、Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ａ／Ｉ２８７Ｔ／Ｇ３５
３Ｅ、Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ、Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｉ２８７Ｋ、Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｌ、Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｒ／Ｉ２８７Ｋ、Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ／Ｎ２７７Ｖ、Ｑ１８４Ｒ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ、Ｈ２０２Ｌ、Ｈ２０２Ｍ、Ｐ２０５Ａ、Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ、Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｑ２６５Ｉ、Ｐ２０５Ａ／Ｅ２６１Ｌ、Ｐ２０５Ａ／Ｅ２６１Ｒ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｋ、Ｐ２０５Ｃ、Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ、Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｒ／Ｑ２６５Ｉ／Ｎ２７７Ｖ／Ｉ２８７Ｔ／Ｇ３５３Ｅ、Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｓ、Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ、Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｖ／Ｎ２７７Ｖ／Ｉ２８７Ｔ、Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｑ２６５Ｉ、Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｖ２７４Ａ、Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｌ／Ｎ２７７Ｖ、Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｌ／Ｇ３５３Ｅ、Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｒ、Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｒ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｋ／Ｇ３５３Ｅ、Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｓ、Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ、Ｐ２０５Ｃ／Ｎ２７７Ｖ／Ｉ２８７Ｋ、Ｐ２０５Ｃ／Ｉ２８７Ｋ、Ｐ２０５Ｃ／Ｉ２８７Ｔ、Ｐ２０５Ｓ、Ｐ２０５Ｔ、Ｓ２２３Ｇ、Ｇ２２５Ｆ、Ｇ２２５Ｙ、Ｃ２５６Ｌ、Ｃ２５６Ｖ、Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ、Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ、Ｅ２６１Ｒ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｋ、Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ、Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ、Ｉ２８３Ｌ、およびＦ２９４Ｉから選択される１つまたは複数の残基の差異を有するアミノ酸配列を含む。
８４Ｒ／２０５Ａ／２６１Ｖ／２６５Ｉ／２８７Ｔ／３５３Ｅ、９４Ｋ／１８４Ｒ／２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｓ／２６５Ｉ／２８７Ｋ、９４Ｋ／１８４Ｒ／３５３Ｅ、９４Ｋ／２０５Ａ、９４Ｋ／２０５Ａ／２５９Ｆ／２６１Ｌ／２６５Ｉ、９４Ｋ／２０５Ａ／２５９Ｆ／２６１Ｌ／２６５Ｉ／２７７Ｖ／２８７Ｋ、９４Ｋ／２０５Ａ／２５９Ｆ／２６１Ｒ／２６５Ｉ、９４Ｋ／２０５Ａ／２５９Ｆ／２６１Ｖ／２８７Ｋ／３５３Ｅ、９４Ｋ／２０５Ａ／２７７Ｖ、９４Ｋ／２０５Ｃ、９４Ｋ／２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｓ／２６５Ｉ、９４Ｋ／２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｓ／２６５Ｉ／３５３Ｅ、９４Ｋ／２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｖ／２６５Ｉ／３５３Ｅ、９４Ｋ／２０５Ｃ／２６１Ｌ／３５３Ｅ、９４Ｋ／２０５Ｃ／２６１Ｓ／２６５Ｉ／２７７Ｖ、９４Ｋ／２０５Ｃ／２６１Ｖ／２６５Ｉ／３５３Ｅ、９４Ｋ／２５９Ｆ／２６１Ｓ／２６５Ｉ、９４Ｋ／２５９Ｆ／２６１Ｖ／２６５Ｉ、１５３Ｆ／１８４Ｒ／２０５Ａ／２６１Ｌ／２７７Ｖ／２８７Ｔ、１５３Ｆ／１８４Ｒ／２６１Ｓ／２６５Ｉ／２８７Ｔ、１５３Ｆ／２０５Ａ、１５３Ｆ／２０５Ａ／２６１Ｒ／２６５Ｉ／２８７Ｔ、１５３Ｆ／２０５Ｃ、１５３Ｆ／２０５Ｃ／２６１Ｌ、１５３Ｆ／２０５Ｃ／２６１Ｖ、１５３Ｆ／２５９Ｆ／２６１Ｖ／２６５Ｉ、１５３Ｆ／２５９Ｆ／２６５Ｉ／２８７Ｋ、１５３Ｆ／２６１Ｌ／２６５Ｉ、１５３Ｆ／２６１Ｒ／２６５Ｉ、１５３Ｆ／２６１Ｓ／２６５Ｉ／２８７Ｔ／３５３Ｅ、１５３Ｆ／２６５Ｉ、１５３Ｆ／２６５Ｉ／２７７Ｖ／２８７Ｔ／３５３Ｅ、１８４Ｒ／２０５Ａ／２６１Ｒ／２６５Ｉ、１８４Ｒ／２０５Ａ／２８７Ｔ／３５３Ｅ、１８４Ｒ／２０５Ｃ、１８４Ｒ／２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｌ／２８７Ｋ、１８４Ｒ／２０５Ｃ／２６１Ｌ、１８４Ｒ／２０５Ｃ／２６１Ｒ／２８７Ｋ、１８４Ｒ／２０５Ｃ／２７７Ｖ、１８４Ｒ／２６１Ｌ／２６５Ｉ／２８７Ｔ、２０２Ｌ、２０２Ｍ、２０５Ａ、２０５Ａ／２５９Ｆ／２６１Ｖ／２６５Ｉ、２０５Ａ／２５９Ｆ／２６５Ｉ、２０５Ａ／２６１Ｌ、２０５Ａ／２６１Ｒ／２６５Ｉ／２８７Ｋ、２０５Ｃ、２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｌ、２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｒ／２６５Ｉ／２７７Ｖ／２８７Ｔ／３５３Ｅ、２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｓ、２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｓ／２６５Ｉ、２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６１Ｖ／２７７Ｖ／２８７Ｔ、２０５Ｃ／２５９Ｆ／２６５Ｉ、２０５Ｃ／２６１Ｌ／２６５Ｉ／２７４Ａ、２０５Ｃ／２６１Ｌ／２７７Ｖ、２０５Ｃ／２６１Ｌ／３５３Ｅ、２０５Ｃ／２６１Ｒ、２０５Ｃ／２６１Ｒ／２６５Ｉ／２８７Ｋ／３５３Ｅ、２０５Ｃ／２６１Ｓ、２０５Ｃ／２６１Ｖ／２６５Ｉ、２０５Ｃ／２７７Ｖ／２８７Ｋ、２０５Ｃ／２８７Ｋ、２０５Ｃ／２８７Ｔ、２０５Ｓ、２０５Ｔ、２２３Ｇ、２２５Ｆ、２２５Ｙ、２５６Ｌ、２５６Ｖ、２５９Ｆ／２６１Ｌ／２６５Ｉ、２５９Ｆ／２６１Ｖ／２６５Ｉ、２６１Ｒ／２６５Ｉ／２８７Ｋ、２６１Ｓ／２６５Ｉ／２８７Ｔ、２６５Ｉ／２８７Ｔ、２８３Ｌ、および２９４Ｉから選択される１つまたは複数の残基の差異を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、イミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、参照配列配列番号５０に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに配列番号５０と比較したＲ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｆ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｌ／Ｐ２０５Ａ／Ｑ２６５Ｉ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ／Ｎ２７７Ｖ／Ｇ３５３Ｅ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｌ／Ｇ３５３Ｅ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｎ１５３Ｆ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ／Ｎ２７７Ｖ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｎ２７７Ｖ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ｃ／Ｎ２７７Ｖ／Ｇ３５３Ｅ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｎ１５３Ｌ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ａ／Ｇ３５３Ｅ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｎ１５３Ｌ／Ｐ２０５Ａ／Ｑ２６５Ｉ／Ｎ２７７Ｖ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｎ２７７Ｖ／Ｉ２８７Ｋ／Ａ３５７Ｓ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ、Ｒ２９Ｓ／Ａ５７Ｇ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ／Ｇ３５３Ｅ、Ｒ２９Ｓ／Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｓ／Ｉ２８７Ｔ／Ｇ３５３Ｅ、Ｒ２９Ｓ／Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｉ２８７Ｋ、Ｒ２９Ｓ／Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｌ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ、Ｒ２９Ｓ／Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｌ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｒ／Ｑ２６５Ｉ、Ｒ２９Ｓ／Ｎ９４Ｋ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｓ、Ｒ２９Ｓ／Ｎ９４Ｋ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｖ、Ｒ２９Ｓ／Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ａ、Ｒ２９Ｓ／Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ａ／Ｅ２６１Ｖ、Ｒ２９Ｓ／Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｉ２８７Ｔ、Ｒ２９Ｓ／Ｎ９４Ｋ／Ｅ２６１Ｒ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ／Ｇ３５３Ｅ、Ｒ２９Ｓ／Ｎ１５３Ｆ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ、Ｒ２９Ｓ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ａ、Ｒ２９Ｓ／Ｎ１５３Ｆ／Ｅ２６１Ｒ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｋ／Ｇ３５３Ｅ、Ｒ２９Ｓ／Ｎ１５３Ｌ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｎ２７７Ｖ／Ｉ２８７Ｔ、Ｒ２９Ｓ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ａ、Ｒ２９Ｓ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ａ／Ｇ３５３Ｅ、Ｒ２９Ｓ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｖ／Ｎ２７７Ｖ、Ｒ２９Ｓ／Ｑ１８４Ｒ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ、Ｒ２９Ｓ／Ｑ１８４Ｒ／Ｑ２６５Ｉ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ａ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｋ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｒ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ａ／Ｅ２６１Ｖ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｉ２８７Ｋ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｉ２８７Ｔ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｓ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｌ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｇ３５３Ｅ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｒ／Ｇ３５３Ｅ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｓ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ｃ／Ｎ２７７Ｖ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ｃ／Ｉ２８７Ｔ、Ｒ２９Ｓ／Ｐ２０５Ｃ／Ｉ２８７Ｔ／Ｇ３５３Ｅ、Ｒ２９Ｓ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ、Ｒ２９Ｓ／Ｅ２６１Ｖ／Ｇ３５３Ｅ、Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｆ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ、Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ａ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ、Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｆ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ、Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｆ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ、Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ、Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｑ１８４Ｒ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ、Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ、Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ／Ｎ２７７Ｖ／Ｉ２８７Ｔ、Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ａ／Ｎ２７７Ｖ、Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ、Ａ５７Ｇ／Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ、Ａ５７Ｇ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ａ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ、Ａ５７Ｇ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ａ／Ｅ２６１Ｓ、Ａ５７Ｇ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ、Ａ５７Ｇ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｑ２６５Ｉ／Ｎ２７７Ｖ、Ａ５７Ｇ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ｃ／Ｑ２６５Ｉ、Ａ５７Ｇ／Ｎ１５３Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｋ／Ｇ３５３Ｅ、Ａ５７Ｇ／Ｎ１５３Ｆ／Ｅ２６１Ｒ／Ｑ２６５Ｉ、Ａ５７Ｇ／Ｐ２０５Ａ、Ａ５７Ｇ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｎ２７７Ｖ／Ｉ２８７Ｋ／Ｇ３５３Ｅ、Ａ５７Ｇ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｉ２８７Ｔ／Ｇ３５３Ｅ、Ａ５７Ｇ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｖ、Ａ５７Ｇ／Ｐ２０５Ａ／Ｅ２６１Ｒ、Ａ５７Ｇ／Ｐ２０５Ｃ、Ａ５７Ｇ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｑ２６５Ｉ、Ａ５７Ｇ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｎ２７７Ｖ／Ｉ２８７Ｔ／Ｇ３５３Ｅ、Ａ５７Ｇ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｌ／Ｎ２７７Ｖ、Ａ５７Ｇ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｓ／Ｎ２７７Ｖ／Ｇ３５３Ｅ、Ａ５７Ｇ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｇ１２６Ｃ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ、Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｆ／Ｑ１８４Ｒ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ、Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ａ／Ｉ２８７Ｋ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ａ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ｃ／Ｉ２８７Ｋ、Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ｃ／Ｉ２８７Ｔ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｌ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ、Ｎ９４Ｋ／Ｎ１５３Ｌ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｓ、Ｎ９４Ｋ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ａ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｋ、Ｎ９４Ｋ／Ｑ１８４Ｒ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ａ、Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ、Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｎ２７７Ｖ／Ｉ２８７Ｋ、Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｒ／Ｑ２６５Ｉ、Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｖ／Ｉ２８７Ｋ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ａ／Ｎ２７７Ｖ、Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ｃ、Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ、Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｌ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ／Ｎ２７７Ｖ、Ｎ９４Ｋ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ９４Ｋ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ、Ｎ９４Ｋ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ、Ｎ１５３Ｆ／Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ａ／Ｅ２６１Ｌ／Ｎ２７７Ｖ／Ｉ２８７Ｔ、Ｎ１５３Ｆ／Ｑ１８４Ｒ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ、Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ａ、Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ａ／Ｅ２６１Ｒ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ、Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ｃ、Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｌ、Ｎ１５３Ｆ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｖ、Ｎ１５３Ｆ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ、Ｎ１５３Ｆ／Ｙ２５９Ｆ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｋ、Ｎ１５３Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ、Ｎ１５３Ｆ／Ｅ２６１Ｒ／Ｑ２６５Ｉ、Ｎ１５３Ｆ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ／Ｇ３５３Ｅ、Ｎ１５３Ｆ／Ｑ２６５Ｉ、Ｎ１５３Ｆ／Ｑ２６５Ｉ／Ｎ２７７Ｖ／Ｉ２８７Ｔ／Ｇ３５３Ｅ、Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ａ／Ｅ２６１Ｒ／Ｑ２６５Ｉ、Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ａ／Ｉ２８７Ｔ／Ｇ３５
３Ｅ、Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ、Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｉ２８７Ｋ、Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｌ、Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｒ／Ｉ２８７Ｋ、Ｑ１８４Ｒ／Ｐ２０５Ｃ／Ｎ２７７Ｖ、Ｑ１８４Ｒ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ、Ｈ２０２Ｌ、Ｈ２０２Ｍ、Ｐ２０５Ａ、Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ、Ｐ２０５Ａ／Ｙ２５９Ｆ／Ｑ２６５Ｉ、Ｐ２０５Ａ／Ｅ２６１Ｌ、Ｐ２０５Ａ／Ｅ２６１Ｒ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｋ、Ｐ２０５Ｃ、Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ、Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｒ／Ｑ２６５Ｉ／Ｎ２７７Ｖ／Ｉ２８７Ｔ／Ｇ３５３Ｅ、Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｓ、Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ、Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｖ／Ｎ２７７Ｖ／Ｉ２８７Ｔ、Ｐ２０５Ｃ／Ｙ２５９Ｆ／Ｑ２６５Ｉ、Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ／Ｖ２７４Ａ、Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｌ／Ｎ２７７Ｖ、Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｌ／Ｇ３５３Ｅ、Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｒ、Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｒ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｋ／Ｇ３５３Ｅ、Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｓ、Ｐ２０５Ｃ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ、Ｐ２０５Ｃ／Ｎ２７７Ｖ／Ｉ２８７Ｋ、Ｐ２０５Ｃ／Ｉ２８７Ｋ、Ｐ２０５Ｃ／Ｉ２８７Ｔ、Ｐ２０５Ｓ、Ｐ２０５Ｔ、Ｓ２２３Ｇ、Ｇ２２５Ｆ、Ｇ２２５Ｙ、Ｃ２５６Ｌ、Ｃ２５６Ｖ、Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｌ／Ｑ２６５Ｉ、Ｙ２５９Ｆ／Ｅ２６１Ｖ／Ｑ２６５Ｉ、Ｅ２６１Ｒ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｋ、Ｅ２６１Ｓ／Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ、Ｑ２６５Ｉ／Ｉ２８７Ｔ、Ｉ２８３Ｌ、およびＦ２９４Ｉから選択される１つまたは複数の残基の差異を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、イミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、参照配列配列番号３０６に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに配列番号３０６と比較した１９７／１９８／２０１／２５９、１９８／２０１／２５９／２８０、２０２／２０５／２２１／２２３／２２５／２６１、２０２／２０５／２２１／２２３／２６１／２９４、２０２／２２１／２２２／２２５／２５６／２６１／２９４、２０２／２２１／２２３／２２５／２８３／２９４、２０５／２２１／２２２、２０５／２２１／２２３／２２５／２５６／２６１／２８３、２１９、２２１／２２２／２２３／２２５、２２１／２２３、２２１／２２３／２２５、２２１／２２３／２２５／２５６／２６１、２２１／２２３／２２５／２６１、２２１／２２３／２２５／２９４、２２１／２２５、２２１／２２５／２５６、２２１／２２５／２５６／２６１、２２１／２２５／２５６／２６１／２８３／２９４、２２３／２２５／２５６／２６１、２２５／２５６／２６１、２８０、および２８０／３０６から選択される１つまたは複数の残基の差異を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、イミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、参照配列配列番号３０６に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに配列番号３０６と比較した１９７Ｔ／１９８Ｓ／２０１Ｌ／２５９Ｖ、１９８Ａ／２０１Ｌ／２５９Ｖ／２８０Ｌ、２０２Ｌ／２０５Ｓ／２２１Ｓ／２２３Ｇ／２２５Ｙ／２６１Ｙ、２０２Ｌ／２２１Ｈ／２２３Ｇ／２２５Ｆ／２８３Ｍ／２９４Ｉ、２０２Ｍ／２０５Ｓ／２２１Ｈ／２２３Ｇ／２６１Ｙ／２９４Ｉ、２０２Ｍ／２０５Ｔ／２２１Ｌ／２２３Ｇ／２２５Ｙ／２６１Ｒ、２０２Ｍ／２２１Ｓ／２２２Ｉ／２２５Ｙ／２５６Ｌ／２６１Ｒ／２９４Ｉ、２０５Ｓ／２２１Ｓ／２２３Ｇ／２２５Ｆ／２５６Ｌ／２６１Ｔ／２８３Ｍ、２０５Ｔ／２２１Ｈ／２２２Ｉ、２１９Ｌ、２２１Ｈ／２２２Ｉ／２２３Ｇ／２２５Ｙ、２２１Ｈ／２２３Ｇ／２２５Ｌ、２２１Ｈ／２２５Ｆ、２２１Ｌ／２２３Ｇ／２２５Ｌ／２５６Ｔ／２６１Ｒ、２２１Ｌ／２２５Ｆ／２５６Ｖ、２２１Ｓ／２２３Ｇ、２２１Ｓ／２２３Ｇ／２２５Ｌ／２５６Ｌ／２６１Ｒ、２２１Ｓ／２２３Ｇ／２２５Ｌ／２６１Ｒ、２２１Ｓ／２２３Ｇ／２２５Ｌ／２９４Ｉ、２２１Ｓ／２２５Ｆ／２５６Ｔ／２６１Ｒ、２２１Ｓ／２２５Ｙ／２５６Ｔ／２６１Ｙ／２８３Ｍ／２９４Ｉ、２２３Ｇ／２２５Ｌ／２５６Ｖ／２６１Ｒ、２２５Ｆ／２５６Ｔ／２６１Ｔ、２８０Ｄ、２８０Ｅ、２８０Ｉ、２８０Ｖ、２８０Ｖ／３０６Ｆ、および２８０Ｗから選択される１つまたは複数の残基の差異を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、イミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、参照配列配列番号３０６に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに配列番号３０６と比較したＶ１９７Ｔ／Ｈ１９８Ｓ／Ｍ２０１Ｌ／Ｙ２５９Ｖ、Ｈ１９８Ａ／Ｍ２０１Ｌ／Ｙ２５９Ｖ／Ｙ２８０Ｌ、Ｈ２０２Ｌ／Ａ２０５Ｓ／Ｙ２２１Ｓ／Ｓ２２３Ｇ／Ｇ２２５Ｙ／Ｖ２６１Ｙ、Ｈ２０２Ｌ／Ｙ２２１Ｈ／Ｓ２２３Ｇ／Ｇ２２５Ｆ／Ｉ２８３Ｍ／Ｆ２９４Ｉ、Ｈ２０２Ｍ／Ａ２０５Ｓ／Ｙ２２１Ｈ／Ｓ２２３Ｇ／Ｖ２６１Ｙ／Ｆ２９４Ｉ、Ｈ２０２Ｍ／Ａ２０５Ｔ／Ｙ２２１Ｌ／Ｓ２２３Ｇ／Ｇ２２５Ｙ／Ｖ２６１Ｒ、Ｈ２０２Ｍ／Ｙ２２１Ｓ／Ｆ２２２Ｉ／Ｇ２２５Ｙ／Ｃ２５６Ｌ／Ｖ２６１Ｒ／Ｆ２９４Ｉ、Ａ２０５Ｓ／Ｙ２２１Ｓ／Ｓ２２３Ｇ／Ｇ２２５Ｆ／Ｃ２５６Ｌ／Ｖ２６１Ｔ／Ｉ２８３Ｍ、Ａ２０５Ｔ／Ｙ２２１Ｈ／Ｆ２２２Ｉ、Ｆ２１９Ｌ、Ｙ２２１Ｈ／Ｆ２２２Ｉ／Ｓ２２３Ｇ／Ｇ２２５Ｙ、Ｙ２２１Ｈ／Ｓ２２３Ｇ／Ｇ２２５Ｌ、Ｙ２２１Ｈ／Ｇ２２５Ｆ、Ｙ２２１Ｌ／Ｓ２２３Ｇ／Ｇ２２５Ｌ／Ｃ２５６Ｔ／Ｖ２６１Ｒ、Ｙ２２１Ｌ／Ｇ２２５Ｆ／Ｃ２５６Ｖ、Ｙ２２１Ｓ／Ｓ２２３Ｇ、Ｙ２２１Ｓ／Ｓ２２３Ｇ／Ｇ２２５Ｌ／Ｃ２５６Ｌ／Ｖ２６１Ｒ、Ｙ２２１Ｓ／Ｓ２２３Ｇ／Ｇ２２５Ｌ／Ｖ２６１Ｒ、Ｙ２２１Ｓ／Ｓ２２３Ｇ／Ｇ２２５Ｌ／Ｆ２９４Ｉ、Ｙ２２１Ｓ／Ｇ２２５Ｆ／Ｃ２５６Ｔ／Ｖ２６１Ｒ、Ｙ２２１Ｓ／Ｇ２２５Ｙ／Ｃ２５６Ｔ／Ｖ２６１Ｙ／Ｉ２８３Ｍ／Ｆ２９４Ｉ、Ｓ２２３Ｇ／Ｇ２２５Ｌ／Ｃ２５６Ｖ／Ｖ２６１Ｒ、Ｇ２２５Ｆ／Ｃ２５６Ｔ／Ｖ２６１Ｔ、Ｙ２８０Ｄ、Ｙ２８０Ｅ、Ｙ２８０Ｉ、Ｙ２８０Ｖ、Ｙ２８０Ｖ／Ｓ３０６Ｆ、およびＹ２８０Ｗから選択される１つまたは複数の残基の差異を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、イミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、参照配列配列番号６４８に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに配列番号６４８と比較した１７／１９８／２５９／２８０、１９７、１９７／１９８、１９７／１９８／２２３／２５９、１９７／２２３／２７７／２８０、１９７／２５９、１９７／２７７、１９８、１９８／２２３、１９８／２２３／２５９／２７７／２８０、１９８／２５９、１９８／２５９／２７７、１９８／２５９／２７７／２８０、１９８／２７７／２８０、２２３／２５９、２２３／２５９／２８０、２５８、２５９、２５９／２６８／２７７／２８０、２５９／２７７、２５９／２８０、２６３、２７７、および２８０から選択される１つまたは複数の残基の差異を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、イミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、参照配列配列番号６４８に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに配列番号６４８と比較した１７Ｐ／１９８Ｓ／２５９Ｖ／２８０Ｆ、１７Ｐ／１９８Ｓ／２５９Ｗ／２８０Ｗ、１９７Ｌ、１９７Ｌ／１９８Ｓ、１９７Ｌ／１９８Ｓ／２２３Ｇ／２５９Ｗ、１９７Ｌ／２２３Ｇ／２７７Ｔ／２８０Ｋ、１９７Ｌ／２５９Ｗ、１９７Ｌ／２７７Ｆ、１９８Ａ、１９８Ｓ、１９８Ｓ／２２３Ｇ、１９８Ｓ／２２３Ｇ／２５９Ｗ／２７７Ｗ／２８０Ｇ、１９８Ｓ／２５９Ｖ、１９８Ｓ／２５９Ｖ／２７７Ｔ、１９８Ｓ／２５９Ｗ／２７７Ｆ／２８０Ｇ、１９８Ｓ／２５９Ｗ／２７７Ｔ／２８０Ｆ、１９８Ｓ／２７７Ｆ／２８０Ｆ、１９８Ｓ／２７７Ｇ／２８０Ｗ、１９８Ｓ／２７７Ｐ／２８０Ｆ、２２３Ｇ／２５９Ｖ／２８０Ｗ、２２３Ｇ／２５９Ｗ、２５８Ｙ、２５９Ｎ／２８０Ｗ、２５９Ｗ、２５９Ｗ／２６８Ｓ／２７７Ｔ／２８０Ｆ、２５９Ｗ／２７７Ｗ、２６３Ｄ、２６３Ｅ、２６３Ｆ、２６３Ｇ、２６３Ｌ、２６３Ｍ、２６３Ｎ、２６３Ｑ、２６３Ｒ、２６３Ｖ、２６３Ｗ、２７７Ｗ、２８０Ｄ、２８０Ｆ、および２８０Ｗから選択される１つまたは複数の残基の差異を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、イミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、参照配列配列番号６４８に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに配列番号６４８と比較したＨ１７Ｐ／Ｈ１９８Ｓ／Ｙ２５９Ｖ／Ｙ２８０Ｆ、Ｈ１７Ｐ／Ｈ１９８Ｓ／Ｙ２５９Ｗ／Ｙ２８０Ｗ、Ｖ１９７Ｌ、Ｖ１９７Ｌ／Ｈ１９８Ｓ、Ｖ１９７Ｌ／Ｈ１９８Ｓ／Ｓ２２３Ｇ／Ｙ２５９Ｗ、Ｖ１９７Ｌ／Ｓ２２３Ｇ／Ｎ２７７Ｔ／Ｙ２８０Ｋ、Ｖ１９７Ｌ／Ｙ２５９Ｗ、Ｖ１９７Ｌ／Ｎ２７７Ｆ、Ｈ１９８Ａ、Ｈ１９８Ｓ、Ｈ１９８Ｓ／Ｓ２２３Ｇ、Ｈ１９８Ｓ／Ｓ２２３Ｇ／Ｙ２５９Ｗ／Ｎ２７７Ｗ／Ｙ２８０Ｇ、Ｈ１９８Ｓ／Ｙ２５９Ｖ、Ｈ１９８Ｓ／Ｙ２５９Ｖ／Ｎ２７７Ｔ、Ｈ１９８Ｓ／Ｙ２５９Ｗ／Ｎ２７７Ｆ／Ｙ２８０Ｇ、Ｈ１９８Ｓ／Ｙ２５９Ｗ／Ｎ２７７Ｔ／Ｙ２８０Ｆ、Ｈ１９８Ｓ／Ｎ２７７Ｆ／Ｙ２８０Ｆ、Ｈ１９８Ｓ／Ｎ２７７Ｇ／Ｙ２８０Ｗ、Ｈ１９８Ｓ／Ｎ２７７Ｐ／Ｙ２８０Ｆ、Ｓ２２３Ｇ／Ｙ２５９Ｖ／Ｙ２８０Ｗ、Ｓ２２３Ｇ／Ｙ２５９Ｗ、Ｗ２５８Ｙ、Ｙ２５９Ｎ／Ｙ２８０Ｗ、Ｙ２５９Ｗ、Ｙ２５９Ｗ／Ａ２６８Ｓ／Ｎ２７７Ｔ／Ｙ２８０Ｆ、Ｙ２５９Ｗ／Ｎ２７７Ｗ、Ｙ２６３Ｄ、Ｙ２６３Ｅ、Ｙ２６３Ｆ、Ｙ２６３Ｇ、Ｙ２６３Ｌ、Ｙ２６３Ｍ、Ｙ２６３Ｎ、Ｙ２６３Ｑ、Ｙ２６３Ｒ、Ｙ２６３Ｖ、Ｙ２６３Ｗ、Ｎ２７７Ｗ、Ｙ２８０Ｄ、Ｙ２８０Ｆ、およびＹ２８０Ｗから選択される１つまたは複数の残基の差異を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、イミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、参照配列配列番号７０８に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに配列番号７０８と比較した１４１、１５４、１９７、１９７／１９８、および２７８から選択される１つまたは複数の残基の差異を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、イミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、参照配列配列番号７０８に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに配列番号７０８と比較した１４１Ｄ、１５４Ｇ、１５４Ｈ、１９７Ａ、１９７Ｐ／１９８Ａ、２７８Ｅ、および２７８Ｖから選択される１つまたは複数の残基の差異を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、イミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、参照配列配列番号７０８に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに配列番号７０８と比較したＴ１４１Ｄ、Ａ１５４Ｇ、Ａ１５４Ｈ、Ｖ１９７Ａ、Ｖ１９７Ｐ／Ｓ１９８Ａ、Ｐ２７８Ｅ、およびＰ２７８Ｖから選択される１つまたは複数の残基の差異を有するアミノ酸配列を含む。
当業者によって理解されるであろうように、一部の実施形態では、選択された上記の残基の差異のうちの１つまたは組合せを、コア特性として操作されたイミンレダクターゼにおいて一定にし（すなわち維持し）、他の残基位置において追加の残基の差異を配列に組み込んで、改善された特性を有する追加の操作されたイミンレダクターゼポリペプチドを生成することができる。したがって、上記の残基の差異のうちの１つまたはサブセットを含む任意の操作されたイミンレダクターゼに関して、本発明は、残基の差異のうちの１つまたはサブセット、および本明細書において開示される他の残基位置における追加の１つまたは複数の残基の差異を含む、他の操作されたイミンレダクターゼを企図することを理解されたい。
上記のように、イミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、基質を（例えば、化合物（２）および化合物（３）を生成物（例えば、化合物（１）に）変換することもできる。一部の実施形態では、操作されたイミンレダクターゼポリペプチドは、基質化合物を、配列番号４、１６、５０、３０６、６４８および／または７０８の参照ポリペプチドの活性と比べて少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍の、またはそれを超える活性で生成物化合物に変換することができる。
一部の実施形態では、基質化合物を、配列番号４、１６、５０、３０６、６４８および／または７０８と比べて少なくとも２倍の活性で生成物化合物に変換することができる操作されたイミンレダクターゼポリペプチドは、配列番号６から８０２における偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、操作されたイミンレダクターゼは、細菌宿主細胞において、特にＥ．ｃｏｌｉにおいて、操作されたイミンレダクターゼ活性の発現を増加させる、配列番号４、１６、５０、３０６、６４８および／または７０８と比較した１つまたは複数の残基の差異を含むアミノ酸配列を有する。
一部の実施形態では、改善された特性を有する操作されたイミンレダクターゼポリペプチドは、配列番号６から８０２の範囲の偶数番号の配列から選択される配列を含むアミノ酸配列を有する。
一部の実施形態では、イミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号６から８０２の範囲の偶数番号の配列のうちの１つに対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性、および実施例で提供される配列番号６～８０２の範囲の偶数番号の配列のいずれか１つに存在する配列番号４、１６、５０、３０６、６４８および／または７０８と比較したアミノ酸残基の差異を有するアミノ酸配列を含む。
上記で指定された残基位置に加えて、本明細書において開示される操作されたイミンレダクターゼポリペプチドのいずれかは、他の残基位置（すなわち、本明細書において含まれるもの以外の残基位置）において配列番号４、１６、５０、３０６、６４８および／または７０８に対して他の残基の差異をさらに含んでいてもよい。これらの他の残基位置における残基の差異は、基質の生成物への変換を行うためのポリペプチドの能力に悪影響を与えることなく、アミノ酸配列における追加のバリエーションを提供することができる。したがって、一部の実施形態では、配列番号６～８０２の範囲の偶数番号の配列から選択される操作されたイミンレダクターゼポリペプチドのうちのいずれか１つに存在するアミノ酸残基の差異に加えて、配列は、配列番号４、１６、５０、３０６、６４８および／または７０８と比較した他のアミノ酸残基位置において１～２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、１～１０、１～１１、１～１２、１～１４、１～１５、１～１６、１～１８、１～２０、１～２２、１～２４、１～２６、１～３０、１～３５、１～４０、１～４５、または１～５０個の残基の差異をさらに含んでいてもよい。一部の実施形態では、参照配列と比較したアミノ酸残基の差異の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３０、３５、４０、４５または５０個の残基位置であってもよい。一部の実施形態では、参照配列と比較したアミノ酸残基の差異の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の残基位置であってもよい。これらの他の位置における残基の差異は保存的な変化であっても非保存的な変化であってもよい。一部の実施形態では、残基の差異は、配列番号４、１６、５０、３０６、６４８および／または７０８の天然に存在するイミンレダクターゼポリペプチドと比較して保存的な置換および非保存的な置換を含んでいてもよい。
一部の実施形態では、本発明は、その操作されたイミンレダクターゼの機能的活性および／または改善された特性を保持する、本明細書において記載される操作されたイミンレダクターゼポリペプチドのいずれかの断片を含む操作されたポリペプチドも提供する。したがって、一部の実施形態では、本発明は、好適な反応条件下で基質を生成物に変換することができるポリペプチド断片であって、断片が、本発明の操作されたイミンレダクターゼポリペプチドの、例えば、配列番号６～８０２の範囲の偶数番号の配列から選択される例示的な操作されたイミンレダクターゼポリペプチドの完全長アミノ酸配列の少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含むポリペプチド断片を提供する。一部の実施形態では、操作されたイミンレダクターゼポリペプチドは、本明細書において記載される操作されたイミンレダクターゼポリペプチド配列の、例えば、配列番号６～８０２の範囲の例示的な操作されたポリペプチドの偶数番号の配列のいずれか１つにおいて欠失を含むアミノ酸配列を有していてもよい。
したがって、本発明の操作されたイミンレダクターゼポリペプチドのそれぞれおよび全ての実施形態に関しては、本明細書において記載される操作されたイミンレダクターゼの関連する機能的活性および／または改善された特性が維持される場合、アミノ酸配列は、イミンレダクターゼポリペプチドの１個または複数のアミノ酸、２個もしくはそれを超えるアミノ酸、３個もしくはそれを超えるアミノ酸、４個もしくはそれを超えるアミノ酸、５個もしくはそれを超えるアミノ酸、６個もしくはそれを超えるアミノ酸、８個もしくはそれを超えるアミノ酸、１０個もしくはそれを超えるアミノ酸、１５個もしくはそれを超えるアミノ酸、または２０個もしくはそれを超えるアミノ酸、アミノ酸総数の最大１０％、アミノ酸総数の最大２０％、またはアミノ酸総数の最大３０％の欠失を含んでいてもよい。一部の実施形態では、欠失は、１～２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、１～１０、１～１５、１～２０、１～２１、１～２２、１～２３、１～２４、１～２５、１～３０、１～３５、１～４０、１～４５、または１～５０個のアミノ酸残基を含んでいてもよい。一部の実施形態では、欠失の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３０、３５、４０、４５、または５０個のアミノ酸残基であってもよい。一部の実施形態では、欠失は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個のアミノ酸残基の欠失を含んでいてもよい。
一部の実施形態では、本明細書における操作されたイミンレダクターゼポリペプチドは、本明細書において記載される操作されたイミンレダクターゼポリペプチド、例えば、配列番号６～８０２の範囲の偶数番号の配列の例示的な操作されたポリペプチドのうちのいずれか１つと比較して挿入を含むアミノ酸配列を有していてもよい。したがって、本発明のイミンレダクターゼポリペプチドのそれぞれおよび全ての実施形態に関しては、挿入は、本明細書において記載される操作されたイミンレダクターゼの関連する機能的活性および／または改善された特性が維持される場合、１個もしくは複数のアミノ酸、２個もしくはそれを超えるアミノ酸、３個もしくはそれを超えるアミノ酸、４個もしくはそれを超えるアミノ酸、５個もしくはそれを超えるアミノ酸、６個もしくはそれを超えるアミノ酸、８個もしくはそれを超えるアミノ酸、１０個もしくはそれを超えるアミノ酸、１５個もしくはそれを超えるアミノ酸、２０個もしくはそれを超えるアミノ酸、３０個もしくはそれを超えるアミノ酸、４０個もしくはそれを超えるアミノ酸、または５０個もしくはそれを超えるアミノ酸を含んでいてもよい。挿入は、イミンレダクターゼポリペプチドのアミノもしくはカルボキシ末端または内部部分に対するものであってもよい。
一部の実施形態では、本明細書における操作されたイミンレダクターゼポリペプチドは、配列番号６～８０２の範囲の偶数番号の配列から選択される配列、および必要に応じて１つまたはいくつかの（例えば、最大３、４、５個、または最大１０個の）アミノ酸残基の欠失、挿入および／または置換を含むアミノ酸配列を有していてもよい。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、必要に応じて１～２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、１～１０、１～１５、１～２０、１～２１、１～２２、１～２３、１～２４、１～２５、１～３０、１～３５、１～４０、１～４５、または１～５０個のアミノ酸残基の欠失、挿入および／または置換を有する。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、必要に応じて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３０、３５、４０、４５、または５０個のアミノ酸残基の欠失、挿入および／または置換を有する。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、必要に応じて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個のアミノ酸残基の欠失、挿入および／または置換を有する。一部の実施形態では、置換は保存的なまたは非保存的な置換であってもよい。
上記の実施形態では、操作されたポリペプチドに関する好適な反応条件は、表５．１、６．１、７．１、８．１、９．１、および１０．１、および本明細書における実施例で記載されるとおりに提供される。
一部の実施形態では、本発明のポリペプチドは、操作されたポリペプチドが他のポリペプチド、例えば、例として、限定するものではないが、抗体タグ（例えば、ｍｙｃエピトープ）、精製配列（例えば、金属に結合するためのＨｉｓタグ）、および細胞局在化シグナル（例えば、分泌シグナル）に融合された融合ポリペプチドである。したがって、本明細書において記載される操作されたポリペプチドは、他のポリペプチドに融合させてまたは融合させずに使用してもよい。
本明細書において記載されるポリペプチドは、遺伝学的にコードされたアミノ酸に限定されるものではないことを理解されたい。遺伝学的にコードされたアミノ酸に加えて、本明細書において記載されるポリペプチドは、天然に存在するおよび／または合成のコードされていないアミノ酸で全体的にまたは部分的に構成され得る。本明細書において記載されるポリペプチドを構成し得るある特定の通常遭遇するコードされていないアミノ酸としては、これらに限定されるものではないが、遺伝学的にコードされたアミノ酸のＤ－立体異性体（ｓｔｅｒｅｏｍｅｒ）；２，３－ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）；α－アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）；ε－アミノヘキサン酸（Ａｈａ）；δ－アミノ吉草酸（Ａｖａ）；Ｎ－メチルグリシンまたはサルコシン（ＭｅＧｌｙまたはＳａｒ）；オルニチン（Ｏｒｎ）；シトルリン（Ｃｉｔ）；ｔ－ブチルアラニン（Ｂｕａ）；ｔ－ブチルグリシン（Ｂｕｇ）；Ｎ－メチルイソロイシン（ＭｅＩｌｅ）；フェニルグリシン（Ｐｈｇ）；シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）；ノルロイシン（Ｎｌｅ）；ナフチルアラニン（Ｎａｌ）；２－クロロフェニルアラニン（Ｏｃｆ）；３－クロロフェニルアラニン（Ｍｃｆ）；４－クロロフェニルアラニン（Ｐｃｆ）；２－フルオロフェニルアラニン（Ｏｆｆ）；３－フルオロフェニルアラニン（Ｍｆｆ）；４－フルオロフェニルアラニン（Ｐｆｆ）；２－ブロモフェニルアラニン（Ｏｂｆ）；３－ブロモフェニルアラニン（Ｍｂｆ）；４－ブロモフェニルアラニン（Ｐｂｆ）；２－メチルフェニルアラニン（Ｏｍｆ）；３－メチルフェニルアラニン（Ｍｍｆ）；４－メチルフェニルアラニン（Ｐｍｆ）；２－ニトロフェニルアラニン（Ｏｎｆ）；３－ニトロフェニルアラニン（Ｍｎｆ）；４－ニトロフェニルアラニン（Ｐｎｆ）；２－シアノフェニルアラニン（Ｏｃｆ）；３－シアノフェニルアラニン（Ｍｃｆ）；４－シアノフェニルアラニン（Ｐｃｆ）；２－トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｏｔｆ）；３－トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｍｔｆ）；４－トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｐｔｆ）；４－アミノフェニルアラニン（Ｐａｆ）；４－ヨードフェニルアラニン（Ｐｉｆ）；４－アミノメチルフェニルアラニン（Ｐａｍｆ）；２，４－ジクロロフェニルアラニン（Ｏｐｅｆ）；３，４－ジクロロフェニルアラニン（Ｍｐｃｆ）；２，４－ジフルオロフェニルアラニン（Ｏｐｆｆ）；３，４－ジフルオロフェニルアラニン（Ｍｐｆｆ）；ピリド－２－イルアラニン（２ｐＡｌａ）；ピリド－３－イルアラニン（３ｐＡｌａ）；ピリド－４－イルアラニン（４ｐＡｌａ）；ナフト－１－イルアラニン（１ｎＡｌａ）；ナフト－２－イルアラニン（２ｎＡｌａ）；チアゾリルアラニン（ｔａＡｌａ）；ベンゾチエニルアラニン（ｂＡｌａ）；チエニルアラニン（ｔＡｌａ）；フリルアラニン（ｆＡｌａ）；ホモフェニルアラニン（ｈＰｈｅ）；ホモチロシン（ｈＴｙｒ）；ホモトリプトファン（ｈＴｒｐ）；ペンタフルオロフェニルアラニン（５ｆｆ）；スチリルアラニン（ｓｔｙｒｙｌｋａｌａｎｉｎｅ）（ｓＡｌａ）；アントリルアラニン（ａｕｔｈｒｙｌａｌａｎｉｎｅ）（ａＡｌａ）；３，３－ジフェニルアラニン（Ｄｆａ）；３－アミノ－５－フェニルペンタン酸（Ａｆｐ）；ペニシラミン（Ｐｅｎ）；１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－３－カルボン酸（Ｔｉｃ）；β－２－チエニルアラニン（Ｔｈｉ）；メチオニンスルホキシド（Ｍｓｏ）；Ｎ（ｗ）－ニトロアルギニン（ｎＡｒｇ）；ホモリシン（ｈＬｙｓ）；ホスホノメチルフェニルアラニン（ｐｍＰｈｅ）；ホスホセリン（ｐＳｅｒ）；ホスホスレオニン（ｐＴｈｒ）；ホモアスパラギン酸（ｈＡｓｐ）；ホモグルタミン酸（ｈｏｍｏｇｌｕｔａｎｉｃ ａｃｉｄ）（ｈＧｌｕ）；１－アミノシクロペンタ－（２または３）－エン－４カルボン酸；ピペコリン酸（ＰＡ）、アゼチジン－３－カルボン酸（ＡＣＡ）；１－アミノシクロペンタン－３－カルボン酸；アリルグリシン（ａＧｌｙ）；プロパルギルグリシン（ｐｇＧｌｙ）；ホモアラニン（ｈＡｌａ）；ノルバリン（ｎＶａｌ）；ホモロイシン（ｈＬｅｕ）、ホモバリン（ｈＶａｌ）；ホモイソロイシン（ｈＩｌｅ）；ホモアルギニン（ｈＡｒｇ）；Ｎ－アセチルリシン（ＡｃＬｙｓ）；２，４－ジアミノ酪酸（Ｄｂｕ）；２，３－ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）；Ｎ－メチルバリン（ＭｅＶａｌ）；ホモシステイン（ｈＣｙｓ）；ホモセリン（ｈＳｅｒ）；ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）およびホモプロリン（ｈＰｒｏ）がある。本明細書において記載されるポリペプチドを構成し得る追加のコードされていないアミノ酸は、当業者であれば明らかであろう（例えば、Ｆａｓｍａｎ， ＣＲＣ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， ＦＬ， ｐｐ． ３－７０ ［１９８９］において提供されるさまざまなアミノ酸、およびそこに引用されている文献を参照されたく、これら全ては参照により組み込まれるものとする）。これらのアミノ酸は、Ｌ－立体配置であってもＤ－立体配置であってもよい。
当業者であれば、側鎖保護基を有するアミノ酸または残基はまた、本明細書において記載されるポリペプチドを構成してもよいことを認識するであろう。そのような保護されたアミノ酸の非限定的な例としては（保護基は括弧内に挙げられる）、この場合、芳香族のカテゴリーに属し、これらに限定されるものではないが：Ａｒｇ（ｔｏｓ）、Ｃｙｓ（メチルベンジル）、Ｃｙｓ（ニトロピリジンスルフェニル）、Ｇｌｕ（δ－ベンジルエステル）、Ｇｌｎ（キサンチル）、Ａｓｎ（Ｎ－δ－キサンチル）、Ｈｉｓ（ｂｏｍ）、Ｈｉｓ（ベンジル）、Ｈｉｓ（ｔｏｓ）、Ｌｙｓ（ｆｍｏｃ）、Ｌｙｓ（ｔｏｓ）、Ｓｅｒ（Ｏ－ベンジル）、Ｔｈｒ（Ｏ－ベンジル）およびＴｙｒ（Ｏ－ベンジル）がある。
本明細書において記載されるポリペプチドを構成し得るコンフォメーション的に拘束されたコードされていないアミノ酸としては、これらに限定されるものではないが、Ｎ－メチルアミノ酸（Ｌ－立体配置）；１－アミノシクロペンタ－（２または３）－エン－４－カルボン酸；ピペコリン酸；アゼチジン－３－カルボン酸；ホモプロリン（ｈＰｒｏ）；および１－アミノシクロペンタン－３－カルボン酸がある。
一部の実施形態では、操作されたポリペプチドはさまざまな形態、例えば、単離された調製物、実質的に精製された酵素、酵素をコードする遺伝子（複数可）で形質転換された細胞全体、ならびに／またはそのような細胞の細胞抽出物および／もしくは溶解産物であってもよい。酵素は、以下でさらに議論されるように、凍結乾燥されていても、噴霧乾燥されていても、沈殿されていても、粗製ペーストの形態であってもよい。
一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、固体支持体、例えば、膜、樹脂、固体担体、または他の固相材料上に提供されてもよい。固体支持体は、有機ポリマー、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシ、およびポリアクリルアミド、ならびにこれらの共重合体およびグラフトから構成されていてもよい。固体支持体はまた、無機物、例えば、ガラス、シリカ、制御多孔ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）（ＣＰＧ）、逆相シリカまたは金属、例えば、金または白金であってもよい。固体支持体の構成は、ビーズ、球、粒子、顆粒、ゲル、膜または表面の形態のものであってもよい。表面は、平面、実質的に平面、または非平面であってもよい。固体支持体は、多孔質または非多孔質であってもよく、膨潤または非膨潤特性を有していてもよい。固体支持体は、ウェル、くぼみ、または他のコンテナ、容器、特徴、もしくは位置の形態において構成されていてもよい。
一部の実施形態では、本発明のイミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、それが、配列番号４、１６、５０、３０６、６４８および／または７０８の参照ポリペプチドと比較して、その改善された活性、および／または他の改善された特性を保持するように固体支持体に固定化してもよい。そのような実施形態では、固定化されたポリペプチドは、基質化合物または他の好適な基質の生成物への生体触媒変換を促進することができ、反応が完了した後、容易に保持され（例えば、ポリペプチドが固定化されたビーズを保持することによって）、次いで、その後の反応において再利用またはリサイクルされる。そのような固定化された酵素プロセスは、さらなる効率およびコスト削減を可能にする。したがって、本発明のイミンレダクターゼポリペプチドを使用する方法のいずれも、固体支持体に結合または固定化された同じイミンレダクターゼポリペプチドを使用して行うことができることがさらに企図される。
酵素固定化の方法は当技術分野において周知である。操作されたポリペプチドは、非共有結合または共有結合により結合され得る。酵素を固体支持体（例えば、樹脂、膜、ビーズ、ガラスなど）にコンジュゲートし、固定化するためのさまざまな方法は、当技術分野において周知である（例えば、Ｙｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ４２（５）： ８９５－８９８ ［２００７］；Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ７６（４）： ８４３－８５１ ［２００７］；Ｋｏｓｚｅｌｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｃａｔ． Ｂ： Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ， ６３： ３９－４４ ［２０１０］；Ｔｒｕｐｐｏ ｅｔ ａｌ．， Ｏｒｇ． Ｐｒｏｃ． Ｒｅｓ． Ｄｅｖ．， ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ： ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ｏｐ２００１５７ｃ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ２ｎｄ ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ ［２００８］；Ｍａｔｅｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇ．， １８（３）：６２９－３４ ［２００２］；および”Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ，” Ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｎｉｅｍｅｙｅｒ （ｅｄ．）， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ ［２００４］を参照のこと；これらそれぞれの開示は参照により本明細書に組み込まれるものとする）。本発明の操作されたイミンレダクターゼを固定化するのに有用である固体支持体としては、これらに限定されるものではないが、エポキシド官能基を有するポリメタクリレート、アミノエポキシド官能基を有するポリメタクリレート、スチレン／ＤＶＢコポリマーまたはオクタデシル官能基を有するポリメタクリレートを含むビーズまたは樹脂がある。本発明の操作されたイミンレダクターゼポリペプチドを固定化するのに有用である例示的な固体支持体としては、これらに限定されるものではないが、キトサンビーズ、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ Ｃ、ならびに以下の異なるタイプのＳＥＰＡＢＥＡＤ：ＥＣ－ＥＰ、ＥＣ－ＨＦＡ／Ｓ、ＥＸＡ２５２、ＥＸＥ１１９およびＥＸＥ１２０を含むＳＥＰＡＢＥＡＤ（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ）がある。
一部の実施形態では、本明細書において記載されるポリペプチドは、キットの形態で提供される。キットにおける酵素は、個々にまたは複数の酵素として存在していてもよい。キットは、酵素反応を行うための試薬、酵素活性を評価するための基質、および生成物を検出するための試薬をさらに含んでいてもよい。キットは、試薬ディスペンサーおよびキットを使用するための指示も含んでいてもよい。
一部の実施形態では、本発明のキットは、異なるアドレス指定可能な（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ）位置において複数の異なるイミンレダクターゼポリペプチドを含むアレイを含み、異なるポリペプチドは、少なくとも１つの異なる改善された酵素特性をそれぞれ有する参照配列の異なるバリアントである。一部の実施形態では、固体支持体上に固定化された複数のポリペプチドは、試薬をロボット送達するために、または検出方法および／もしくは機器によって、アドレス指定可能なさまざまな位置でアレイ上に構成される。アレイは、ポリペプチドによる変換に関してさまざまな基質化合物を試験するために使用することができる。複数の操作されたポリペプチドを含むそのようなアレイおよびその使用方法は、当技術分野において公知である（例えば、ＷＯ２００９／００８９０８Ａ２を参照のこと）。
操作されたイミンレダクターゼをコードするポリヌクレオチド、発現ベクター、および宿主細胞
別の態様では、本発明は、本明細書に記載される操作されたイミンレダクターゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現することが可能な組換えポリヌクレオチドを創出するよう遺伝子発現を制御する、１つまたは複数の異種制御配列に、動作可能に連結し得る。操作されたイミンレダクターゼをコードする異種ポリヌクレオチドを含有する発現構築物は、適切な宿主細胞に導入されて、対応するイミンレダクターゼポリペプチドを発現する。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載される操作されたイミンレダクターゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現することが可能な組換えポリヌクレオチドを創出するよう遺伝子発現を制御する、１つまたは複数の異種制御配列に、動作可能に連結し得る。操作されたイミンレダクターゼをコードする異種ポリヌクレオチドを含有する発現構築物は、適切な宿主細胞に導入されて、対応するイミンレダクターゼポリペプチドを発現する。
当業者には明らかであるように、タンパク質配列の利用可能性および様々なアミノ酸に対応するコドンの知識は、対象ポリペプチドをコードすることが可能なポリヌクレオチドの全てについての記載を提供する。同じアミノ酸が代替または同義コドンによりコードされる、遺伝子コードの縮重は、極めて多数の核酸を作製可能にし、その全ては、改善されたイミンレダクターゼ酵素をコードする。このように、特定のアミノ酸配列の知識を有することで、当業者は、タンパク質のアミノ酸配列を変化させない手法で１つまたは複数のコドンの配列を単に修飾することにより、任意の数の種々の核酸を作製することができる。この点に関し、本発明は特に、可能性のあるコドンの選択に基づいて組合せを選択することにより本明細書に記載されるポリペプチドをコードする、作製可能な、それぞれおよび全ての可能性のあるポリヌクレオチドのバリエーションを企図し、そのような全てのバリエーションは、表５．１、６．１、７．１、８．１、９．１、および１０．１に提示されかつ配列番号６～８０２の範囲の偶数番号の配列として本明細書に参照により組み込まれる配列表に開示されるアミノ酸配列も含め、本明細書に記載される任意のポリペプチドに関して具体的に開示されると見なされる。
様々な実施形態では、コドンは、タンパク質が内部で生成されている宿主細胞に適合するように、好ましくは選択される。例えば、細菌で使用される好ましいコドンは、細菌内に遺伝子を発現させるのに使用され；酵母で使用される好ましいコドンは、酵母内での発現のために使用され；哺乳動物で使用される好ましいコドンは、哺乳動物細胞内で発現させるために使用される。一部の実施形態では、イミンレダクターゼのコドン使用を最適化するように全てのコドンが置き換えられる必要はない。なぜなら、天然配列が好ましいコドンを含むからであり、かつ好ましいコドンの使用が全てのアミノ酸残基に必要とされるわけではないことがあるからである。その結果、イミンレダクターゼ酵素をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドは、全長コード領域のコドン位置の約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％超で、好ましいコドンを含有し得る。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４、１６、５０、３０６、６４８、および／または７０８により表されるように、天然に存在するイミンレダクターゼポリペプチドアミノ酸配列をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号６～８０２の範囲の偶数番号の配列をコードするコドン最適化核酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い同一性を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５～８０１の範囲の奇数番号の配列のコドン最適化核酸配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い同一性を含む核酸配列を有する。一部の実施形態では、配列番号５～８０１の範囲の奇数番号の配列のコドン最適化配列は、コードされた野生型イミンレダクターゼの発現を高め、基質を生成物に変換することが可能な酵素の調製物を提供する。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、高度にストリンジェントな条件下、配列番号５～８０１の奇数番号の配列から選択される参照配列またはその相補鎖（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）に、ハイブリダイズすることが可能であり、イミンレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
一部の実施形態では上述のように、ポリヌクレオチドは、配列番号４、１６、５０、３０６、６４８、および／または７０８と比較して改善された特徴を持つイミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードし、これらのポリペプチドは、配列番号４、１６、５０、３０６、６４８、および／または７０８から選択される参照配列に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い同一性と、配列番号４、１６、５０、３０６、６４８、および／または７０８と比較して１つまたは複数の残基の差異とを有するアミノ酸配列を含み、配列は、配列番号６～８０２の範囲の偶数番号の配列から選択される。一部の実施形態では、参照アミノ酸配列が、配列番号６～８０２の範囲の偶数番号の配列から選択される。一部の実施形態では、参照アミノ酸配列が配列番号４であり、一方、一部の他の実施形態では、参照配列が配列番号１６であり、一方、一部の他の実施形態では、参照配列が配列番号５０であり、一方、一部の他の実施形態では、参照配列が配列番号３０６であり、一方、一部の他の実施形態では、参照配列が配列番号６４８であり、さらに一部の他の実施形態では、参照配列が配列番号７０８である。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４、１６、５０、３０６、６４８、および／または７０８と比較して改善された特徴で、生成物に、基質を変換することが可能なイミンレダクターゼポリペプチドをコードし、このポリペプチドは、参照配列の配列番号４、１６、５０、３０６、６４８、および／または７０８に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、操作されたイミンレダクターゼをコードするポリヌクレオチドは、配列番号５～８０１の範囲の奇数番号の配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、高度にストリンジェントな条件下、配列番号５～８０１の範囲の奇数番号の配列から選択される参照ポリヌクレオチド配列またはその相補鎖にハイブリダイズすることが可能であり、本明細書に記載される改善された特徴の１つまたは複数を持つイミンレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドは、１４５、１４６、１５３、１６０、２２２、２２３、２２６、および２６１から選択される残基位置で、配列番号４と比較して１つまたは複数の残基の差異を含むアミノ酸配列を有する、配列番号４に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列を含むイミンレダクターゼポリペプチドをコードする。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、高度にストリンジェントな条件下、配列番号５～８０１の範囲の奇数番号の配列から選択される参照ポリヌクレオチド配列またはその相補鎖にハイブリダイズすることが可能であり、本明細書に記載される改善された特徴の１つまたは複数を持つイミンレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドは、２９／９４／１８４／２２３／２３２／２８８／２９３、２９／９４／１８４／２３２／２８７／２８８／２９３／３１１、２９／９４／１８４／２３２／２８７／２８８／３１１、２９／９４／１８４／２３２／２８７／２９３／３３２、２９／９４／１８４／２３２／２８８／２９３／３１１／３２４／３５３、２９／９４／１８４／２３２／２８８／３１１／３２４／３３２、２９／９４／１８４／２３２／２９３、２９／９４／１８４／２３２／３１１、２９／９４／１８４／２８７／２９３、２９／９４／１８４／２８７／２９３／３１１／３５３、２９／９４／１８４／２８７／３１１、２９／９４／１８４／２８８／２９３／３２４、２９／９４／１８４／２８８／２９３／３３２／３５３、２９／９４／１８４／２８８／２９８／３３２、２９／９４／１８４／２８８／３５３、２９／９４／１８４／２９３／３１１、２９／９４／１８４／３２４、２９／９４／２２３／２３２／２８７、２９／９４／２２３／２３２／２９３／３１１／３２４、２９／９４／２２３／２８８／２９３、２９／９４／２３２／２８７／２８８／３１１、２９／９４／２３２／２８８／２９３、２９／９４／２８７／２８８／２９３、２９／９４／２８７／２８８／２９３／３５３、２９／９４／２８７／３１１、２９／９４／２９３／３１１／３２４、２９／９４／２９３／３３２／３５３、２９／９４／３１１、２９／９４／３２４／３５３、２９／１８４、２９／１８４／２２３／２８８／２９３／３２４、２９／１８４／２３２／２８８、２９／１８４／２８７、２９／１８４／２８７／２８８／２９３、２９／１８４／２８７／２８８／２９３／３１１、２９／１８４／２８７／３１１／３３２、２９／１８４／２８８／２９３、２９／１８４／２８８／２９３／３１１、２９／１８４／２９３、２９／１８４／２９３／３１１、２９／１８４／２９３／３２４、２９／１８４／３５３、２９／２２３／２８７／２８８／２９３／３５３、２９／２３２／２８７／２８８／２９３／３３２／３５３、２９／２８７／２８８／２９３、２９／２８７／２８８／２９３／３２４／３５３、２９／２８８／２９３、２９／３１１、２９／３１１／３３２、２９／３５３、７２／９４／１８４／２８８／３１１、８６、９４／９６／２２３／２８７／２８８／２９３／３１１／３２４／３３２、９４／９９／１８４／２９３／３１１／３３２／３５３、９４／１８４／２２３、９４／１８４／２２３／２３２／２８７／３１１、９４／１８４／２２３／２８８／２９３、９４／１８４／２２３／２９３、９４／１８４／２３２／２８７／２８８、９４／１８４／２３２／２８７／２８８／３２４／３３２、９４／１８４／２３２／２８７／２９３、９４／１８４／２３２／２８７／２９３／３３２、９４／１８４／２８７／２８８／２９３、９４／１８４／２８７／２８８／３１１、９４／１８４／２８７／２９３／３１１／３２４／３５３、９４／１８４／２８７／３１１、９４／１８４／２８７／３５３、９４／１８４／２８８／２９３、９４／１８４／２８８／２９３／３１１、９４／１８４／２８８／２９３／３１１／３３２、９４／１８４／２９３、９４／１８４／２９３／３１１、９４／１８４／２９３／３３２／３５３、９４／２２３／２３２／３１１／３５３／３５５／３５６／３５７／３５８／３５９、９４／２２３／２８７／２８８／２９３、９４／２２３／２８８／２９３／３１１、９４／２３２／２８７／２８８／２９３／３５３、９４／２３２／２８８／２９３／３５３、９４／２３２／２９３、９４／２３２／２９３／３２４／３３２、９４／２３２／３１１、９４／２８７／２８８／２９３、９４／２８７／２８８／３１１／３２４、９４／２８８／２９３、９４／２８８／２９３／３２４、９４／２９３／３２４、９４／３１１／３２４、１５３、１８４／２２３、１８４／２２３／２８７／２８８／３５３、１８４／２３２／２８７／２８８／２９３／３１１、１８４／２３２／２８７／２８８／３２４／３５３、１８４／２３２／２８７／２９３／３３２、１８４／２８７／２８８、１８４／２８７／２８８／２９３、１８４／２８７／２８８／２９３／３２４／３５３、１８４／２８７／２９３、１８４／２８７／２９３／３１１、１８４／２８８／２９３／３１１／３２４、１８４／３３２／３５３、２０５、２２３／２３２／２８７／２８８／３３２／３５３、２２３／２８７／２８８、２２３／２８７／２８８／２９３／３１１、２２３／２８７／３１１／３５３、２２３／２８８／２９３、２３２／２８７／２８８／２９３、２３２／２８７／２８８／２９３／３１１、２３２／２８７／２８８／２９３／３２１、２３２／２８７／３１１、２３２／２８８／２９３、２３２／２８８／２９３／３３２、２３４／２８７／２８８／２９３／３１１、２８７／２８８／２９３、２８７／２８８／３１１／３２４、２８７／２９３、２８７／３１１、２８７／３１１／３３２、２８７／３２４、２８８／２９３、２８８／２９３／３１１／３２４／３５３、２８８／２９３／３２４、２９３／３１１、および３１１／３３２から選択される残基位置で配列番号１６と比較して１つまたは複数の残基の差異を含むアミノ酸配列を有する、配列番号１６に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列を含むイミンレダクターゼポリペプチドをコードする。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、高度にストリンジェントな条件下、配列番号５～８０１の範囲の奇数番号の配列から選択される参照ポリヌクレオチド配列またはその相補鎖にハイブリダイズすることが可能であり、本明細書に記載される改善された特徴の１つまたは複数を持つイミンレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドは、２９／５７／９４／１５３／１８４／２０５／２６１／２６５／２８７、２９／５７／９４／１５３／２０５／２６５、２９／５７／９４／１８４／２０５／２７７／３５３、２９／５７／９４／２０５／２５９／２６１／２６５、２９／５７／９４／２０５／２６１／３５３、２９／５７／１５３／１８４／２０５／２５９／２６１／２６５／２７７、２９／５７／１５３／１８４／２０５／３５３、２９／５７／１５３／２０５／２６１／２６５、２９／５７／１５３／２０５／２６１／２６５／２７７、２９／５７／１５３／２０５／２６５／２７７、２９／５７／１５３／２０５／２７７／３５３、２９／５７／１８４／２０５／２５９／２６１／２６５／２７７／２８７／３５７、２９／５７／１８４／２０５／２５９／２６１／２６５／２８７、２９／５７／２０５／２５９／２６１／２６５、２９／５７／２０５／２５９／２６１／２６５／２８７、２９／５７／２０５／２６１／２６５／３５３、２９／９４／１５３／１８４／２０５、２９／９４／１５３／２０５／２５９／２６１／２６５、２９／９４／１５３／２０５／２５９／２６１／２８７、２９／９４／１５３／２０５／２５９／２６１／２８７／３５３、２９／９４／１８４／２０５／２５９／２６１、２９／９４／１８４／２０５／２６１、２９／９４／２０５、２９／９４／２０５／２５９／２６１／２８７、２９／９４／２０５／２６１、２９／９４／２６１／２６５／２８７／３５３、２９／１５３／１８４／２０５、２９／１５３／２０５、２９／１５３／２０５／２５９／２６１／２６５／２７７／２８７、２９／１５３／２６１／２６５／２８７／３５３、２９／１８４／２０５、２９／１８４／２０５／２５９／２６１／２７７、２９／１８４／２０５／３５３、２９／１８４／２６１／２６５、２９／１８４／２６５、２９／２０５、２９／２０５／２５９／２６１、２９／２０５／２５９／２６１／２６５／２８７、２９／２０５／２５９／２６１／２８７、２９／２０５／２６１、２９／２０５／２６１／２６５、２９／２０５／２６１／２６５／３５３、２９／２０５／２６１／３５３、２９／２０５／２７７、２９／２０５／２８７、２９／２０５／２８７／３５３、２９／２５９／２６１／２６５、２９／２６１／３５３、５７／９４／１５３／１８４／２０５／２５９／２６１、５７／９４／１５３／２０５／２６１／２６５、５７／９４／１５３／２５９／２６１／２６５、５７／９４／１５３／２６１／２６５、５７／９４／１８４／２０５／２６１／２６５／２８７、５７／９４／１８４／２６１／２６５／２８７、５７／９４／２０５／２５９、５７／９４／２０５／２５９／２６１／２６５／２７７／２８７、５７／９４／２０５／２６１／２６５、５７／９４／２０５／２７７、５７／１５３／２０５／２５９／２６１／２６５／２８７、５７／１５３／２０５／２５９／２６５／２７７、５７／１５３／２０５／２６１、５７／１５３／２０５／２６１／２６５、５７／１５３／２０５／２６５、５７／１５３／２６１／２６５、５７／１５３／２６１／２６５／２８７／３５３、５７／２０５、５７／２０５／２５９／２６１、５７／２０５／２５９／２６１／２６５／２７７／２８７／３５３、５７／２０５／２５９／２６１／２８７／３５３、５７／２０５／２５９／２６５、５７／２０５／２６１、５７／２０５／２６１／２６５／２７７／２８７／３５３、５７／２０５／２６１／２７７、５７／２０５／２６１／２７７／３５３、５７／２６１／２６５／３５３、９４／１２６／１８４／２０５／２５９／２６１／２６５、９４／１５３／１８４／２０５、９４／１５３／１８４／２５９／２６１／２６５、９４／１５３／２０５／２５９／２６１／２６５／３５３、９４／１５３／２０５／２８７、９４／１５３／２０５／２８７／３５３、９４／１５３／２０５／３５３、９４／１８４／２０５／２５９／２６１、９４／１８４／２０５／２５９／２６１／２６５／２８７、９４／１８４／２０５／２５９／２６１／３５３、９４／１８４／２０５／２６１／２６５／２８７／３５３、９４／１８４／３５３、９４／２０５、９４／２０５／２５９／２６１／２６５、９４／２０５／２５９／２６１／２６５／２７７／２８７、９４／２０５／２５９／２６１／２６５／３５３、９４／２０５／２５９／２６１／２８７／３５３、９４／２０５／２６１／２６５／２７７、９４／２０５／２６１／２６５／３５３、９４／２０５／２６１／３５３、９４／２０５／２７７、９４／２５９／２６１／２６５、１５３／１８４／２０５／２６１／２７７／２８７、１５３／１８４／２６１／２６５／２８７、１５３／２０５、１５３／２０５／２６１、１５３／２０５／２６１／２６５／２８７、１５３／２５９／２６１／２６５、１５３／２５９／２６５／２８７、１５３／２６１／２６５、１５３／２６１／２６５／２８７／３５３、１５３／２６５、１５３／２６５／２７７／２８７／３５３、１８４／２０５、１８４／２０５／２５９／２６１／２８７、１８４／２０５／２６１、１８４／２０５／２６１／２６５、１８４／２０５／２６１／２８７、１８４／２０５／２７７、１８４／２０５／２８７／３５３、１８４／２６１／２６５／２８７、２０２、２０５、２０５／２５９／２６１、２０５／２５９／２６１／２６５、２０５／２５９／２６１／２６５／２７７／２８７／３５３、２０５／２５９／２６１／２７７／２８７、２０５／２５９／２６５、２０５／２６１、２０５／２６１／２６５、２０５／２６１／２６５／２７４、２０５／２６１／２６５／２８７、２０５／２６１／２６５／２８７／３５３、２０５／２６１／２７７、２０５／２６１／３５３、２０５／２７７／２８７、２０５／２８７、２２３、２２５、２５６、２５９／２６１／２６５、２６１／２６５／２８７、２６５／２８７、２８３、および２９４から選択される残基位置で、配列番号５０と比較して１つまたは複数の残基の差異を含むアミノ酸配列を有する、配列番号５０に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列を含むイミンレダクターゼポリペプチドをコードする。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、高度にストリンジェントな条件下、配列番号５～８０１の範囲の奇数番号の配列から選択される参照ポリヌクレオチド配列またはその相補鎖にハイブリダイズすることが可能であり、本明細書に記載される改善された特徴の１つまたは複数を持つイミンレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドは、１９７／１９８／２０１／２５９、１９８／２０１／２５９／２８０、２０２／２０５／２２１／２２３／２２５／２６１、２０２／２０５／２２１／２２３／２６１／２９４、２０２／２２１／２２２／２２５／２５６／２６１／２９４、２０２／２２１／２２３／２２５／２８３／２９４、２０５／２２１／２２２、２０５／２２１／２２３／２２５／２５６／２６１／２８３、２１９、２２１／２２２／２２３／２２５、２２１／２２３、２２１／２２３／２２５、２２１／２２３／２２５／２５６／２６１、２２１／２２３／２２５／２６１、２２１／２２３／２２５／２９４、２２１／２２５、２２１／２２５／２５６、２２１／２２５／２５６／２６１、２２１／２２５／２５６／２６１／２８３／２９４、２２３／２２５／２５６／２６１、２２５／２５６／２６１、２８０、および２８０／３０６から選択される残基位置で、配列番号３０６と比較して１つまたは複数の残基の差異を含むアミノ酸配列を有する、配列番号３０６に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列を含む、イミンレダクターゼポリペプチドをコードする。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、高度にストリンジェントな条件下、配列番号５～８０１の範囲の奇数番号の配列から選択される参照ポリヌクレオチド配列またはその相補鎖にハイブリダイズすることが可能であり、本明細書に記載される改善された特徴の１つまたは複数を持つイミンレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドは、１７／１９８／２５９／２８０、１９７、１９７／１９８、１９７／１９８／２２３／２５９、１９７／２２３／２７７／２８０、１９７／２５９、１９７／２７７、１９８、１９８／２２３、１９８／２２３／２５９／２７７／２８０、１９８／２５９、１９８／２５９／２７７、１９８／２５９／２７７／２８０、１９８／２７７／２８０、２２３／２５９、２２３／２５９／２８０、２５８、２５９、２５９／２６８／２７７／２８０、２５９／２７７、２５９／２８０、２６３、２７７、および２８０から選択される残基位置で、配列番号６４８と比較して１つまたは複数の残基の差異を含むアミノ酸配列を有する、配列番号６４８に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列を含む、イミンレダクターゼポリペプチドをコードする。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、高度にストリンジェントな条件下、配列番号５～８０１の範囲の奇数番号の配列から選択される参照ポリヌクレオチド配列またはその相補鎖にハイブリダイズすることが可能であり、本明細書に記載される改善された特徴の１つまたは複数を持つイミンレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドは、１４１、１５４、１９７、１９７／１９８、および２７８から選択される残基位置で、配列番号７０８と比較して１つまたは複数の残基の差異を含むアミノ酸配列を有する、配列番号７０８に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列を含む、イミンレダクターゼポリペプチドをコードする。
一部の実施形態では、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドは、配列番号４、１６、５０、３０６、６４８、および／または７０８に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列を含む、改善された特徴を持つイミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるポリペプチドをコードするが、操作されたイミンレダクターゼをコードする参照ポリヌクレオチドに対してヌクレオチドレベルで少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、またはそれよりも高い配列同一性を有する。一部の実施形態では、参照ポリヌクレオチド配列は、配列番号５～８０１から選択される。
一部の実施形態では、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドは、配列番号４に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列を含む、改善された特徴を持つイミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるポリペプチドをコードするが、操作されたイミンレダクターゼをコードする参照ポリヌクレオチドに対してヌクレオチドレベルで少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、またはそれよりも高い配列同一性を有する。一部の実施形態では、参照ポリヌクレオチド配列は、配列番号５～３５から選択される。
一部の実施形態では、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドは、配列番号１６に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列を含む、改善された特徴を持つイミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるポリペプチドをコードするが、操作されたイミンレダクターゼをコードする参照ポリヌクレオチドに対してヌクレオチドレベルで少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、またはそれよりも高い配列同一性を有する。一部の実施形態では、参照ポリヌクレオチド配列は、配列番号３７～３０１から選択される。
一部の実施形態では、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドは、配列番号５０に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列を含む、改善された特徴を持つイミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるポリペプチドをコードするが、操作されたイミンレダクターゼをコードする参照ポリヌクレオチドに対してヌクレオチドレベルで少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、またはそれよりも高い配列同一性を有する。一部の実施形態では、参照ポリヌクレオチド配列は、配列番号３０１～６４５から選択される。
一部の実施形態では、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドは、配列番号３０６に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列を含む、改善された特徴を持つイミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるポリペプチドをコードするが、操作されたイミンレダクターゼをコードする参照ポリヌクレオチドに対してヌクレオチドレベルで少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、またはそれよりも高い配列同一性を有する。一部の実施形態では、参照ポリヌクレオチド配列は、配列番号６４７～７０３から選択される。
一部の実施形態では、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドは、配列番号６４８に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列を含む、改善された特徴を持つイミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるポリペプチドをコードするが、操作されたイミンレダクターゼをコードする参照ポリヌクレオチドに対してヌクレオチドレベルで少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、またはそれよりも高い配列同一性を有する。一部の実施形態では、参照ポリヌクレオチド配列は、配列番号７０５～７８５から選択される。
一部の実施形態では、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドは、配列番号７０８に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列を含む、改善された特徴を持つイミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるポリペプチドをコードするが、操作されたイミンレダクターゼをコードする参照ポリヌクレオチドに対してヌクレオチドレベルで少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、またはそれよりも高い配列同一性を有する。一部の実施形態では、参照ポリヌクレオチド配列は、配列番号７８７～８０１から選択される。
一部の実施形態では、本明細書で提供される操作されたイミンレダクターゼポリペプチドのいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチドは、ポリペプチドの発現をもたらすように様々な手法で操作される。一部の実施形態では、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは発現ベクターとして提供され、１つまたは複数の制御配列が、ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を調節するよう存在する。ベクター内へのその挿入前の、単離されたポリヌクレオチドの操作は、発現ベクターに応じて望ましくまたは必要と考えられる。組換えＤＮＡ法を利用してポリヌクレオチドおよび核酸配列を修飾するための技法は、当技術分野で周知である。
一部の実施形態では、制御配列は、数ある配列の中でもプロモーター、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、シグナルペプチド配列、および転写ターミネーターを含む。当技術分野で公知のように、適切なプロモーターは、使用される宿主細胞に基づいて選択することができる。細菌宿主細胞の場合、本出願の核酸構築物の転写を指示するのに適したプロモーターには、限定するものではないが、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃオペロン、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒアガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓアルファ－アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓマルトジェニックアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓアルファ－アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子、および原核生物ベータ－ラクタマーゼ遺伝子（例えば、Ｖｉｌｌａ－Ｋａｍａｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７５： ３７２７－３７３１ ［１９７８］参照）、ならびにｔａｃプロモーター（例えば、ＤｅＢｏｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０： ２１－２５ ［１９８３］参照）から得られるプロモーターが含まれる。糸状菌宿主細胞のための例示的なプロモーターには、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ中性アルファ－アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ酸安定アルファ－アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉリパーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅアルカリプロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアセトアミダーゼ、およびＦｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼ（例えば、ＷＯ９６／００７８７号）に関する遺伝子から得られるプロモーター、ならびにＮＡ２－ｔｐｉプロモーター（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ中性アルファ－アミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼに関する遺伝子からのプロモーターのハイブリッド）、およびその変異体、短縮、およびハイブリッドプロモーターが含まれる。例示的な酵母細胞プロモーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ－１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ３－ホスホグリセリン酸キナーゼに関する遺伝子に由来し得る。酵母宿主細胞のためのその他の有用なプロモーターが、当技術分野で公知である（例えば、Ｒｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．， Ｙｅａｓｔ ８：４２３－４８８ ［１９９２］参照）。
一部の実施形態では、制御配列は、適切な転写ターミネーター配列、即ち転写を終わらせるため宿主細胞により認識される配列である。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端に作動可能に連結される。選択された宿主細胞内で機能する任意のターミネーターは、本発明における用途を見出す。例えば、糸状菌宿主細胞のための例示的な転写ターミネーターは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒアルファ－グルコシダーゼ、およびＦｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼに関する遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞のための例示的なターミネーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅシトクロムＣ（ＣＹＣ１）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼに関する遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞のためのその他の有用なターミネーターは、当技術分野で公知である（例えば、Ｒｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．、上掲参照）。
一部の実施形態では、制御配列は、適切なリーダー配列、即ち宿主細胞による翻訳に重要なｍＲＮＡの非翻訳領域である。リーダー配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端に作動可能に連結される。選択された宿主細胞内で機能する任意のリーダー配列が使用され得る。糸状菌宿主細胞のための例示的なリーダーは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓトリオースリン酸イソメラーゼに関する遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための適切なリーダーには、限定するものではないが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ－１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ３－ホスホグリセリン酸キナーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ－因子、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）に関する遺伝子から得られるものが含まれる。制御配列は、ポリアデニル化配列であってもよくこれは核酸配列の３’末端に作動可能に連結された配列でありかつ転写されたときに、ポリアデノシン残基を転写ｍＲＮＡに付加するシグナルとして宿主細胞により認識されるものである。選択された宿主細胞内で機能する任意のポリアデニル化配列が、本発明で使用されてもよい。糸状菌宿主細胞のための例示的なポリアデニル化配列には、限定するものではないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒアルファ－グルコシダーゼに関する遺伝子からのものが含まれる。酵母宿主細胞のための有用なポリアデニル化配列も、当技術分野で公知である（例えば、Ｇｕｏ ａｎｄ Ｓｈｅｒｍａｎ， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏ．， １５：５９８３－５９９０ ［１９９５］参照）。
一部の実施形態では、制御配列は、ポリペプチドのアミノ末端に連結されたアミノ酸配列をコードしかつコードされたポリペプチドを細胞の分泌経路へと導く、シグナルペプチドコード領域である。核酸配列のコード配列の５’末端は、元々、分泌されたポリペプチドをコードするコード領域のセグメントに、翻訳リーディングフレーム内で天然に連結された、シグナルペプチドコード領域を含有し得る。あるいは、コード配列の５’末端は、コード配列に対して外来のシグナルペプチドコード領域を含有し得る。発現したポリペプチドを、選択された宿主細胞の分泌経路に導く任意のシグナルペプチドコード領域は、本明細書で提供される操作されたイミンレダクターゼポリペプチドの発現に、用途を見出す。細菌宿主細胞に有効なシグナルペプチドコード領域には、限定するものではないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ＮＣｌＢ １１８３７マルトジェニックアミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓアルファ－アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓサブチリシン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓベータ－ラクタマーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）、およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐｒｓＡに関する遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域が含まれる。さらなるシグナルペプチドは、当技術分野で公知である（例えば、Ｓｉｍｏｎｅｎ ａｎｄ Ｐａｌｖａ， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ．， ５７：１０９－１３７ ［１９９３］参照）。糸状菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード領域には、限定するものではないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ中性アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓセルラーゼ、およびＨｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａリパーゼに関する遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域が含まれる。酵母宿主細胞のための有用なシグナルペプチドには、限定するものではないが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ－因子およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼに関する遺伝子からのものが含まれる。
一部の実施形態では、制御配列は、ポリペプチドのアミノ末端に配置されたアミノ酸配列をコードする、プロペプチドコード領域である。得られるポリペプチドは、「酵素前駆体」、「プロポリペプチド」、または「チモーゲン」と、場合によっては呼ばれる）。プロポリペプチドは、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒または自己触媒切断によって、成熟活性ポリペプチドに変換することができる。プロペプチドコード領域には、限定するものではないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓアルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ－因子、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、およびＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａラクターゼ（例えば、ＷＯ９５／３３８３６号参照）に関する遺伝子が含まれる。シグナルペプチドおよびプロペプチド領域の両方がポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、プロペプチド領域は、ポリペプチドのアミノ末端の次に配置され、シグナルペプチド領域は、プロペプチド領域のアミノ末端の次に配置される。
一部の実施形態では、調節配列も利用される。これらの配列は、宿主細胞の成長に対してポリペプチドの発現の調節を容易にする。調節系の例は、調節化合物の存在を含む、化学的または物理的刺激に応答して遺伝子の発現をオンまたはオフにさせるものである。原核生物宿主細胞では、適切な調節配列に、限定するものではないが、ｌａｃ、ｔａｃ、およびｔｒｐオペレーター系が含まれる。酵母宿主細胞では、適切な調節系に、限定するものではないが、ＡＤＨ２系またはＧＡＬ１系が含まれる。糸状菌では、適切な調節配列に、限定するものではないが、ＴＡＫＡアルファ－アミラーゼプロモーター、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼプロモーター、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅグルコアミラーゼプロモーターが含まれる。
本発明は、操作されたイミンレダクターゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、プロモーターおよびターミネーター、複製起点などの１つまたは複数の発現調節領域とを含む組換え発現ベクターも、それらが導入される宿主のタイプに応じて提供する。一部の実施形態では、上述の様々な核酸および制御配列が一緒に組み合わされて、１つまたは複数の好都合な制限部位を含む組換え発現ベクターを生成し、そのような部位でバリアントイミンレダクターゼポリペプチドをコードする核酸配列の挿入または置換が可能になる。あるいは、本発明のポリヌクレオチド配列（複数可）は、ポリヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列を含む核酸構築物を、発現に適切なベクターに挿入することによって、発現する。発現ベクターの創出では、コード配列を、コード配列が発現に適切な制御配列に作動可能に連結するように、ベクター内に位置させる。
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ手順に都合良く供することができかつバリアントイミンレダクターゼポリヌクレオチド配列の発現をもたらすことができる、任意のベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であってもよい。ベクターの選択は、内部にベクターが導入される宿主細胞に対するベクターの適合性に、典型的には依存する。ベクターは、直鎖状または閉環プラスミドであってもよい。
一部の実施形態では、発現ベクターは、自律的に複製するベクターである（即ち、染色体外実体として存在するベクターであり、その複製は、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、または人工染色体など、染色体複製から独立している）。ベクターは、自己複製を確実にするために、任意の手段を含有していてもよい。一部の代替の実施形態では、ベクターは、宿主細胞に導入されたときにゲノムと一体化されかつそれが一体化された染色体（複数可）と一緒に複製されるものであってもよい。さらに、単一ベクターもしくはプラスミドまたは２つもしくはそれよりも多いベクターもしくはプラスミドであって、宿主細胞のゲノム内に導入される総ＤＮＡまたはトランスポソンを一緒に含有するものが、使用され得る。
一部の実施形態では、発現ベクターは好ましくは、形質転換された細胞の容易な選択を可能にする、１つまたは複数の選択可能なマーカーを含有する。「選択可能なマーカー」は、その生成物が、殺生物剤またはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求性に対する原栄養性、および同様のものを提供する遺伝子である。細菌の選択可能なマーカーの例には、限定するものではないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓもしくはＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓからのｄａｌ遺伝子、またはアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、もしくはテトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性を与えるマーカーが含まれる。酵母宿主細胞に適切なマーカーには、限定するものではないが、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１、およびＵＲＡ３が含まれる。糸状菌宿主細胞で使用される選択可能なマーカーには、限定するものではないが、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン－５’－リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ならびにこれらの等価物が含まれる。別の態様では、本発明は、本発明の少なくとも１種の操作されたイミンレダクターゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供し、このポリヌクレオチドは、宿主細胞内の操作されたイミンレダクターゼ酵素（複数可）の発現のために１つまたは複数の制御配列に動作可能に連結される。本発明の発現ベクターによりコードされるポリペプチドを発現するのに使用される宿主細胞は、当技術分野で周知であり、限定するものではないが、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞などの細菌細胞；酵母細胞などの真菌細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ［ＡＴＣＣ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．２０１１７８］）；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、２９３、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞などの動物細胞；および植物細胞が含まれる。例示的な宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株（例えば、Ｗ３１１０（ΔｆｈｕＡ）およびＢＬ２１）である。
したがって、別の態様では、本発明は、操作されたイミンレダクターゼポリペプチドを生成するための方法であって、ポリペプチドの発現に適した条件下、操作されたイミンレダクターゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現することが可能な宿主細胞を培養することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、方法はさらに、本明細書に記載されるように、イミンレダクターゼポリペプチドを単離および／または精製するステップを含む。
上述の宿主細胞に適した培地および成長条件は、当技術分野で周知である。イミンレダクターゼポリペプチドの発現のためにポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の様々な方法によって細胞内に導入されてもよい。技法には、とりわけ電気穿孔、微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、リポソーム媒介トランスフェクション、塩化カルシウムトランスフェクション、およびプロトプラスト融合が含まれる。
本明細書に開示される特徴を持つ操作されたイミンレダクターゼは、天然に存在するまたは操作されたイミンレダクターゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、当技術分野で公知のおよび本明細書に記載されるような変異誘発および／または定向進化法に供することによって、得ることができる。例示的な定向進化技法は、変異誘発および／またはＤＮＡシャッフリングである（例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：１０７４７－１０７５１ ［１９９４］；ＷＯ９５／２２６２５号；ＷＯ９７／００７８号；ＷＯ９７／３５９６６号；ＷＯ９８／２７２３０号；ＷＯ００／４２６５１号；ＷＯ０１／７５７６７号、および米国特許第６，５３７，７４６号参照）。使用することができるその他の定向進化手順には、とりわけ、スタッガード伸長プロセス（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ）（ＳｔＥＰ）、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換え（例えば、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １６：２５８－２６１ ［１９９８］参照）、変異誘発ＰＣＲ（例えば、Ｃａｌｄｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．， ３：Ｓ１３６－Ｓ１４０ ［１９９４］参照）、およびカセット変異誘発（例えば、Ｂｌａｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：３５２５－３５２９ ［１９９６］参照）が含まれる。
例えば、変異誘発および定向進化法は、発現、スクリーニング、およびアッセイすることができるバリアントライブラリーを発生させるため、ポリヌクレオチドに容易に適用することができる。変異誘発および定向進化法は、当技術分野で周知である（例えば、米国特許第５，６０５，７９３号、第５，８１１，２３８号、第５，８３０，７２１号、第５，８３４，２５２号、第５，８３７，４５８号、第５，９２８，９０５号、第６，０９６，５４８号、第６，１１７，６７９号、第６，１３２，９７０号、第６，１６５，７９３号、第６，１８０，４０６号、第６，２５１，６７４号、第６，２６５，２０１号、第６，２７７，６３８号、第６，２８７，８６１号、第６，２８７，８６２号、第６，２９１，２４２号、第６，２９７，０５３号、第６，３０３，３４４号、第６，３０９，８８３号、第６，３１９，７１３号、第６，３１９，７１４号、第６，３２３，０３０号、第６，３２６，２０４号、第６，３３５，１６０号、第６，３３５，１９８号、第６，３４４，３５６号、第６，３５２，８５９号、第６，３５５，４８４号、第６，３５８，７４０号、第６，３５８，７４２号、第６，３６５，３７７号、第６，３６５，４０８号、第６，３６８，８６１号、第６，３７２，４９７号、第６，３３７，１８６号、第６，３７６，２４６号、第６，３７９，９６４号、第６，３８７，７０２号、第６，３９１，５５２号、第６，３９１，６４０号、第６，３９５，５４７号、第６，４０６，８５５号、第６，４０６，９１０号、第６，４１３，７４５号、第６，４１３，７７４号、第６，４２０，１７５号、第６，４２３，５４２号、第６，４２６，２２４号、第６，４３６，６７５号、第６，４４４，４６８号、第６，４５５，２５３号、第６，４７９，６５２号、第６，４８２，６４７号、第６，４８３，０１１号、第６，４８４，１０５号、第６，４８９，１４６号、第６，５００，６１７号、第６，５００，６３９号、第６，５０６，６０２号、第６，５０６，６０３号、第６，５１８，０６５号、第６，５１９，０６５号、第６，５２１，４５３号、第６，５２８，３１１号、第６，５３７，７４６号、第６，５７３，０９８号、第６，５７６，４６７号、第６，５７９，６７８号、第６，５８６，１８２号、第６，６０２，９８６号、第６，６０５，４３０号、第６，６１３，５１４号、第６，６５３，０７２号、第６，６８６，５１５号、第６，７０３，２４０号、第６，７１６，６３１号、第６，８２５，００１号、第６，９０２，９２２号、第６，９１７，８８２号、第６，９４６，２９６号、第６，９６１，６６４号、第６，９９５，０１７号、第７，０２４，３１２号、第７，０５８，５１５号、第７，１０５，２９７号、第７，１４８，０５４号、第７，２２０，５６６号、第７，２８８，３７５号、第７，３８４，３８７号、第７，４２１，３４７号、第７，４３０，４７７号、第７，４６２，４６９号、第７，５３４，５６４号、第７，６２０，５００号、第７，６２０，５０２号、第７，６２９，１７０号、第７，７０２，４６４号、第７，７４７，３９１号、第７，７４７，３９３号、第７，７５１，９８６号、第７，７７６，５９８号、第７，７８３，４２８号、第７，７９５，０３０号、第７，８５３，４１０号、第７，８６８，１３８号、第７，７８３，４２８号、第７，８７３，４７７号、第７，８７３，４９９号、第７，９０４，２４９号、第７，９５７，９１２号、第７，９８１，６１４号、第８，０１４，９６１号、第８，０２９，９８８号、第８，０４８，６７４号、第８，０５８，００１号、第８，０７６，１３８号、第８，１０８，１５０号、第８，１７０，８０６号、第８，２２４，５８０号、第８，３７７，６８１号、第８，３８３，３４６号、第８，４５７，９０３号、第８，５０４，４９８号、第８，５８９，０８５号、第８，７６２，０６６号、第８，７６８，８７１号、第９，５９３，３２６号、および全ての関連あるＵＳ、ならびにＰＣＴ、および非ＵＳ同等物；Ｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２５４（２）：１５７－７８ ［１９９７］；Ｄａｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ５７：３６９－７４ ［１９９６］；Ｓｍｉｔｈ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ．， １９：４２３－４６２ ［１９８５］；Ｂｏｔｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２９：１１９３－１２０１ ［１９８５］；Ｃａｒｔｅｒ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．， ２３７：１－７ ［１９８６］；Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， ３８：８７９－８８７ ［１９８４］；Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， ３４：３１５－３２３ ［１９８５］；Ｍｉｎｓｈｕｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．， ３：２８４－２９０ ［１９９９］；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １７：２５９－２６４ ［１９９９］；Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３９１：２８８－２９１ ［１９９８］；Ｃｒａｍｅｒｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １５：４３６－４３８ ［１９９７］；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ９４：４５０４－４５０９ ［１９９７］；Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １４：３１５－３１９ ［１９９６］；Ｓｔｅｍｍｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ， ３７０：３８９－３９１ ［１９９４］；Ｓｔｅｍｍｅｒ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９１：１０７４７－１０７５１ ［１９９４］；ＷＯ９５／２２６２５号；ＷＯ９７／００７８号；ＷＯ９７／３５９６６号；ＷＯ９８／２７２３０号；ＷＯ００／４２６５１号；ＷＯ０１／７５７６７号；およびＷＯ２００９／１５２３３６号であって、その全てが参照により本明細書に組み込まれるものを参照）。
一部の実施形態では、変異誘発処理後に得られた酵素クローンを、規定の温度（またはその他のアッセイ条件、例えば、広範な基質にわたって酵素の活性を試験すること）に酵素を供しし、熱処理またはその他のアッセイ条件の後に残された酵素活性の量を測定するすることによってスクリーニングする。次いでイミンレダクターゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するクローンを配列決定して、ヌクレオチド配列変化（存在する場合）を特定し、宿主細胞内で酵素を発現させるのに使用する。発現ライブラリーから酵素活性を測定することは、当技術分野で公知の任意の適切な方法（例えば、ＨＰＬＣ分析などの標準生化学技法）を使用して行うことができる。
一部の実施形態では、変異誘発処理後に得られたクローンは、１つまたは複数の所望の改善された酵素特性（例えば、改善された位置選択性）を有する操作されたイミンレダクターゼに関してスクリーニングすることができる。発現ライブラリーからの酵素活性の測定は、生成物のＨＰＬＣ分析および／または誘導体化（分離前または後）などの標準生化学技法を使用して、例えば塩化ダンシルまたはＯＰＡを使用して行うことができる（例えば、Ｙａｅｇａｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． ３５６（１）：１６３－７０ ［１９８６］参照）。
操作されたポリペプチドの配列がわかっている場合、酵素をコードするポリヌクレオチドは、公知の合成方法に従い、標準固相法によって調製することができる。一部の実施形態では、最大約１００塩基の断片を個々に合成することができ、次いで接合して（例えば、酵素もしくは化学ライゲーション法、またはポリメラーゼ媒介法による）、任意の所望の連続配列を形成することができる。例えば、イミンレダクターゼの部分をコードするポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、当技術分野で公知のような化学合成（例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔ． Ｌｅｔｔ． ２２：１８５９－６９ ［１９８１］の古典的なホスホロアミダイト法、またはＭａｔｔｈｅｓ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ３：８０１－０５ ［１９８４］により記載される方法）によって、自動化合成法で典型的に実施されるように調製することができる。ホスホロアミダイト法によれば、オリゴヌクレオチドは合成され（例えば、自動ＤＮＡ合成器で）、精製され、アニールされ、ライゲーションされ、および適切なベクター内でクローニングされる。さらに、本質的に任意の核酸は、様々な商業上の供給元のいずれかから得ることができる。一部の実施形態では、追加のバリエーションは、欠失、挿入、および／または置換を含有するオリゴヌクレオチドを合成し、オリゴヌクレオチドを様々な順列で組み合わせて改善された特徴を持つ操作されたイミンレダクターゼを作り出すことによって、創出することができる。
したがって、一部の実施形態では、操作されたイミンレダクターゼポリペプチドを調製するための方法は：（ａ）配列番号６～８０２の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％またはそれよりも高い配列同一性を有しかつ配列番号４、１６、５０、３０６、６４８、および／または７０８と比較して１つまたは複数の残基の差異を有する、アミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成することであって、残基の差異が、表５．１、６．１、７．１、８．１、９．１、および／または１０．１における残基の差異のいずれかから選択されるものであること；および（ｂ）ポリヌクレオチドによりコードされたイミンレダクターゼポリペプチドを発現することを含む。
方法の一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、必要に応じて１つまたはいくつかの（例えば、最大３、４、５、または１０まで）アミノ酸残基の欠失、挿入、および／または置換を有する操作されたイミンレダクターゼをコードする。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、必要に応じて１～２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、１～１０、１～１５、１～２０、１～２１、１～２２、１～２３、１～２４、１～２５、１～３０、１～３５、１～４０、１～４５、または１～５０のアミノ酸残基の欠失、挿入、および／または置換を有する。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、必要に応じて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３０、３５、４０、４５、または５０のアミノ酸残基の欠失、挿入、および／または置換を有する。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、必要に応じて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、または２５のアミノ酸残基の欠失、挿入、および／または置換を有する。一部の実施形態では、置換は、保存的または非保存的置換にすることができる。
一部の実施形態では、宿主細胞内で発現する操作されたイミンレダクターゼ酵素のいずれかを、とりわけリゾチーム処理、超音波処理、濾過、塩析、限外濾過、およびクロマトグラフィーを含む、タンパク質精製に関して周知の技法のいずれか１つまたは複数を使用して、細胞および／または培養培地から回収することができる。Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌からのタンパク質の溶解および高効率抽出に適した溶液は、市販されている（例えば、ＣｅｌＬｙｔｉｃ Ｂ（商標）、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）。
イミンレダクターゼポリペプチドを単離するためのクロマトグラフィー技法には、とりわけ、逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、および親和性クロマトグラフィーが含まれる。特定の酵素を精製するための条件は、部分的には、正味の電荷、疎水性、親水性、分子量、分子形状などの因子に依存することになり、当業者に明らかにされよう。
一部の実施形態では、親和性技法を使用して、改善されたイミンレダクターゼ酵素を単離してもよい。親和性クロマトグラフィー精製では、イミンレダクターゼポリペプチドを特異的に結合する任意の抗体が使用されてもよい。抗体の生成では、限定するものではないが、ウサギ、マウス、ラットなどを含む様々な宿主動物を、イミンレダクターゼポリペプチドまたはその断片を注射することによって免疫化してもよい。イミンレダクターゼポリペプチドまたは断片は、側鎖官能基または側鎖官能基に取着されたリンカーを用いて、ＢＳＡなどの適切な担体に取着されてもよい。一部の実施形態では、親和性精製は、イミンレダクターゼまたは色素親和性カラムにより結合された特異的リガンドを使用することができる（例えば、ＥＰ０６４１８６２；Ｓｔｅｌｌｗａｇｅｎ， ”Ｄｙｅ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，” Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｕｎｉｔ ９．２－９．２．１６ ［２００１］参照）。
操作されたイミンレダクターゼ酵素を使用する方法
一部の実施形態では、本明細書に記載されるイミンレダクターゼは、１つまたは複数の適切な基質から生成物に変換するためのプロセスに、用途を見出す。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるイミンレダクターゼは、１つまたは複数の適切な基質から生成物に変換するためのプロセスに、用途を見出す。
別の態様では、本明細書に開示された操作されたポリペプチドは、基質化合物（２）またはその構造類似体および基質化合物（３）またはその構造類似体を、化合物（１）の生成物または対応する構造類似体に変換するためのプロセスで使用することができる。一般に、化合物（１）の構造類似体は、構造式（ＩＶ）内に包含される。
一部の実施形態では、本開示は、構造式（ＩＶ）：
の化合物を調製するためのプロセスを提供し、
式中、
Ｒ１は、水素原子、または必要に応じて置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アリールアルコキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、ハロアルキル、アルキルチオアルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、およびヘテロアリールアルキルから選択され；
Ｒ２は独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシアルキル、カルボキシ、アミノカルボニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボキシアルキル、アルキルアミノ、ハロアルキル、アルキルチオアルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、およびヘテロアリールアルキルから選択され；
Ｒ３は独立して、メチル、ｄ３－メチル、およびエチルから選択され；
このプロセスは、構造式（Ｖ）のケトン基質および式（ＶＩ）：
のアミン基質を、本明細書に開示されるような操作されたポリペプチドと、適切な反応条件下で接触させて式（ＩＶ）の生成物が調製されるようにするステップを含む。
式中、
Ｒ１は、水素原子、または必要に応じて置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アリールアルコキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、ハロアルキル、アルキルチオアルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、およびヘテロアリールアルキルから選択され；
Ｒ２は独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシアルキル、カルボキシ、アミノカルボニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボキシアルキル、アルキルアミノ、ハロアルキル、アルキルチオアルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、およびヘテロアリールアルキルから選択され；
Ｒ３は独立して、メチル、ｄ３－メチル、およびエチルから選択され；
このプロセスは、構造式（Ｖ）のケトン基質および式（ＶＩ）：
一部の実施形態では、本開示は、化合物（１）；
を調製するプロセスを提供し、このプロセスは、化合物（２）
の基質および化合物（３）
の基質を、本明細書に開示されるような操作されたポリペプチドと、適切な反応条件下で接触させて、化合物（１）の生成物が調製されるようにするステップを含む。
Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．株１Ｃの野生型酵素から誘導された、操作されたイミンレダクターゼポリペプチドは、基質化合物（２）および（３）を生成物化合物（１）に効率的に変換することが可能であるが、下記の表２に列挙される変換反応（Ａ）から（Ｅ）までで示されるように、ある範囲の式（Ｉ）のケトン基質化合物および式（ＩＩ）のアミン基質化合物を式（ＩＩＩ）の第二級および第三級アミン生成物化合物に効率的に変換することも可能である。
本発明は、イミンレダクターゼ活性を有する、数多くの例示的な操作されたポリペプチドを提供する。これらの例示的なポリペプチドは、配列番号４、１６、５０、３０６、６４８、および／または７０８（配列番号２の野性型ＣＥＮＤＨからの定向進化を介して得られた）の既に操作されたポリペプチドから進化し、改善された特徴、特に、化合物（２ａ）および（３ａ）からアミン生成物化合物（１ａ）への変換、化合物（２）および（３ａ）からアミン生成物化合物（１ｂ）への変換、化合物（２ａ）および（３ｂ）からアミン生成物化合物（１ｃ）への変換、化合物（２）および（３ｃ）からアミン生成物化合物（１ｄ）への変換、および化合物（２）および（３ｂ）からアミン生成物化合物（１ｅ）への変換を含めた様々なケトンおよびアミン基質の変換において、増大した活性および安定性を示す。表５．１、６．１、７．１、８．１、９．１、および１０．１の結果は、ある範囲のケトンおよびアミン基質全体にわたって増大したイミンレダクターゼ活性および／または安定性を持つバリアントを提供する。
本発明の、例示的な、天然に存在しない（または操作された）イミンレダクターゼポリペプチドに関する構造および機能の情報は、これらの酵素の定向進化で使用される以下の５つの異なる高スループット（ＨＴＰ）スクリーニングアッセイに基づく：化合物（２ａ）および（３ａ）からアミン生成物化合物（１ａ）への変換、化合物（２）および（３ａ）からアミン生成物化合物（１ｂ）への変換、化合物（２ａ）および（３ｂ）からアミン生成物化合物（１ｃ）への変換、化合物（２）および（３ｃ）からアミン生成物化合物（１ｄ）への変換、および化合物（２）および（３ｂ）からアミン生成物化合物（１ｅ）への変換。
したがって、一部の実施形態では、偶数番号の配列識別子の配列番号４～８０２から選択される参照配列に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い同一性を有し、かつ本明細書に提供されるものから選択される残基位置で、配列番号２と比較して１つまたは複数の残基の差異を有する、アミノ酸配列を有する、本発明のイミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、適切な反応条件下、下記の変換反応の１つまたは複数が可能であり、偶数番号の配列識別子の配列番号４～８０２の参照ポリペプチドと比べて改善された活性および／または改善された立体選択性を備える：
（ａ）基質化合物（２ａ）および（３ａ）から生成物化合物（１ａ）への変換；
（ｂ）基質化合物（２）および（３ａ）から生成物化合物（１ｂ）への変換；
（ｃ）基質化合物（２ａ）および（３ｂ）から生成物化合物（１ｃ）への変換；
（ｄ）基質化合物（２）および（３ｃ）から生成物化合物（１ｄ）への変換；および
（ｅ）基質化合物（２）および（３ｂ）から生成物化合物（１ｅ）への変換。
（ａ）基質化合物（２ａ）および（３ａ）から生成物化合物（１ａ）への変換；
（ｂ）基質化合物（２）および（３ａ）から生成物化合物（１ｂ）への変換；
（ｃ）基質化合物（２ａ）および（３ｂ）から生成物化合物（１ｃ）への変換；
（ｄ）基質化合物（２）および（３ｃ）から生成物化合物（１ｄ）への変換；および
（ｅ）基質化合物（２）および（３ｂ）から生成物化合物（１ｅ）への変換。
一部の実施形態では、イミンレダクターゼ活性を有しかつ適切な反応条件下、改善された活性および／または立体選択性で上記変換反応（Ａ）～（Ｅ）の１つまたは複数の触媒することが可能な操作されたポリペプチドは、偶数番号の配列識別子の配列番号４～８０２の１つに対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有し、かつ表５．１、６．１、７．１、８．１、９．１、および１０．１に提示されるように偶数番号の配列識別子の配列番号４～８０２のいずれか１つに存在する、配列番号２と比較してアミノ酸残基の差異を有する、アミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、イミンレダクターゼ活性を有しかつ適切な反応条件下、改善された活性および／または立体選択性で上記変換反応（Ａ）～（Ｅ）の１つまたは複数を触媒することが可能な、操作されたポリペプチドは、偶数番号の配列識別子の配列番号４～８０２から選択される配列を含むアミノ酸配列を有する。本発明の操作されたポリペプチドが誘導された、配列番号２のＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．株Ｃ１（ＣＥＮＤＨ）からの野生型オパインデヒドロゲナーゼは、化合物（２）のケトン基質および化合物（３）のアミン基質から第二級アミン生成物化合物（１）への変換の際に、検出可能な活性はない。しかしながら一部の実施形態では、イミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、本明細書で提供されるケトン基質およびアミン基質を、本明細書に記載されるような第二級アミン生成物化合物に変換することが可能である。
本明細書で提供されるおよび実施例に例示される実施形態では、プロセスで使用することができる様々な範囲の適切な反応条件には、限定するものではないが、基質負荷、補基質負荷、ｐＨ、温度、緩衝液、溶媒系、ポリペプチド負荷、および反応時間が含まれる。本明細書に記載される操作されたイミンレダクターゼを使用して基質化合物から生成物化合物に生体触媒変換するためのプロセスを実施するための、他の適切な反応条件は、限定するものではないが、濃度、ｐＨ、温度、および溶媒条件の実験反応条件下で操作されたイミンレダクターゼポリペプチドおよび１種または複数の基質化合物を接触させること、および生成物化合物を検出することを含む、通常の実験により、本明細書で提供される指針に鑑み容易に最適化することができる。
反応混合物中の基質化合物（複数可）は、例えば所望の量の生成物化合物、酵素活性に対する各基質濃度の影響、反応条件下での酵素の安定性、および各基質から生成物への変換パーセントを考慮に入れて、変えることができる。一部の実施形態では、適切な反応条件は、少なくとも約０．５から約２５ｇ／Ｌ、１から約２５ｇ／Ｌ、５から約２５ｇ／Ｌ、約１０から約２５ｇ／Ｌ、または２０から約２５ｇ／Ｌの、１つまたは複数の基質のそれぞれに関する基質化合物負荷を含む。一部の実施形態では、適切な反応条件は、少なくとも約０．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１ｇ／Ｌ、少なくとも約５ｇ／Ｌ、少なくとも約１０ｇ／Ｌ、少なくとも約１５ｇ／Ｌ、少なくとも約２０ｇ／Ｌ、または少なくとも約３０ｇ／Ｌ、またはさらに大きい、１つまたは複数の基質のそれぞれに関する基質化合物負荷を含む。
本明細書に記載されるイミンレダクターゼ媒介プロセスを実施する際、操作されたポリペプチドは、精製された酵素、部分的に精製された酵素、酵素をコードする遺伝子（複数可）で形質転換された全細胞の形で、そのような細胞の細胞抽出物および／または溶解産物として、および／または固体支持体上に固定化された酵素として、反応混合物に添加されてもよい。操作されたイミンレダクターゼ酵素をコードする遺伝子（複数可）で形質転換された全細胞、または細胞抽出物、その溶解産物、および単離された酵素は、固体（例えば、凍結乾燥された、噴霧乾燥された、および同様のもの）または半固体（例えば、粗製ペースト）を含む様々な異なる形で用いられてもよい。細胞抽出物または細胞溶解産物は、沈殿（硫酸アンモニウム、ポリエチレンイミン、熱処理、または同様のもの、その後の脱塩手順、その後の凍結乾燥（例えば、限外濾過、透析など）によって、部分的に精製されてもよい。酵素調製物（全細胞調製物を含む）のいずれかは、例えばグルタルアルデヒドなどの公知の架橋剤を使用する架橋、または固相への固定化（例えば、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ Ｃおよび同様のもの）によって、安定化され得る。
操作されたイミンレダクターゼポリペプチドをコードする遺伝子（複数可）は、同じ宿主細胞に別々にまたは一緒に、宿主細胞に形質転換することができる。例えば、一部の実施形態では、ひと組の宿主細胞を、１種の操作されたイミンレダクターゼポリペプチドをコードする遺伝子（複数可）で形質転換することができ、別の組を、別の操作されたイミンレダクターゼポリペプチドをコードする遺伝子（複数可）で形質転換することができる。両方の組の形質転換された細胞は、全細胞の形で、またはそこから誘導された溶解産物もしくは抽出物の形で、反応混合物中で一緒に利用することができる。他の実施形態では、宿主細胞は、複数の操作されたイミンレダクターゼポリペプチドをコードする遺伝子（複数可）で形質転換することができる。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、分泌されたポリペプチドの形で発現することができ、分泌されたポリペプチドを含有する培養培地は、イミンレダクターゼ反応で使用することができる。
一部の実施形態では、本明細書に開示される操作されたイミンレダクターゼポリペプチドの改善された活性および／または位置選択性および／または立体選択性は、操作されたポリペプチドの濃度がより低い状態でより高い変換パーセンテージを達成することができる、プロセスを提供する。プロセスの一部の実施形態では、適切な反応条件は、基質化合物負荷が約１％（ｗ／ｗ）、２％（ｗ／ｗ）、５％（ｗ／ｗ）、１０％（ｗ／ｗ）、２０％（ｗ／ｗ）、３０％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）、７５％（ｗ／ｗ）、１００％（ｗ／ｗ）、またはそれよりも高い、操作されたポリペプチドの量を含む。
一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、約０．０１ｇ／Ｌから約５０ｇ／Ｌ；約０．０５ｇ／Ｌから約５０ｇ／Ｌ；約０．１ｇ／Ｌから約４０ｇ／Ｌ；約１ｇ／Ｌから約４０ｇ／Ｌ；約２ｇ／Ｌから約４０ｇ／Ｌ；約５ｇ／Ｌから約４０ｇ／Ｌ；約５ｇ／Ｌから約３０ｇ／Ｌ；約０．１ｇ／Ｌから約１０ｇ／Ｌ；約０．５ｇ／Ｌから約１０ｇ／Ｌ；約１ｇ／Ｌから約１０ｇ／Ｌ；約０．１ｇ／Ｌから約５ｇ／Ｌ；約０．５ｇ／Ｌから約５ｇ／Ｌ；または約０．１ｇ／Ｌから約２ｇ／Ｌで存在する。一部の実施形態では、イミンレダクターゼポリペプチドは、約０．０１ｇ／Ｌ、０．０５ｇ／Ｌ、０．１ｇ／Ｌ、０．２ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、１、２ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、または５０ｇ／Ｌで存在する。
反応の過程において、反応混合物のｐＨが変化してもよい。反応混合物のｐＨは、所望のｐＨでまたは所望のｐＨ範囲内で維持されてもよい。これは反応の過程の前および／または間に、酸または塩基の添加によって行ってもよい。あるいは、ｐＨは、緩衝液を使用することによって制御されてもよい。したがって、一部の実施形態では、反応条件は、緩衝液を含む。所望のｐＨ範囲を維持するのに適した緩衝液は、当技術分野で公知であり、例としてかつ限定するものではないが、ボレート、ホスフェート、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、アセテート、トリエタノールアミン、および２－アミノ－２－ヒドロキシメチル－プロパン－１，３－ジオール（Ｔｒｉｓ）、および同様のものが含まれる。一部の実施形態では、反応条件は、緩衝液が存在しないときに適切な溶媒として水を含む。
プロセスの実施形態では、反応条件は、適切なｐＨを含む。所望のｐＨまたは所望のｐＨ範囲は、酸もしくは塩基、適切な緩衝液、または緩衝および酸もしくは塩基の添加の組合せの使用によって、維持することができる。反応混合物のｐＨは、反応の過程の前および／または間に制御することができる。一部の実施形態では、適切な反応条件は、約４から約１０の溶液ｐＨ、約５から約１０のｐＨ、約５から約９のｐＨ、約６から約９のｐＨ、約６から約８のｐＨを含む。一部の実施形態では、反応条件は、約４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、または１０の溶液ｐＨを含む。
本明細書のプロセスの実施形態では、適切な温度は、例えばより高い温度での反応速度の増大および反応期間中の酵素の活性を考慮に入れて、反応条件に使用される。したがって、一部の実施形態では、適切な反応条件は、約１０℃から約６０℃、約１０℃から約５５℃、約１５℃から約６０℃、約２０℃から約６０℃、約２０℃から約５５℃、約２５℃から約５５℃、または約３０℃から約５０℃の温度を含む。一部の実施形態では、適切な反応条件は、約１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、または６０℃の温度を含む。一部の実施形態では、酵素反応中の温度は、反応の過程全体を通して特定の温度で維持することができる。一部の実施形態では、酵素反応中の温度は、反応の過程で、温度プロファイル全体にわたり調節することができる。
一部の実施形態では、本発明のプロセスは、溶媒中で実施される。適切な溶媒は、水、水性緩衝溶液、有機溶媒、ポリマー溶媒、および／または共溶媒系であって、一般に水性溶媒、有機溶媒、および／またはポリマー溶媒を含むものを、含む。水性溶媒（水または水性共溶媒系）は、ｐＨが緩衝されていても緩衝されていなくてもよい。一部の実施形態では、操作されたイミンレダクターゼポリペプチドを使用するプロセスは、有機溶媒（例えば、エタノール、イソプロパノール（ＩＰＡ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）酢酸エチル、酢酸ブチル、１－オクタノール、ヘプタン、オクタン、メチルｔブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、トルエン、および同様のもの）、イオン性または極性溶媒（例えば、１－エチル４メチルイミダゾリウムテトラフルオロボレート、１－ブチル－３－メチルイミダゾリウムテトラフルオロボレート、１－ブチル３メチルイミダゾリウムヘキサフルオロホスフェート、グリセロール、ポリエチレングリコール、および同様のもの）を含む水性共溶媒系で実施することができる。一部の実施形態では、共溶媒は、ポリオール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、または低級アルコールなどの極性溶媒とすることができる。水性共溶媒系の非水性共溶媒成分は、水性成分と混和可能で単一液相を提供してもよく、または水性成分と部分的に混和性もしくは非混和性で２つの液相を提供してもよい。例示的な水性共溶媒系は、水と、有機溶媒、極性溶媒、およびポリオール溶媒から選択される１種または複数の共溶媒とを含むことができる。一般に、水性共溶媒系の共溶媒成分は、反応条件下でイミンレダクターゼ酵素を有害に失活させないように選択される。適切な共溶媒系は、本明細書に記載されるものなどの酵素活性アッセイを利用して、候補溶媒系において、目的の規定の基質に対する、指定された、操作されたイミンレダクターゼ酵素の酵素活性を測定することによって、容易に特定することができる。
プロセスの一部の実施形態では、適切な反応条件は水性共溶媒を含み、この共溶媒は、ＤＭＳＯを、約１％から約５０％（ｖ／ｖ）、約１から約４０％（ｖ／ｖ）、約２％から約４０％（ｖ／ｖ）、約５％から約３０％（ｖ／ｖ）、約１０％から約３０％（ｖ／ｖ）、または約１０％から約２０％（ｖ／ｖ）含む。プロセスの一部の実施形態では、適切な反応条件は、エタノールを約１％（ｖ／ｖ）、約５％（ｖ／ｖ）、約１０％（ｖ／ｖ）、約１５％（ｖ／ｖ）、約２０％（ｖ／ｖ）、約２５％（ｖ／ｖ）、約３０％（ｖ／ｖ）、約３５％（ｖ／ｖ）、約４０％（ｖ／ｖ）、約４５％（ｖ／ｖ）、または約５０％（ｖ／ｖ）含む、水性共溶媒を含むことができる。
一部の実施形態では、反応条件は、反応を安定化させまたは強化するために界面活性剤を含む。界面活性剤は、非イオン性、陽イオン性、陰イオン性、および／または両親媒性界面活性剤を含むことができる。例示的な界面活性剤には、例としてかつ限定するものではないが、ノニルフェノキシポリエトキシルエタノール（ＮＰ４０）、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００ポリエチレングリコールｔｅｒｔ－オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン－ステアリルアミン、臭化セチルトリメチルアンモニウム、オレイルアミド硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン－ソルビタンモノステアレート、ヘキサデシルジメチルアミンなどが含まれる。反応を安定化させ得るまたは高め得る任意の界面活性剤が用いられてもよい。反応で用いられる界面活性剤の濃度は、一般に０．１から５０ｍｇ／ｍｌ、特に１から２０ｍｇ／ｍｌであってもよい。
一部の実施形態では、反応条件は、反応溶液が混合されまたはスパージング（ｓｐａｒｇｅ）されるときなど、反応溶液中での泡の形成を低減させまたは防止するのを助ける消泡剤を含む。消泡剤は、非極性油（例えば、鉱物、シリコーンなど）、極性油（例えば、脂肪酸、アルキルアミン、アルキルアミド、アルキルスルフェートなど）、および疎水性（例えば、処理されたシリカ、ポリプロピレンなど）を含み、そのいくつかは界面活性剤としても機能する。例示的な消泡剤には、Ｙ－３０（登録商標）（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ）、ポリ－グリコールコポリマー、オキシ／エトキシ化アルコール、およびポリジメチルシロキサンが含まれる。一部の実施形態では、消泡剤は、約０．００１％（ｖ／ｖ）から約５％（ｖ／ｖ）、約０．０１％（ｖ／ｖ）から約５％（ｖ／ｖ）、約０．１％（ｖ／ｖ）から約５％（ｖ／ｖ）、または約０．１％（ｖ／ｖ）から約２％（ｖ／ｖ）で存在することができる。一部の実施形態では、消泡剤は、反応を促進させるのに望まれるように、約０．００１％（ｖ／ｖ）、約０．０１％（ｖ／ｖ）、約０．１％（ｖ／ｖ）、約０．５％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）、約２％（ｖ／ｖ）、約３％（ｖ／ｖ）、約４％（ｖ／ｖ）、または約５％（ｖ／ｖ）またはそれよりも高い量で存在することができる。
イミンレダクターゼ反応で使用される反応物の量は、一般に、所望の生成物の量、および付随して用いられるイミンレダクターゼ基質の量に応じて、様々になる。当業者なら、これらの量を所望の生産性レベルおよび生産規模に合わせて調製するのにどのように変化させるのか、容易に理解されよう。
一部の実施形態では、反応物の添加の順序は重要ではない。反応物は、溶媒（例えば、単相溶媒、二相水性共溶媒系、および同様のもの）に同時に一緒に添加されてもよく、あるいは、反応物の一部が別々に添加されてもよく、一部は異なる時点で一緒に添加されてもよい。例えば、補因子、補基質、および基質を、最初に溶媒に添加してもよい。
固体反応物（例えば、酵素、塩など）は、粉末（例えば、凍結乾燥した、噴霧乾燥した、および同様のもの）、溶液、エマルジョン、懸濁物、および同様のものを含む様々な種々の形で、反応に提供されてもよい。反応物は、当業者に公知の方法および装置を使用して、容易に凍結乾燥しまたは噴霧乾燥することができる。例えば、タンパク質溶液は、少量のアリコートで－８０℃で凍結することができ、次いで予冷した凍結乾燥チャンバーに添加し、その後、真空を適用することができる。
水性共溶媒系が使用されるとき、改善された混合効率を得るには、最初に水性相に、イミンレダクターゼおよび補基質を添加および混合してもよい。イミンレダクターゼ基質を、添加および混合し、その後、有機相を添加および混合してもよく、または基質を有機相に溶解し、混合してもよい。あるいは、イミンレダクターゼ基質を有機相に予備混合してもよく、その後、水性相を添加してもよい。
本発明のプロセスは、一般に、基質から生成物へのさらなる変換が反応時間と共に著しく変化しなくなるまで（例えば、１０％未満の基質が変換される、または５％未満の基質が変換される）、進行させることが可能である。一部の実施形態では、反応は、基質から生成物への完全なまたはほぼ完全な変換が生じるまで、進行させることが可能である。基質から生成物への転換は、誘導体化と共にまたは誘導体化なしで、基質および／または生成物を検出することにより、公知の方法を使用してモニターすることができる。適切な分析方法は、ガスクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、ＭＳ、および同様のものを含む。
プロセスの一部の実施形態では、適切な反応条件は、少なくとも約５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、またはそれよりも多い、１種または複数の基質のそれぞれに関する基質負荷を含み、方法は、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれよりも高い、基質化合物から生成物化合物への変換を、約２４時間またはそれよりも短い時間内、約１２時間またはそれよりも短い時間内、約６時間またはそれよりも短い時間内、または約４時間またはそれよりも短い時間内でもたらす。
本発明の操作されたイミンレダクターゼポリペプチドは、適切な反応条件下でプロセスで使用された場合、過剰な所望の生成物を、望ましくない生成物（複数可）よりも少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高いジアステレオマー過剰率でもたらす。
操作されたイミンレダクターゼポリペプチドを使用して１種または複数の化合物を生成物化合物に変換するためのプロセスの、一部の他の実施形態では、適切な反応条件は、後にポリペプチドに接触する反応溶液への、１種または複数の基質のそれぞれに関する初期基質負荷を含むことができる。次いでこの反応溶液にはさらに、追加の基質化合物が、連続またはバッチ式添加として経時的に、少なくとも約１ｇ／Ｌ／時、少なくとも約２ｇ／Ｌ／時、少なくとも約４ｇ／Ｌ／時、少なくとも約６ｇ／Ｌ／時、またはそれよりも高い速度で、１種または複数の基質のそれぞれに関して補われる。したがって、これらの適切な反応条件に従い、ポリペプチドは、１種または複数の基質のそれぞれに関して少なくとも約１ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、または１０ｇ／Ｌの初期基質負荷を有する溶液に添加される。次いでポリペプチドのこの添加の後、１種または複数の基質のそれぞれに関してさらなる基質を約２ｇ／Ｌ／時、４ｇ／Ｌ／時、または６ｇ／Ｌ／時の速度で、少なくとも約３０ｇ／Ｌまたはそれよりも高い、非常に高い最終基質負荷が１種または複数の基質のそれぞれに関して到達するまで、溶液に連続添加する。したがって、プロセスの一部の実施形態では、適切な反応条件は、少なくとも約１ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、または１０ｇ／Ｌの初期基質負荷を有する溶液へのポリペプチドの添加と、その後の、少なくとも約３０ｇ／Ｌまたはそれよりも高い最終基質負荷に１種または複数の基質のそれぞれが到達するまで、約２ｇ／Ｌ／時、４ｇ／Ｌ／時、または６ｇ／Ｌ／時の速度での、溶液へのさらなる基質の添加を含む。この基質補充反応条件は、１種または複数の基質化合物のいずれかまたは両方に関して少なくとも約５％、２５％、５０％、７５％、９０％、またはそれよりも高い基質の変換で、基質から生成物への高速の変換を維持しながら、より高い基質負荷を達成可能にする。
式（ＩＶ）の化合物または化合物（１）を調製するために、操作されたポリペプチドを使用する、本明細書に開示されるプロセスのいずれかは、アミン基質の範囲、ケトン基質の範囲、温度、ｐＨ、溶媒系、基質負荷、ポリペプチド負荷、補因子負荷、および反応時間を含むがこれらに限定されないある範囲の適切な反応条件下で実施することができる。一実施例では、一部の実施形態で、式（ＩＶ）の化合物または化合物（１）の調製は、適切な反応条件が：（ａ）基質化合物が約１から５０ｇ／Ｌのアミン基質負荷；（ｂ）基質化合物が約１から５０ｇ／Ｌのケトン基質負荷；（ｃ）約０．５ｇ／Ｌから１０ｇ／Ｌの操作されたポリペプチド；（ｄ）０～２０％のＤＭＳＯ；（ｅ）１ｇ／ＬのＰＤＨ補因子リサイクル酵素、０．１ｇ／ＬのＮＡＤ＋補因子、および最大２０ｇ／Ｌのホスファイト；（ｆ）約３０℃から６０℃の温度を含む場合に実施することができる。一部の実施形態では、適切な反応条件は：（ａ）約２ｇ／Ｌのアミン基質化合物）；（ｂ）約２ｇ／Ｌのケトン基質化合物）；（ｃ）約５ｇ／Ｌの操作されたポリペプチド；（ｄ）５％のＤＭＳＯ；（ｅ）１ｇ／ＬのＰＤＨ補因子リサイクル酵素、０．１ｇ／Ｌ ＮＡＤ＋補因子、および２０ｇ／Ｌのホスファイト；および（ｆ）約３０℃を含む。
一部の実施形態では、追加の反応成分または追加の技法を実施して、反応条件を補った。これらは、酵素の失活を安定化させまたは防止し、生成物の阻害を低減させ、反応平衡を所望の生成物の形成にシフトするよう、対策を講じることを含むことができる。
他の実施形態では、１種または複数の基質化合物から生成物化合物への変換のための上述のプロセスのいずれかは：生成物化合物の抽出；単離；精製；および結晶化から選択される１つまたは複数のステップをさらに含むことができる。上記開示されたプロセスにより生成された生体触媒反応混合物から、生成物を抽出、単離、精製、および／または結晶化するための方法、技法、およびプロトコールは、当業者に公知でありかつ／または通常の実験を経て利用可能である。さらに、例示的な方法が、下記の実施例で提示される。
本発明の様々な特徴および実施形態は、例示が意図されかつ限定するものではない、下記の代表的な実施例に例示される。
実験
実験および実現された結果を含む下記の実施例は、単なる例示を目的に提供され、本発明を限定すると解釈するものではない。
実験および実現された結果を含む下記の実施例は、単なる例示を目的に提供され、本発明を限定すると解釈するものではない。
下記の実施例では、以下の略称が適用される：ｐｐｍ（百万分率）；Ｍ（モル濃度）；ｍＭ（ミリモル濃度）、ｕＭおよびμＭ（マイクロモル濃度）；ｎＭ（ナノモル濃度）；ｍｏｌ（モル）；ｇｍおよびｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；ｕｇおよびμｇ（マイクログラム）；Ｌおよびｌ（リットル）；ｍｌおよびｍＬ（ミリリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；ｕｍおよびμｍ（マイクロメートル）；ｓｅｃ．（秒）；ｍｉｎ（ｓ）（分（複数可））；ｈ（ｓ）およびｈｒ（ｓ）（時（複数可））；Ｕ（単位）；ＭＷ（分子量）；ｒｐｍ（分当たりの回転数）；ｐｓｉおよびＰＳＩ（平方インチ当たりのポンド数）；℃（摂氏度）；ＲＴおよびｒｔ（室温）；ＣＡＭおよびｃａｍ（クロラムフェニコール）；ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）；ＰＭＢＳ（硫酸ポリミキシンＢ）；ＩＰＴＧ（イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド）；ＬＢ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉブロス）；ＴＢ（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ；１２ｇ／Ｌ ｂａｃｔｏ－トリプトン、２４ｇ／Ｌ酵母抽出物、４ｍＬ／Ｌグリセロール、６５ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．０、１ｍＭ ＭｇＳＯ４）；ＨＥＰＥＳ（ＨＥＰＥＳ双性イオン緩衝液；４－（２－ヒドロキシエチル）－ピペラジンエタンスルホン酸）；ＳＦＰ（振盪フラスコ粉末）；ＣＤＳ（コード配列）；ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）；ＲＮＡ（リボ核酸）；Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（一般に使用される実験室Ｅ．ｃｏｌｉ株、Ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ［ＣＧＳＣ］、Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ、ＣＴから入手可能）；ＨＴＰ（高スループット）；ＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフィー）；ＦＩＯＰＣ（陽性対照に対する倍数改善（ｆｏｌｄ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ））；Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｃｏｒｐ．、Ｗｅｓｔｗｏｏｄ、ＭＡ）；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ；Ｄｉｆｃｏ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＢＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）；Ａｇｉｌｅｎｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）；Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃ．、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）；Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｐ．、Ｍｉｄｌａｎｄ、ＭＩ）；およびＧｅｎｅ Ｏｒａｃｌｅ（Ｇｅｎｅ Ｏｒａｃｌｅ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）。
（実施例１）
組換えＣＥＮＤＨ遺伝子を含有するＥ．ｃｏｌｉ発現宿主
Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．株Ｃ１からの、報告された野生型オパインデヒドロゲナーゼポリペプチド（ＣＥＮＤＨ）は、ＧｅｎｅＩＯＳ合成プラットフォーム（ＧｅｎｅＯｒａｃｌｅ）を使用してコドン最適化され、配列番号２の遺伝子として合成された。野生型ＣＥＮＤＨコード遺伝子を、ｌａｃｌリプレッサーの制御下で、ｌａｃプロモーターに動作可能に連結された発現ベクターｐＣＫ１１０９００にクローニングした（米国特許出願公開第２００６／０１９５９４７号の図３参照）。発現ベクターは、Ｐ１５ａ複製起点およびクロラムフェニコール耐性遺伝子も含有する。得られたプラスミドを、当技術分野で公知の標準方法を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ｆｈｕＡに形質転換した。形質転換体は、当技術分野で公知のように、細胞をクロラムフェニコール選択に供することにより単離した（例えば、米国特許第８，３８３，３４６号およびＷＯ２０１０／１４４１０３号参照）。本発明のバリアントを生成するのに使用される初期ＣＥＮＤＨ酵素は、配列番号４により表されるように、米国特許第９，４８７，７６０号および第９，６９５，４５１号に記載されるように配列番号２の遺伝子に基づいて操作した。
組換えＣＥＮＤＨ遺伝子を含有するＥ．ｃｏｌｉ発現宿主
Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．株Ｃ１からの、報告された野生型オパインデヒドロゲナーゼポリペプチド（ＣＥＮＤＨ）は、ＧｅｎｅＩＯＳ合成プラットフォーム（ＧｅｎｅＯｒａｃｌｅ）を使用してコドン最適化され、配列番号２の遺伝子として合成された。野生型ＣＥＮＤＨコード遺伝子を、ｌａｃｌリプレッサーの制御下で、ｌａｃプロモーターに動作可能に連結された発現ベクターｐＣＫ１１０９００にクローニングした（米国特許出願公開第２００６／０１９５９４７号の図３参照）。発現ベクターは、Ｐ１５ａ複製起点およびクロラムフェニコール耐性遺伝子も含有する。得られたプラスミドを、当技術分野で公知の標準方法を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ｆｈｕＡに形質転換した。形質転換体は、当技術分野で公知のように、細胞をクロラムフェニコール選択に供することにより単離した（例えば、米国特許第８，３８３，３４６号およびＷＯ２０１０／１４４１０３号参照）。本発明のバリアントを生成するのに使用される初期ＣＥＮＤＨ酵素は、配列番号４により表されるように、米国特許第９，４８７，７６０号および第９，６９５，４５１号に記載されるように配列番号２の遺伝子に基づいて操作した。
（実施例２）
ＨＴＰ ＣＥＮＤＨを含有する湿潤細胞ペレットの調製
モノクローナルコロニーからの組換えＣＥＮＤＨコード遺伝子を含有するＥ．ｃｏｌｉ細胞を、９６ウェルの浅いウェルのマイクロタイタープレートのウェル内で、１％グルコースおよび３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含有する１８０μｌのＬＢに接種した。プレートをＯ２透過性封止材で密封し、培養物を３０℃、２００ｒｐｍ、および８５％湿度で一晩成長させた。次いで細胞培養物のそれぞれの２０μｌを、３８０ｍＬのＴＢおよび３０μｇ／ｍＬのＣＡＭを含有する９６ウェルのディープウェルプレートのウェルに移した。ディープウェルプレートを、Ｏ２透過性封止材で密封し、ＯＤ６００ ０．６～０．８に到達するまで、３０℃、２５０ｒｐｍ、および８５％湿度でインキュベートした。次いで細胞培養物を、１ｍＭの最終濃度までのＩＰＴＧによって誘導し、当初使用したものと同じ条件下で一晩インキュベートした。次いで細胞を、４０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を使用してペレット化した。ある場合には、遠心分離の前に、２つのプレートからの一晩培養物を合わせ、２倍のペレットを得た。上澄みを捨て、ペレットを－８０℃で凍結した後、溶解した。
ＨＴＰ ＣＥＮＤＨを含有する湿潤細胞ペレットの調製
モノクローナルコロニーからの組換えＣＥＮＤＨコード遺伝子を含有するＥ．ｃｏｌｉ細胞を、９６ウェルの浅いウェルのマイクロタイタープレートのウェル内で、１％グルコースおよび３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含有する１８０μｌのＬＢに接種した。プレートをＯ２透過性封止材で密封し、培養物を３０℃、２００ｒｐｍ、および８５％湿度で一晩成長させた。次いで細胞培養物のそれぞれの２０μｌを、３８０ｍＬのＴＢおよび３０μｇ／ｍＬのＣＡＭを含有する９６ウェルのディープウェルプレートのウェルに移した。ディープウェルプレートを、Ｏ２透過性封止材で密封し、ＯＤ６００ ０．６～０．８に到達するまで、３０℃、２５０ｒｐｍ、および８５％湿度でインキュベートした。次いで細胞培養物を、１ｍＭの最終濃度までのＩＰＴＧによって誘導し、当初使用したものと同じ条件下で一晩インキュベートした。次いで細胞を、４０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を使用してペレット化した。ある場合には、遠心分離の前に、２つのプレートからの一晩培養物を合わせ、２倍のペレットを得た。上澄みを捨て、ペレットを－８０℃で凍結した後、溶解した。
（実施例３）
ＨＴＰ－ＣＥＮＤＨを含有する細胞溶解産物の調製
最初に、２００ｍＭのトリエタノールアミン（ＴＥｏＡ）緩衝液、ｐＨ８．５、１ｍｇ／ｍＬリゾチーム、および０．５ｍｇ／ｍＬ ＰＭＢＳを含有する２００μｌの溶解緩衝液を、実施例２に記載されたように、生成された各ウェル内の細胞ペーストに添加した。細胞を室温で２時間、ベンチトップシェーカー上で振盪させながら溶解した。次いでプレートを、４０００ｒｐｍおよび４℃で１５分間、遠心分離した。透明な上澄みを、生体触媒反応に使用して、それらの活性レベルを決定した。
ＨＴＰ－ＣＥＮＤＨを含有する細胞溶解産物の調製
最初に、２００ｍＭのトリエタノールアミン（ＴＥｏＡ）緩衝液、ｐＨ８．５、１ｍｇ／ｍＬリゾチーム、および０．５ｍｇ／ｍＬ ＰＭＢＳを含有する２００μｌの溶解緩衝液を、実施例２に記載されたように、生成された各ウェル内の細胞ペーストに添加した。細胞を室温で２時間、ベンチトップシェーカー上で振盪させながら溶解した。次いでプレートを、４０００ｒｐｍおよび４℃で１５分間、遠心分離した。透明な上澄みを、生体触媒反応に使用して、それらの活性レベルを決定した。
（実施例４）
振盪フラスコ（ＳＦ）培養物からの凍結乾燥した溶解産物の調製
上述のように成長した、選択されたＨＴＰ培養物を、１％グルコースおよび３０μｇ／ｍｌ ＣＡＭを含むＬＢ寒天プレート上に播き、３７℃で一晩成長させた。各培養物からの単一コロニーを、１％グルコースおよび３０μｇ／ｍｌ ＣＡＭを含むＬＢ ６ｍｌに移した。培養物を、３０℃、２５０ｒｐｍで１８時間成長させ、約１：５０で、３０μｇ／ｍｌのＣＡＭを含有する２５０ｍｌのＴＢ中で二次培養して、最終ＯＤ６００を０．０５にした。培養物を、３０℃、２５０ｒｐｍで、約１９５分間成長させて、ＯＤ６００を０．６～０．８にし、１ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。次いで培養物を、３０℃、２５０ｒｐｍで２０時間成長させた。培養物を、４０００ｒｐｍで２０分間、遠心分離した。上澄みを廃棄し、ペレットを、３０ｍｌの２００ｍＭ ＴＥｏＡ緩衝液、ｐＨ８．５に再懸濁した。細胞をペレット化し（４０００ｒｐｍ×２０分）、－８０℃で１２０分間凍結した。凍結したペレットを、３０ｍｌの２００ｍＭ ＴＥｏＡ緩衝液、ｐＨ８．５に再懸濁し、マイクロフルイダイザーシステム（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）を使用して、１８，０００ｐｓｉで溶解した。溶解産物をペレット化し（１０，０００ｒｐｍ×６０分）上澄みを凍結し、凍結乾燥して振盪フラスコ（ＳＦ）酵素を発生させた。
振盪フラスコ（ＳＦ）培養物からの凍結乾燥した溶解産物の調製
上述のように成長した、選択されたＨＴＰ培養物を、１％グルコースおよび３０μｇ／ｍｌ ＣＡＭを含むＬＢ寒天プレート上に播き、３７℃で一晩成長させた。各培養物からの単一コロニーを、１％グルコースおよび３０μｇ／ｍｌ ＣＡＭを含むＬＢ ６ｍｌに移した。培養物を、３０℃、２５０ｒｐｍで１８時間成長させ、約１：５０で、３０μｇ／ｍｌのＣＡＭを含有する２５０ｍｌのＴＢ中で二次培養して、最終ＯＤ６００を０．０５にした。培養物を、３０℃、２５０ｒｐｍで、約１９５分間成長させて、ＯＤ６００を０．６～０．８にし、１ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。次いで培養物を、３０℃、２５０ｒｐｍで２０時間成長させた。培養物を、４０００ｒｐｍで２０分間、遠心分離した。上澄みを廃棄し、ペレットを、３０ｍｌの２００ｍＭ ＴＥｏＡ緩衝液、ｐＨ８．５に再懸濁した。細胞をペレット化し（４０００ｒｐｍ×２０分）、－８０℃で１２０分間凍結した。凍結したペレットを、３０ｍｌの２００ｍＭ ＴＥｏＡ緩衝液、ｐＨ８．５に再懸濁し、マイクロフルイダイザーシステム（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）を使用して、１８，０００ｐｓｉで溶解した。溶解産物をペレット化し（１０，０００ｒｐｍ×６０分）上澄みを凍結し、凍結乾燥して振盪フラスコ（ＳＦ）酵素を発生させた。
（実施例５）
高スループットスクリーニングにおける配列番号４に対するＣＥＮＤＨの活性の改善
配列番号４を、シクロヘキサン（ｃｙｃｌｏｈｅｘｏｎｅ）およびノルボリンから第二級アミン生成物に変換するために改善されたイミンレダクターゼ活性に向けて既に進化した親酵素として選択した。これは、米国特許第９，４８７，７６０号および第９，６９５，４５１号に開示されるように、配列番号２に対して１つのアミノ酸の差異（Ｎ１９８Ｈ）を有する。クロロ－ビフェニルピルベート（化合物（２））およびＬ－アラニン－エステル（化合物（３））からそのアミン生成物（化合物（１））に変換するためのまたはフェニルピルベート（化合物（２ａ））およびＬ－アラニン－エステル（化合物（３））からそのアミン生成物に変換するための、配列番号４のポリペプチドによる検出可能な活性はない。操作された遺伝子のライブラリーを、十分確立された技法（例えば、飽和変異誘発、既に特定された有益な突然変異の組換え）を使用して生成して、フェニルピルベート（化合物（２ａ））およびＬ－アラニン（化合物（３ａ））反応生成物（化合物（１ａ））に向かうそのイミンレダクターゼ活性を改善した。各遺伝子によりコードされたポリペプチドを、実施例２に記載されるようにＨＴＰで生成し、２倍のペレットを得、可溶性溶解産物を実施例３に記載されるように発生させた。
高スループットスクリーニングにおける配列番号４に対するＣＥＮＤＨの活性の改善
配列番号４を、シクロヘキサン（ｃｙｃｌｏｈｅｘｏｎｅ）およびノルボリンから第二級アミン生成物に変換するために改善されたイミンレダクターゼ活性に向けて既に進化した親酵素として選択した。これは、米国特許第９，４８７，７６０号および第９，６９５，４５１号に開示されるように、配列番号２に対して１つのアミノ酸の差異（Ｎ１９８Ｈ）を有する。クロロ－ビフェニルピルベート（化合物（２））およびＬ－アラニン－エステル（化合物（３））からそのアミン生成物（化合物（１））に変換するためのまたはフェニルピルベート（化合物（２ａ））およびＬ－アラニン－エステル（化合物（３））からそのアミン生成物に変換するための、配列番号４のポリペプチドによる検出可能な活性はない。操作された遺伝子のライブラリーを、十分確立された技法（例えば、飽和変異誘発、既に特定された有益な突然変異の組換え）を使用して生成して、フェニルピルベート（化合物（２ａ））およびＬ－アラニン（化合物（３ａ））反応生成物（化合物（１ａ））に向かうそのイミンレダクターゼ活性を改善した。各遺伝子によりコードされたポリペプチドを、実施例２に記載されるようにＨＴＰで生成し、２倍のペレットを得、可溶性溶解産物を実施例３に記載されるように発生させた。
細胞を溶解するため、２００ｍＭ ＴＥｏＡ緩衝液、ｐＨ８．５、１ｍｇ／ｍＬのリゾチーム、および０．５ｍｇ／ｍＬのＰＭＢＳを含有する２００μｌの溶解緩衝液を、細胞ペーストに添加した。細胞を室温で２時間、ベンチトップシェーカー上で振盪させながらインキュベートした。次いでプレートを、４０００ｒｐｍおよび４℃で１５分間、遠心分離し、透明な上澄みを後続の生体触媒反応で使用した。
ＨＴＰ反応を、２００μＬの０．２Ｍ ＴＥｏＡ、ｐＨ８．５、２．５ｇ／Ｌのフェニルピルビン酸ナトリウム、６ｇ／ＬのＬ－アラニン（約５×モル過剰）、１ｇ／Ｌのグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）１０５（米国特許第７，８１６，１１１号および第７，９３９，３０９号）、１０ｇ／Ｌのグルコース、３ｇ／ＬのＮＡＤ＋、および５μｌまたは１０μｌの上記ＨＴＰ上澄みを含有する、９６ウェルのディープウェルプレートで実施した。ＨＴＰプレートを、Ｔｈｅｒｍｏｔｒｏｎｓ（３ｍｍ行程、モデル＃ＡＪ１８５、Ｉｎｆｏｒｓ）で、３０℃、４００ｒｐｍで１２時間インキュベートした。反応を、２００μｌアセトニトリルでクエンチし、ベンチトップシェーカーを使用して５分間、混合した。次いでプレートを、４０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離した。４ｕＬの上澄みを、３９９６ｕＬの水にさらに希釈し、実施例１１に記載されるようにＲａｐｉｄＦｉｒｅにロードして分析した。
配列番号４と比べた活性を、陽性対照に対する倍数改善（ＦＩＯＰＣ）として計算した。これは、各試料の生成物質量スペクトルシグナルを、指定された反応条件下、同じプレートに存在する親バリアント（陽性対照）のフェニルピルベート酸（ｐｈｅｎｙｌｐｕｒｕｖａｔｅ ａｃｉｄ）生成物（化合物（１ａ））質量スペクトルシグナルで除することによって決定し、それを表５．１に示した。
（実施例６）
高スループットスクリーニングにおける配列番号１６と比べたＣＥＮＤＨの活性の改善
配列番号１６を、実施例５に記載されるバリアントをスクリーニングした後に親酵素として選択した。操作された遺伝子のライブラリーを、十分確立された技法（例えば、飽和変異誘発、既に特定された有益な突然変異の組換え）を使用して生成した。各遺伝子によりコードされたポリペプチドを、実施例２に記載されるようにＨＴＰで生成し、２倍のペレットを得、可溶性溶解産物を実施例３に記載されるように発生させた。
高スループットスクリーニングにおける配列番号１６と比べたＣＥＮＤＨの活性の改善
配列番号１６を、実施例５に記載されるバリアントをスクリーニングした後に親酵素として選択した。操作された遺伝子のライブラリーを、十分確立された技法（例えば、飽和変異誘発、既に特定された有益な突然変異の組換え）を使用して生成した。各遺伝子によりコードされたポリペプチドを、実施例２に記載されるようにＨＴＰで生成し、２倍のペレットを得、可溶性溶解産物を実施例３に記載されるように発生させた。
細胞を溶解するために、２００ｍＭのＴＥｏＡ緩衝液、ｐＨ８．５、１ｍｇ／ｍＬのリゾチーム、および０．５ｍｇ／ｍＬのＰＭＢＳを含有する、２００μｌの溶解緩衝液を、細胞ペーストに添加した。細胞を、室温で２時間、ベンチトップシェーカー上で振盪させながらインキュベートした。次いでプレートを１５分間、４０００ｒｐｍおよび４℃で遠心分離し、透明な上澄みを、後続の生体触媒反応で使用した。
ＨＴＰ反応を、２００μＬの０．２Ｍ ＴＥｏＡ、ｐＨ８．５、２．５ｇ／Ｌの３－［４－（３－クロロフェニル）フェニル］－２－オキソ－プロパン酸（本明細書では、クロロ－ビフェニルピルベートまたは（化合物（２））と呼ぶ）、４ｇ／ＬのＬ－アラニン（化合物（３ａ））（約５×モル過剰）、１ｇ／Ｌ ＧＤＨ１０５、１０ｇ／Ｌのグルコース、３ｇ／ＬのＮＡＤ＋、５％のＤＭＳＯ、および１００μｌの上記ＨＴＰ上澄みを含有する、９６ウェルのディープウェルプレートで実施した。ＨＴＰプレートを、Ｔｈｅｒｍｏｔｒｏｎｓ（３ｍｍ行程、モデル＃ＡＪ１８５、Ｉｎｆｏｒｓ）で、３０℃、４００ｒｐｍで１２時間、インキュベートした。並行して、実施例５に記載されるように、フェニルピルベート（化合物（２ａ））およびＬ－アラニン反応（化合物（３ａ））に関してＨＴＰ反応も実施した。反応は、１：１０の比で０．１％のギ酸をメタノールに加えたものでクエンチし、ベンチトップシェーカーを使用して５分間、混合した。次いでプレートを、４０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離し、上澄みをさらに、１：４０の比で水により希釈し、次いで実施例１１に記載されるようにＲａｐｉｄＦｉｒｅにロードして分析した。
配列番号５０と比べた活性を、陽性対照に対する倍数改善（ＦＩＯＰＣ）として計算した。これは、各試料の生成物質量スペクトルシグナルを、指定された反応条件下、同じプレートに存在する親バリアント（陽性対照）のフェニルピルベート酸生成物（化合物（１ａ））またはクロロ－ビフェニルピルベート酸生成物（化合物（１ｂ））質量スペクトルシグナルで、除することによって決定され、これを表６．１に示した。
（実施例７）
配列番号５０と比べたＣＥＮＤＨの活性の改善
配列番号５０を、実施例６に記載されるバリアントをスクリーニングした後に、親酵素として選択した。操作した遺伝子のライブラリーを、十分確立した技法（例えば、飽和変異誘発、既に特定された有益な突然変異の組換え）を使用して生成した。各遺伝子によりコードされたポリペプチドを、実施例２に記載されるようにＨＴＰで生成し、２倍のペレットを得、可溶性溶解産物を実施例３に記載されるように発生させた。
配列番号５０と比べたＣＥＮＤＨの活性の改善
配列番号５０を、実施例６に記載されるバリアントをスクリーニングした後に、親酵素として選択した。操作した遺伝子のライブラリーを、十分確立した技法（例えば、飽和変異誘発、既に特定された有益な突然変異の組換え）を使用して生成した。各遺伝子によりコードされたポリペプチドを、実施例２に記載されるようにＨＴＰで生成し、２倍のペレットを得、可溶性溶解産物を実施例３に記載されるように発生させた。
細胞を溶解するために、２００ｍＭのＴＥｏＡ緩衝液、ｐＨ８．５、１ｍｇ／ｍＬのリゾチーム、および０．５ｍｇ／ｍＬのＰＭＢＳを含有する３００μｌの溶解緩衝液を、細胞ペーストに添加した。細胞を、室温で２時間、ベンチトップシェーカー上で振盪させながらインキュベートした。次いでプレートを、１５分間、４０００ｒｐｍおよび４℃で遠心分離し、透明な上澄みを後続の生体触媒反応に使用した。
ＨＴＰ反応を、実施例６の場合と同様に実施して、クロロ－ビフェニルピルベート（化合物（２））およびＬ－アラニン（化合物（３ａ））反応生成物（化合物（１ｂ））を検出した。
配列番号５０と比べた活性を、陽性対照に対する倍数改善（ＦＩＯＰＣ）として計算し、これを表７．１に示した。これは各試料の生成物質量スペクトルシグナルを、指定された反応条件下、同じプレートに存在する親バリアント（陽性対照）のクロロ－ビフェニルピルベート酸生成物（化合物（１ｂ））質量スペクトルシグナルで除することによって、決定した。
（実施例８）
配列番号３０６と比べたＣＥＮＤＨの活性の改善
配列番号３０６を、実施例７に記載されるバリアントをスクリーニングした後に、親酵素として選択した。操作された遺伝子のライブラリーを、十分確立された技法（例えば、飽和変異誘発、既に特定された有益な突然変異の組換え）を使用して生成した。各遺伝子によりコードされたポリペプチドを、実施例２に記載されるようにＨＴＰで生成し、２倍のペレットを得、可溶性溶解産物を実施例３に記載されるように発生させた。
配列番号３０６と比べたＣＥＮＤＨの活性の改善
配列番号３０６を、実施例７に記載されるバリアントをスクリーニングした後に、親酵素として選択した。操作された遺伝子のライブラリーを、十分確立された技法（例えば、飽和変異誘発、既に特定された有益な突然変異の組換え）を使用して生成した。各遺伝子によりコードされたポリペプチドを、実施例２に記載されるようにＨＴＰで生成し、２倍のペレットを得、可溶性溶解産物を実施例３に記載されるように発生させた。
細胞を溶解するために、２００ｍＭのＴＥｏＡ緩衝液、ｐＨ８．５、１ｍｇ／ｍＬのリゾチーム、および０．５ｍｇ／ｍＬのＰＭＢＳを含有する３００μｌの溶解緩衝液を、細胞ペーストに添加した。細胞を、室温で２時間、ベンチトップシェーカー上で振盪させながらインキュベートした。次いでプレートを、１５分間、４０００ｒｐｍおよび４℃で遠心分離し、透明な上澄みを後続の生体触媒反応で使用した。
ＨＴＰ反応を、２００μＬの０．２Ｍ ＴＥｏＡ、ｐＨ８．５、１．２５ｇ／Ｌのクロロ－ビフェニルピルベート（化合物（２））、３．６ｇ／Ｌの３，３，３－ｄ３ Ｌ－アラニンエステル（化合物（３ｂ））（約５×モル過剰）、０．５ｇ／Ｌ ＰＤＨ ｗｔ、２５ｍＭホスファイト、１．５ｇ／Ｌ ＮＡＤ＋、５％ＤＭＳＯ、および１００μｌの上記ＨＴＰ上澄みを含有する、９６ウェルのディープウェルプレートで実施して、化合物（１ｅ）の生成物を生成した。ＨＴＰプレートを、Ｔｈｅｒｍｏｔｒｏｎｓ（３ｍｍ行程、モデル＃ＡＪ１８５、Ｉｎｆｏｒｓ）で、３０℃、４００ｒｐｍで１２時間、インキュベートした。ＨＴＰ反応は、フェニルピルベート（化合物（２ａ））および３，３，３－ｄ３ Ｌ－アラニンエステル（化合物（３ｂ））反応生成物（化合物（１ｃ））を決定するためにも実施した。反応条件は、１．２５ｇ／Ｌのフェニルピルビン酸ナトリウムおよび２．６ｇ／Ｌの３，３，３－ｄ３ Ｌ－アラニンエステル（約５×モル過剰）を使用したこと以外、上記クロロ－ビフェニルピルベート反応と同じであった。
反応を、１：１０の比のメタノール中０．１％ギ酸でクエンチし、ベンチトップシェーカーを使用して５分間混合した。次いでプレートを、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄みをさらに、１：４０の比で水により希釈し、次いで実施例１１に記載されるようにＲａｐｉｄＦｉｒｅにロードして分析した。クロロ－ビフェニルピルベートおよび３，３，３－ｄ３ Ｌ－アラニンエステルのＨＴＰ反応を、２００μｌのアセトニトリルでもクエンチし、４０ｕＬの上澄みをさらに、１６０ｕＬの５０％アセトニトリル中に希釈し、ＬＣ－ＭＳにロードして、実施例１２に記載されるように分析した。
ＨＴＰ反応は、２００μＬの０．２Ｍ ＴＥＡ、ｐＨ８．５、１．２５ｇ／Ｌのクロロ－ビフェニルピルベート（化合物（２））、約３．６ｇ／Ｌのエチルアミドアラニン（化合物（３ｃ））（約５×モル過剰）、０．５ｇ／Ｌ ＰＤＨ ｗｔ、２５ｍＭホスファイト、１．５ｇ／Ｌ ＮＡＤ＋、５％ＤＭＳＯ、および１００μｌの上記ＨＴＰ上澄みを含有する、９６ウェルのディープウェルプレートでも実施して、化合物（１ｄ）の生成物を生成した。ＨＴＰプレートを、Ｔｈｅｒｍｏｔｒｏｎｓ（３ｍｍ行程、モデル＃ＡＪ１８５、Ｉｎｆｏｒｓ）で、３０℃、４００ｒｐｍで１２時間、インキュベートした。反応を、２００μｌのアセトニトリルでクエンチし、ベンチトップシェーカーを使用して５分間混合した。次いでプレートを、４０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離し、４０ｕＬの上澄みをさらに、１６０ｕＬの５０％アセトニトリル中に希釈し、ＬＣ－ＭＳにロードして、実施例１２に記載されるように分析した。
配列番号３０６と比べた活性を、陽性対照に対する倍数改善（ＦＩＯＰＣ）として計算し、表８．１に示した。これは各試料の生成物質量スペクトルシグナルを、指定された反応条件下、同じプレート内に存在する親バリアント（陽性対照）中、Ｄ３－クロロ－ビフェニルピルベートエステル生成物シグナル（化合物（１ｅ））、Ｄ３－フェニルピルベートエステル生成物シグナル（化合物（１ｃ））、Ｄ３－クロロ－ビフェニルピルベート酸生成物シグナル（加水分解したエステル基質の望ましくない生成物）、Ｄ３－フェニルピルベート酸シグナル（加水分解したエステル基質の望ましくない生成物）、またはクロロ－ビフェニルピルベートアミド生成物（化合物（１ｄ））質量スペクトルシグナルで除することによって、決定された。
（実施例９）
配列番号６４８と比べたＣＥＮＤＨの活性の改善
配列番号６４８を、実施例８に記載されるバリアントのスクリーニング後に親酵素として選択した。操作した遺伝子のライブラリーを、十分確立された技法（例えば、飽和変異誘発、既に特定された有益な突然変異の組換え）を使用して生成した。各遺伝子によりコードされたポリペプチドを、実施例２に記載されるようにＨＴＰで生成し、２倍のペレットを得、可溶性溶解産物を実施例３に記載されるように発生させた。
配列番号６４８と比べたＣＥＮＤＨの活性の改善
配列番号６４８を、実施例８に記載されるバリアントのスクリーニング後に親酵素として選択した。操作した遺伝子のライブラリーを、十分確立された技法（例えば、飽和変異誘発、既に特定された有益な突然変異の組換え）を使用して生成した。各遺伝子によりコードされたポリペプチドを、実施例２に記載されるようにＨＴＰで生成し、２倍のペレットを得、可溶性溶解産物を実施例３に記載されるように発生させた。
細胞を溶解するために、２００ｍＭ ＴＥｏＡ緩衝液、ｐＨ８．５、１ｍｇ／ｍＬのリゾチーム、および０．５ｍｇ／ｍＬのＰＭＢＳを含有する、２００μｌの溶解緩衝液を、細胞ペーストに添加した。細胞を、室温で２時間、ベンチトップシェーカー上で振盪させながらインキュベートした。次いでプレートを１５分間、４０００ｒｐｍおよび４℃で遠心分離し、透明な上澄みを後続の生体触媒反応で使用した。
ＨＴＰ反応を、２００μＬの０．２Ｍ ＴＥｏＡ、ｐＨ８．５、１．２５ｇ／Ｌのクロロ－ビフェニルピルベート（化合物（２））、３．６ｇ／Ｌの３，３，３－ｄ３ Ｌ－アラニンエステル（化合物（３ｂ））（約５×モル過剰）、０．５ｇ／ＬのＰＤＨ ｗｔ、２５ｍＭのホスファイト、１．５ｇ／ＬのＮＡＤ＋、５％ＤＭＳＯ、および１００μｌの上記ＨＴＰ上澄みを含有する、９６ウェルのディープウェルプレートで実施した。ＨＴＰプレートを、Ｔｈｅｒｍｏｔｒｏｎｓ（３ｍｍ行程、モデル＃ＡＪ１８５、Ｉｎｆｏｒｓ）で、３０℃、４００ｒｐｍで１２時間、インキュベートした。ＨＴＰプレートを、Ｔｈｅｒｍｏｔｒｏｎｓ（３ｍｍ行程、モデル＃ＡＪ１８５、Ｉｎｆｏｒｓ）で、３０℃、４００ｒｐｍで１２時間、インキュベートした。反応を、１：１０の比のメタノール中０．１％ギ酸でクエンチし、ベンチトップシェーカーを使用して５分間混合した。次いでプレートを、４０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離し、上澄みをさらに、１：４０の比で水により希釈し、次いで実施例１１に記載されるようにＲａｐｉｄＦｉｒｅにロードして分析した。試料の全てを２００μｌのアセトニトリルでもクエンチし、４０ｕＬの上澄みをさらに、１６０ｕＬの５０％アセトニトリル中に希釈し、実施例１２に記載されるようにＬＣ－ＭＳにロードして分析した。
配列番号６４８と比べた活性を、陽性対照に対する倍数改善（ＦＩＯＰＣ）として計算し、表９．１に示した。これは各試料の生成物質量スペクトルシグナルを、指定された反応条件下、同じプレート内に存在する親バリアント（陽性対照）中のＤ３－クロロ－ビフェニルピルベートエステル生成物（化合物（１ｅ））またはＤ３－クロロ－ビフェニルピルベート酸生成物（加水分解したエステル基質の望ましくない生成物）質量スペクトルシグナルで除することによって、決定された。
（実施例１０）
配列番号７０８と比べたＣＥＮＤＨの活性の改善
配列番号７０８を、実施例９に記載されるバリアントのスクリーニング後に、親酵素として選択した。操作された遺伝子のライブラリーを、十分確立された技法（例えば、飽和変異誘発、既に特定された有益な突然変異の組換え）を使用して生成した。各遺伝子によりコードされたポリペプチドを、実施例２に記載されるようにＨＴＰで生成し、単一ペレットを得、可溶性溶解産物を実施例３に記載されるように発生させた。
配列番号７０８と比べたＣＥＮＤＨの活性の改善
配列番号７０８を、実施例９に記載されるバリアントのスクリーニング後に、親酵素として選択した。操作された遺伝子のライブラリーを、十分確立された技法（例えば、飽和変異誘発、既に特定された有益な突然変異の組換え）を使用して生成した。各遺伝子によりコードされたポリペプチドを、実施例２に記載されるようにＨＴＰで生成し、単一ペレットを得、可溶性溶解産物を実施例３に記載されるように発生させた。
細胞を溶解するために、２００ｍＭ ＴＥｏＡ緩衝液、ｐＨ８．５、１ｍｇ／ｍＬのリゾチーム、および０．５ｍｇ／ｍＬのＰＭＢＳを含有する、２００μｌの溶解緩衝液を、細胞ペーストに添加した。細胞を、室温で２時間、ベンチトップシェーカー上で振盪させながらインキュベートした。次いでプレートを１５分間、４０００ｒｐｍおよび４℃で遠心分離し、透明な上澄みを後続の生体触媒反応で使用した。
ＨＴＰ反応を、２００μＬの０．２Ｍ ＴＥｏＡ、ｐＨ８．５、１．２５ｇ／Ｌのクロロ－ビフェニルピルベート（化合物（２））、３．５ｇ／ＬのＬ－アラニン－エステル（化合物（３））（約５×モル過剰）、０．５ｇ／Ｌ ＰＤＨ ｗｔ、２０ｍＭのホスファイト、１．５ｇ／Ｌ ＮＡＤ＋、５％ＤＭＳＯ、および５０μｌの上記ＨＴＰ上澄みを含有する、９６ウェルのディープウェルプレートで実施した。ＨＴＰプレートを、Ｔｈｅｒｍｏｔｒｏｎｓ（３ｍｍ行程、モデル＃ＡＪ１８５、Ｉｎｆｏｒｓ）で、３０℃、６００ｒｐｍで２０時間インキュベートした。次いで反応をクエンチし、実施例９に記載されるようにさらに分析した。
配列番号７０８と比べた活性を、陽性対照に対する倍数改善（ＦＩＯＰＣ）として計算し、表１０．１に示した。これは各試料の生成物質量スペクトルシグナルを、指定された反応条件下、同じプレートに存在する親バリアント（陽性対照）のクロロ－ビフェニルピルベートエステル生成物（化合物（１））質量スペクトルシグナルで除することによって、決定した。
（実施例１１）
ＣＥＮＤＨ反応生成物のＲａｐｉｄＦｉｒｅ分析検出
実施例５～１０で調製されたＨＴＰアッセイ混合物を、フェニルピルベートアラニン酸生成物（化合物（１ａ））、クロロ－ビフェニル－アラニン酸生成物（化合物（１ｂ））、Ｄ３標識フェニルピルベートアラニンエステル生成物（化合物（１ｃ））、Ｄ３標識クロロ－ビフェニルアラニンエステル生成物（化合物（１ｅ））、およびクロロ－ビフェニルアラニンエステル生成物（化合物（１））ＲａｐｉｄＦｉｒｅ ＳＰＥ－ＭＳ／ＭＳのジアステレオマー型の形成に関して分析し、機器およびパラメーターは以下の表１１．１に記載した。
ＣＥＮＤＨ反応生成物のＲａｐｉｄＦｉｒｅ分析検出
実施例５～１０で調製されたＨＴＰアッセイ混合物を、フェニルピルベートアラニン酸生成物（化合物（１ａ））、クロロ－ビフェニル－アラニン酸生成物（化合物（１ｂ））、Ｄ３標識フェニルピルベートアラニンエステル生成物（化合物（１ｃ））、Ｄ３標識クロロ－ビフェニルアラニンエステル生成物（化合物（１ｅ））、およびクロロ－ビフェニルアラニンエステル生成物（化合物（１））ＲａｐｉｄＦｉｒｅ ＳＰＥ－ＭＳ／ＭＳのジアステレオマー型の形成に関して分析し、機器およびパラメーターは以下の表１１．１に記載した。
（実施例１２）
ＣＥＮＤＨ反応生成物のＬＣ－ＵＶ－ＭＳ分析検出
実施例８～１０の少量の試料と、実施例８における全てのＨＴＰクロロ－ビフェニルピルベートおよびエチルアミドアラニン反応混合物を、表１２．１に示す機器パラメーターおよび条件を使用するＬＣ－ＭＳ法を使用して分析した。それらは、実施例に記載されるように、水およびアセトニトリル中の希釈物として調製した。生成物の質量を、生成物異性体のピークを決定するのに使用した。ＬＣ－ＭＳに基づき、全ての（Ｄ３）－クロロ－ビフェニルピルベート酸生成物を、ジアステレオマー型として検出した。全ての（Ｄ３）－クロロ－ビフェニルピルベートエステル生成物（化合物（１ｅ））は、１．１分で溶出されたｓ，ｒ生成物異性体として検出した。４つのピークが、クロロ－ビフェニルピルベートエチルアミド生成物（化合物（１ｄ））に関して検出され、それぞれ４種のエナンチオマーの１つを表すものと仮定し、全てをクロロ－ビフェニルピルベートエチルアミド生成物の活性を計算するのに使用した。
ＣＥＮＤＨ反応生成物のＬＣ－ＵＶ－ＭＳ分析検出
実施例８～１０の少量の試料と、実施例８における全てのＨＴＰクロロ－ビフェニルピルベートおよびエチルアミドアラニン反応混合物を、表１２．１に示す機器パラメーターおよび条件を使用するＬＣ－ＭＳ法を使用して分析した。それらは、実施例に記載されるように、水およびアセトニトリル中の希釈物として調製した。生成物の質量を、生成物異性体のピークを決定するのに使用した。ＬＣ－ＭＳに基づき、全ての（Ｄ３）－クロロ－ビフェニルピルベート酸生成物を、ジアステレオマー型として検出した。全ての（Ｄ３）－クロロ－ビフェニルピルベートエステル生成物（化合物（１ｅ））は、１．１分で溶出されたｓ，ｒ生成物異性体として検出した。４つのピークが、クロロ－ビフェニルピルベートエチルアミド生成物（化合物（１ｄ））に関して検出され、それぞれ４種のエナンチオマーの１つを表すものと仮定し、全てをクロロ－ビフェニルピルベートエチルアミド生成物の活性を計算するのに使用した。
本出願に引用される全ての刊行物、特許、特許出願、およびその他の文書は、個々の刊行物、特許、特許出願、またはその他の文書のそれぞれがあたかも全ての目的で参照により組み込まれることが個々に示されるのと同じ程度まで、全ての目的でそれらの全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる。
様々な特定の実施形態について例示し記載してきたが、本発明（複数可）の精神および範囲から逸脱することなく様々な変更を行うことができることが理解されよう。
Claims (35)
- 配列番号４、１６、５０、３０６、６４８および／または７０８の参照配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列またはその機能的断片を含む操作されたポリペプチドであって、前記ポリペプチド配列において少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が配列番号４、１６、５０、３０６、６４８および／または７０８を参照して番号を付されている、操作されたポリペプチド。
- 表５．１、６．１、７．１、８．１、９．１および／または１０．１において示す少なくとも１つの操作されたポリペプチドの配列に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはこれらを超えて同一であるポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
- 配列番号４の参照配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、２２２、１４５、１４６、１５３、１６０、２２３、２２６、および２６１から選択される１つまたは複数の位置において少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記位置が配列番号４を参照して番号を付されている、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
- 配列番号１６の参照配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、２９／９４／１８４／２２３／２３２／２８８／２９３、２９／９４／１８４／２３２／２８７／２８８／２９３／３１１、２９／９４／１８４／２３２／２８７／２８８／３１１、２９／９４／１８４／２３２／２８７／２９３／３３２、２９／９４／１８４／２３２／２８８／２９３／３１１／３２４／３５３、２９／９４／１８４／２３２／２８８／３１１／３２４／３３２、２９／９４／１８４／２３２／２９３、２９／９４／１８４／２３２／３１１、２９／９４／１８４／２８７／２９３、２９／９４／１８４／２８７／２９３／３１１／３５３、２９／９４／１８４／２８７／３１１、２９／９４／１８４／２８８／２９３／３２４、２９／９４／１８４／２８８／２９３／３３２／３５３、２９／９４／１８４／２８８／２９８／３３２、２９／９４／１８４／２８８／３５３、２９／９４／１８４／２９３／３１１、２９／９４／１８４／３２４、２９／９４／２２３／２３２／２８７、２９／９４／２２３／２３２／２９３／３１１／３２４、２９／９４／２２３／２８８／２９３、２９／９４／２３２／２８７／２８８／３１１、２９／９４／２３２／２８８／２９３、２９／９４／２８７／２８８／２９３、２９／９４／２８７／２８８／２９３／３５３、２９／９４／２８７／３１１、２９／９４／２９３／３１１／３２４、２９／９４／２９３／３３２／３５３、２９／９４／３１１、２９／９４／３２４／３５３、２９／１８４、２９／１８４／２２３／２８８／２９３／３２４、２９／１８４／２３２／２８８、２９／１８４／２８７、２９／１８４／２８７／２８８／２９３、２９／１８４／２８７／２８８／２９３／３１１、２９／１８４／２８７／３１１／３３２、２９／１８４／２８８／２９３、２９／１８４／２８８／２９３／３１１、２９／１８４／２９３、２９／１８４／２９３／３１１、２９／１８４／２９３／３２４、２９／１８４／３５３、２９／２２３／２８７／２８８／２９３／３５３、２９／２３２／２８７／２８８／２９３／３３２／３５３、２９／２８７／２８８／２９３、２９／２８７／２８８／２９３／３２４／３５３、２９／２８８／２９３、２９／３１１、２９／３１１／３３２、２９／３５３、７２／９４／１８４／２８８／３１１、８６、９４／９６／２２３／２８７／２８８／２９３／３１１／３２４／３３２、９４／９９／１８４／２９３／３１１／３３２／３５３、９４／１８４／２２３、９４／１８４／２２３／２３２／２８７／３１１、９４／１８４／２２３／２８８／２９３、９４／１８４／２２３／２９３、９４／１８４／２３２／２８７／２８８、９４／１８４／２３２／２８７／２８８／３２４／３３２、９４／１８４／２３２／２８７／２９３、９４／１８４／２３２／２８７／２９３／３３２、９４／１８４／２８７／２８８／２９３、９４／１８４／２８７／２８８／３１１、９４／１８４／２８７／２９３／３１１／３２４／３５３、９４／１８４／２８７／３１１、９４／１８４／２８７／３５３、９４／１８４／２８８／２９３、９４／１８４／２８８／２９３／３１１、９４／１８４／２８８／２９３／３１１／３３２、９４／１８４／２９３、９４／１８４／２９３／３１１、９４／１８４／２９３／３３２／３５３、９４／２２３／２３２／３１１／３５３／３５５／３５６／３５７／３５８／３５９、９４／２２３／２８７／２８８／２９３、９４／２２３／２８８／２９３／３１１、９４／２３２／２８７／２８８／２９３／３５３、９４／２３２／２８８／２９３／３５３、９４／２３２／２９３、９４／２３２／２９３／３２４／３３２、９４／２３２／３１１、９４／２８７／２８８／２９３、９４／２８７／２８８／３１１／３２４、９４／２８８／２９３、９４／２８８／２９３／３２４、９４／２９３／３２４、９４／３１１／３２４、１５３、１８４／２２３、１８４／２２３／２８７／２８８／３５３、１８４／２３２／２８７／２８８／２９３／３１１、１８４／２３２／２８７／２８８／３２４／３５３、１８４／２３２／２８７／２９３／３３２、１８４／２８７／２８８、１８４／２８７／２８８／２９３、１８４／２８７／２８８／２９３／３２４／３５３、１８４／２８７／２９３、１８４／２８７／２９３／３１１、１８４／２８８／２９３／３１１／３２４、１８４／３３２／３５３、２０５、２２３／２３２／２８７／２８８／３３２／３５３、２２３／２８７／２８８、２２３／２８７／２８８／２９３／３１１、２２３／２８７／３１１／３５３、２２３／２８８／２９３、２３２／２８７／２８８／２９３、２３２／２８７／２８８／２９３／３１１、２３２／２８７／２８８／２９３／３２１、２３２／２８７／３１１、２３２／２８８／２９３、２３２／２８８／２９３／３３２、２３４／２８７／２８８／２９３／３１１、２８７／２８８／２９３、２８７／２８８／３１１／３２４、２８７／２９３、２８７／３１１、２８７／３１１／３３２、２８７／３２４、２８８／２９３、２８８／２９３／３１１／３２４／３５３、２８８／２９３／３２４、２９３／３１１、および３１１／３３２から選択される１つまたは複数の位置において少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記位置が配列番号１６を参照して番号を付されている、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
- 配列番号５０の参照配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、２９／５７／９４／１５３／１８４／２０５／２６１／２６５／２８７、２９／５７／９４／１５３／２０５／２６５、２９／５７／９４／１８４／２０５／２７７／３５３、２９／５７／９４／２０５／２５９／２６１／２６５、２９／５７／９４／２０５／２６１／３５３、２９／５７／１５３／１８４／２０５／２５９／２６１／２６５／２７７、２９／５７／１５３／１８４／２０５／３５３、２９／５７／１５３／２０５／２６１／２６５、２９／５７／１５３／２０５／２６１／２６５／２７７、２９／５７／１５３／２０５／２６５／２７７、２９／５７／１５３／２０５／２７７／３５３、２９／５７／１８４／２０５／２５９／２６１／２６５／２７７／２８７／３５７、２９／５７／１８４／２０５／２５９／２６１／２６５／２８７、２９／５７／２０５／２５９／２６１／２６５、２９／５７／２０５／２５９／２６１／２６５／２８７、２９／５７／２０５／２６１／２６５／３５３、２９／９４／１５３／１８４／２０５、２９／９４／１５３／２０５／２５９／２６１／２６５、２９／９４／１５３／２０５／２５９／２６１／２８７、２９／９４／１５３／２０５／２５９／２６１／２８７／３５３、２９／９４／１８４／２０５／２５９／２６１、２９／９４／１８４／２０５／２６１、２９／９４／２０５、２９／９４／２０５／２５９／２６１／２８７、２９／９４／２０５／２６１、２９／９４／２６１／２６５／２８７／３５３、２９／１５３／１８４／２０５、２９／１５３／２０５、２９／１５３／２０５／２５９／２６１／２６５／２７７／２８７、２９／１５３／２６１／２６５／２８７／３５３、２９／１８４／２０５、２９／１８４／２０５／２５９／２６１／２７７、２９／１８４／２０５／３５３、２９／１８４／２６１／２６５、２９／１８４／２６５、２９／２０５、２９／２０５／２５９／２６１、２９／２０５／２５９／２６１／２６５／２８７、２９／２０５／２５９／２６１／２８７、２９／２０５／２６１、２９／２０５／２６１／２６５、２９／２０５／２６１／２６５／３５３、２９／２０５／２６１／３５３、２９／２０５／２７７、２９／２０５／２８７、２９／２０５／２８７／３５３、２９／２５９／２６１／２６５、２９／２６１／３５３、５７／９４／１５３／１８４／２０５／２５９／２６１、５７／９４／１５３／２０５／２６１／２６５、５７／９４／１５３／２５９／２６１／２６５、５７／９４／１５３／２６１／２６５、５７／９４／１８４／２０５／２６１／２６５／２８７、５７／９４／１８４／２６１／２６５／２８７、５７／９４／２０５／２５９、５７／９４／２０５／２５９／２６１／２６５／２７７／２８７、５７／９４／２０５／２６１／２６５、５７／９４／２０５／２７７、５７／１５３／２０５／２５９／２６１／２６５／２８７、５７／１５３／２０５／２５９／２６５／２７７、５７／１５３／２０５／２６１、５７／１５３／２０５／２６１／２６５、５７／１５３／２０５／２６５、５７／１５３／２６１／２６５、５７／１５３／２６１／２６５／２８７／３５３、５７／２０５、５７／２０５／２５９／２６１、５７／２０５／２５９／２６１／２６５／２７７／２８７／３５３、５７／２０５／２５９／２６１／２８７／３５３、５７／２０５／２５９／２６５、５７／２０５／２６１、５７／２０５／２６１／２６５／２７７／２８７／３５３、５７／２０５／２６１／２７７、５７／２０５／２６１／２７７／３５３、５７／２６１／２６５／３５３、９４／１２６／１８４／２０５／２５９／２６１／２６５、９４／１５３／１８４／２０５、９４／１５３／１８４／２５９／２６１／２６５、９４／１５３／２０５／２５９／２６１／２６５／３５３、９４／１５３／２０５／２８７、９４／１５３／２０５／２８７／３５３、９４／１５３／２０５／３５３、９４／１８４／２０５／２５９／２６１、９４／１８４／２０５／２５９／２６１／２６５／２８７、９４／１８４／２０５／２５９／２６１／３５３、９４／１８４／２０５／２６１／２６５／２８７／３５３、９４／１８４／３５３、９４／２０５、９４／２０５／２５９／２６１／２６５、９４／２０５／２５９／２６１／２６５／２７７／２８７、９４／２０５／２５９／２６１／２６５／３５３、９４／２０５／２５９／２６１／２８７／３５３、９４／２０５／２６１／２６５／２７７、９４／２０５／２６１／２６５／３５３、９４／２０５／２６１／３５３、９４／２０５／２７７、９４／２５９／２６１／２６５、１５３／１８４／２０５／２６１／２７７／２８７、１５３／１８４／２６１／２６５／２８７、１５３／２０５、１５３／２０５／２６１、１５３／２０５／２６１／２６５／２８７、１５３／２５９／２６１／２６５、１５３／２５９／２６５／２８７、１５３／２６１／２６５、１５３／２６１／２６５／２８７／３５３、１５３／２６５、１５３／２６５／２７７／２８７／３５３、１８４／２０５、１８４／２０５／２５９／２６１／２８７、１８４／２０５／２６１、１８４／２０５／２６１／２６５、１８４／２０５／２６１／２８７、１８４／２０５／２７７、１８４／２０５／２８７／３５３、１８４／２６１／２６５／２８７、２０２、２０５、２０５／２５９／２６１、２０５／２５９／２６１／２６５、２０５／２５９／２６１／２６５／２７７／２８７／３５３、２０５／２５９／２６１／２７７／２８７、２０５／２５９／２６５、２０５／２６１、２０５／２６１／２６５、２０５／２６１／２６５／２７４、２０５／２６１／２６５／２８７、２０５／２６１／２６５／２８７／３５３、２０５／２６１／２７７、２０５／２６１／３５３、２０５／２７７／２８７、２０５／２８７、２２３、２２５、２５６、２５９／２６１／２６５、２６１／２６５／２８７、２６５／２８７、２８３、および２９４から選択される１つまたは複数の位置において少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記位置が配列番号５０を参照して番号を付されている、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
- 配列番号３０６の参照配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、１９７／１９８／２０１／２５９、１９８／２０１／２５９／２８０、２０２／２０５／２２１／２２３／２２５／２６１、２０２／２０５／２２１／２２３／２６１／２９４、２０２／２２１／２２２／２２５／２５６／２６１／２９４、２０２／２２１／２２３／２２５／２８３／２９４、２０５／２２１／２２２、２０５／２２１／２２３／２２５／２５６／２６１／２８３、２１９、２２１／２２２／２２３／２２５、２２１／２２３、２２１／２２３／２２５、２２１／２２３／２２５／２５６／２６１、２２１／２２３／２２５／２６１、２２１／２２３／２２５／２９４、２２１／２２５、２２１／２２５／２５６、２２１／２２５／２５６／２６１、２２１／２２５／２５６／２６１／２８３／２９４、２２３／２２５／２５６／２６１、２２５／２５６／２６１、２８０、および２８０／３０６から選択される１つまたは複数の位置において少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記位置が配列番号３０６を参照して番号を付されている、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
- 配列番号６４８の参照配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、１７／１９８／２５９／２８０、１９７、１９７／１９８、１９７／１９８／２２３／２５９、１９７／２２３／２７７／２８０、１９７／２５９、１９７／２７７、１９８、１９８／２２３、１９８／２２３／２５９／２７７／２８０、１９８／２５９、１９８／２５９／２７７、１９８／２５９／２７７／２８０、１９８／２７７／２８０、２２３／２５９、２２３／２５９／２８０、２５８、２５９、２５９／２６８／２７７／２８０、２５９／２７７、２５９／２８０、２６３、２７７、および２８０から選択される１つまたは複数の位置において少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記位置が配列番号６４８を参照して番号を付されている、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
- 配列番号７０８の参照配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、１４１、１５４、１９７、１９７／１９８、および２７８から選択される１つまたは複数の位置において少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記位置が配列番号７０８を参照して番号を付されている、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
- 配列番号４、１６、５０、３０６、６４８および／または７０８に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはこれらを超えて同一であるポリペプチド配列またはその機能的断片を含む、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
- 配列番号４、１６、５０、３０６、６４８および／もしくは７０８またはこれらの機能的断片を含む、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
- 配列番号６から配列番号８０２において示す任意の偶数番号の配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
- 配列番号６～８０２の偶数番号の配列において示すポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
- 配列番号４の操作されたポリペプチドと比較して少なくとも１つの改善された特徴を示すポリペプチド配列を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
- 前記改善された特徴が、構造式（ＩＶ）
Ｒ１は、水素原子、または必要に応じて置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アリールアルコキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、ハロアルキル、アルキルチオアルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、およびヘテロアリールアルキルから選択され；
Ｒ２は、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシアルキル、カルボキシ、アミノカルボニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボキシアルキル、アルキルアミノ、ハロアルキル、アルキルチオアルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、およびヘテロアリールアルキルから独立して選択され；
Ｒ３は、メチル、ｄ３－メチルおよびエチルから独立して選択される、
請求項１３に記載の操作されたポリペプチド。 - 前記改善された特徴が、化合物（１）
- 前記改善された特徴が、化合物（２）
- 前記改善された特徴が、化合物（３）
- 前記改善された特徴が、化合物（２）
- 前記改善された特徴が、表２における変換反応（Ａ）から（Ｅ）のうちの１つまたは複数の改善された変換を含む、請求項１３に記載の操作されたポリペプチド。
- 前記改善された特徴が改善されたエナンチオ選択性を含む、請求項１３に記載の操作されたポリペプチド。
- 前記改善された特徴が改善された安定性を含む、請求項１３に記載の操作されたポリペプチド。
- 精製されている、請求項１から２１のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
- 請求項１から２２のいずれか一項に記載の少なくとも１つのポリペプチドを含む組成物。
- 請求項１から２２のいずれか一項に記載の少なくとも１つの操作されたポリペプチドをコードする、操作されたポリヌクレオチド配列。
- 少なくとも１つの操作されたポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド配列であって、前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号３、１５、４９、３０５、６４７および／または７０７に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはこれらを超える配列同一性を含み、前記ポリペプチドのポリヌクレオチド配列が、１つまたは複数の位置において少なくとも１つの置換を含む、操作されたポリヌクレオチド配列。
- 配列番号３、１５、４９、３０５、６４７および／または７０７に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはこれらを超える配列同一性を含む、請求項２４または２５に記載の操作されたポリヌクレオチド配列。
- 配列番号３、１５、４９、３０５、６４７および／または７０７を含む、請求項２４から２６のいずれか一項に記載の操作されたポリヌクレオチド配列。
- 配列番号５から配列番号８０１において示す奇数番号の配列を含む、操作されたポリヌクレオチド。
- 請求項２４から２８のいずれか一項に記載の操作されたポリヌクレオチドを含むベクター。
- 少なくとも１つの制御配列をさらに含む、請求項２９に記載のベクター。
- 請求項２９および／または３０に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項１から２２のいずれか一項に記載の少なくとも１つの操作されたポリペプチドを産生する、請求項３１に記載の宿主細胞。
- 宿主細胞において操作されたポリペプチドを産生する方法であって、少なくとも１つの操作されたポリペプチドが産生されるような好適な条件下、培養培地中で請求項３１および／または３２に記載の宿主細胞を培養するステップを含む、方法。
- 前記操作されたポリペプチドを回収するステップをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
- 前記少なくとも１つの操作されたポリペプチドを精製するステップをさらに含む、請求項３３および／または３４に記載の方法。
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