JP2023543990A - キラルアミンを合成するための操作された生体触媒および方法 - Google Patents
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Abstract
本開示は、アミンの生産のための操作されたトランスアミナーゼポリペプチド、操作されたトランスアミナーゼをコードするポリヌクレオチド、操作されたトランスアミナーゼを発現することが可能な宿主細胞、および活性医薬用薬剤の生産で有益な化合物を調製するために操作されたトランスアミナーゼを使用する方法を提供する。本発明の操作されたトランスアミナーゼは、Vibrio fluvialisの野生型トランスアミナーゼまたは野生型トランスアミナーゼの操作されたバリアントと比較して増強された活性および熱安定性を有する。
Description
本出願は、本明細書によって全ての目的のために参照により完全に組み込まれている、2020年9月28日に出願された米国仮特許出願第63/084,166号に基づく優先権を主張する。
1.技術分野
本開示は、キラルアミンの調製のためのトランスアミナーゼ生体触媒および生体触媒を使用するプロセスに関する。
本開示は、キラルアミンの調製のためのトランスアミナーゼ生体触媒および生体触媒を使用するプロセスに関する。
2.配列表、表またはコンピュータプログラムへの参照
配列表の公式なコピーは、2021年9月16日に作成されたサイズが984キロバイトのファイル名が「CX2-212WO1_ST25.txt」のASCIIフォーマットのテキストファイルとして、EFSウェブを通して本明細書と同時に提出される。EFSウェブを通して提出される配列表は本明細書の一部であり、参照により本明細書に完全に組み込まれる。
配列表の公式なコピーは、2021年9月16日に作成されたサイズが984キロバイトのファイル名が「CX2-212WO1_ST25.txt」のASCIIフォーマットのテキストファイルとして、EFSウェブを通して本明細書と同時に提出される。EFSウェブを通して提出される配列表は本明細書の一部であり、参照により本明細書に完全に組み込まれる。
アミノ受容体化合物(I)(所望のキラルアミン生成物(III)の前駆体)を、アミノ供与体化合物(II)と反応させる。トランスアミナーゼは、アミノ受容体(I)のケト基へのアミノ供与体(II)のアミン基の転移を触媒する。反応は、所望のキラルアミン生成物化合物(III)および副産物としてケトン基を有する新規のアミノ受容体化合物(IV)をもたらす。
スキーム1の反応を触媒する能力を有する野生型トランスアミナーゼは、Alcaligenes denitrificans、Bordetella bronchiseptica、Bordetella parapertussis、Brucella melitensis、Burkholderia malle、Burkholderia pseudomallei、Chromobacterium violaceum、Oceanicola granulosus HTCC2516、Oceanobacter sp. RED65、Oceanospirillum sp. MED92、Pseudomonas putida、Ralstonia solanacearum、Rhizobium meliloti、Rhizobium sp.(NGR234株)、Bacillus thuringensis、Klebsiella pneumoniaおよびVibrio fluvialisを限定されずに含む、様々な微生物から単離されている(例えば、Shin et al., 2001, Biosci. Biotechnol, Biochem. 65:1782-1788を参照する)。これらの野生型トランスアミナーゼ遺伝子およびコードされるポリペプチドのいくつかが配列決定をされており、例えば、Ralstonia solanacearum(Genbank受託番号YP_002257813.1、GI:207739420)、Burkholderia pseudomallei 1710b(Genbank受託番号ABA47738.1、GI:76578263)、Bordetella petrii(Genbank受託番号AM902716.1、GI:163258032)およびVibrio fluvialis(Genbank受託番号AEA39183.1、GI:327207066)が挙げられる。クラスEC2.6.1.18およびEC2.6.1-19の2つの野生型トランスアミナーゼが結晶化され、構造が決定されている(例えば、Yonaha et al., 1983, Agric. Biol. Chem. 47 (10):2257-2265を参照する)。
Vibrio fluvialis JS17からの野生型トランスアミナーゼは、スキーム2の反応を触媒する補因子としてピリドキサール-5’-ホスフェートを使用するω-アミノ酸:ピルビン酸トランスアミナーゼ(E.C.2.6.1.18)である。
Vibrio fluvialisからのこの野生型トランスアミナーゼは、カルボキシル基を有しない脂肪族アミノ供与体への触媒活性を示すことも報告されている。
キラルアミン化合物は、セファロスポリンまたはピロリジン誘導体などの様々な医薬の調製のための中間体またはシントンとして、医薬、農薬および化学産業で頻繁に使用されている。キラルアミン化合物の多数のこれらの工業的応用は、1つの特定の光学活性型だけを使用することを含み、例えば(R)または(S)鏡像異性体だけが生理的に活性である。トランスアミナーゼは、例えばアミノ酸の鏡像異性的富化における光学的に純粋なキラルアミン化合物の立体選択的合成のための潜在的工業的用途を有する(例えば、Shin et al., 2001, Biosci. Biotechnol. Biochem. 65:1782-1788;Iwasaki et al., 2003, Biotech. Lett. 25:1843-1846;Iwasaki et al., 2004, Appl. Microb. Biotech. 69:499-505, Yun et al., 2004, Appl. Environ. Microbiol. 70:2529-2534;およびHwang et al., 2004, Enzyme Microbiol. Technol. 34:429-426を参照する)。
トランスアミナーゼの使用の他の例には、プレギャバリンの中間体および前駆体の調製(例えば、WO2008/127646);シクロパミン類似体の酵素的アミノ基転移(例えば、WO2011/017551);β-アミノ酸の立体特異的合成および鏡像異性富化(例えば、WO2005/005633);アミンの鏡像異性富化(例えば、米国特許第4,950,606号;米国特許第5,300,437号;および米国特許第5,169,780号);ならびにアミノ酸および誘導体の生産(例えば、米国特許第5,316,943号;米国特許第4,518,692号;米国特許第4,826,766号;米国特許第6,197,558号;および米国特許第4,600,692号)が含まれる。
しかし、キラルアミン化合物の調製のための反応を触媒するために使用されるトランスアミナーゼは、工業的に有益なプロセス条件(例えば、溶媒、温度)の不安定性および狭い基質認識などの、商業的利用に望ましくない特性を有する可能性がある。したがって、光学活性型のキラルアミン化合物を調製するための工業プロセスで使用することができる、他のタイプのトランスアミナーゼ生体触媒の必要性がある。
トランスアミナーゼの使用の他の例には、プレギャバリンの中間体および前駆体の調製(例えば、WO2008/127646);シクロパミン類似体の酵素的アミノ基転移(例えば、WO2011/017551);β-アミノ酸の立体特異的合成および鏡像異性富化(例えば、WO2005/005633);アミンの鏡像異性富化(例えば、米国特許第4,950,606号;米国特許第5,300,437号;および米国特許第5,169,780号);ならびにアミノ酸および誘導体の生産(例えば、米国特許第5,316,943号;米国特許第4,518,692号;米国特許第4,826,766号;米国特許第6,197,558号;および米国特許第4,600,692号)が含まれる。
しかし、キラルアミン化合物の調製のための反応を触媒するために使用されるトランスアミナーゼは、工業的に有益なプロセス条件(例えば、溶媒、温度)の不安定性および狭い基質認識などの、商業的利用に望ましくない特性を有する可能性がある。したがって、光学活性型のキラルアミン化合物を調製するための工業プロセスで使用することができる、他のタイプのトランスアミナーゼ生体触媒の必要性がある。
Shin et al., 2001, Biosci. Biotechnol, Biochem. 65:1782-1788
Yonaha et al., 1983, Agric. Biol. Chem. 47 (10):2257-2265
Iwasaki et al., 2003, Biotech. Lett. 25:1843-1846
Iwasaki et al., 2004, Appl. Microb. Biotech. 69:499-505
Yun et al., 2004, Appl. Environ. Microbiol. 70:2529-2534
Hwang et al., 2004, Enzyme Microbiol. Technol. 34:429-426
4.要旨
本開示はトランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチド、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ポリペプチドを作製する方法、およびケトン基質のアミン生成物への生体触媒変換のためにポリペプチドを使用する方法を提供する。本開示のトランスアミナーゼ活性を有するポリペプチドは、Vibrio fluvialisの野生型トランスアミナーゼまたは野生型トランスアミナーゼの操作されたバリアントと比較して増強された活性および熱安定性を有する、(アミノ酸配列番号4の)前もって操作されたトランスアミナーゼポリペプチドと比較して1つまたは複数の残基の差を有するように操作されている。アミノ酸残基の差は、とりわけ活性、立体選択性、安定性、発現、生成物寛容性および基質寛容性を含む、様々な酵素特性に影響を及ぼす残基位置に位置する。
本開示はトランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチド、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ポリペプチドを作製する方法、およびケトン基質のアミン生成物への生体触媒変換のためにポリペプチドを使用する方法を提供する。本開示のトランスアミナーゼ活性を有するポリペプチドは、Vibrio fluvialisの野生型トランスアミナーゼまたは野生型トランスアミナーゼの操作されたバリアントと比較して増強された活性および熱安定性を有する、(アミノ酸配列番号4の)前もって操作されたトランスアミナーゼポリペプチドと比較して1つまたは複数の残基の差を有するように操作されている。アミノ酸残基の差は、とりわけ活性、立体選択性、安定性、発現、生成物寛容性および基質寛容性を含む、様々な酵素特性に影響を及ぼす残基位置に位置する。
サボリチニブまたは3-[(1S)-1-イミダゾ[1,2-a]ピリジン-6-イルエチル]-5-(1-メチルピラゾール-4-イル)トリアゾロ[4,5-b]ピラジン(1)は、Hutchison MediPharma LimitedおよびAstraZenecaによって開発された小分子薬物である。それは、非小細胞肺がんおよび進行したか転移性の乳頭状腎臓細胞がんの患者を処置するために、オシメルチニブと組み合わせて試験されている強力なc-Metキナーゼ阻害剤である(下のセクション5.3を参照する)。
化合物(1)を生成する現行の化学合成アプローチは5ステップを含み、第1ステップは、エナンチオ選択性アミン生成物、化合物(3)を生成する基質ケトン、化合物(2)のアミノ基転移を含む(WO2020/053198)。操作された(S)-選択的アミノトランスアミナーゼ酵素は、工業的プロセス条件下でのこの変換のために使用することができる。選択性は好適であったが、工業生産を最適化するためにより高い基質ロードを許容するように酵素の活性を向上させる必要性がある。この開示は、向上した活性および基質寛容性を有する操作されたS選択的アミノ基転移酵素を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号4および/または6またはその機能的断片と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、操作されたトランスアミナーゼを提供し、ここで前記操作されたトランスアミナーゼは、前記ポリペプチド配列中に少なくとも1つの置換または置換のセットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置は配列番号4および/または6に関して番号付けされる。一部の実施形態では、操作されたトランスアミナーゼは、配列番号4と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を含むポリペプチド配列を含み、ここで前記操作されたトランスアミナーゼは、前記ポリペプチド配列中に、13、41/57/130/415/419、41/113/415、53/57、88、88/89、97/415、148、227、260、302、355/415/419、362、417および443から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの置換または置換のセットを含み、ここで前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置は配列番号4に関して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、操作されたトランスアミナーゼは、配列番号6と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を含むポリペプチド配列を含み、ここで前記操作されたトランスアミナーゼは、前記ポリペプチド配列中に、13、13/41/57/88/130/415/417、13/41/57/89/97/417、13/41/57/97/130/415/417、13/41/57/97/130/415/417/443、13/41/57/97/443、13/41/57/130/417、13/41/57/417、13/41/88、13/41/88/89、13/41/88/89/97/415/443、13/41/88/89/417、13/41/88/97、13/41/88/130/415/443、13/41/88/443、13/41/89/130/148/443、13/41/89/417、13/41/89/443、13/41/97/130/417、13/41/97/415、13/41/97/415/417、13/41/97/417、13/41/97/417/443、13/41/130/415/443、13/41/415、13/41/415/417、13/41/415/443、13/41/417、13/41/417/443、13/57/88/89/130/415/443、13/57/88/97、13/57/88/97/415/443、13/57/88/130/415、13/57/88/130/417/443、13/57/88/415、13/57/97/130/415/417/443、13/57/97/417、13/88/89/415/417、13/88/89/415/417/443、13/88/130/443、13/88/415、13/89/97/415/417、13/89/97/417、13/89/417、13/97/148/415、13/97/415、13/97/415/417、13/97/417、13/130/415、13/130/415/417、13/130/417、13/130/417/443、13/415、13/415/417、13/415/417/443、13/415/443、13/417、13/417/443、13/443、23/53/162/233/277/315/415/418/432、23/53/315/417/418、23/277/315/395/415/417/432、23/277/395/417/418、23/395/418、23/418、41、41/57/88、41/57/88/415/443、41/57/130/148/415/417、41/57/130/443、41/57/415/417、41/88/89/97/130/415、41/88/89/415/417、41/88/97/130/417、41/88/130/415/417、41/88/443、41/97/130/148/415/417/443、41/97/417、41/97/417/443、41/130/415、41/130/415/417/443、41/130/415/443、41/415/443、41/417、41/417/443、53/162、53/162/395/417、53/162/418/432、53/233、53/277/395、53/277/395/417/418、53/277/415/417、57/88/97/130/415/443、57/88/97/130/417、57/88/97/417、57/97/130/148/417/443、57/417、88、88/89/130/417、88/97/415/417/443、88/130/417/443、88/148/417/443、88/415、88/415/417、88/415/417/443、88/417、89/97/415/417、89/97/417、89/443、97、97/130、97/148/415、97/415、97/415/417、97/417、130、130/415、130/417、130/443、162/233/415/417、162/395/415/417、162/418、233/315/415/417、233/315/417、277/395/415/418/432、315、315/415/418/432、395/418、415、415/417、415/417/418、415/417/418/432、415/417/443、415/443、417および443から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの置換または置換のセットを含み、ここで前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置は配列番号6に関して番号付けされる。
一部のさらなる実施形態では、操作されたトランスアミナーゼは、表5.1および/または6.1に示す少なくとも1つの操作されたトランスアミナーゼバリアントの配列と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を含むポリペプチド配列を含む。さらなる一部の追加の実施形態では、操作されたトランスアミナーゼは、表5.1および/または6.1で提供されるバリアントの操作されたトランスアミナーゼである。一部のさらなる実施形態では、操作されたトランスアミナーゼは、配列番号4および/または6に示す少なくとも1つの操作されたトランスアミナーゼバリアントの配列と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高く同一であるポリペプチド配列を含む。一部のさらなる実施形態では、操作されたトランスアミナーゼは、配列番号4および/または6を含むポリペプチド配列を含む。一部のさらなる実施形態では、操作されたトランスアミナーゼは、配列番号6~358の偶数番号の配列に示す少なくとも1つの操作されたトランスアミナーゼバリアントの配列と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高く同一であるポリペプチド配列を含む。さらなる一部の追加の実施形態では、操作されたトランスアミナーゼは、配列番号6~358の偶数番号の配列に示すポリペプチド配列を含む。一部のさらなる実施形態では、操作されたトランスアミナーゼは、野生型V.fluvialisトランスアミナーゼと比較して、または野生型トランスアミナーゼの操作されたバリアントと比較して少なくとも1つの向上した特性を含む。一部の追加の実施形態では、操作されたトランスアミナーゼの向上した特性は、基質への向上した活性を含む。一部のさらなる実施形態では、基質は化合物(2)を含む。一部の追加の実施形態では、操作されたトランスアミナーゼの向上した特性は、向上した基質寛容性を含む。さらに一部の追加の実施形態では、操作されたトランスアミナーゼの向上した特性は、向上した熱安定性を含む。一部の追加の実施形態では、操作されたトランスアミナーゼは精製される。本開示は、本明細書で提供される操作されたトランスアミナーゼを含む組成物も提供する。一部の実施形態では、組成物は本明細書で提供される1つよりも多くの操作されたトランスアミナーゼを含む。
本開示は、本明細書で提供される少なくとも1つの操作されたトランスアミナーゼをコードするポリヌクレオチド配列も提供する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は少なくとも1つの操作されたトランスアミナーゼをコードし、前記ポリヌクレオチド配列は、配列番号3および/または5と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を含み、ここで前記操作されたトランスアミナーゼのポリヌクレオチド配列は、1つまたは複数の位置に少なくとも1つの置換を含む。一部のさらなる実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号3および/または5、またはその機能的断片と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を含む、少なくとも1つの操作されたトランスアミナーゼをコードする。さらに一部の追加の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は制御配列に作動可能に連結される。さらに一部のさらなる実施形態では、ポリヌクレオチド配列はコドン最適化される。
本開示は、本明細書で提供される操作されたトランスアミナーゼをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターも提供する。一部の実施形態では、発現ベクターは、配列番号3および/または5と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を含む少なくとも1つのポリヌクレオチド配列を含み、ここで前記操作されたトランスアミナーゼのポリヌクレオチド配列は、1つまたは複数の位置に少なくとも1つの置換を含む。一部の実施形態では、発現ベクターは、配列番号3および/または5、またはその機能的断片と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を含む、少なくとも1つの操作されたトランスアミナーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含む。
本開示は、本明細書で提供される少なくとも1つの発現ベクターを含む宿主細胞も提供する。一部の実施形態では、宿主細胞は、本明細書で提供される少なくとも1つのポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、配列番号3および/または5と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を含む少なくとも1つのポリヌクレオチド配列を含み、ここで操作されたトランスアミナーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、1つまたは複数の位置に少なくとも1つの置換を含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、配列番号4および/または6またはその機能的断片と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を含む、少なくとも1つの操作されたトランスアミナーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、操作されたトランスアミナーゼをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド配列は、少なくとも1つの発現ベクターの中に存在する。
本開示は、宿主細胞の中で操作されたトランスアミナーゼを生成する方法であって、少なくとも1つの操作されたトランスアミナーゼが生成されるような好適な条件の下で、本明細書で提供される宿主細胞を培養することを含む方法も提供する。一部の実施形態では、本方法は、培養および/または宿主細胞から少なくとも1つの操作されたトランスアミナーゼを回収することをさらに含む。一部の追加の実施形態では、本方法は、前記少なくとも1つの操作されたトランスアミナーゼを精製するステップをさらに含む。
一部の実施形態では、トランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは固体支持体の上に固定化され、必要に応じて固体支持体は、エポキシド官能基を有するポリメタクリレート、アミノエポキシド官能基を有するポリメタクリレート、スチレン/DVBコポリマーまたはオクタデシル官能基を有するポリメタクリレートを含むビーズまたは樹脂から選択される。
一部の実施形態では、トランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、好適な反応条件の下で化合物(2)の基質を化合物(3)の生成物へ変換することが可能である(下のセクション5.3を参照する)。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、好適な反応条件の下で化合物(2)を参照配列(例えば配列番号4および/または6)の活性よりも少なくとも1.2倍、2倍、5倍、10倍、20倍、25倍、50倍、75倍、100倍またはそれよりも大きく化合物(3)へ変換することが可能である。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、化合物(2)を参照配列(配列番号4および/または6)と比較して増加した活性で化合物(3)へ変換することが可能であり、ここで好適な反応条件には、ロードが少なくとも50g/Lの化合物(2)、約5g/Lの操作されたポリペプチド、約0.25g/LのPLP、約1.8Mのイソプロピルアミン、約pH10および約50℃が含まれる。
操作されたトランスアミナーゼの選択に関する指針、生体触媒の調製、酵素基質の選択およびプロセスを実行するためのパラメータは、後に続く詳細な記載でさらに記載される。
5.詳細な記載
本明細書および添付の請求項で使用されるように、内容が別途明らかに指示しない限り、単数形「a」、「an」および「the」は複数の指示物を含む。したがって、例えば、「ポリペプチド」への言及は、1つよりも多くのポリペプチドを含む。
本明細書および添付の請求項で使用されるように、内容が別途明らかに指示しない限り、単数形「a」、「an」および「the」は複数の指示物を含む。したがって、例えば、「ポリペプチド」への言及は、1つよりも多くのポリペプチドを含む。
同様に、「comprise」、「comprises」、「comprising」、「include」、「includes」および「including」は互換性であり、限定するものではない。
様々な実施形態の記載が「含む」という用語を使用する場合、一部の具体的な例では、実施形態は言語「から本質的になる」または「からなる」を代わりに使用して記載することができることを当業者は理解するだろうことをさらに理解すべきである。
図面を含む上記一般記載および以下の詳細な記載の両方は例示および説明するだけであり、本開示を制限するものでないことを理解すべきである。
本明細書で使用されるセクション見出しは構成上の目的だけのためであり、記載される対象発明を限定するものと解釈されるべきでない。
5.1 略記号
5.1 略記号
三文字略記号が使用される場合、特に「L」または「D」が先頭に付かないか、その略記号が使用される文脈から明らかでない限り、アミノ酸は、α-炭素(Cα)に関してL配置でもD配置でもよい。例えば、「Ala」はα-炭素について配置を特定することなくアラニンを指定するのに対して、「D-Ala」および「L-Ala」はD-アラニンおよびL-アラニンをそれぞれ指定する。一文字略記号が使用される場合、大文字はα-炭素についてL配置のアミノ酸を指定し、小文字はα-炭素についてD配置のアミノ酸を指定する。例えば、「A」はL-アラニンを指定し、「a」はD-アラニンを指定する。ポリペプチド配列が一連の一文字または三文字略記号(または、それらの混合物)として提示されるとき、配列は一般的慣例によりアミノ(N)からカルボキシ(C)の方向で提示される。
遺伝子コードヌクレオシドのために使用される略記号は従来通りであり、以下の通りである:アデノシン(A);グアノシン(G);シチジン(C);チミジン(T);およびウリジン(U)。特記されない限り、省略されたヌクレオチドはリボヌクレオシドまたは2’-デオキシリボヌクレオシドであってよい。ヌクレオシドは、個別にまたは集合的に、リボヌクレオシドであるかまたは2’-デオキシリボヌクレオシドであると特定することができる。核酸配列が一連の一文字略記号で提示されるとき、配列は一般的慣例により5’から3’の方向で提示され、リン酸基は示されない。
5.2 定義
5.2 定義
本開示に関して、別途特に規定されない限り、本明細書の記載で使用される専門用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。したがって、以下の用語は以下の意味を有するものである。
「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は本明細書で互換的に使用され、長さまたは翻訳後修飾(例えば、グリコシル化、リン酸化、リピド化、ミリスチル化、ユビキチン化等)に関係なく、アミド結合によって共有結合した少なくとも2アミノ酸のポリマーを表す。この定義の中には、D-およびL-アミノ酸、ならびにD-およびL-アミノ酸の混合物が含まれる。
「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、共有結合している2つまたはそれより多くのヌクレオシドを指す。ポリヌクレオチドは、全体がリボヌクレオシドで構成されるか(すなわち、RNA)、全体が2’-デオキシリボヌクレオチドで構成されるか(すなわち、DNA)、またはリボ-および2’-デオキシリボヌクレオシドの混合物で構成されてもよい。ヌクレオシドは標準のホスホジエステル結合を通して一般的に連結されるが、ポリヌクレオチドは1つまたは複数の非標準連結を含むことができる。ポリヌクレオチドは一本鎖または二本鎖であってよいか、または一本鎖領域および二本鎖領域の両方を含むことができる。さらに、ポリヌクレオチドは天然に存在するコード核酸塩基(すなわち、アデニン、グアニン、ウラシル、チミンおよびシトシン)で一般的に構成されるが、それは、1つまたは複数の改変および/または合成された核酸塩基、例えばイノシン、キサンチン、ヒポキサンチン等を含むことができる。好ましくは、そのような改変または合成された核酸塩基は、コードする核酸塩基になる。
「アミノ基転移酵素」および「トランスアミナーゼ」は本明細書で互換的に使用され、アミノ基(NH2)を第一アミンから受容体分子のカルボニル基(C=O)に転移させる酵素能力を有するポリペプチドを指す。本明細書で使用されるトランスアミナーゼには、天然に存在する(野生型)トランスアミナーゼ、ならびに人の操作によって生成された天然に存在しない操作されたポリペプチドが含まれる。
「アミノ受容体」および「アミン受容体」、「ケト基質」、「ケト」および「ケトン」は本明細書で互換的に使用され、供与体アミンからアミノ基を受け取るカルボニル(ケトまたはケトン)化合物を指す。一部の実施形態では、アミノ受容体は、以下の一般式の分子であり、
ここで、RαおよびRβの各々は、独立してアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり、それらは非置換であるかまたは1つまたは複数の酵素的に許容される基で置換されてもよい。Rαは構造またはキラリティーでRβと同じであるか異なってもよい。一部の実施形態では、RαおよびRβは、非置換であるか、置換されているかまたは他の環と融合している環を一緒に形成することができる。アミノ受容体には、ケトカルボン酸およびアルカノン(ケトン)が含まれる。一般的なケトカルボン酸は、α-ケトカルボン酸、例えば、グリオキサル酸、ピルビン酸、オキサロ酢酸など、ならびにこれらの酸の塩である。アミノ受容体には、フマル酸(オキサロ酢酸へ変換させることができる)、グルコース(ピルビン酸へ変換することができる)、乳酸塩、マレイン酸その他などの、他の酵素または全細胞プロセスによってアミノ受容体へ変換される物質も含まれる。使用することができるアミノ受容体には、限定されずに例として、3,4-ジヒドロナフタレン-1(2H)-オン、1-フェニルブタン-2-オン、3,3-ジメチルブタン-2-オン、オクタン-2-オン、エチル3-オキソブタノエート、4-フェニルブタン-2-オン、1-(4-ブロモフェニル)エタノン、2-メチル-シクロヘキサノン(cyclohexamone)、7-メトキシ-2-テトラロン、1-ヒドロキシブタン-2-オン、ピルビン酸、アセトフェノン、3’-ヒドロキシアセトフェノン、2-メトキシ-5-フルオロアセトフェノン、レブリン酸、1-フェニルプロパン-1-オン、1-(4-ブロモフェニル)プロパン-1-オン、1-(4-ニトロフェニル)プロパン-1-オン、1-フェニルプロパン-2-オン、2-オキソ-3-メチルブタン酸、1-(3-トリフルオロメチルフェニル)プロパン-1-オン、ヒドロキシプロパノン、メトキシオキシプロパノン、1-フェニルブタン-1-オン、1-(2,5-ジメトキシ-4-メチルフェニル)ブタン-2-オン、1-(4-ヒドロキシフェニル)ブタン-3-オン、2-アセチルナフタレン、フェニルピルビン酸、2-ケトグルタル酸および2-ケトコハク酸が含まれ、可能な場合には(R)および(S)単独の異性体を含む。
「アミノ供与体」または「アミン供与体」は、アミノ基をアミノ受容体へ供与し、それによってカルボニル種になるアミノ化合物を指す。一部の実施形態では、アミノ供与体は、以下の一般式の分子であり、
ここで、RεおよびRδの各々は、独立してアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり、それらは非置換であるかまたは1つまたは複数の酵素的に非阻害性の基で置換されてもよい。Rεは構造またはキラリティーでRδと同じであるか異なってもよい。一部の実施形態では、RεおよびRδは、非置換であるか、置換されているかまたは他の環と融合している環を一緒に形成することができる。使用することができる一般的なアミノ供与体には、キラルおよびアキラルのアミノ酸ならびにキラルおよびアキラルのアミンが含まれる。使用することができるアミノ供与体には、限定されずに例として、イソプロピルアミン(2-アミノプロパンとも呼ばれる)、α-フェネチルアミン(1-フェニルエタンアミンとも呼ばれる)ならびにその鏡像異性体(S)-1-フェニルエタンアミンおよび(R)-1-フェニルエタンアミン、2-アミノ-4-フェニルブタン、グリシン、L-グルタミン酸、L-グルタミン酸塩、グルタミン酸一ナトリウム、L-アラニン、D-アラニン、D,L-アラニン、L-アスパラギン酸、L-リシン、D,L-オルニチン、β-アラニン、タウリン、n-オクチルアミン、シクロヘキシルアミン、1,4-ブタンジアミン(プトレシンとも呼ばれる)、1,6-ヘキサンジアミン、6-アミノヘキサン酸、4-アミノ酪酸、チラミンおよびベンジルアミン、2-アミノブタン、2-アミノ-1-ブタノール、1-アミノ-1-フェニルエタン、1-アミノ-1-(2-メトキシ-5-フルオロフェニル)エタン、1-アミノ-1-フェニルプロパン、1-アミノ-1-(4-ヒドロキシフェニル)プロパン、1-アミノ-1-(4-ブロモフェニル)プロパン、1-アミノ-1-(4-ニトロフェニル)プロパン、1-フェニル-2-アミノプロパン、1-(3-トリフルオロメチルフェニル)-2-アミノプロパン、2-アミノプロパノール、1-アミノ-1-フェニルブタン、1-フェニル-2-アミノブタン、1-(2,5-ジメトキシ-4-メチルフェニル)-2-アミノブタン、1-フェニル-3-アミノブタン、1-(4-ヒドロキシフェニル)-3-アミノブタン、1-アミノ-2-メチルシクロペンタン、1-アミノ-3-メチルシクロペンタン、1-アミノ-2-メチルシクロヘキサン、1-アミノ-1-(2-ナフチル)エタン、3-メチルシクロペンチルアミン、2-メチルシクロペンチルアミン、2-エチルシクロペンチルアミン、2-メチルシクロヘキシルアミン、3-メチルシクロヘキシルアミン、1-アミノテトラリン、2-アミノテトラリン、2-アミノ-5-メトキシテトラリンおよび1-アミノインダンが含まれ、可能な場合は(R)および(S)の単独の異性体を含み、アミンの全ての可能な塩を含む。
「キラルアミン」は一般式Rα-CH(NH2)-Rβのアミンを指し、本明細書では、その最も広い意味で用いられ、水素原子に加えて、(i)キラル環構造を形成する二価の基、もしくは(ii)構造またはキラリティーで互いと異なる2つの置換基(水素以外の)を有する、第二炭素原子に結合している第一アミノ基の存在によって特徴付けられる、異なるおよび混合した機能タイプの多種多様の脂肪族および脂環式化合物を含む。キラル環構造を形成する二価の基には、例えば、2-メチルブタン-1,4-ジイル、ペンタン-1,4-ジイル、ヘキサン-1,4-ジイル、ヘキサン-1,5-ジイル、2-メチルペンタン-1,5-ジイルが含まれる。第二炭素原子の上の2つの異なる置換基(上のRαおよびRβ)は広く異なることもでき、アルキル、アラルキル、アリール、ハロ、ヒドロキシ、低級アルキル、低級アルコキシ、低級アルキルチオ、シクロアルキル、カルボキシ、カルバルコキシ、カルバモイル、一および二(低級アルキル)置換カルバモイル、トリフルオロメチル、フェニル、ニトロ、アミノ、一および二(低級アルキル)置換アミノ、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アルキルカルボキシアミド、アリールカルボキシアミド等、ならびに上によって置換されたアルキル、アラルキルまたはアリールを含むことができる。
「ピリドキサールリン酸」、「PLP」、「ピリドキサール-5’-ホスフェート」、「PYP」および「P5P」は本明細書で互換的に使用され、トランスアミナーゼ反応においてコエンザイムとして作用する化合物を指す。一部の実施形態では、ピリドキサールリン酸は、構造1-(4’-ホルミル-3’-ヒドロキシ-2’-メチル-5’-ピリジル)メトキシホスホン酸、CAS番号[54-47-7]によって規定される。ピリドキサール-5’-ホスフェートは、ピリドキソール(ビタミンB6としても知られる)のリン酸化および酸化によってin vivoで生成することができる。トランスアミナーゼ酵素を使用したアミノ基転移反応では、アミノ供与体のアミン基はコエンザイムへ転移されてケト副産物を生成するが、ピリドキサール-5’-ホスフェートはピリドキサミンリン酸へ変換される。ピリドキサール-5’-ホスフェートは、異なるケト化合物(アミノ受容体)との反応によって再生される。ピリドキサミンリン酸からアミノ受容体へのアミン基の転移はアミンを生成し、コエンザイムを再生させる。一部の実施形態では、ピリドキサール-5’-ホスフェートは、ピリドキシン(PN)、ピリドキサール(PL)、ピリドキサミン(PM)およびそれらのリン酸化された対応物;ピリドキシンリン酸(PNP)およびピリドキサミンリン酸(PMP)を含む、ビタミンB6ファミリーの他のメンバーと置き換えることができる。
「コード配列」は、タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸(例えば、遺伝子)の部分を指す。
「天然に存在する」または「野生型」は、天然に見出される形態を指す。例えば、天然に存在するまたは野生型のポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然の供給源から単離することができ、人の操作によって故意に改変されていない生物体に存在する配列である。
例えば細胞、核酸またはポリペプチドに関して使用されるときの「組換えの」または「操作された」または「天然に存在しない」は、さもなければ天然に存在しないだろう方法で改変されているか、またはそれと同一であるが、合成物質からおよび/もしくは組換え技術を使用した操作によって生成されたか導かれた物質もしくはその物質の自然のもしくは天然の形態に対応する物質を指す。非限定的な例には、中でも、細胞の天然の(非組換え)形態の中で見出されない遺伝子を発現するか、または非組換えの場合は異なるレベルで発現される天然遺伝子を発現する組換え細胞が含まれる。
「配列同一性のパーセンテージ」および「パーセンテージ相同性」は本明細書で互換的に使用され、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの間の比較を指し、比較ウインドウにわたって2つの最適に整列させた配列を比較することによって決定され、ここで、比較ウインドウの中のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、2つの配列の最適整列のための参照配列と比較して付加または欠失(すなわち、ギャップ)を含むことができる。パーセンテージは、両方の配列で同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が存在する位置の数を決定してマッチした位置の数を与え、マッチした位置の数を比較ウインドウの中の位置の総数によって割り、その結果に100を掛け算して配列同一性のパーセンテージを与えることによって計算される。あるいは、パーセンテージは、両方の配列で同一の核酸塩基もしくはアミノ酸残基が存在するか、または核酸塩基もしくはアミノ酸残基がギャップを伴って整列する位置の数を決定し、マッチした位置の数を与え、マッチした位置の数を比較ウインドウの中の位置の総数によって割り、その結果に100を掛け算して配列同一性のパーセンテージを与えることによって計算される。当業者は、2つの配列を整列させるために利用可能な多くの確立されたアルゴリズムがあることを理解する。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Smith and Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482のローカルホモロジーアルゴリズムによって、Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443のホモロジーアラインメントアルゴリズムによって、Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズム(GCG Wisconsin Software Package中のGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA)のコンピュータによる実行によって、目視検査によって(一般的にはCurrent Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds.、Current Protocols、Greene Publishing Associates、Inc.およびJohn Wiley & Sons、Inc.の合弁事業(1995年の補遺)(Ausubel)を参照する)実行することができる。パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに好適なアルゴリズムの例は、BLASTおよびBLAST2.0アルゴリズムであり、それらは、Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410およびAltschul et al., 1977, Nucleic Acids Res. 3389-3402にそれぞれ記載される。BLAST分析を実行するためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Informationウェブサイトを通して公開されている。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列させた場合にいくつかの正の値の閾値スコアTにマッチするかまたはそれを満たす、長さWの短いワードをクエリー配列中で同定することによって、ハイスコアの配列対(HSP)を最初に同定することを含む。Tは、近傍ワードスコア閾値(Altschul et al、前掲)と呼ばれる。これらの初期近傍ワードヒットは、それらを含むより長いHSPを見出す検索を開始するためのシードとして機能する。ワードヒットは、累積アラインメントスコアを増加させることができる限り、各配列に沿って両方向に次に延長させられる。累積スコアは、ヌクレオチド配列の場合、パラメータM(マッチした残基の対のためのリワードスコア;常に>0)およびN(ミスマッチ残基のためのペナルティスコア;常に<0)を使用して計算される。アミノ酸配列の場合、累積スコアを計算するためにスコアリングマトリックスが使用される。各方向へのワードヒットの延長は、次の場合に停止される:累積アラインメントスコアがその最大達成値から量X落ちる;1つまたは複数の負のスコアの残基アラインメントの蓄積のために、累積スコアがゼロまたはそれより小さくなる;または、いずれかの配列の末端に到達する。BLASTアルゴリズムのパラメータW、TおよびXは、アラインメントの感度および速度を決定する。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列の場合)は、デフォルトとして11のワードレンス(W)、10の期待値(E)、M=5、N=-4および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列の場合、BLASTPプログラムは、デフォルトとして3のワードレンス(W)、10の期待値(E)およびBLOSUM62スコアリングマトリックスを使用する(Henikoff and Henikoff, 1989, Proc Natl Acad Sci USA 89:10915を参照する)。配列アラインメントおよび%配列同一性の例示的な判定は、GCG Wisconsinソフトウェアパッケージ(Accelrys、Madison WI)中のBESTFITまたはGAPプログラムを提供されるデフォルトパラメータで用いることができる。
「参照配列」は配列比較の基準として使用される規定配列を指す。参照配列は、より大きな配列のサブセット、例えば完全長遺伝子またはポリペプチド配列のセグメントであってよい。一般的に、参照配列は、核酸もしくはポリペプチドの少なくとも20ヌクレオチドもしくはアミノ酸残基の長さ、少なくとも25残基の長さ、少なくとも50残基の長さ、または完全長である。2つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの各々は、(1)2つの配列の間で類似している配列(すなわち、完全配列の一部)を含むこと、および(2)2つの配列の間で異なる配列をさらに含むことができるので、2つの(またはそれより多くの)ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの間の配列比較は、「比較ウインドウ」にわたって2つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列を比較して、配列類似性の局所領域を同定し、比較することによって一般的に実行される。一部の実施形態では、「参照配列」は、第一アミノ酸配列に基づくことができ、ここで参照配列は第一配列中に1つまたは複数の変化を有することができる配列である。例えば、「X34に対応する残基でアラニンを有する配列番号2に基づく参照配列」またはX34Aは、配列番号2のX34のトレオニンである対応する残基がアラニンに変更されている参照配列を指す。
「比較ウインドウ」は、少なくとも約20の連続したヌクレオチド位置またはアミノ酸残基の概念上のセグメントを指し、配列は、少なくとも20の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸の参照配列と比較することができ、ここで、比較ウインドウの中の配列の一部は、2つの配列の最適整列のための参照配列と比較して20%またはそれより低い付加または欠失(すなわち、ギャップ)を含むことができる。比較ウインドウは、20の連続した残基より長くてもよく、必要に応じて30、40、50、100の、またはそれより長いウインドウを含む。
「実質的な同一性」は、少なくとも20残基位置の比較ウインドウにわたる、頻繁には少なくとも30~50残基のウインドウにわたる参照配列と比較して、少なくとも80パーセントの配列同一性、少なくとも85パーセントの同一性、および89~95パーセントの配列同一性、より普通には少なくとも99パーセントの配列同一性を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を指し、配列同一性のパーセンテージは、比較ウインドウにわたって参照配列の合計20パーセントまたはそれより低い欠失または付加を含む配列と参照配列を比較することによって計算される。ポリペプチドに適用される具体的な実施形態では、用語「実質的な同一性」は、例えばデフォルトギャップ重みを使用したプログラムGAPまたはBESTFITによって最適に整列させたとき、2つのポリペプチド配列が少なくとも80パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも89パーセントの配列同一性、少なくとも95パーセントの配列同一性またはそれより多く(例えば、99パーセントの配列同一性)を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基位置は保存的アミノ酸置換で異なる。
所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列の番号付けとの関連で使用されるとき、「に対応する」、「に関して」または「と比較して」は、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列を参照配列と比較したときの特定の参照配列の残基の番号付けを指す。言い換えると、所与のポリマーの残基番号または残基位置は、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列の中の残基の実際の数値的位置によってではなく参照配列に関して指定される。例えば、操作されたトランスアミナーゼのものなどの所与のアミノ酸配列は、2つの配列の間の残基マッチを最適化するためにギャップを導入することによって参照配列と整列させることができる。これらの場合、ギャップは存在するが、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列中の残基の番号付けはそれが整列させられた参照配列に関して行われる。
「アミノ酸の差」または「残基差」は、参照配列中の対応する位置のアミノ酸残基と比較したポリペプチド配列の位置でのアミノ酸残基の変化を指す。アミノ酸の差の位置は本明細書で一般的に「Xn」と呼ばれ、ここでnは残基差が基づく参照配列中の対応する位置を指す。例えば、「配列番号2と比較した位置X34における残基差」は、配列番号2の位置34に対応するポリペプチド位置でのアミノ酸残基の変化を指す。したがって、配列番号2の参照ポリペプチドが位置34にトレオニンを有するならば、「配列番号2と比較した位置X34における残基差」は、配列番号2の位置34に対応するポリペプチド位置でのトレオニン以外の任意の残基のアミノ酸置換を指す。本明細書でほとんどの場合、ある位置における特定のアミノ酸残基の差は「XnY」で示され、ここで、「Xn」は前記の通り対応する位置を規定し、「Y」は操作されたポリペプチドで見出されるアミノ酸(すなわち、参照ポリペプチドにおけるものと異なる残基)の単一文字識別子である。一部の実施形態では、1つよりも多くのアミノ酸が特定の残基位置で出現することができる場合、代わりのアミノ酸はXnY/Zの形で記載することができ、ここでYおよびZは代替のアミノ酸残基を表す。一部の場合(例えば、表5.1および6.1)では、本開示は、従来の表記法「AnB」によって表される特定のアミノ酸の差も提供し、ここでAは参照配列中の残基の単一文字識別子であり、「n」は参照配列中の残基位置の数であり、Bは操作されたポリペプチドの配列中の残基置換の単一文字識別子である。さらに、一部の場合では、本開示のポリペプチドは、参照配列と比較して1つまたは複数のアミノ酸残基の差を含むことができ、それは参照配列と比較して変化している特定位置のリストによって示される。
「保存的アミノ酸置換」は類似の側鎖を有する異なる残基による残基の置換を指し、したがってアミノ酸の同じかまたは類似の規定のクラスの中のアミノ酸によるポリペプチド中のアミノ酸の置換を一般的に含む。限定でなく例として、脂肪族側鎖を有するアミノ酸は、別の脂肪族アミノ酸、例えばアラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンで置換されてもよく;ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸はヒドロキシル側鎖を有する別のアミノ酸、例えばセリンおよびトレオニンで置換され;芳香族側鎖を有するアミノ酸は、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸、例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびヒスチジンで置換され;塩基性側鎖を有するアミノ酸は、塩基性側鎖を有する別のアミノ酸、例えばリシンおよびアルギニンで置換され;酸性側鎖を有するアミノ酸は、酸性側鎖を有する別のアミノ酸、例えばアスパラギン酸またはグルタミン酸で置換され;疎水性または親水性のアミノ酸は、別の疎水性または親水性のアミノ酸でそれぞれ置き換えられる。例示的な保存的置換は、下の表1で提供される。
「非保存的置換」は、ポリペプチド中のアミノ酸の、有意に異なる側鎖特性を有するアミノ酸による置換を指す。非保存的置換は、規定の基の中ではなくそれらの間のアミノ酸を使用することができ、(a)置換(例えば、グリシンの代わりのプロリン)の領域におけるペプチド主鎖の構造、(b)電荷もしくは疎水性、または(c)側鎖のバルクに影響を及ぼす。限定ではなく例として、例示的な非保存的置換は、塩基性または脂肪族アミノ酸で置換される酸性アミノ酸;小さいアミノ酸で置換される芳香族アミノ酸;および疎水性アミノ酸で置換される親水性アミノ酸であってよい。
「欠失」は、参照ポリペプチドからの1つまたは複数のアミノ酸の除去によるポリペプチドへの改変を指す。欠失は、操作されたトランスアミナーゼ酵素の酵素活性を保持しつつ、および/または向上した特性を保持しつつ、1つまたは複数のアミノ酸、2つまたはそれより多くのアミノ酸、5つまたはそれより多くのアミノ酸、10個またはそれより多くのアミノ酸、15個またはそれより多くのアミノ酸、または20個またはそれより多くのアミノ酸、アミノ酸総数の最高10%、または参照酵素を占めるアミノ酸の総数の最高20%の除去を含むことができる。欠失は、ポリペプチドの内部および/または末端部分に向けることができる。様々な実施形態では、欠失は連続したセグメントを含むことができるか、不連続であってもよい。
「挿入」は、参照ポリペプチドからの1つまたは複数のアミノ酸の付加によるポリペプチドへの改変を指す。一部の実施形態では、向上した操作されたトランスアミナーゼ酵素は、天然に存在するトランスアミナーゼポリペプチドへの1つまたは複数のアミノ酸の挿入、ならびに他の向上したトランスアミナーゼポリペプチドへの1つまたは複数のアミノ酸の挿入を含む。挿入はポリペプチドの内部にあってよいか、またはカルボキシもしくはアミノ末端にあってもよい。本明細書で使用される挿入は、当技術分野で公知である融合タンパク質を含む。挿入は参照ポリペプチド中のアミノ酸の連続したセグメントであってよいか、またはアミノ酸の1つまたは複数によって分割されてもよい。
本明細書で使用される「断片」は、アミノ末端および/またはカルボキシ末端の欠失を有するが、残りのアミノ酸配列は配列の対応する位置と同一であるポリペプチドを指す。断片は、少なくとも14アミノ酸の長さ、少なくとも20アミノ酸の長さ、少なくとも50アミノ酸またはそれより長い長さ、ならびに完全長トランスアミナーゼポリペプチド、例えば配列番号2の参照の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドの最高70%、80%、90%、95%、98%および99%であってよい。
「単離されたポリペプチド」は、それに天然に付随している他の夾雑物、例えば、タンパク質、脂質およびポリヌクレオチドから実質的に分離されるポリペプチドを指す。この用語は、それらの天然に存在する環境または発現系(例えば、宿主細胞またはin vitro合成)から取り出されたかまたは精製されたポリペプチドを包含する。向上したトランスアミナーゼ酵素は細胞の中に存在するか、細胞媒質の中に存在してもよく、または溶解物または単離された調製物などの様々な形態で調製することができる。このように、一部の実施形態では、向上したトランスアミナーゼ酵素は単離されたポリペプチドであってよい。
「実質的に純粋なポリペプチド」は、ポリペプチド種が存在する支配的な種である組成物を指し(すなわち、モルまたは重量ベースで、それは組成物中のいかなる他の個々の高分子種より豊富である)、目的種がモルまたは%重量によって存在する高分子種の少なくとも約50パーセントを構成するとき、それは一般的に実質的に精製された組成物である。一般的に、実質的に純粋なトランスアミナーゼ組成物は、モルまたは%重量により組成物中に存在する全ての高分子種の約60%またはそれより多く、約70%またはそれより多く、約80%またはそれより多く、約90%またはそれより多く、約95%またはそれより多く、および約98%またはそれより多くを構成する。一部の実施形態では、目的種は本質的な均質性(すなわち、従来の検出方法によって組成物中に夾雑物種を検出することができない)まで精製され、ここでは、組成物は単一の高分子種から本質的になる。溶媒種、小分子(<500ダルトン)および元素イオン種は高分子種とみなされない。一部の実施形態では、単離された向上したトランスアミナーゼポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチド組成物である。
「立体選択性」は、別のものに対する1つの立体異性体の化学的または酵素的反応における優先的形成を指す。立体選択性は部分的であってよく、そこでは1つの立体異性体の形成は他のものに対して有利であり、またはそれは完全であってよく、そこでは1つの立体異性体だけが形成される。立体異性体が鏡像異性体である場合、立体選択性はエナンチオ選択性、両方の合計中の1つの鏡像異性体の割合(一般的にパーセンテージで報告される)と呼ばれる。それは、当技術分野で一般的に、式[主要な鏡像異性体-マイナーな鏡像異性体]/[主要な鏡像異性体+マイナーな鏡像異性体]によってそれから計算される鏡像異性体過剰(e.e.)として代わりに報告される(一般的にパーセンテージとして)。立体異性体がジアステレオ異性体である場合、立体選択性はジアステレオ選択性、2つのジアステレオ異性体の混合物中の1つのジアステレオ異性体の割合(一般的にパーセンテージで報告される)と呼ばれ、一般的にジアステレオマー過剰(d.e.)として代わりに報告される。鏡像異性体過剰およびジアステレオマー過剰は、立体異性体過剰のタイプである。
「高度に立体選択的」は、基質、例えば化合物(2)を、その対応するキラルアミン生成物、例えば化合物(3)へ少なくとも約85%の立体異性体過剰で変換することが可能である化学的または酵素的反応を指す。
「向上した酵素特性」は、参照トランスアミナーゼと比較して任意の酵素特性における向上を示すトランスアミナーゼポリペプチドを指す。本明細書に記載される操作されたトランスアミナーゼポリペプチドの場合、比較は野生型トランスアミナーゼ酵素に対して一般的に行われるが、一部の実施形態では、参照トランスアミナーゼは別の操作されたトランスアミナーゼであってよい。向上が望まれる酵素特性には、限定されずに、酵素活性(基質のパーセント変換で表すことができる)、熱安定性、溶媒安定性、pH活性プロファイル、補因子必要量、阻害剤(例えば、基質または生成物阻害)への不応性、生成物または基質寛容性、および立体選択性(エナンチオ選択性を含む)が含まれる。
「増加した酵素活性」は、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドの向上した特性を指し、それは、参照トランスアミナーゼ酵素と比較して増加した比活性(例えば、時間、タンパク質重量当たりの生成された生成物)または生成物への基質の増加したパーセント変換(例えば、トランスアミナーゼの指定量を使用した指定時間中の生成物への基質の開始量のパーセント変換)で表すことができる。酵素活性を決定する例示的な方法は、実施例で提供される。Km、Vmaxまたはkcatの古典的酵素特性を含む、酵素活性に関する任意の特性に影響を及ぼすことができ、その変化は増加する酵素活性に導くことができる。酵素活性の向上は、天然に存在するトランスアミナーゼまたはトランスアミナーゼポリペプチドが由来する別の操作されたトランスアミナーゼと比べて、対応する野生型トランスアミナーゼ酵素の酵素活性の約1.2倍から、2倍、5倍、10倍、20倍、25倍、50倍、75倍、100倍またはそれより高い酵素活性であってよい。トランスアミナーゼ活性は、標準アッセイのいずれか1つによって、例えば反応体または生成物の分光光度的特性の変化をモニタリングすることによって測定することができる。一部の実施形態では、生成される生成物の量は、例えばo-フタルジアルデヒド(OPA)による誘導体化の後に、UV吸光度または蛍光検出と組み合わせた高速液体クロマトグラフィー(HPLC)分離によって測定することができる。本明細書で詳細にさらに記載される通り、酵素活性の比較は、酵素の規定の調製、設定条件下での規定のアッセイ、および1つまたは複数の規定の基質を使用して行われる。一般的に、溶解物を比較する場合、宿主細胞によって生成され、溶解物中に存在する酵素の量の変動を最小にするために、細胞の数およびアッセイするタンパク質の量ならびに同一の発現系および同一の宿主細胞の使用が決定される。
「変換」は、対応する生成物への基質の酵素的変換を指す。「パーセント変換」は、指定条件下の時間内に生成物に変換される基質のパーセントを指す。したがって、トランスアミナーゼポリペプチドの「酵素活性」または「活性」は、生成物への基質の「パーセント変換」で表すことができる。
「熱安定性の」は、野生型酵素と比較してある期間(例えば、0.5~24時間)の高い温度(例えば、40~80℃)への曝露の後に類似の活性(例えば、60%~80%より高い)を維持するトランスアミナーゼポリペプチドを指す。
「溶媒安定性」は、野生型酵素と比較してある期間(例えば、0.5~24時間)の溶媒(エタノール、イソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド(DMSO)、テトラヒドロフラン、2-メチルテトラヒドロフラン、アセトン、トルエン、酢酸ブチル、メチルtert-ブチルエーテル等)の様々な濃度(例えば、5~99%)への曝露の後に類似の活性(例えば、60%~80%より高い)を維持するトランスアミナーゼポリペプチドを指す。
「熱-および溶媒安定性」は、熱安定性および溶媒安定性であるトランスアミナーゼポリペプチドを指す。
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」は、核酸ハイブリッドが安定している条件を指すために本明細書で使用される。当業者に公知であるように、ハイブリッドの安定性はハイブリッドの融解温度(Tm)に反映される。一般に、ハイブリッドの安定性は、イオン強度、温度、G/C含有量およびカオトロピック剤の存在の関数である。ポリヌクレオチドのTm値は、融解温度を予測するための公知の方法を使用して計算することができる(例えば、Baldino et al., Methods Enzymology 168:761-777;Bolton et al., 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:1390;Bresslauer et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci USA 83:8893-8897;Freier et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci USA 83:9373-9377;Kierzek et al., Biochemistry 25:7840-7846;Rychlik et al., 1990, Nucleic Acids Res 18:6409-6412(誤記、1991, Nucleic Acids Res 19:698);Sambrook et al.、前掲);Suggs et al., 1981、Developmental Biology Using Purified Genes(Brown et al., eds.), pp. 683-693, Academic Press;およびWetmur, 1991, Crit Rev Biochem Mol Biol 26:227-259を参照する。全ての刊行物は参照により本明細書に組み込まれる)。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは本明細書に開示されるポリペプチドをコードし、中程度ストリンジェントであるか高度にストリンジェントな条件などの規定の条件下で、本開示の操作されたトランスアミナーゼ酵素をコードする配列の相補体とハイブリダイズする。
「ハイブリダイゼーションストリンジェンシー」は、核酸のハイブリダイゼーションにおける洗浄条件などのハイブリダイゼーション条件に関する。一般的に、ハイブリダイゼーション反応はより低いストリンジェンシー条件の下で実行され、その後様々であるがより高いストリンジェンシーの洗浄が続く。「中程度ストリンジェントなハイブリダイゼーション」という用語は、標的DNAが、標的DNAと約60%の同一性、好ましくは約75%の同一性、約85%の同一性を有し、標的ポリヌクレオチドと約90%より高い同一性を有する相補的核酸に結合することを可能にする条件を指す。例示的な中程度ストリンジェントな条件は、50%ホルムアミド、5×デンハルトの溶液、5×SSPE、0.2%SDS、42℃、でのハイブリダイゼーションと、それに続く0.2×SSPE、0.2%SDS、42℃での洗浄と同等の条件である。「高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション」は、規定のポリヌクレオチド配列のための溶液条件の下で決定されるとき、熱融解温度Tmから約10℃またはそれより低い条件を一般的に指す。一部の実施形態では、高ストリンジェンシー条件は、65℃の0.018M NaCl中で安定したハイブリッドを形成する核酸配列だけのハイブリダイゼーションを可能にする条件を指す(すなわち、ハイブリッドが65℃の0.018M NaClで安定していない場合、本明細書で企図される通りにそれは高ストリンジェンシー条件の下で安定しない)。高ストリンジェンシー条件は、例えば、50%ホルムアミド、5×デンハルトの溶液、5×SSPE、0.2%SDS、42℃、と同等の条件でのハイブリダイゼーションと、それに続く0.1×SSPEおよび0.1%SDS、65℃での洗浄によって提供することができる。別の高ストリンジェンシー条件は、65℃で0.1%(w:v)SDSを含有する5×SSCでハイブリダイズさせるのと同等の条件でハイブリダイズさせ、65℃で0.1%SDSを含有する0.1×SSCで洗浄することである。他の高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、ならびに中程度ストリンジェント条件は、上で引用される文献に記載される。
「異種」ポリヌクレオチドは、実験技術によって宿主細胞に導入される任意のポリヌクレオチドを指し、宿主細胞から取り出され、実験操作にかけられ、その後宿主細胞に再導入されるポリヌクレオチドを含む。
「コドン最適化された」は、タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドンにおける、コードされるタンパク質が目的の生物体で効率的に発現されるように特定の生物体で優先的に使用されるものへの変化を指す。ほとんどのアミノ酸は「同義語」または「同義の」コドンと呼ばれるいくつかのコドンによって表されるという点で、遺伝子コードは同義性をもつが、特定の生物体によるコドン使用頻度は非ランダムであり、特定のコドントリプレットに偏ることはよく知られている。このコドン使用頻度バイアスは、所与の遺伝子、共通の機能または先祖起源の遺伝子、高度に発現されるタンパク質対低コピー数タンパク質、および生物体のゲノムの凝集タンパク質コード領域に関してより高い可能性がある。一部の実施形態では、トランスアミナーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドは、発現のために選択される宿主生物体からの最適な生成のためにコドン最適化されてもよい。
「好ましい、最適な、高いコドン使用頻度バイアスのコドン」は、同じアミノ酸をコードする他のコドンより高い頻度でタンパク質コード領域で使用されるコドンを互換的に指す。好ましいコドンは、単一の遺伝子におけるコドン使用頻度、共通の機能または起源の遺伝子セット、高度に発現される遺伝子、全生物体の凝集タンパク質コード領域におけるコドン頻度、関連した生物体の凝集タンパク質コード領域におけるコドン頻度、またはそれらの組合せに関して決定することができる。その頻度が遺伝子発現のレベルと一緒に増加するコドンは、一般的に発現のために最適なコドンである。特定の生物体におけるコドン頻度(例えば、コドン使用頻度、相対的な同義コドン使用)およびコドン優先度を決定するために、例えばクラスター解析または対応する解析を使用した多変量解析、および遺伝子で使用されるコドンの有効な数を含む、様々な方法が公知である(GCG CodonPreference、Genetics Computer Group Wisconsin Package;CodonW、John Peden、University of Nottingham;McInerney, J. O, 1998, Bioinformatics 14:372-73;Stenico et al., 1994, Nucleic Acids Res. 222437-46;Wright, F., 1990, Gene 87:23-29を参照する)。コドン使用頻度表は、生物体の大きくなりつつあるリストで利用可能である(例えば、Wada et al., 1992, Nucleic Acids Res. 20:2111-2118;Nakamura et al., 2000, Nucl. Acids Res. 28:292;Duret, et al.、前掲;Henaut and Danchin, "Escherichia coli and Salmonella," 1996, Neidhardt, et al. Eds., ASM Press, Washington D.C., p. 2047-2066を参照する)。コドン使用頻度を得るためのデータソースは、タンパク質をコードすることが可能な任意の利用可能なヌクレオチド配列に依存することができる。これらのデータセットは、発現されるタンパク質(例えば、完全なタンパク質コード配列-CDS)、発現される配列タグ(ESTS)、またはゲノム配列の予測されるコード領域をコードすることが実際に知られている核酸配列を含む(例えば、Mount, D., Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis, Chapter 8, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001;Uberbacher, E. C., 1996, Methods Enzymol. 266:259-281;Tiwari et al., 1997, Comput. Appl. Biosci. 13:263-270を参照する)。
「制御配列」は、本明細書において本開示のポリヌクレオチドおよび/またはポリペプチドの発現のために必要であるか有利である全ての成分を含むと規定される。各制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列にとって天然であってもまたは外来であってもよい。そのような制御配列には、限定されずに、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列および転写ターミネーターが含まれる。最低限でも、制御配列はプロモーターならびに転写および翻訳終止シグナルを含む。制御配列のポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域とのライゲーションを促進する特異的制限部位を導入するために、リンカーを制御配列に提供することができる。
「作動可能に連結した」は、制御配列が目的のポリヌクレオチドおよび/またはポリペプチドの発現を指示または調節するように、制御配列が目的のポリヌクレオチドに対してある位置に適切に置かれる(すなわち、機能的関係で)構成として本明細書で規定される。
「プロモーター配列」は、コード配列などの目的のポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞によって認識される核酸配列を指す。プロモーター配列は、目的のポリヌクレオチドの発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモーターは、突然変異体、トランケーション体およびハイブリッド体のプロモーターを含む、選択された宿主細胞で転写活性を示す任意の核酸配列であってよく、宿主細胞にとって同種であるか異種である細胞外または細胞内のポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。
「好適な反応条件」は、本開示のトランスアミナーゼポリペプチドが基質化合物を生成物化合物へ変換すること(例えば、化合物(2)の化合物(3)への変換)が可能である、生体触媒反応溶液中の条件(例えば、酵素ローディング、基質ローディング、補因子ローディング、温度、pH、緩衝液、共存溶媒等の範囲)を指す。例示的な「好適な反応条件」は詳細な記載に提供され、実施例によって例示される。
例えば「化合物ローディング」または「酵素ローディング」または「補因子ローディング」などの「ローディング」は、反応開始時の反応混合物中の成分の濃度または量を指す。
生体触媒媒介プロセスとの関連で「基質」は、生体触媒が作用する化合物または分子を指す。例えば、本明細書で開示されるプロセスにおける操作されたトランスアミナーゼ生体触媒のための例示的な基質は、化合物(2)である。
生体触媒媒介プロセスとの関連で「生成物」は、生体触媒の作用から生じる化合物または分子を指す。例えば、本明細書で開示されるプロセスにおける操作されたトランスアミナーゼ生体触媒の例示的な生成物は、化合物(3)である。
「ヘテロアルキル」、「ヘテロアルケニル」および「ヘテロアルキニル」は、炭素原子の1つまたは複数が同じか異なるヘテロ原子またはヘテロ原子団で各々独立して置き換えられる、本明細書に規定されるアルキル、アルケニルおよびアルキニルを指す。炭素原子を置き換えることができるヘテロ原子および/またはヘテロ原子団には、限定されずに、-O-、-S-、-S-O-、-NRγ-、-PH-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)NRγ-、-S(O)2NRγ-などが含まれ、それらの組合せも含まれ、ここで、各Rγは、水素、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリールおよび他の好適な置換基から独立して選択される。
「アリール」は、単環(例えば、フェニル)または複数の縮合環(例えば、ナフチルまたはアントリル)を込みで有する、6から12の炭素原子の不飽和芳香族炭素環基を指す。例示的なアリールには、フェニル、ピリジル、ナフチルなどが含まれる。
「アリールアルキル」は、アリールで置換されるアルキル、すなわちアリール-アルキル基を指し、好ましくはアルキル部分に込みで1~6の炭素原子を、およびアリール部分に込みで6~12の炭素原子を有する。そのようなアリールアルキル基は、ベンジル、フェネチルなどによって例示される。
「アリールアルケニル」は、アリールで置換されるアルケニル、すなわちアリール-アルケニル基を指し、好ましくはアルケニル部分に込みで2~6の炭素原子を、およびアリール部分に込みで6~12の炭素原子を有する。
「アリールアルキニル」は、アリールで置換されるアルキニル、すなわちアリール-アルキニル基を指し、好ましくはアルキニル部分に込みで2~6の炭素原子を、およびアリール部分に込みで6~12の炭素原子を有する。
「シクロアルキル」は、必要に応じて1~3のアルキル基で置換されてもよい単環式の環または複数の縮合環を込みで有する、3~12の炭素原子の環状アルキル基を指す。例示的なシクロアルキル基には、限定されずに、単環構造、例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロオクチル、1-メチルシクロプロピル、2-メチルシクロペンチル、2-メチルシクロオクチルなど、または架橋環系、例えばアダマンチルなどを含む多環構造が含まれる。
「シクロアルキルアルキル」は、シクロアルキルで置換されるアルキル、すなわちシクロアルキル-アルキル基を指し、好ましくはアルキル部分に込みで1~6の炭素原子を、およびシクロアルキル部分に込みで3~12の炭素原子を有する。そのようなシクロアルキルアルキル基は、シクロプロピルメチル、シクロヘキシルエチルなどによって例示される。
「シクロアルキルアルケニル」は、シクロアルキルで置換されるアルケニル、すなわちシクロアルキル-アルケニル基を指し、好ましくはアルケニル部分に込みで2~6の炭素原子を、およびシクロアルキル部分に込みで3~12の炭素原子を有する。
「シクロアルキルアルキニル」は、シクロアルキルで置換されるアルキニル、すなわちシクロアルキル-アルキニル基を指し、好ましくはアルキニル部分に込みで2~6の炭素原子を、およびシクロアルキル部分に込みで3~12の炭素原子を有する。
「アミノ」は、基-NH2を指す。置換されたアミノは基-NHRη、NRηRηおよびNRηRηRηを指し、各Rηは置換型または非置換型のアルキル、シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アシル、アルコキシカルボニル、スルファニル、スルフィニル、スルホニルなどから独立して選択される。一般的なアミノ基には、限定されずに、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、トリメチルアンモニウム、トリエチルアンモニウム、メチルスルホニルアミノ、フラニル-オキシ-スルファミノなどが含まれる。
「アルキルアミノ」は-NHRζ基を指し、Rζはアルキル、N-オキシド誘導体、またはその保護された誘導体であり、例えば、メチルアミノ、エチルアミノ、n-プロピルアミノ、イソ-プロピルアミノ、n-ブチルアミノ、イソ-ブチルアミノ、tert-ブチルアミノまたはメチルアミノ-N-オキシドなどである。
「アリールアミノ」は-NHRλを指し、Rλはアリール基であり、それは必要に応じて置換されてもよい。
「ヘテロアリールアミノ」は-NHRσを指し、Rσはヘテロアリール基であり、それは必要に応じて置換されてもよい。
「アミノアルキル」は水素原子の1つまたは複数が、置換されたアミノ基を含むアミノ基で置き換えられるアルキル基を指す。
「オキソ」は、=Oを指す
「オキシ」は二価の基-O-を指し、それはエーテルおよびエステルを含む異なるオキシ基を形成する様々な置換基を有することができる。
「アルコキシ」または「アルキルオキシ」は本明細書で互換的に使用されて基-ORζを指し、Rζは本明細書でも規定されるように必要に応じて置換されたアルキル基を含むアルキル基である。
「アリールオキシ」は-ORλ基を指し、Rλはアリール基であり、それは必要に応じて置換されてもよい。
「ヘテロアリールオキシ」は-ORσを指し、Rσはヘテロアリール基であり、それは必要に応じて置換されてもよい。
「カルボキシ」は、-COOHを指す。
「カルボキシアルキル」は、カルボキシ基で置換されたアルキルを指す。
「カルボニル」は-C(O)-を指し、酸、酸ハライド、アルデヒド、アミド、エステルおよびケトンを含む異なるカルボニル基を形成する様々な置換基を有することができる。
「アルキルカルボニル」は-C(O)Rζを指し、Rζはアルキル基であり、それは必要に応じて置換されてもよい。
「アリールカルボニル」は-C(O)Rλを指し、Rλはアリール基であり、それは必要に応じて置換されてもよい。
「ヘテロアリールカルボニル」は-C(O)Rσを指し、Rσはヘテロアリール基であり、それは必要に応じて置換されてもよい。
「アルキルオキシカルボニル」は-C(O)ORζを指し、Rζはアルキル基であり、それは必要に応じて置換されてもよい。
「アリールオキシカルボニル」は-C(O)ORλを指し、Rλはアリール基であり、それは必要に応じて置換されてもよい。
「ヘテロアリールオキシカルボニル」は-C(O)ORσを指し、Rσはヘテロアリール基であり、それは必要に応じて置換されてもよい。
「アリールアルキルオキシカルボニル」は-C(O)ORρを指し、Rρはアリール-アルキル基であり、それは必要に応じて置換されてもよい。
「アルキルカルボニルオキシ」は-OC(O)-Rζを指し、Rはアルキル基であり、それは必要に応じて置換されてもよい。
「アリールカルボニルオキシ」は-OC(O)Rλを指し、Rはアリール基であり、それは必要に応じて置換されてもよい。
「ヘテロアリールアルキルオキシカルボニル」は-C(O)ORωを指し、Rωはヘテロアリールアルキル基であり、それは必要に応じて置換されてもよい。
「ヘテロアリールカルボニルオキシ」は-OC(O)Rσを指し、Rσはヘテロアリール基であり、それは必要に応じて置換されてもよい。
「アミノカルボニル」は-C(O)NH2を指す。置換されたアミノカルボニルは-C(O)NRηRηを指し、アミノ基NRηRηは本明細書で規定される通りである。
「アミノカルボニルアルキル」は、アミノカルボニル基で置換されたアルキルを指す。
「ハロゲン」または「ハロ」は、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードを指す。
「ハロアルキル」は、1つまたは複数のハロゲンで置換されたアルキル基を指す。したがって、用語「ハロアルキル」は、モノハロアルキル、ジハロアルキル、トリハロアルキル等からペルハロアルキルまでを含むものである。例えば、表現「(C1 C2)ハロアルキル」は、1-フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、1-フルオロエチル、1,1-ジフルオロエチル、1,2-ジフルオロエチル、1,1,1トリフルオロエチル、ペルフルオロエチル等を含む。
「ヒドロキシ」は、-OHを指す。
「ヒドロキシアルキル」は、1つまたは複数のヒドロキシ基で置換されたアルキルを指す。
「シアノ」は、-CNを指す。
「ニトロ」は、-NO2を指す。
「チオ」または「スルファニル」は、-SHを指す。置換されたチオまたはスルファニルは-S-Rηを指し、Rηはアルキル、アリールまたは他の好適な置換基である。
「アルキルチオ」は-SRζを指し、Rζはアルキルであり、それは必要に応じて置換されてもよい。一般的なアルキルチオ基には、限定されずに、メチルチオ、エチルチオ、n-プロピルチオなどが含まれる。
「アリールチオ」は-SRλを指し、Rλはアリールであり、それは必要に応じて置換されてもよい。一般的なアリールチオ基には、限定されずに、フェニルチオ、(4-メチルフェニル)チオ、ピリジニルチオなどが含まれる。
「ヘテロアリールチオ」は-SRσを指し、Rσはヘテロアリールであり、それは必要に応じて置換されてもよい。
「スルホニル」は、-SO2-を指す。置換されたスルホニルは-SO2-Rηを指し、Rηはアルキル、アリールまたは他の好適な置換基である。
「アルキルスルホニル」は-SO2-Rζを指し、Rζはアルキルであり、それは必要に応じて置換されてもよい。一般的なアルキルスルホニル基には、限定されずに、メチルスルホニル、エチルスルホニル、n-プロピルスルホニルなどが含まれる。
「アリールスルホニル」は-SO2-Rλを指し、Rλはアリールであり、それは必要に応じて置換されてもよい。一般的なアリールスルホニル基には、限定されずに、フェニルスルホニル、(4-メチルフェニル)スルホニル、ピリジニルスルホニルなどが含まれる。
「ヘテロアリールスルホニル」は-SO2-Rσを指し、Rσはヘテロアリール基であり、それは必要に応じて置換されてもよい。
「スルフィニル」は、-SO-を指す。置換されたスルフィニルは-SO-Rηを指し、Rηはアルキル、アリールまたは他の好適な置換基である。
「アルキルスルフィニル」は-SO-Rζを指し、Rζはアルキルであり、それは必要に応じて置換されてもよい。一般的なアルキルスルフィニル基には、限定されずに、メチルスルフィニル、エチルスルフィニル、n-プロピルスルフィニルなどが含まれる。
「アリールスルフィニル」は-SO-Rλを指し、Rλはアリールであり、それは必要に応じて置換されてもよい。一般的なアリールスルフィニル基には、限定されずに、フェニルスルフィニル、(4-メチルフェニル)スルフィニル、ピリジニルスルフィニルなどが含まれる。
「ヘテロアリールスルフィニル」は-SO-Rσを指し、Rσはヘテロアリール基であり、それは必要に応じて置換されてもよい。
「アルキルアミノスルホニルアルキル」は、アルキル-NH-SO2基で置換されたアルキルを指す。
「アリールスルホニルアルキル」は、アリール-SO2基で置換されたアルキルを指す。
「ヘテロアリールスルホニルアルキル」は、ヘテロアリール-SO2基で置換されたアルキルを指す。
「アミノスルホニル」は-SO2NH2を指す。置換されたアミノスルホニルは-SO2NRδRδを指し、アミノ基-NRηRηは本明細書で規定される通りである。
「ヘテロアリール」は、環の中の込みで1から10の炭素原子、および酸素、窒素および硫黄から選択される込みで1から4のヘテロ原子の芳香族複素環基を指す。そのようなヘテロアリール基は、単環(例えば、ピリジルまたはフリル)または複数の縮合環(例えば、インドリジニルまたはベンゾチエニル)を有することができる。
「ヘテロアリールアルキル」は、ヘテロアリールで置換されるアルキル、すなわちヘテロアリール-アルキル基を指し、好ましくはアルキル部分に込みで1~6の炭素原子を、およびヘテロアリール部分に込みで5~12の環原子を有する。そのようなヘテロアリールアルキル基は、ピリジルメチルなどによって例示される。
「ヘテロアリールアルケニル」は、ヘテロアリールで置換されるアルケニル、すなわちヘテロアリール-アルケニル基を指し、好ましくはアルケニル部分に込みで2~6の炭素原子を、およびヘテロアリール部分に込みで5~12の環原子を有する。
「ヘテロアリールアルキニル」は、ヘテロアリールで置換されるアルキニル、すなわちヘテロアリール-アルキニル基を指し、好ましくはアルキニル部分に込みで2~6の炭素原子を、およびヘテロアリール部分に込みで5~12の環原子を有する。
「複素環」、「複素環式の」および互換性の「ヘテロシクロアルキル」は、環の中に単環または複数の縮合環、込みで2~10の炭素環原子、および窒素、硫黄または酸素から選択される込みで1~4のヘテロ環原子を有する、飽和または不飽和の基を指す。そのような複素環基は、単環(例えば、ピペリジニルまたはテトラヒドロフリル)または複数の縮合環(例えば、インドリニル、ジヒドロベンゾフランまたはキヌクリジニル)を有することができる。複素環の例には、限定されずに、フラン、チオフェン、チアゾール、オキサゾール、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドリジン、イソインドール、インドール、インダゾール、プリン、キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチルピリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、フェナントロリン、イソチアゾール、フェナジン、イソオキサゾール、フェノキサジン、フェノサイアジン、イミダゾリジン、イミダゾリン、ピペリジン、ピペラジン、ピロリジン、インドリンなどが含まれる。
「ヘテロシクロアルキルアルキル」は、ヘテロシクロアルキルで置換されるアルキル、すなわちヘテロシクロアルキル-アルキル基を指し、好ましくはアルキル部分に込みで1~6の炭素原子を、およびヘテロシクロアルキル部分に込みで3~12の環原子を有する。
「ヘテロシクロアルキルアルケニル」は、ヘテロシクロアルキルで置換されるアルケニル、すなわちヘテロシクロアルキル-アルケニル基を指し、好ましくはアルケニル部分に込みで2~6の炭素原子を、およびヘテロシクロアルキル部分に込みで3~12の環原子を有する。
「ヘテロシクロアルキルアルキニル」は、ヘテロシクロアルキルで置換されるアルキニル、すなわちヘテロシクロアルキル-アルキニル基を指し、好ましくはアルキニル部分に込みで2~6の炭素原子を、およびヘテロシクロアルキル部分に込みで3~12の環原子を有する。
「脱離基」は、化学反応で別の原子または部分によって排除されることが可能である任意の原子または部分を一般的に指す。より具体的には、脱離基は求核体(例えば、アミン、チオール、アルコールまたはシアン化物)によって容易に排除され、置換される原子または部分を指す。そのような脱離基は周知であり、カルボキシレート、N-ヒドロキシスクシンイミド(「NHS」)、N-ヒドロキシベンゾトリアゾール、ハロゲン(フッ素、塩素、臭素またはヨウ素)およびアルキルオキシ基が含まれる。脱離基の非限定的な特徴および例は、例えばOrganic Chemistry, 2d ed., Francis Carey (1992), pages 328-331;Introduction to Organic Chemistry, 2d ed., Andrew Streitwieser and Clayton Heathcock (1981), pages 169-171;およびOrganic Chemistry, 5th Ed., John McMurry, Brooks/Cole Publishing (2000), pages 398 and 408;で見出すことができ、その全ては参照により本明細書に組み込まれる。
特記しない限り、上記の基において水素によって占められる位置は、ヒドロキシ、オキソ、ニトロ、メトキシ、エトキシ、アルコキシ、置換されたアルコキシ、トリフルオロメトキシ、ハロアルコキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、ハロ、メチル、エチル、プロピル、ブチル、アルキル、アルケニル、アルキニル、置換されたアルキル、トリフルオロメチル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、チオ、アルキルチオ、アシル、カルボキシ、アルコキシカルボニル、カルボキシアミド、置換されたカルボキシアミド、アルキルスルホニル、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニルアミノ、スルホンアミド、置換されたスルホンアミド、シアノ、アミノ、置換されたアミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、アシルアミノ、アミジノ、アミドオキシモ、ヒドロキサモイル、フェニル、アリール、置換されたアリール、アリールオキシ、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ピリジル、イミダゾリル、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、置換されたシクロアルキル、シクロアルキルオキシ、ピロリジニル、ピペリジニル、モルホリノ、複素環、(複素環)オキシおよび(複素環)アルキル;によって限定されずに例示される置換基でさらに置換されてもよく、好ましいヘテロ原子は、酸素、窒素および硫黄である。これらの置換基にオープンな結合価が存在する場合、それらはアルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールおよび/または複素環基でさらに置換されてもよいこと、これらのオープンな結合価が炭素に存在する場合、それらはハロゲンによって、および酸素、窒素または硫黄に結合した置換基によってさらに置換されてもよいこと、およびそのようなオープンな結合価が複数存在する場合、これらの基は結合の直接的な形成によって、または新規のヘテロ原子、好ましくは酸素、窒素もしくは硫黄への結合の形成によって、連結して環を形成することができることが理解される。上記の置換は、水素を置換基で置き換えることが本開示の分子に許容されない不安定性を導入せず、それ以外の点で化学的に合理的であるならば可能であることがさらに理解される。
「必要に応じた」または「必要に応じて」は、その後に記載される事象または状況が起こるかまたは起こらないかもしれないこと、ならびにその記載が事象または状況が起こる場合および起こらない場合を含むことを意味する。当業者は、1つまたは複数の必要に応じた置換基を含有すると記載される任意の分子に関して、立体配置的に実際的なおよび/または合成的に実行可能な化合物だけが含まれるものであることを理解するだろう。「必要に応じて置換された」は、用語の中の全ての以降の修飾因子または一連の化学基を指す。例えば、用語「必要に応じて置換されたアリールアルキル」で、分子の「アルキル」部分および「アリール」部分は置換されてもよいか置換されなくてもよく、一連の「必要に応じて置換されたアルキル、シクロアルキル、アリールおよびヘテロアリール」の場合、アルキル、シクロアルキル、アリールおよびヘテロアリール基は、他と独立して置換されても置換されなくてもよい。
「保護基」は、分子中の反応性官能基に結合したとき、官能基の反応性をマスクするか、低減するか、阻止する一群の原子を指す。一般的に、保護基は、合成中に所望により選択的に除去することができる。保護基の例は、Wuts and Greene, "Greene's Protective Groups in Organic Synthesis," 4th Ed., Wiley Interscience (2006)およびHarrison et al., Compendium of Synthetic Organic Methods, Vols. 1-8, 1971-1996, John Wiley & Sons, NY、に見出すことができる。保護基を有することができる官能基には、限定されずに、ヒドロキシ、アミノおよびカルボキシ基が含まれる。代表的なアミノ保護基には、限定されずに、ホルミル、アセチル、トリフルオロアセチル、ベンジル、ベンジルオキシカルボニル(「CBZ」)、tert-ブトキシカルボニル(「Boc」)、トリメチルシリル(「TMS」)、2-トリメチルシリル-エタンスルホニル(「SES」)、トリチルおよび置換されたトリチル基、アリルオキシカルボニル、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル(「FMOC」)、ニトロ-ベラトリルオキシカルボニル(「NVOC」)などが含まれる。
本明細書で使用される「ポリオール」は、複数のヒドロキシ基を含有する化合物を指す。ポリマーに関して、ポリオールはヒドロキシル官能基を有するポリマーを含む。例示的なポリマーポリオールには、限定ではなく例として、ポリエーテルおよびポリエステル、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリ(テトラメチレン)グリコールおよびポリテトラヒドロフランが含まれる。
5.3 操作されたトランスアミナーゼポリペプチド
5.3 操作されたトランスアミナーゼポリペプチド
本開示は、トランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチド、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびポリペプチドを使用する方法を提供する。上記の記載がポリペプチドに関連する場合、それがポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも記載することを理解すべきである。
アミノ基転移酵素としても知られるトランスアミナーゼは、アミノ供与体基質の一級アミンからアミノ受容体分子のカルボニル基(例えば、ケトまたはアルデヒド基)へのアミノ基の転移を触媒する。トランスアミナーゼは、Alcaligenes denitrificans、Bordetella bronchiseptica、Bordetella parapertussis、Brucella melitensis、Burkholderia malle、Burkholderia pseudomallei、Chromobacterium violaceum、Oceanicola granulosus HTCC2516、Oceanobacter sp.RED65、Oceanospirillum sp.MED92、Pseudomonas putida、Ralstonia solanacearum、Rhizobium meliloti、Rhizobium sp.(株NGR234)、Bacillus thuringensis、Klebsiella pneumoniaeおよびVibrio fluvialisを限定されずに含む、様々な微生物から同定されている(例えば、Shin et al., 2001, Biosci. Biotechnol, Biochem. 65:1782-1788を参照する)。
トランスアミナーゼは、反応を立体特異的方法で、すなわち1つの鏡像異性体の対応するケトンへの優先変換で実行し、それによって他の鏡像異性体に富む混合物をもたらすトランスアミナーゼの能力を活用することによって、ラセミアミンをキラル分割するために有益である(例えば、Koselewski et al., 2009, Org Lett. 11(21):4810-2を参照する)。ケトンから対応するアミンへの変換におけるトランスアミナーゼの立体選択性のおかげで、これらの酵素は、対応するケト化合物からの光学的に純粋なアミンの非対称合成においても有益である(例えば、Hohne et al., "Biocatalytic Routes to Optically Active Amines," Chem Cat Chem 1(1):42 - 51;Zua and Hua, 2009, Biotechnol J. 4(10):1420-31を参照する)。
Vibrio fluvialis ω-VfTからの野生型ω-トランスアミナーゼは、ある特定のキラルアミンの(S)-鏡像異性体への高いエナンチオ選択性を示し、キラル芳香族アミンへの基質特異性を有する(例えば、Shin and Kim, 2002, J. Org. Chem. 67:2848-2853を参照する)。ω-VfTの高いエナンチオ選択性は、アミンのキラル分割に適用されてきた(例えば、Yun, et al., 2004, Biotechnol. Bioeng. 87:772-778;Shin and Kim, 1997, Biotechnol. Bioeng. 55:348-358;M. Hchne, et al., 2008, Adv. Synth. Catal. 350:802-807を参照する)。ω-VfTトランスアミナーゼは、プロキラルケトン基質を使用した光学的に純粋なアミンの非対称合成でも使用されている。しかし、キラルアミンの非対称合成におけるこのトランスアミナーゼの使用は、逆反応の好ましからぬ平衡(例えば、Shin and Kim, 1999, Biotechnol. Bioeng. 65, 206-211を参照する);キラルアミン生成物による阻害(例えば、Shin et al., 2001, Biotechnol Bioeng 73:179-187;Yun and Kim, 2008, Biosci. Biotechnol. Biochem. 72(11):3030-3033を参照する);芳香族基などのかさばった側鎖を有するアミン受容体への低い活性(例えば、Shin and Kim, 2002, J. Org. Chem. 67:2848-2853を参照する);および低い酵素安定性(例えば、Yun and Kim、前掲、を参照する)によって制限される。
脂肪族ケトンへの抵抗性が増加した(例えば、Yun et al., 2005, Appl Environ Micriobiol. 71(8):4220-4224を参照する)およびアミノ供与体基質特異性が広がった(例えば、Cho et al., 2008, Biotechnol Bioeng. 99(2):275-84を参照する)Vibrio fluvialisのω-VfTトランスアミナーゼに由来するバリアントトランスアミナーゼが報告されている。米国特許第8,470,564号、米国特許第9,029,106号、米国特許第9,512,410号、米国特許第9,944,909号、米国特許第10,323,233号および米国特許第10,550,370号(その各々はここに参照により本明細書に組み込まれる)は、温度および/または有機溶媒への安定性の増加、ならびに構造的に異なるアミノ受容体分子への酵素活性の増加を含む、キラルアミン化合物の合成で使用するための向上した特性を有する、ω-VfTに由来する操作されたトランスアミナーゼを記載する。米国特許公開第8,852,900号および第8,932,838号(その各々はここに参照により本明細書に組み込まれる)は、基質3’-ヒドロキシアセトフェノンの生成物(S)-3-(1-アミノエチル)-フェノールへのエナンチオマー選択的変換のために最適化される、ω-VfTに由来する操作されたトランスアミナーゼを記載する。
重要なことに、本開示は、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドの中で、酵素活性、エナンチオ選択性、安定性、基質寛容性および生成物阻害への不応性を増加させることができるアミノ酸残基の位置および対応するアミノ酸残基置換を同定する。
構造ベースの合理的な配列ライブラリー設計を使用した指向性進化方法を通して操作されたし、合わせて化合物の例示的な基質アミン受容体のプロキラルケトン基からのその対応するキラルアミン生成物への変換に基づく活性アッセイを使用して向上した機能特性についてスクリーニングすることによる、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドの中での特定の残基位置および置換の同定。具体的には、化合物(2)のケトンの化合物(3)の対応するキラルアミン化合物への変換、スキーム4で示す。
一部の実施形態では、本発明は、強力な小分子薬物サボリチニブ(1)を生成するためにさらなるステップで利用される、中間体(1S)-1-イミダゾ[1,2-a]ピリジン-6-イルエタンアミン(3)の生成のために好適なATA酵素の詳細を提供する。
サボリチニブ、化合物(1)または3-[(1S)-1-イミダゾ[1,2-a]ピリジン-6-イルエチル]-5-(1-メチルピラゾール-4-イル)トリアゾロ[4,5-b]ピラジン。
化合物(1)を生成する現行の化学合成アプローチは、スキーム3に示すように、7つのステップを含む初期のプロセス(WO2020/053198)を置き換える4つのステップを含む。この新規のアプローチは、最後のステップで生成物の50%の浪費に導く最終化合物(1)の望ましくないキラル分割を排除するだけでなく、それは元の経路からの中間体のいくつかの単離および精製ステップも回避する。より重要なことに、残りの合成を通して維持されるエナンチオ選択性アミン(3)を生成するために、それは操作されたATA酵素を使用して第1のステップでキラル中心を導入する。
一部の実施形態では、本開示の操作されたトランスアミナーゼを、スキーム4に示す基質ケトン1-イミダゾ[1,2-a]ピリジン-6-イルエタノン(2)の生成物(1S)-1-イミダゾ[1,2-a]ピリジン-6-イルエタンアミン(3)への非対称エナンチオ選択性アミノ基転移における活性および基質寛容性をさらに向上させるために進化させた。
ケトン基質化合物からキラルアミン生成物化合物への効率的な変換のために適合させた操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、配列番号4の参照の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドのアミノ酸配列と比較して1つまたは複数の残基差を有する。残基差は、酵素活性、酵素安定性、基質寛容性および生成物アミンによる阻害への抵抗性を含む酵素特性の増強と関連している。
本開示は、一部の実施形態では化合物(3)を含むことができる、キラルアミン生成物を生成するアミノ受容体基質化合物の選択的アミノ基転移のために有益なトランスアミナーゼ活性(本明細書では「操作されたトランスアミナーゼポリペプチド」とも呼ばれる)を有する、操作されたポリペプチドを提供する。したがって、一態様では、本開示は、スキーム4に示すように基質化合物(2)を生成物化合物(3)へ変換することが可能である、トランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。
本開示の操作されたポリペプチドは、Vibrio fluvialis JS17(GenBank Acc.番号AEA39183.1、GI:327207066;配列番号2)の野生型トランスアミナーゼポリペプチドと比較して、さらに、本開示の操作されたポリペプチドの指向性進化のための出発主鎖配列として使用された配列番号4の参照の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドと比較して、向上した酵素特性(例えば増加した活性)を有するように操作された天然に存在しないトランスアミナーゼである。配列番号4の参照の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、Vibrio fluvialis JS17の野生型トランスアミナーゼ(配列番号2)と比較して26のアミノ酸差を有する。
本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、ある特定の産業的に妥当な条件の下での化合物(2)から化合物(3)への効率的な変換のための配列番号4の指向性進化によって生成され、参照の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドと比較して1つまたは複数の残基差を有する。これらの残基差は、様々な酵素特性の向上、特に増加した活性、増加した立体選択性、増加した安定性、ならびに増加した基質および/または生成物濃度の寛容性(例えば、減少した生成物阻害)と関連している。したがって、一部の実施形態では、トランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、好適な反応条件の下で、参照ポリペプチド(例えば、配列番号4および/または6)の活性と比較して少なくとも約1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍またはそれより多く増加した活性で基質化合物(2)を化合物(3)へ変換することが可能である。一部の実施形態では、トランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、好適な反応条件の下で、約48時間、約36時間、約24時間またはさらにより短い時間の反応時間内で、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%または少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%のパーセント変換で、化合物(2)の基質を化合物(3)へ変換することが可能である。一部の実施形態では、トランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、好適な反応条件の下で、少なくとも90%、95%、97%、98%、99%またはそれより大きなジアステレオマー過剰で、化合物(2)を化合物(3)へ変換することが可能である。
本開示は、偶数の配列識別子配列番号6~358のアミノ酸配列を含む多数の例示的な操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを提供する。これらの例示的な操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、参照配列(例えば、配列番号4および/または6)と比較して化合物(2)から化合物(3)への変換に関するそれらの向上した特性と関連している以下の残基差の1つまたは複数を含むアミノ酸配列を含む。
一部の場合には、例示的な操作されたポリペプチドは、参照配列(例えば、配列番号4および/または6)と比較して1つまたは複数の残基差をさらに含むアミノ酸配列を有する。一部の場合には、例示的な操作されたポリペプチドは、参照配列(例えば、配列番号4および/または6)と比較して1つまたは複数の残基差をさらに含むアミノ酸配列を有する。
一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号4および/または6から選択される参照配列と少なくとも約80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高く同一であるアミノ酸配列を含み、ここでポリペプチドはトランスアミナーゼ活性、および本明細書に記載される向上した特性の1つまたは複数、例えば、化合物(2)を参照配列(例えば、配列番号4および/または6のポリペプチド)と比較して増加した活性で生成物化合物(3)へ変換する能力を有する。一部の実施形態では、参照配列は配列番号4である。一部の実施形態では、参照配列は配列番号6である。
一部の実施形態では、アミノ酸配列を含む操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、配列番号4および/または6と比較して1つまたは複数のアミノ酸残基差を有する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号4および/または6の参照配列と少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性、ならびに本明細書で提供される置換から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基差を有するアミノ酸配列を含む、トランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する(例えば、表5.1および/または6.1を参照する)。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号4と比較して、13、41/57/130/415/419、41/113/415、53/57、88、88/89、97/415、148、227、260、302、355/415/419、362、417および443から選択される1つまたは複数のアミノ酸残基差を有するアミノ酸配列を含む、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを提供し、これらの位置は配列番号4に関して番号付けされる。一部の実施形態では、アミノ酸の差は置換13A、13E、13G、13K、13S、41V/57Y/130Y/415F/419D、41V/113F/415F、53M/57W、88K、88R、88R/89L、88V、97A/415S、148E、148G、227A、227C、260T、302N、355C/415S/419D、362G、417A、417I、417V、443Eおよび443Mを含み、これらの位置は配列番号4に関して番号付けされる。一部の追加の実施形態では、アミノ酸の差は置換T13A、T13E、T13G、T13K、T13S、I41V/F57Y/F130Y/R415F/Q419D、I41V/V113F/R415F、N53M/F57W、L88K、L88R、L88R/M89L、L88V、S97A/R415S、Q148E、Q148G、G227A、G227C、C260T、E302N、R355C/R415S/Q419D、H362G、L417A、L417I、L417V、K443EおよびK443Mを含み、これらの位置は配列番号4に関して番号付けされる。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号6と比較して、13、13/41/57/88/130/415/417、13/41/57/89/97/417、13/41/57/97/130/415/417、13/41/57/97/130/415/417/443、13/41/57/97/443、13/41/57/130/417、13/41/57/417、13/41/88、13/41/88/89、13/41/88/89/97/415/443、13/41/88/89/417、13/41/88/97、13/41/88/130/415/443、13/41/88/443、13/41/89/130/148/443、13/41/89/417、13/41/89/443、13/41/97/130/417、13/41/97/415、13/41/97/415/417、13/41/97/417、13/41/97/417/443、13/41/130/415/443、13/41/415、13/41/415/417、13/41/415/443、13/41/417、13/41/417/443、13/57/88/89/130/415/443、13/57/88/97、13/57/88/97/415/443、13/57/88/130/415、13/57/88/130/417/443、13/57/88/415、13/57/97/130/415/417/443、13/57/97/417、13/88/89/415/417、13/88/89/415/417/443、13/88/130/443、13/88/415、13/89/97/415/417、13/89/97/417、13/89/417、13/97/148/415、13/97/415、13/97/415/417、13/97/417、13/130/415、13/130/415/417、13/130/417、13/130/417/443、13/415、13/415/417、13/415/417/443、13/415/443、13/417、13/417/443、13/443、23/53/162/233/277/315/415/418/432、23/53/315/417/418、23/277/315/395/415/417/432、23/277/395/417/418、23/395/418、23/418、41、41/57/88、41/57/88/415/443、41/57/130/148/415/417、41/57/130/443、41/57/415/417、41/88/89/97/130/415、41/88/89/415/417、41/88/97/130/417、41/88/130/415/417、41/88/443、41/97/130/148/415/417/443、41/97/417、41/97/417/443、41/130/415、41/130/415/417/443、41/130/415/443、41/415/443、41/417、41/417/443、53/162、53/162/395/417、53/162/418/432、53/233、53/277/395、53/277/395/417/418、53/277/415/417、57/88/97/130/415/443、57/88/97/130/417、57/88/97/417、57/97/130/148/417/443、57/417、88、88/89/130/417、88/97/415/417/443、88/130/417/443、88/148/417/443、88/415、88/415/417、88/415/417/443、88/417、89/97/415/417、89/97/417、89/443、97、97/130、97/148/415、97/415、97/415/417、97/417、130、130/415、130/417、130/443、162/233/415/417、162/395/415/417、162/418、233/315/415/417、233/315/417、277/395/415/418/432、315、315/415/418/432、395/418、415、415/417、415/417/418、415/417/418/432、415/417/443、415/443、417および443から選択される1つまたは複数のアミノ酸残基差を有するアミノ酸配列を含む操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを提供し、これらの位置は配列番号6に関して番号付けされる。
一部の実施形態では、アミノ酸の差は、置換13A、13A/41V/57Y/88R/130Y/415S/417V、13A/41V/57Y/89L/97A/417V、13A/41V/57Y/97A/130Y/415S/417I/443M、13A/41V/57Y/130Y/417V、13A/41V/57Y/417I、13A/41V/88R/89L、13A/41V/88R/443M、13A/41V/89L/130Y/148G/443M、13A/41V/89L/443M、13A/41V/97A/417I、13A/41V/130Y/415S/443M、13A/41V/415S、13A/41V/415S/417I、13A/41V/415S/417V、13A/41V/417V/443M、13A/57Y/88R/89L/130Y/415S/443M、13A/57Y/88R/97A、13A/57Y/88R/97A/415S/443M、13A/57Y/88R/130Y/415S、13A/57Y/88R/130Y/417V/443M、13A/57Y/88R/415S、13A/88R/89L/415S/417V、13A/88R/130Y/443M、13A/88R/415S、13A/89L/417I、13A/97A/148G/415S、13A/97A/417I、13A/97A/417V、13A/130Y/417V、13A/415S、13A/415S/417I/443M、13A/415S/417V、13A/415S/443M、13A/417I/443M、13E/41V/57Y/97A/130Y/415S/417V、13E/41V/57Y/97A/443M、13E/41V/88R、13E/41V/88R/89L/97A/415S/443M、13E/41V/88R/89L/417V、13E/41V/88R/97A、13E/41V/88R/130Y/415S/443M、13E/41V/89L/417V、13E/41V/97A/130Y/417I、13E/41V/97A/415S、13E/41V/97A/415S/417V、13E/41V/97A/417I/443M、13E/41V/415S/443M、13E/41V/417V、13E/57Y/88R/97A/415S/443M、13E/57Y/97A/130Y/415S/417V/443M、13E/57Y/97A/417V、13E/88R/89L/415S/417I、13E/88R/89L/415S/417V、13E/88R/89L/415S/417V/443M、13E/89L/97A/415S/417V、13E/89L/97A/417V、13E/97A/415S、13E/97A/415S/417V、13E/130Y/415S、13E/130Y/415S/417I、13E/130Y/417I/443M、13E/130Y/417V、13E/415S/443M、13E/417I、13E/417V、13E/417V/443M、13E/443M、23K/53C/162A/233I/277I/315G/415A/418D/432V、23K/53C/315G/417V/418D、23K/277I/315G/395D/415A/417G/432V、23K/277I/395D/417V/418D、23K/395D/418D、23K/418D、41V、41V/57Y/88R、41V/57Y/88R/415S/443M、41V/57Y/130Y/148G/415S/417I、41V/57Y/130Y/443M、41V/57Y/415S/417I、41V/88R/89L/97A/130Y/415S、41V/88R/89L/415S/417I、41V/88R/97A/130Y/417I、41V/88R/130Y/415S/417I、41V/88R/443M、41V/97A/130Y/148G/415S/417V/443M、41V/97A/417I、41V/97A/417I/443M、41V/130Y/415S、41V/130Y/415S/417I/443M、41V/130Y/415S/443M、41V/415S/443M、41V/417I、41V/417V、41V/417V/443M、53C/162A、53C/162A/395D/417V、53C/162A/418D/432V、53C/233I、53C/277I/395D、53C/277I/395D/417V/418D、53C/277I/415A/417G、57Y/88R/97A/130Y/415S/443M、57Y/88R/97A/130Y/417V、57Y/88R/97A/417I、57Y/97A/130Y/148G/417I/443M、57Y/417V、88R、88R/89L/130Y/417I、88R/97A/415S/417I/443M、88R/130Y/417I/443M、88R/148G/417V/443M、88R/415S、88R/415S/417I、88R/415S/417I/443M、88R/415S/417V/443M、88R/417I、89L/97A/415S/417I、89L/97A/417I、89L/443M、97A、97A/130Y、97A/148G/415S、97A/415S、97A/415S/417I、97A/415S/417V、97A/417I、130Y、130Y/415S、130Y/417I、130Y/443M、162A/233I/415A/417V、162A/395D/415A/417V、162A/418D、233I/315G/415A/417V、233I/315G/417V、277I/395D/415A/418D/432V、315G、315G/415A/418D/432V、395D/418D、415A/417G/418D、415A/417V、415A/417V/418D、415A/417V/418D/432V、415S、415S/417I/443M、415S/417V、415S/417V/443M、415S/443M、417Vおよび443Mを含み、これらの位置は配列番号6に関して番号付けされる。
一部の追加の実施形態では、アミノ酸の差は、置換T13A、T13A/I41V/F57Y/L88R/F130Y/R415S/L417V、T13A/I41V/F57Y/M89L/S97A/L417V、T13A/I41V/F57Y/S97A/F130Y/R415S/L417I/K443M、T13A/I41V/F57Y/F130Y/L417V、T13A/I41V/F57Y/L417I、T13A/I41V/L88R/M89L、T13A/I41V/L88R/K443M、T13A/I41V/M89L/F130Y/Q148G/K443M、T13A/I41V/M89L/K443M、T13A/I41V/S97A/L417I、T13A/I41V/F130Y/R415S/K443M、T13A/I41V/R415S、T13A/I41V/R415S/L417I、T13A/I41V/R415S/L417V、T13A/I41V/L417V/K443M、T13A/F57Y/L88R/M89L/F130Y/R415S/K443M、T13A/F57Y/L88R/S97A、T13A/F57Y/L88R/S97A/R415S/K443M、T13A/F57Y/L88R/F130Y/R415S、T13A/F57Y/L88R/F130Y/L417V/K443M、T13A/F57Y/L88R/R415S、T13A/L88R/M89L/R415S/L417V、T13A/L88R/F130Y/K443M、T13A/L88R/R415S、T13A/M89L/L417I、T13A/S97A/Q148G/R415S、T13A/S97A/L417I、T13A/S97A/L417V、T13A/F130Y/L417V、T13A/R415S、T13A/R415S/L417I/K443M、T13A/R415S/L417V、T13A/R415S/K443M、T13A/L417I/K443M、T13E/I41V/F57Y/S97A/F130Y/R415S/L417V、T13E/I41V/F57Y/S97A/K443M、T13E/I41V/L88R、T13E/I41V/L88R/M89L/S97A/R415S/K443M、T13E/I41V/L88R/M89L/L417V、T13E/I41V/L88R/S97A、T13E/I41V/L88R/F130Y/R415S/K443M、T13E/I41V/M89L/L417V、T13E/I41V/S97A/F130Y/L417I、T13E/I41V/S97A/R415S、T13E/I41V/S97A/R415S/L417V、T13E/I41V/S97A/L417I/K443M、T13E/I41V/R415S/K443M、T13E/I41V/L417V、T13E/F57Y/L88R/S97A/R415S/K443M、T13E/F57Y/S97A/F130Y/R415S/L417V/K443M、T13E/F57Y/S97A/L417V、T13E/L88R/M89L/R415S/L417I、T13E/L88R/M89L/R415S/L417V、T13E/L88R/M89L/R415S/L417V/K443M、T13E/M89L/S97A/R415S/L417V、T13E/M89L/S97A/L417V、T13E/S97A/R415S、T13E/S97A/R415S/L417V、T13E/F130Y/R415S、T13E/F130Y/R415S/L417I、T13E/F130Y/L417I/K443M、T13E/F130Y/L417V、T13E/R415S/K443M、T13E/L417I、T13E/L417V、T13E/L417V/K443M、T13E/K443M、P23K/N53C/G162A/T233I/T277I/E315G/R415A/G418D/A432V、P23K/N53C/E315G/L417V/G418D、P23K/T277I/E315G/G395D/R415A/L417G/A432V、P23K/T277I/G395D/L417V/G418D、P23K/G395D/G418D、P23K/G418D、I41V、I41V/F57Y/L88R、I41V/F57Y/L88R/R415S/K443M、I41V/F57Y/F130Y/Q148G/R415S/L417I、I41V/F57Y/F130Y/K443M、I41V/F57Y/R415S/L417I、I41V/L88R/M89L/S97A/F130Y/R415S、I41V/L88R/M89L/R415S/L417I、I41V/L88R/S97A/F130Y/L417I、I41V/L88R/F130Y/R415S/L417I、I41V/L88R/K443M、I41V/S97A/F130Y/Q148G/R415S/L417V/K443M、I41V/S97A/L417I、I41V/S97A/L417I/K443M、I41V/F130Y/R415S、I41V/F130Y/R415S/L417I/K443M、I41V/F130Y/R415S/K443M、I41V/R415S/K443M、I41V/L417I、I41V/L417V、I41V/L417V/K443M、N53C/G162A、N53C/G162A/G395D/L417V、N53C/G162A/G418D/A432V、N53C/T233I、N53C/T277I/G395D、N53C/T277I/G395D/L417V/G418D、N53C/T277I/R415A/L417G、F57Y/L88R/S97A/F130Y/R415S/K443M、F57Y/L88R/S97A/F130Y/L417V、F57Y/L88R/S97A/L417I、F57Y/S97A/F130Y/Q148G/L417I/K443M、F57Y/L417V、L88R、L88R/M89L/F130Y/L417I、L88R/S97A/R415S/L417I/K443M、L88R/F130Y/L417I/K443M、L88R/Q148G/L417V/K443M、L88R/R415S、L88R/R415S/L417I、L88R/R415S/L417I/K443M、L88R/R415S/L417V/K443M、L88R/L417I、M89L/S97A/R415S/L417I、M89L/S97A/L417I、M89L/K443M、S97A、S97A/F130Y、S97A/Q148G/R415S、S97A/R415S、S97A/R415S/L417I、S97A/R415S/L417V、S97A/L417I、F130Y、F130Y/R415S、F130Y/L417I、F130Y/K443M、G162A/T233I/R415A/L417V、G162A/G395D/R415A/L417V、G162A/G418D、T233I/E315G/R415A/L417V、T233I/E315G/L417V、T277I/G395D/R415A/G418D/A432V、E315G、E315G/R415A/G418D/A432V、G395D/G418D、R415A/L417G/G418D、R415A/L417V、R415A/L417V/G418D、R415A/L417V/G418D/A432V、R415S、R415S/L417I/K443M、R415S/L417V、R415S/L417V/K443M、R415S/K443M、L417VおよびK443Mを含み、これらの位置は配列番号6に関して番号付けされる。
一部の実施形態では、アミノ酸の差は、置換13A、13A/41V/57Y/88R/130Y/415S/417V、13A/41V/57Y/89L/97A/417V、13A/41V/57Y/97A/130Y/415S/417I/443M、13A/41V/57Y/130Y/417V、13A/41V/57Y/417I、13A/41V/88R/89L、13A/41V/88R/443M、13A/41V/89L/130Y/148G/443M、13A/41V/89L/443M、13A/41V/97A/417I、13A/41V/130Y/415S/443M、13A/41V/415S、13A/41V/415S/417I、13A/41V/415S/417V、13A/41V/417V/443M、13A/57Y/88R/89L/130Y/415S/443M、13A/57Y/88R/97A、13A/57Y/88R/97A/415S/443M、13A/57Y/88R/130Y/415S、13A/57Y/88R/130Y/417V/443M、13A/57Y/88R/415S、13A/88R/89L/415S/417V、13A/88R/130Y/443M、13A/88R/415S、13A/89L/417I、13A/97A/148G/415S、13A/97A/417I、13A/97A/417V、13A/130Y/417V、13A/415S、13A/415S/417I/443M、13A/415S/417V、13A/415S/443M、13A/417I/443M、13E/41V/57Y/97A/130Y/415S/417V、13E/41V/57Y/97A/443M、13E/41V/88R、13E/41V/88R/89L/97A/415S/443M、13E/41V/88R/89L/417V、13E/41V/88R/97A、13E/41V/88R/130Y/415S/443M、13E/41V/89L/417V、13E/41V/97A/130Y/417I、13E/41V/97A/415S、13E/41V/97A/415S/417V、13E/41V/97A/417I/443M、13E/41V/415S/443M、13E/41V/417V、13E/57Y/88R/97A/415S/443M、13E/57Y/97A/130Y/415S/417V/443M、13E/57Y/97A/417V、13E/88R/89L/415S/417I、13E/88R/89L/415S/417V、13E/88R/89L/415S/417V/443M、13E/89L/97A/415S/417V、13E/89L/97A/417V、13E/97A/415S、13E/97A/415S/417V、13E/130Y/415S、13E/130Y/415S/417I、13E/130Y/417I/443M、13E/130Y/417V、13E/415S/443M、13E/417I、13E/417V、13E/417V/443M、13E/443M、23K/53C/162A/233I/277I/315G/415A/418D/432V、23K/53C/315G/417V/418D、23K/277I/315G/395D/415A/417G/432V、23K/277I/395D/417V/418D、23K/395D/418D、23K/418D、41V、41V/57Y/88R、41V/57Y/88R/415S/443M、41V/57Y/130Y/148G/415S/417I、41V/57Y/130Y/443M、41V/57Y/415S/417I、41V/88R/89L/97A/130Y/415S、41V/88R/89L/415S/417I、41V/88R/97A/130Y/417I、41V/88R/130Y/415S/417I、41V/88R/443M、41V/97A/130Y/148G/415S/417V/443M、41V/97A/417I、41V/97A/417I/443M、41V/130Y/415S、41V/130Y/415S/417I/443M、41V/130Y/415S/443M、41V/415S/443M、41V/417I、41V/417V、41V/417V/443M、53C/162A、53C/162A/395D/417V、53C/162A/418D/432V、53C/233I、53C/277I/395D、53C/277I/395D/417V/418D、53C/277I/415A/417G、57Y/88R/97A/130Y/415S/443M、57Y/88R/97A/130Y/417V、57Y/88R/97A/417I、57Y/97A/130Y/148G/417I/443M、57Y/417V、88R、88R/89L/130Y/417I、88R/97A/415S/417I/443M、88R/130Y/417I/443M、88R/148G/417V/443M、88R/415S、88R/415S/417I、88R/415S/417I/443M、88R/415S/417V/443M、88R/417I、89L/97A/415S/417I、89L/97A/417I、89L/443M、97A、97A/130Y、97A/148G/415S、97A/415S、97A/415S/417I、97A/415S/417V、97A/417I、130Y、130Y/415S、130Y/417I、130Y/443M、162A/233I/415A/417V、162A/395D/415A/417V、162A/418D、233I/315G/415A/417V、233I/315G/417V、277I/395D/415A/418D/432V、315G、315G/415A/418D/432V、395D/418D、415A/417G/418D、415A/417V、415A/417V/418D、415A/417V/418D/432V、415S、415S/417I/443M、415S/417V、415S/417V/443M、415S/443M、417Vおよび443Mを含み、これらの位置は配列番号6に関して番号付けされる。
一部の追加の実施形態では、アミノ酸の差は、置換T13A、T13A/I41V/F57Y/L88R/F130Y/R415S/L417V、T13A/I41V/F57Y/M89L/S97A/L417V、T13A/I41V/F57Y/S97A/F130Y/R415S/L417I/K443M、T13A/I41V/F57Y/F130Y/L417V、T13A/I41V/F57Y/L417I、T13A/I41V/L88R/M89L、T13A/I41V/L88R/K443M、T13A/I41V/M89L/F130Y/Q148G/K443M、T13A/I41V/M89L/K443M、T13A/I41V/S97A/L417I、T13A/I41V/F130Y/R415S/K443M、T13A/I41V/R415S、T13A/I41V/R415S/L417I、T13A/I41V/R415S/L417V、T13A/I41V/L417V/K443M、T13A/F57Y/L88R/M89L/F130Y/R415S/K443M、T13A/F57Y/L88R/S97A、T13A/F57Y/L88R/S97A/R415S/K443M、T13A/F57Y/L88R/F130Y/R415S、T13A/F57Y/L88R/F130Y/L417V/K443M、T13A/F57Y/L88R/R415S、T13A/L88R/M89L/R415S/L417V、T13A/L88R/F130Y/K443M、T13A/L88R/R415S、T13A/M89L/L417I、T13A/S97A/Q148G/R415S、T13A/S97A/L417I、T13A/S97A/L417V、T13A/F130Y/L417V、T13A/R415S、T13A/R415S/L417I/K443M、T13A/R415S/L417V、T13A/R415S/K443M、T13A/L417I/K443M、T13E/I41V/F57Y/S97A/F130Y/R415S/L417V、T13E/I41V/F57Y/S97A/K443M、T13E/I41V/L88R、T13E/I41V/L88R/M89L/S97A/R415S/K443M、T13E/I41V/L88R/M89L/L417V、T13E/I41V/L88R/S97A、T13E/I41V/L88R/F130Y/R415S/K443M、T13E/I41V/M89L/L417V、T13E/I41V/S97A/F130Y/L417I、T13E/I41V/S97A/R415S、T13E/I41V/S97A/R415S/L417V、T13E/I41V/S97A/L417I/K443M、T13E/I41V/R415S/K443M、T13E/I41V/L417V、T13E/F57Y/L88R/S97A/R415S/K443M、T13E/F57Y/S97A/F130Y/R415S/L417V/K443M、T13E/F57Y/S97A/L417V、T13E/L88R/M89L/R415S/L417I、T13E/L88R/M89L/R415S/L417V、T13E/L88R/M89L/R415S/L417V/K443M、T13E/M89L/S97A/R415S/L417V、T13E/M89L/S97A/L417V、T13E/S97A/R415S、T13E/S97A/R415S/L417V、T13E/F130Y/R415S、T13E/F130Y/R415S/L417I、T13E/F130Y/L417I/K443M、T13E/F130Y/L417V、T13E/R415S/K443M、T13E/L417I、T13E/L417V、T13E/L417V/K443M、T13E/K443M、P23K/N53C/G162A/T233I/T277I/E315G/R415A/G418D/A432V、P23K/N53C/E315G/L417V/G418D、P23K/T277I/E315G/G395D/R415A/L417G/A432V、P23K/T277I/G395D/L417V/G418D、P23K/G395D/G418D、P23K/G418D、I41V、I41V/F57Y/L88R、I41V/F57Y/L88R/R415S/K443M、I41V/F57Y/F130Y/Q148G/R415S/L417I、I41V/F57Y/F130Y/K443M、I41V/F57Y/R415S/L417I、I41V/L88R/M89L/S97A/F130Y/R415S、I41V/L88R/M89L/R415S/L417I、I41V/L88R/S97A/F130Y/L417I、I41V/L88R/F130Y/R415S/L417I、I41V/L88R/K443M、I41V/S97A/F130Y/Q148G/R415S/L417V/K443M、I41V/S97A/L417I、I41V/S97A/L417I/K443M、I41V/F130Y/R415S、I41V/F130Y/R415S/L417I/K443M、I41V/F130Y/R415S/K443M、I41V/R415S/K443M、I41V/L417I、I41V/L417V、I41V/L417V/K443M、N53C/G162A、N53C/G162A/G395D/L417V、N53C/G162A/G418D/A432V、N53C/T233I、N53C/T277I/G395D、N53C/T277I/G395D/L417V/G418D、N53C/T277I/R415A/L417G、F57Y/L88R/S97A/F130Y/R415S/K443M、F57Y/L88R/S97A/F130Y/L417V、F57Y/L88R/S97A/L417I、F57Y/S97A/F130Y/Q148G/L417I/K443M、F57Y/L417V、L88R、L88R/M89L/F130Y/L417I、L88R/S97A/R415S/L417I/K443M、L88R/F130Y/L417I/K443M、L88R/Q148G/L417V/K443M、L88R/R415S、L88R/R415S/L417I、L88R/R415S/L417I/K443M、L88R/R415S/L417V/K443M、L88R/L417I、M89L/S97A/R415S/L417I、M89L/S97A/L417I、M89L/K443M、S97A、S97A/F130Y、S97A/Q148G/R415S、S97A/R415S、S97A/R415S/L417I、S97A/R415S/L417V、S97A/L417I、F130Y、F130Y/R415S、F130Y/L417I、F130Y/K443M、G162A/T233I/R415A/L417V、G162A/G395D/R415A/L417V、G162A/G418D、T233I/E315G/R415A/L417V、T233I/E315G/L417V、T277I/G395D/R415A/G418D/A432V、E315G、E315G/R415A/G418D/A432V、G395D/G418D、R415A/L417G/G418D、R415A/L417V、R415A/L417V/G418D、R415A/L417V/G418D/A432V、R415S、R415S/L417I/K443M、R415S/L417V、R415S/L417V/K443M、R415S/K443M、L417VおよびK443Mを含み、これらの位置は配列番号6に関して番号付けされる。
一部の実施形態では、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、野生型または配列番号4の参照の操作されたトランスアミナーゼと比較して、同じ量の酵素により規定時間内に立体異性体過剰で、基質化合物(例えば、化合物(2))からアミノ生成物化合物(例えば、化合物(3))への変換において増加した活性を示す。一部の実施形態では、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、好適な反応条件の下で配列番号4で表される参照の操作されたポリペプチドと比較して、少なくとも約1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍または50倍またはそれより強い活性を有する。
一部の実施形態では、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、野生型または参照の操作された酵素と比較して、変換反応で使用される温度および/または溶媒への増加した安定性を有する。一部の実施形態では、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、好適な反応条件の下で配列番号4の参照ポリペプチドと比較して、少なくとも1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍またはそれより高い安定性を有する。
一部の実施形態では、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、野生型または参照の操作された酵素と比較して、化合物(2)のケトン基質への増加した寛容性を有する。一部の実施形態では、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、下でさらに記載される通り、好適な反応条件の下で配列番号4によって表されるポリペプチドと比較して、化合物(2)の基質への少なくとも1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍またはそれを超えて増加した寛容性を有する。
一部の実施形態では、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、野生型または参照の操作された酵素と比較して、化合物(3)の生成物キラルアミンによる阻害への増加した不応性または抵抗性を有する。一部の実施形態では、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、下でさらに記載される通り、好適な反応条件の下で配列番号4によって表されるポリペプチドと比較して、化合物(3)の生成物による阻害への少なくとも1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍またはそれを超えて増加した抵抗性を有する。
一部の実施形態では、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、好適な反応条件の下で90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%またはそれを超えてより高い立体異性体過剰で(すなわち、キラルアミン中心に反対の鏡像異性体を有する他の立体異性体生成物化合物より過剰)、化合物(2)の基質を化合物(3)へ変換することが可能である。
一部の実施形態では、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、好適な反応条件の下で配列番号4の参照ポリペプチドと比較して、基質の存在への増加した寛容性で基質化合物(2)を生成物化合物(3)へ変換することが可能である。したがって、一部の実施形態では、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、少なくとも約1g/L、約5g/L、約10g/L、約20g/L、約30g/L、約40g/L、約50g/L、約70g/L、約100g/L、約125g/L、150g/L、約175g/Lまたは約200g/Lまたはそれより高い基質ローディング濃度の下で、約72時間またはそれ未満、約48時間またはそれ未満、約36時間またはそれ未満、または約24時間またはそれ未満の反応時間内に、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%のパーセント変換で、好適な反応条件の下で基質化合物(2)を生成物化合物(3)へ変換することが可能である。
一部の実施形態では、本開示は、その操作されたトランスアミナーゼの機能的活性および/または向上した特性を保持する、本明細書に記載される操作されたポリペプチドのいずれかの断片を含む操作されたトランスアミナーゼポリペプチドも提供する。したがって、一部の実施形態では、本開示は、例えば好適な反応条件の下での化合物(2)から化合物(3)への変換におけるトランスアミナーゼ活性を有するポリペプチド断片を提供し、ここで、断片は、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチド、例えば、配列番号4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38,40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356および358から選択される例示的な操作されたトランスアミナーゼポリペプチドの完全長アミノ酸配列の少なくとも約80%、90%、95%、96%、97%、98%または99%を含む。
一部の実施形態では、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、本明細書に記載される操作されたトランスアミナーゼポリペプチド、例えば、配列番号4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38,40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356および358の例示的な操作されたポリペプチドのいずれか1つの欠失を含むアミノ酸配列を有することができる。したがって、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドのいずれの実施形態に関しても、アミノ酸配列は1つまたは複数のアミノ酸、2つまたはそれより多くのアミノ酸、3つまたはそれより多くのアミノ酸、4つまたはそれより多くのアミノ酸、5つまたはそれより多くのアミノ酸、6つまたはそれより多くのアミノ酸、8つまたはそれより多くのアミノ酸、10またはそれより多くのアミノ酸、15またはそれより多くのアミノ酸、または20またはそれより多くのアミノ酸、トランスアミナーゼポリペプチドのアミノ酸総数の最高10%、アミノ酸総数の最高10%、アミノ酸総数の最高20%、またはアミノ酸総数の最高30%の欠失を含むことができ、ここで、本明細書に記載される操作されたトランスアミナーゼの関連した機能的活性および/または向上した特性は維持される。一部の実施形態では、欠失は、1~2、1~3、1~4、1~5、1~6、1~7、1~8、1~9、1~10、1~15、1~20、1~21、1~22、1~23、1~24、1~25、1~30、1~35、1~40、1~45または1~50のアミノ酸残基を含むことができる。一部の実施形態では、欠失の数は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、30、35、40、45または50のアミノ酸残基であってよい。一部の実施形態では、欠失は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、20、21、22、23、24または25アミノ酸残基の欠失を含むことができる。
一部の実施形態では、本明細書の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、本明細書に記載される操作されたトランスアミナーゼポリペプチド、例えば、配列番号4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38,40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356および358の例示的な操作されたポリペプチドのいずれか1つと比較して、挿入を含むアミノ酸配列を有することができる。したがって、本開示のトランスアミナーゼポリペプチドのいずれの実施形態に関しても、挿入は、1つまたは複数のアミノ酸、2つまたはそれより多くのアミノ酸、3つまたはそれより多くのアミノ酸、4つまたはそれより多くのアミノ酸、5つまたはそれより多くのアミノ酸、6つまたはそれより多くのアミノ酸、8つまたはそれより多くのアミノ酸、10またはそれより多くのアミノ酸、15またはそれより多くのアミノ酸、20またはそれより多くのアミノ酸、30またはそれより多くのアミノ酸、40またはそれより多くのアミノ酸、または50またはそれより多くのアミノ酸を含むことができ、ここで、本明細書に記載される操作されたトランスアミナーゼの関連した機能的活性および/または向上した特性は維持される。挿入は、アミノもしくはカルボキシ末端にあっても、またはトランスアミナーゼポリペプチドの内部にあってもよい。
一部の実施形態では、本明細書の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、配列番号4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38,40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356および358から選択される配列、ならびに、必要に応じて1つまたはいくつかの(例えば、最高3、4、5または最高10の)アミノ酸残基の欠失、挿入および/または置換を含むアミノ酸配列を有することができる。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、1~2、1~3、1~4、1~5、1~6、1~7、1~8、1~9、1~10、1~15、1~20、1~21、1~22、1~23、1~24、1~25、1~30、1~35、1~40、1~45または1~50のアミノ酸残基の欠失、挿入および/または置換を必要に応じて含む。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、30、35、40、45または50のアミノ酸残基の欠失、挿入および/または置換を必要に応じて含む。一部の実施形態では、アミノ酸配列は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、20、21、22、23、24または25のアミノ酸残基の欠失、挿入および/または置換を必要に応じて有する。一部の実施形態では、置換は保存的または非保存的な置換であってよい。
一部の実施形態では、本開示は、トランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供し、このポリペプチドは、配列番号4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38,40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356および358から選択される配列と少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、但し、アミノ酸配列は、その全ては参照により本明細書に組み込まれる、特許米国特許第8,470,564号、米国特許第9,029,106号、米国特許第9,512,410号、米国特許第9,944,909号、米国特許第10,323,233号、米国特許第10,550,370号、米国特許第8,852,900号および米国特許第8,932,838号;Yun et al., 2005, Appl Environ Micriobiol., 71(8):4220-4224);およびCho et al., 2008, Biotechnol Bioeng. 99(2):275-84に開示される例示的な操作されたトランスアミナーゼポリペプチドアミノ酸配列のいずれとも同一でない(すなわち、排除する)。
上記の実施形態では、操作されたポリペプチドの好適な反応条件は、表5.1および6.1、実施例および本明細書の他の場所で記載されるものであってよい。操作されたポリペプチドの上記の向上した特性が変換を実行する好適な反応条件は、下で、および実施例でさらに記載されるように、ポリペプチドの濃度もしくは量、基質、補因子、緩衝液、共存溶媒、pHおよび/または温度および反応時間を含む条件に関して決定することができる。
一部の実施形態では、本開示のポリペプチドは、操作されたポリペプチドが他のポリペプチド、例えば、限定ではなく例として、抗体タグ(例えば、mycエピトープ)、精製配列(例えば、金属に結合するためのHisタグ)、および細胞局在シグナル(例えば、分泌シグナル)と融合される融合ポリペプチドの形であってよい。したがって、本明細書に記載される操作されたポリペプチドは、他のポリペプチドへの融合の有無にかかわらず使用することができる。
本明細書に記載されるポリペプチドは遺伝子コードされたアミノ酸に限定されないことを理解すべきである。遺伝子コードされたアミノ酸に加えて、本明細書に記載されるポリペプチドは、全体または一部が天然に存在する、および/または合成の非コードアミノ酸で構成されてもよい。本明細書に記載されるポリペプチドを構成することができるある特定の一般的に遭遇する非コードアミノ酸には、限定されずに以下のものが含まれる:遺伝子コードされたアミノ酸のD-ステレオマー;2,3-ジアミノプロピオン酸(Dpr);α-アミノイソ酪酸(Aib);ε-アミノヘキサン酸(Aha);δ-アミノ吉草酸(Ava);N-メチルグリシンまたはサルコシン(MeGlyまたはSar);オルニチン(Orn);シトルリン(Cit);t-ブチルアラニン(Bua);t-ブチルグリシン(Bug);N-メチルイソロイシン(MeIle);フェニルグリシン(Phg);シクロヘキシルアラニン(Cha);ノルロイシン(Nle);ナフチルアラニン(Nal);2-クロロフェニルアラニン(Ocf);3-クロロフェニルアラニン(Mcf);4-クロロフェニルアラニン(Pcf);2-フルオロフェニルアラニン(Off);3-フルオロフェニルアラニン(Mff);4-フルオロフェニルアラニン(Pff);2-ブロモフェニルアラニン(Obf);3-ブロモフェニルアラニン(Mbf);4-ブロモフェニルアラニン(Pbf);2-メチルフェニルアラニン(Omf);3-メチルフェニルアラニン(Mmf);4-メチルフェニルアラニン(Pmf);2-ニトロフェニルアラニン(Onf);3-ニトロフェニルアラニン(Mnf);4-ニトロフェニルアラニン(Pnf);2-シアノフェニルアラニン(Ocf);3-シアノフェニルアラニン(Mcf);4-シアノフェニルアラニン(Pcf);2-トリフルオロメチルフェニルアラニン(Otf);3-トリフルオロメチルフェニルアラニン(Mtf);4-トリフルオロメチルフェニルアラニン(Ptf);4-アミノフェニルアラニン(Paf);4-ヨードフェニルアラニン(Pif);4-アミノメチルフェニルアラニン(Pamf);2,4-ジクロロフェニルアラニン(Opef);3,4-ジクロロフェニルアラニン(Mpcf);2,4-ジフルオロフェニルアラニン(Opff);3,4-ジフルオロフェニルアラニン(Mpff);ピリド-2-イルアラニン(2pAla);ピリド-3-イルアラニン(3pAla);ピリド-4-イルアラニン(4pAla);ナフト-1-イルアラニン(1nAla);ナフト-2-イルアラニン(2nAla);チアゾリルアラニン(taAla);ベンゾチエニルアラニン(bAla);チエニルアラニン(tAla);フリルアラニン(fAla);ホモフェニルアラニン(hPhe);ホモチロシン(hTyr);ホモトリプトファン(hTrp);ペンタフルオロフェニルアラニン(5ff);スチリルカラニン(sAla);アウトリルアラニン(aAla);3,3-ジフェニルアラニン(Dfa);3-アミノ-5-フェニルペンタン酸(Afp);ペニシラミン(Pen);1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸(Tic);β-2-チエニルアラニン(Thi);メチオニンスルホキシド(Mso);N(w)-ニトロアルギニン(nArg);ホモリジン(hLys);ホスホノメチルフェニルアラニン(pmPhe);ホスホセリン(pSer);ホスホトレオニン(pThr);ホモアスパラギン酸(hAsp);ホモグルタミン酸(homoglutanic acid)(hGlu);1-アミノシクロペンタ-(2または3)-エン-4カルボン酸;ピペコリン酸(PA)、アゼチジン-3-カルボン酸(ACA);1-アミノシクロペンタン-3-カルボン酸;アリルグリシン(aOly);プロパルギルグリシン(pgGly);ホモアラニン(hAla);ノルバリン(nVal);ホモロイシン(hLeu)、ホモバリン(hVal);ホモイソロイシン(hIle);ホモアルギニン(hArg);N-アセチルリシン(AcLys);2,4-ジアミノ酪酸(Dbu);2,3-ジアミノ酪酸(Dab);N-メチルバリン(MeVal);ホモシステイン(hCys);ホモセリン(hSer);ヒドロキシプロリン(Hyp)およびホモプロリン(hPro)。本明細書に記載されるポリペプチドを構成することができる追加の非コードアミノ酸は、当業者に明らかとなる(例えば、Fasman, 1989, CRC Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, CRC Press, Boca Raton, FL, at pp. 3-70およびその中の引用文献で提供される様々なアミノ酸を参照する、その全ては参照により組み込まれる)。これらのアミノ酸は、L配置でもD配置でもよい。
当業者は、側鎖保護基を有するアミノ酸または残基も、本明細書に記載されるポリペプチドを構成することができることを認める。この場合には芳香族カテゴリーに属するそのような保護されたアミノ酸の非限定例には、限定されずに、以下のものが含まれる(保護基は括弧内に掲載される):Arg(tos)、Cys(メチルベンジル)、Cys(ニトロピリジンスルフェニル)、Glu(δ-ベンジルエステル)、Gln(キサンチル)、Asn(N-δ-キサンチル)、His(bom)、His(ベンジル)、His(tos)、Lys(fmoc)、Lys(tos)、Ser(O-ベンジル)、Thr(O-ベンジル)およびTyr(O-ベンジル)。
本明細書に記載されるポリペプチドを構成することができる、高次構造的に制約される非コードアミノ酸には、限定されずに以下のものが含まれる:Nメチルアミノ酸(L構成);1-アミノシクロペンタ-(2または3)-エン-4-カルボン酸;ピペコリン酸;アゼチジン-3-カルボン酸;ホモプロリン(hPro);および1-アミノシクロペンタン-3-カルボン酸。
一部の実施形態では、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、固体支持体、例えば膜、樹脂、固体担体または他の固相物質の上で提供することができる。固体支持体は、有機ポリマー、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフッ化エチレン、ポリエチレンオキシおよびポリアクリルアミド、ならびにそのコポリマーおよびグラフトで構成することができる。固体支持体は、無機、例えば、ガラス、シリカ、制御孔ガラス(CPG)、逆相シリカまたは金もしくはプラチナなどの金属であってもよい。固体支持体の構成は、ビーズ、球体、粒子、顆粒、ゲル、膜または表面の形であってもよい。表面は、平面、実質的に平面または非平面であってもよい。固体支持体は多孔性または非多孔性であってもよく、膨潤性または非膨潤性であってもよい。固体支持体は、ウェル、陥没または他の容器、管、機構または立地の形で構成されてもよい。
一部の実施形態では、本開示のトランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、それらが配列番号4の参照ポリペプチドと比較してそれらの向上した活性、立体選択性および/または他の向上した特性を保持するように、固体支持体の上に固定化することができる。そのような実施形態では、固定化ポリペプチドは、化合物(2)などの基質化合物または他の好適な基質から、化合物(3)の生成物化合物または対応する生成物への生体触媒変換を促進することができ(例えば、本明細書に記載されるスキーム4で示すように)、反応が完了した後には容易に保持され(例えば、ポリペプチドが固定化されるビーズを保持することによって)、その後以降の反応で再利用または再生利用される。そのような固定化酵素プロセスは、さらなる効率および費用低減を可能にする。したがって、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを使用する方法のいずれも、固体支持体の上に結合しているか固定化される同じ操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを使用して実行することができることがさらに企図される。
酵素固定化の方法は、当技術分野で周知である。操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、非共有結合的または共有結合的に結合させることができる。固体支持体(例えば、樹脂、膜、ビーズ、ガラス等)への酵素のコンジュゲーションおよび固定化のための様々な方法が当技術分野で周知であり、例えば以下で記載される:Yi et al., "Covalent immobilization of ω-transaminase from Vibrio fluvialis JS17 on chitosan beads," Process Biochemistry 42(5): 895-898 (May 2007);Martin et al., "Characterization of free and immobilized (S)-aminotransferase for acetophenone production," Applied Microbiology and Biotechnology 76(4): 843-851 (Sept. 2007);Koszelewski et al., "Immobilization of ω-transaminases by encapsulation in a sol-gel/celite matrix," Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 63: 39-44 (Apr. 2010);Truppo et al., "Development of an Improved Immobilized CAL-B for the Enzymatic Resolution of a Key Intermediate to Odanacatib," Organic Process Research & Development, published online: dx.doi.org/10.1021/op200157c;Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques, Second Edition, Academic Press (2008);Mateo et al., "Epoxy sepabeads: a novel epoxy support for stabilization of industrial enzymes via very intense multipoint covalent attachment," Biotechnology Progress 18(3):629-34 (2002);およびBioconjugation Protocols: Strategies and Methods, In Methods in Molecular Biology, C.M. Niemeyer ed., Humana Press (2004);各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる。本開示の操作されたトランスアミナーゼの固定化のために有益である固体支持体には、限定されずに、エポキシド官能基を有するポリメタクリレート、アミノエポキシド官能基を有するポリメタクリレート、スチレン/DVBコポリマーまたはオクタデシル官能基を有するポリメタクリレートを含むビーズまたは樹脂が含まれる。本開示の操作されたトランスアミナーゼの固定化のために有益である例示的な固体支持体には、限定されずに、キトサンビーズ、Eupergit C、およびSEPABEAD(Mitsubishi)、例えば以下の異なるタイプのSEPABEAD:EC-EP、EC-HFA/S、EXA252、EXE119およびEXE120が含まれる。
一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、様々な形、例えば、実質的に精製された酵素、酵素をコードする遺伝子で形質転換させた全細胞、および/またはそのような細胞の細胞抽出物および/もしくは溶解物のような単離された調製物であってよい。下でさらに議論されるように、酵素は、凍結乾燥、噴霧乾燥させることができるか、または粗いペースト状であってもよい。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、キットの形で提供することができる。キット内の酵素は個々に存在してもよいか、または複数の酵素として存在してもよい。キットは、酵素反応を実行するための試薬、酵素の活性を調査するための基質、ならびに生成物を検出するための試薬をさらに含むことができる。キットは、試薬ディスペンサーおよびキットの使用説明書を含むこともできる。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、ポリペプチドが位置的に異なる位置に配置されるアレイの形で固体支持体の上で提供することができる。アレイは、ポリペプチドによる変換について様々な基質化合物を試験するために使用することができる。試薬のロボット送達のためにまたは検出方法および/または機器によってアドレス可能な様々な位置で、複数の支持体をアレイの上で構成することができる。基質、例えば膜、ビーズ、ガラス、等へのコンジュゲーションのための様々な方法が、中でもHermanson, G.T., Bioconjugate Techniques, 2nd Edition, Academic Press; (2008)およびBioconjugation Protocols: Strategies and Methods, In Methods in Molecular Biology, C.M. Niemeyer ed., Humana Press (2004)に記載され、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、本開示のキットは、異なるアドレス可能な位置に本明細書に開示される複数の異なる操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを含むアレイを含み、異なるポリペプチドは参照配列の異なるバリアントであり、各々は少なくとも1つの異なる向上した酵素特性を有する。複数の操作されたポリペプチドを含むそのようなアレイおよびそれらの使用の方法は、米国特許第9,228,223号に記載される。
5.4 操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、発現ベクターおよび宿主細胞
5.4 操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、発現ベクターおよび宿主細胞
別の態様では、本開示は、本明細書に記載される操作されたトランスアミナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現することが可能な組換えポリヌクレオチドを作製するために遺伝子発現を制御する、1つまたは複数の異種の調節配列に作動可能に連結することができる。操作されたトランスアミナーゼをコードする異種ポリヌクレオチドを含有する発現構築物は、対応するトランスアミナーゼポリペプチドを発現するように適当な宿主細胞に導入することができる。
当業者に明らかな通り、タンパク質配列の利用可能性および様々なアミノ酸に対応するコドンについての知識は、対象ポリペプチドをコードすることが可能な全てのポリヌクレオチドの記載を提供する。同じアミノ酸が代わりのまたは同義のコドンによってコードされる、遺伝子コードの同義性は、極めて多くの数の核酸の作製を可能にし、その全ては向上したトランスアミナーゼ酵素をコードする。したがって、特定のアミノ酸配列についての知識を有すると、当業者は単に1つまたは複数のコドンの配列をタンパク質のアミノ酸配列を変更しない方法で改変することによって、任意の数の異なる核酸を作製することができるかもしれない。この点に関して、本開示は、可能なコドン選択に基づいて組合せを選択することによって、本明細書に記載されるポリペプチドをコードするようにできるかもしれないポリヌクレオチドのいずれの可能な変異も具体的に企図し、全てのそのような変異は、表5.1および6.1で提示され、参照により本明細書に組み入れられる配列表に配列番号4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38,40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356および358として開示されるアミノ酸配列を含む、本明細書に記載される任意のポリペプチドのために具体的に開示されているとみなすべきである。
様々な実施形態では、コドンは、好ましくはタンパク質が生成される宿主細胞にフィットするように選択される。例えば、細菌で使用される好ましいコドンは、細菌での発現のために使用され;酵母で使用される好ましいコドンは、酵母での発現のために使用され;哺乳動物で使用される好ましいコドンは、哺乳動物細胞での発現のために使用される。一部の実施形態では、天然配列は好ましいコドンを含むので、および全てのアミノ酸残基のために好ましいコドンの使用が必要とされるとは限らない可能性があるので、トランスアミナーゼのコドン使用を最適化するために全てのコドンを置き換える必要があるとは限らない。その結果として、トランスアミナーゼ酵素をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドは、完全長コード領域のコドン位置の約40%、50%、60%、70%、80%で、または90%を超えて好ましいコドンを含有することができる。
一部の実施形態では、前記のように、ポリヌクレオチドは、本明細書に開示される特性、例えば、基質化合物(2)を生成物化合物(3)へ変換する能力を有するトランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードし、このポリペプチドは、配列番号4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38,40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356および358から選択される参照配列と少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれより高い同一性、および参照ポリペプチドと比較して1つまたは複数の残基差を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、参照配列は配列番号4および/または6から選択される。一部の実施形態では、参照配列は配列番号4である。一部の実施形態では、参照配列は配列番号6である。
一部の実施形態では、操作されたトランスアミナーゼをコードするポリヌクレオチドは、配列番号3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355および/または357から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、高度にストリンジェントな条件の下で配列番号3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355および/または357から選択される参照ポリヌクレオチド配列、またはその相補体へハイブリダイズすることが可能であり、本明細書に記載される向上した特性の1つまたは複数を有するトランスアミナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは本明細書に記載されるポリペプチドをコードするが、操作されたトランスアミナーゼをコードする参照ポリヌクレオチドとヌクレオチドレベルで約80%またはそれより高い配列同一性、約80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%またはそれより高い配列同一性を有する。一部の実施形態では、参照ポリヌクレオチド配列は、配列番号3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355および/または357から選択される。
本明細書の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドのいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチドは、ポリペプチドの発現をもたらす様々な方法で操作することができる。一部の実施形態では、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、1つまたは複数の制御配列が存在してポリヌクレオチドおよび/またはポリペプチドの発現を調節する、発現ベクターとして提供することができる。発現ベクターによってはベクターへのその挿入より前の単離されたポリヌクレオチドの操作が望ましいかまたは必要かもしれない。組換えDNA方法を利用してポリヌクレオチドおよび核酸配列を改変する技術は、当技術分野で周知である。指針が、Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press;およびCurrent Protocols in Molecular Biology, Ausubel. F. ed., Greene Pub. Associates, 1998、2006年の最新版で提供される。
一部の実施形態では、制御配列には、とりわけ、プロモーター、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、シグナルペプチド配列および転写ターミネーターが含まれる。好適なプロモーターは、使用する宿主細胞に基づいて選択することができる。細菌宿主細胞の場合、本開示の核酸構築物の転写を指示するための好適なプロモーターには、E.coliラックオペロン、Streptomyces coelicolorアガラーゼ遺伝子(dagA)、Bacillus subtilisレバンスクラーゼ遺伝子(sacB)、Bacillus licheniformisアルファ-アミラーゼ遺伝子(amyL)、Bacillus stearothermophilusマルト原性アミラーゼ遺伝子(amyM)、Bacillus amyloliquefaciensアルファ-アミラーゼ遺伝子(amyQ)、Bacillus licheniformisペニシリナーゼ遺伝子(penP)、Bacillus subtilis xylAおよびxylB遺伝子、ならびに原核生物のベータ-ラクタマーゼ遺伝子から得られるプロモーター(Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl Acad. Sci. USA 75: 3727-3731)、ならびにtacプロモーター(DeBoer et al., 1983, Proc. Natl Acad. Sci. USA 80: 21-25)が含まれる。糸状菌宿主細胞のための例示的なプロモーターには、Aspergillus oryzae TAKAアミラーゼ、Rhizomucor mieheiアスパラギン酸プロテイナーゼ、Aspergillus niger中性アルファ-アミラーゼ、Aspergillus niger酸安定アルファ-アミラーゼ、Aspergillus nigerまたはAspergillus awamoriグルコアミラーゼ(glaA)、Rhizomucor mieheiリパーゼ、Aspergillus oryzaeアルカリプロテアーゼ、Aspergillus oryzaeトリオースリン酸イソメラーゼ、Aspergillus nidulansアセトアミダーゼおよびFusarium oxysporumトリプシン様プロテアーゼ(国際公開第96/00787)のための遺伝子から得られるプロモーター、ならびに、NA2-tpiプロモーター(Aspergillus niger中性アルファ-アミラーゼおよびAspergillus oryzaeトリオースリン酸イソメラーゼのための遺伝子からのプロモーターのハイブリッド)、およびその突然変異体、トランケーションされたおよびハイブリッドのプロモーターが含まれる。例示的な酵母細胞プロモーターは、Saccharomyces cerevisiaeエノラーゼ(ENO-1)、Saccharomyces cerevisiaeガラクトキナーゼ(GAL1)、Saccharomyces cerevisiaeアルコール脱水素酵素/グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ(ADH2/GAP)およびSaccharomyces cerevisiae3-ホスホグリセリン酸キナーゼのための遺伝子からであってよい。酵母宿主細胞のための他の有益なプロモーターは、Romanos et al., 1992, Yeast 8:423-488によって記載される。
制御配列は好適な転写ターミネーター配列、転写を終了するために宿主細胞によって認識される配列であってもよい。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の3’末端に作動可能に連結される。選択される宿主細胞において機能的である任意のターミネーターを、本発明で使用することができる。例えば、糸状菌宿主細胞のための例示的な転写ターミネーターは、Aspergillus oryzae TAKAアミラーゼ、Aspergillus nigerグルコアミラーゼ、Aspergillus nidulansアントラニル酸シンターゼ、Aspergillus nigerアルファ-グルコシダーゼおよびFusarium oxysporumトリプシン様プロテアーゼのための遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞のための例示的なターミネーターは、Saccharomyces cerevisiaeエノラーゼ、Saccharomyces cerevisiaeシトクロムC(CYC1)およびSaccharomyces cerevisiaeグリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼのための遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞のための他の有益なターミネーターは、前掲のRomanos et al., 1992によって記載される。
制御配列は好適なリーダー配列、宿主細胞による翻訳にとって重要であるmRNAの非翻訳領域であってもよい。リーダー配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の5’末端に作動可能に連結される。選択される宿主細胞において機能的である任意のリーダー配列を使用することができる。糸状菌宿主細胞のための例示的なリーダーは、Aspergillus oryzae TAKAアミラーゼおよびAspergillus nidulansトリオースリン酸イソメラーゼのための遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための好適なリーダーは、Saccharomyces cerevisiaeエノラーゼ(ENO-1)、Saccharomyces cerevisiae 3-ホスホグリセリン酸キナーゼ、Saccharomyces cerevisiaeアルファ-因子およびSaccharomyces cerevisiaeアルコール脱水素酵素/グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ(ADH2/GAP)のための遺伝子から得られる。
制御配列はポリアデニル化配列、核酸配列の3’末端に作動可能に連結され、転写されるときに転写されたmRNAへポリアデノシン残基を加えるシグナルとして宿主細胞によって認識される配列であってもよい。選択される宿主細胞において機能的である任意のポリアデニル化配列を、本発明で使用することができる。糸状菌宿主細胞のための例示的なポリアデニル化配列は、Aspergillus oryzae TAKAアミラーゼ、Aspergillus nigerグルコアミラーゼ、Aspergillus nidulansアントラニル酸シンターゼ、Fusarium oxysporumトリプシン様プロテアーゼおよびAspergillus nigerアルファ-グルコシダーゼのための遺伝子からであってよい。酵母宿主細胞のための有益なポリアデニル化配列は、Guo and Sherman, 1995, Mol Cell Bio 15:5983-5990によって記載される。
制御配列は、ポリペプチドのアミノ末端に連結されるアミノ酸配列をコードし、コードされたポリペプチドを細胞の分泌経路に導くシグナルペプチドコード領域であってもよい。核酸配列のコード配列の5’末端は、分泌されるポリペプチドをコードするコード領域のセグメントと翻訳読み枠内で天然に連結されるシグナルペプチドコード領域を本来含有することができる。あるいは、コード配列の5’末端は、コード配列に外来であるシグナルペプチドコード領域を含有することができる。発現されたポリペプチドを選択される宿主細胞の分泌経路に導く任意のシグナルペプチドコード領域を、操作されたポリペプチドの発現のために使用することができる。細菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード領域は、Bacillus NCIB11837のマルト原性アミラーゼ、Bacillus stearothermophilusアルファ-アミラーゼ、Bacillus licheniformisサブチリシン、Bacillus licheniformisベータ-ラクタマーゼ、Bacillus stearothermophilus中性プロテアーゼ(nprT、nprS、nprM)およびBacillus subtilis prsAのための遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域である。さらなるシグナルペプチドは、Simonen and Palva, 1993, Microbiol Rev 57:109-137によって記載される。糸状菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード領域は、Aspergillus oryzae TAKAアミラーゼ、Aspergillus niger中性アミラーゼ、Aspergillus nigerグルコアミラーゼ、Rhizomucor mieheiアスパラギン酸プロテイナーゼ、Humicola insolensセルラーゼおよびHumicola lanuginosaリパーゼのための遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域であってよい。酵母宿主細胞のための有益なシグナルペプチドは、Saccharomyces cerevisiaeアルファ-因子およびSaccharomyces cerevisiaeインベルターゼのための遺伝子からであってよい。
制御配列は、ポリペプチドのアミノ末端に置かれるアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード領域であってもよい。結果として生じるポリペプチドは、酵素前駆体またはプロポリペプチド(または、一部の場合にはチモーゲン)と呼ばれる。プロポリペプチドは、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒または自触媒的切断によって、成熟した活性ポリペプチドへ変換することができる。プロペプチドコード領域は、Bacillus subtilisアルカリプロテアーゼ(aprE)、Bacillus subtilis中性プロテアーゼ(nprT)、Saccharomyces cerevisiaeアルファ-因子、Rhizomucor mieheiアスパラギン酸プロテイナーゼおよびMyceliophthora thermophilaラクターゼのための遺伝子から得ることができる(国際公開第95/33836号)。シグナルペプチドおよびプロペプチド領域の両方がポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、プロペプチド領域はポリペプチドのアミノ末端の次に配置され、シグナルペプチド領域はプロペプチド領域のアミノ末端の次に配置される。
宿主細胞の増殖に対してポリペプチドの発現の調節を可能にする調節配列を加えることも望ましいかもしれない。調節系の例は、調節化合物の存在を含む化学的または物理的刺激に応答して遺伝子の発現をオンまたはオフにするものである。原核生物の宿主細胞では、好適な調節配列には、lac、tacおよびtrpオペレーター系が含まれる。酵母の宿主細胞では、好適な調節系には、例として、ADH2系またはGAL1系が含まれる。糸状菌では、好適な調節配列には、TAKAアルファ-アミラーゼプロモーター、Aspergillus nigerグルコアミラーゼプロモーターおよびAspergillus oryzaeグルコアミラーゼプロモーターが含まれる。
別の態様では、本開示は、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにそれらが導入される宿主のタイプによって1つまたは複数の発現調節領域、例えばプロモーターおよびターミネーター、複製起源等を含む組換え発現ベクターにも関する。上記の様々な核酸および制御配列は、そのような部位でポリペプチドをコードする核酸配列の挿入または置換を可能にする1つまたは複数の都合のよい制限部位を含むことができる組換え発現ベクターを生成するために、一緒に連結することができる。あるいは、本開示の核酸配列は、核酸配列またはその配列を含む核酸構築物を発現に適当なベクターに挿入することによって発現させることができる。発現ベクターの作製において、コード配列は、コード配列が発現のために適当な制御配列と作動可能に連結するようにベクター内に置かれる。
組換え発現ベクターは、組換えDNA手順に便利にかけることができ、ポリヌクレオチド配列の発現をもたらすことができる、任意のベクター(例えば、プラスミドまたはウイルス)であってよい。ベクターの選択は、ベクターが導入される宿主細胞とのベクターの適合性に一般的に依存する。ベクターは、線状または閉環状のプラスミドであってよい。
発現ベクターは、自己複製ベクター、すなわち、その複製は染色体複製から独立している染色体外の実体として存在するベクター、例えば、プラスミド、染色体外のエレメント、ミニクロモゾームまたは人工染色体であってよい。ベクターは、自己複製を担保するための任意の手段を含有することができる。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入されたとき、ゲノムに組み入れられてそれが組み入れられた染色体と一緒に複製されるものであってよい。さらに、単一のベクターもしくはプラスミド、または宿主細胞のゲノムに導入される全DNAを一緒に含有する2つまたはそれより多くのベクターもしくはプラスミド、またはトランスポゾンを使用することができる。
発現ベクターは1つまたは複数の選択可能なマーカーを好ましくは含有し、それは形質転換細胞の容易な選択を可能にする。選択可能なマーカーは、その生成物が殺生物剤またはウイルスへの抵抗性、重金属への抵抗性、原栄養性から栄養要求性などを提供する遺伝子である。細菌の選択可能なマーカーの例は、Bacillus subtilisまたはBacillus licheniformisからのdal遺伝子、またはアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール(実施例1)またはテトラサイクリン抵抗性などの抗生物質抵抗性を付与するマーカーである。酵母宿主細胞のための好適なマーカーは、ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1およびURA3である。糸状菌宿主細胞で使用するための選択可能なマーカーには、限定されずに、amdS(アセトアミダーゼ)、argB(オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ)、bar(ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ)、hph(ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ)、niaD(硝酸還元酵素)、pyrG(オロチジン-5’-ホスフェートデカルボキシラーゼ)、sC(硫酸アデニルトランスフェラーゼ)およびtrpC(アントラニル酸シンターゼ)、ならびにその同等物が含まれる。Aspergillus細胞で使用するための実施形態には、Aspergillus nidulansまたはAspergillus oryzaeのamdSおよびpyrG遺伝子、およびStreptomyces hygroscopicusのbar遺伝子が含まれる。
別の態様では、本開示は、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供し、ポリヌクレオチドは、宿主細胞でのトランスアミナーゼ酵素の発現のために1つまたは複数の制御配列に作動可能に連結している。本発明の発現ベクターによってコードされるポリペプチドの発現で使用するための宿主細胞は当技術分野で周知であり、限定されずに、E.coli、Vibrio fluvialis、StreptomycesおよびSalmonella typhimurium細胞などの細菌細胞;酵母細胞(例えば、Saccharomyces cerevisiaeまたはPichia pastoris(ATCC受託番号201178))などの真菌細胞;Drosophila S2およびSpodoptera Sf9細胞などの昆虫細胞;CHO、COS、BHK、293およびボーズ黒色腫細胞などの動物細胞;ならびに植物細胞が含まれる。例示的な宿主細胞は、Escherichia coli W3110(ΔfhuA)およびBL21である。
したがって、別の態様では、本開示は操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを製造する方法を提供し、本方法は、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをポリペプチドの発現に好適な条件下で発現することが可能な宿主細胞を培養することを含むことができる。本方法は、本明細書に記載される通り、発現されたトランスアミナーゼポリペプチドを単離または精製することをさらに含むことができる。
上記の宿主細胞のための適当な培養培地および増殖条件は、当技術分野で周知である。トランスアミナーゼの発現のためのポリヌクレオチドは、当技術分野で公知である様々な方法によって細胞に導入することができる。技術としては、とりわけ、エレクトロポレーション、微粒子銃粒子衝撃、リポソーム媒介トランスフェクション、塩化カルシウムトランスフェクションおよびプロトプラスト融合が挙げられる。
本明細書の実施形態のために、操作されたポリペプチドおよび対応するポリヌクレオチドは、当業者によって使用される方法を使用して得ることができる。Vibrio fluvialisの野生型ポリペプチドをコードする親のポリヌクレオチド配列は、Shin et al., 2003, Appl. Microbiol. Biotechnol. 61(5-6):463-471に記載され、向上した安定性および基質認識特性を有する操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを生成する方法は、参照により本明細書に組み込まれる、特許出願公開米国特許第8,470,564号、米国特許第9,029,106号、米国特許第9,512,410号、米国特許第9,944,909号、米国特許第10,323,233号および米国特許第10,550,370号、米国特許第8,852,900号、米国特許第8,932,838号に開示される。
本明細書に開示される特性を有する操作されたトランスアミナーゼは、上記の通り、天然に存在するか操作されたトランスアミナーゼをコードするポリヌクレオチドを突然変異誘発および/または指向性進化方法にかけることによって得ることができる。例えば、発現させ、スクリーニングし、アッセイすることができるバリアントライブラリーを生成するために、突然変異誘発および指向性進化方法をポリヌクレオチドに容易に適用することができる。突然変異誘発および指向性進化方法は、当技術分野で周知である(例えば、米国特許第5,605,793号、5,811,238号、5,830,721号、5,834,252号、5,837,458号、5,928,905号、6,096,548号、6,117,679号、6,132,970号、6,165,793号、6,180,406号、6,251,674号、6,265,201号、6,277,638号、6,287,861号、6,287,862号、6,291,242号、6,297,053号、6,303,344号、6,309,883号、6,319,713号、6,319,714号、6,323,030号、6,326,204号、6,335,160号、6,335,198号、6,344,356号、6,352,859号、6,355,484号、6,358,740号、6,358,742号、6,365,377号、6,365,408号、6,368,861号、6,372,497号、6,337,186号、6,376,246号、6,379,964号、6,387,702号、6,391,552号、6,391,640号、6,395,547号、6,406,855号、6,406,910号、6,413,745号、6,413,774号、6,420,175号、6,423,542号、6,426,224号、6,436,675号、6,444,468号、6,455,253号、6,479,652号、6,482,647号、6,483,011号、6,484,105号、6,489,146号、6,500,617号、6,500,639号、6,506,602号、6,506,603号、6,518,065号、6,519,065号、6,521,453号、6,528,311号、6,537,746号、6,573,098号、6,576,467号、6,579,678号、6,586,182号、6,602,986号、6,605,430号、6,613,514号、6,653,072号、6,686,515号、6,703,240号、6,716,631号、6,825,001号、6,902,922号、6,917,882号、6,946,296号、6,961,664号、6,995,017号、7,024,312号、7,058,515号、7,105,297号、7,148,054号、7,220,566号、7,288,375号、7,384,387号、7,421,347号、7,430,477号、7,462,469号、7,534,564号、7,620,500号、7,620,502号、7,629,170号、7,702,464号、7,747,391号、7,747,393号、7,751,986号、7,776,598号、7,783,428号、7,795,030号、7,853,410号、7,868,138号、7,783,428号、7,873,477号、7,873,499号、7,904,249号、7,957,912号、7,981,614号、8,014,961号、8,029,988号、8,048,674号、8,058,001号、8,076,138号、8,108,150号、8,170,806号、8,224,580号、8,377,681号、8,383,346号、8,457,903号、8,504,498号、8,589,085号、8,762,066号、8,768,871号、9,593,326号および全ての関連した米国外の対応物;Ling et al., Anal. Biochem., 254(2):157-78 [1997];Dale et al., Meth. Mol. Biol., 57:369-74 [1996];Smith, Ann. Rev. Genet., 19:423-462 [1985];Botstein et al., Science, 229:1193-1201 [1985];Carter, Biochem. J., 237:1-7 [1986];Kramer et al., Cell, 38:879-887 [1984];Wells et al., Gene, 34:315-323 [1985];Minshull et al., Curr. Op. Chem. Biol., 3:284-290 [1999];Christians et al., Nat. Biotechnol., 17:259-264 [1999];Crameri et al., Nature, 391:288-291 [1998];Crameri, et al., Nat. Biotechnol., 15:436-438 [1997];Zhang et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 94:4504-4509 [1997];Crameri et al., Nat. Biotechnol., 14:315-319 [1996];Stemmer, Nature, 370:389-391 [1994];Stemmer, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91:10747-10751 [1994];国際公開第95/22625号;国際公開第97/0078号;国際公開第97/35966号;国際公開第98/27230号;国際公開第00/42651号;国際公開第01/75767号;および国際公開第2009/152336号を参照する、その全ては参照により本明細書に組み込まれる)。全ての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。
突然変異誘発処置の後に得られたクローンは、所望の向上した酵素特性を有する操作されたトランスアミナーゼについてスクリーニングすることができる。例えば、所望の向上した酵素特性が熱安定性である場合、酵素調製物を規定の温度にさらし、熱処理の後に残っている酵素活性の量を測定した後に酵素活性を測定することができる。トランスアミナーゼをコードするポリヌクレオチドを含有するクローンは、ヌクレオチド配列の変化(あるならば)を同定するために次に単離され、配列決定をされ、宿主細胞で酵素を発現させるために使用される。発現ライブラリーから酵素活性を測定することは、生成物アミンの例えばOPAによる誘導体化の後のHPLC分析などの標準の生化学技術を使用して実行することができる。
操作されたポリペプチドの配列が既知の場合、酵素をコードするポリヌクレオチドは、公知である合成方法にしたがって標準の固相方法によって調製することができる。一部の実施形態では、最高約100塩基の断片を個々に合成し、次に連結して(例えば、酵素的または化学的ライゲーション方法またはポリメラーゼ媒介方法によって)任意の所望の連続配列を形成することができる。例えば、本明細書に開示されるポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、例えばBeaucage et al., 1981, Tet Lett 22:1859-69によって記載される古典的ホスホラミダイト方法、または、例えばそれが自動合成方法で一般的に実施されているので、Matthes et al., 1984, EMBO J. 3:801-05によって記載される方法を使用した化学合成によって調製することができる。ホスホラミダイト方法によると、オリゴヌクレオチドは、例えば自動DNA合成装置で合成され、精製され、アニールされ、ライゲーションされ、適当なベクターにクローニングされる。
したがって、一部の実施形態では、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを調製する方法は、以下を含むことができる:(a)配列番号4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38,40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356および358から選択されるアミノ酸配列を含み、配列番号4と比較して1つまたは複数の残基差を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成すること。
本方法の一部の実施形態では、ポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列は、1つまたはいくつかの(例えば、最高3、4、5または最高10の)アミノ酸残基欠失、挿入および/または置換を必要に応じて有することができる。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、必要に応じて1~2、1~3、1~4、1~5、1~6、1~7、1~8、1~9、1~10、1~15、1~20、1~21、1~22、1~23、1~24、1~25、1~30、1~35、1~40、1~45または1~50のアミノ酸残基欠失、挿入および/または置換を有する。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、必要に応じて1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、30、35、40、45または50のアミノ酸残基欠失、挿入および/または置換を有する。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、20、21、22、23、24または25のアミノ酸残基の欠失、挿入および/または置換を必要に応じて有する。一部の実施形態では、置換は保存的または非保存的な置換であってよい。
発現される操作されたトランスアミナーゼは、本明細書に記載されるアッセイ条件のいずれかによる化合物(3)への化合物(2)の変換における、所望の向上した特性、例えば、活性、エナンチオ選択性、安定性および生成物寛容性について測定することができる。
一部の実施形態では、宿主細胞で発現される操作されたトランスアミナーゼ酵素のいずれも、とりわけリゾチーム処理、超音波処理、濾過、塩析、超遠心およびクロマトグラフィーを含むタンパク質精製のための周知の技術のいずれか1つまたは複数を使用して、細胞および/または培養培地から回収することができる。E.coliなどの細菌からのタンパク質の溶解および高効率抽出のための好適な溶液は実施例で提供され、市販されてもいる、例えばSt.Louis MOのSigma-AldrichからのCelLytic B(商標)。
トランスアミナーゼポリペプチドの単離のためのクロマトグラフィー技術には、中でも、逆相クロマトグラフィー高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動および親和性クロマトグラフィーが含まれる。特定の酵素を精製する条件は、実効電荷、疎水性、親水性、分子量、分子形状等などの因子に一部依存し、当業者に明らかになる。
一部の実施形態では、向上したトランスアミナーゼ酵素を単離するために、親和性技術を使用することができる。親和性クロマトグラフィー精製のために、トランスアミナーゼポリペプチドに特異的に結合する任意の抗体を使用することができる。抗体の生産のために、ウサギ、マウス、ラット等を限定されずに含む様々な宿主動物を、トランスアミナーゼポリペプチドまたはその断片による注射によって免疫化することができる。トランスアミナーゼポリペプチドまたは断片は、側鎖官能基または側鎖官能基に結合したリンカーによってBSAなどの好適な担体に結合させることができる。
5.7 操作されたトランスアミナーゼ酵素の使用方法
5.7 操作されたトランスアミナーゼ酵素の使用方法
上記したように、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを、アミノ供与体の存在下の好適な反応条件の下で、例示的な基質化合物(2)のケトンを立体異性体過剰で例示的な生成物化合物(3)の対応するキラルアミンへ効率的に変換するように進化させた。操作されたトランスアミナーゼポリペプチドの構造的特徴は、化合物(2)以外のプロキラルケトン基質化合物のそれらの対応するキラルアミン化合物への立体異性体過剰での変換も可能にする。したがって、別の態様では、本開示は、アミノ供与体からのアミノ基がアミノ受容体、例えばケトン基質化合物に移されてアミン化合物を生成するアミノ基転移反応を実行するための、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを使用したプロセスを提供する。一般的に、アミノ基転移反応を実行するためのプロセスは、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを、アミノ受容体をアミン化合物へ変換するのに好適な反応条件の下でアミノ受容体(例えば、ケトン基質化合物)およびアミノ供与体(例えば、イソプロピルアミン)と接触させるかまたはインキュベートすることを含む。
上記のプロセスのために、本明細書に記載される操作されたトランスアミナーゼポリペプチドのいずれも使用することができる。例であり、限定するものではないが、一部の実施形態では、このプロセスは、配列番号4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38,40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356および358から選択される参照配列と少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれより高い同一性を有するアミノ酸配列、および配列番号4と比較して1つまたは複数の残基差を含む、本開示のトランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを使用することができる。
一部の実施形態では、本明細書のプロセスを実行することが可能な例示的なトランスアミナーゼポリペプチドは、配列番号4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38,40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356および358から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであってよい。操作されたトランスアミナーゼポリペプチドの選択および使用に関する指針は、本明細書の記載、例えば表5.1および6.1ならびに実施例で提供される。
本明細書および実施例で例示される実施形態では、アミノ供与体、pH、温度、緩衝液、溶媒系、基質ローディング、ポリペプチドローディング、補因子ローディング、圧および反応時間の範囲を限定されずに含む、好適な反応条件の様々な範囲を使用することができる。本明細書に記載される操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを使用した基質化合物の生成物化合物への生体触媒変換のためのプロセスを実行するためのさらなる好適な反応条件は、本明細書で提供される指針を考慮して、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドおよび基質化合物を濃度、pH、温度、溶媒条件の実験的反応条件の下で接触させ、生成物化合物を検出することを限定されずに含む、ルーチン実験によって容易に最適化することができる。
本明細書の一部の実施形態では、トランスアミナーゼポリペプチドはアミノ供与体を使用して生成物化合物を形成する。一部の実施形態では、反応条件におけるアミノ供与体は、イソプロピルアミン(本明細書で「IPM」とも呼ばれる)、プトレシン、L-リシン、α-フェネチルアミン、D-アラニン、L-アラニンまたはD,L-アラニンまたはD,L-オルニチンから選択することができる。一部の実施形態では、アミノ供与体は、IPM、プトレシン、L-リシン、D-またはL-アラニンから選択される。一部の実施形態では、アミノ供与体はIPMである。一部の実施形態では、好適な反応条件は、少なくとも約0.1~約3M、0.2~約2.5M、約0.5~約2Mまたは約1~約2Mの濃度で存在するアミノ供与体、特にIPMを含む。一部の実施形態では、アミノ供与体は、約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、1、1.5、2、2.5または3Mの濃度で存在する。平衡をアミン生成物形成の方へシフトするために、アミノ供与体、例えばIPMのより高い濃度を使用することができる。
操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを使用した好適な反応条件は、補因子も一般的に含む。本明細書でトランスアミナーゼ酵素のために有益な補因子には、限定されずに、ピリドキサール-5’-ホスフェート(ピリドキサールリン酸、PLP、P5Pとしても公知)、ピリドキシン(PN)、ピリドキサール(PL)、ピリドキサミン(PM)、ならびにそれらのリン酸化された対応物ピリドキシンリン酸(PNP)およびピリドキサミンリン酸(PMP)が含まれる。一部の実施形態では、補因子PLPは細胞抽出液中に天然に存在し、補う必要はない。プロセスの一部の実施形態では、好適な反応条件は、例えば部分的に精製されたか精製されたトランスアミナーゼ酵素を使用するときに酵素反応混合液へ加えられる外因性補因子を含む。一部の実施形態では、好適な反応条件は、約0.1g/L~約10g/L、約0.2g/L~約5g/L、約0.5g/L~約2.5g/Lの濃度の、PLP、PN、PL、PM、PNPおよびPMPから選択される補因子の存在を含むことができる。一部の実施形態では、反応条件は約0.1g/Lまたはそれ未満、0.2g/Lまたはそれ未満、0.5g/Lまたはそれ未満、1g/Lまたはそれ未満、2.5g/Lまたはそれ未満、5g/Lまたはそれ未満、または10g/Lまたはそれ未満のPLP濃度を含む。一部の実施形態では、補因子は反応の開始時に加えることができ、および/または反応の間に追加の補因子が加えられる。
反応混合液中の基質化合物は、例えば生成物化合物の所望の量、酵素活性に及ぼす基質濃度の影響、反応条件下の酵素の安定性、および基質から生成物へのパーセント変換を考慮して変更することができる。一部の実施形態では、好適な反応条件は、少なくとも約0.5~約200g/L、1~約200g/L、約5~約150g/L、約10~約100g/L、約20~約100g/L、または約50~約100g/Lの基質化合物ローディングを含む。一部の実施形態では、好適な反応条件は、少なくとも約0.5g/L、少なくとも約1g/L、少なくとも約5g/L、少なくとも約10g/L、少なくとも約15g/L、少なくとも約20g/L、少なくとも約30g/L、少なくとも約50g/L、少なくとも約75g/L、少なくとも約100g/L、少なくとも約150g/Lまたは少なくとも約200g/Lまたはそれよりさらに多くの基質化合物ローディングを含む。本明細書で提供される基質ローディングの値は化合物(2)の分子量に基づくが、それは化合物(2)の様々な水和物および塩の同等のモル量もプロセスで使用することができることも企図した。
本明細書で記載される反応の実行では、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、精製された酵素、酵素をコードする遺伝子で形質転換させた全細胞、および/またはそのような細胞の細胞抽出物および/もしくは溶解物の形で反応混合液に加えることができる。操作されたトランスアミナーゼ酵素をコードする遺伝子で形質転換させた全細胞、またはその細胞抽出物、溶解物、および単離された酵素は、固体(例えば、凍結乾燥されたもの、噴霧乾燥されたものなど)または半固体(例えば、粗いペースト)を含む様々な異なる形で用いることができる。細胞抽出物または細胞溶解物は、沈殿(硫酸アンモニウム、ポリエチレンイミン、熱処理など)、その後凍結乾燥前の脱塩手順(例えば、限外濾過、透析など)によって部分的に精製することができる。細胞調製物のいずれも、公知の架橋剤、例えばグルタルアルデヒドなどを使用した架橋、または固相(例えば、Eupergit Cなど)への固定化によって安定させることができる。
操作されたトランスアミナーゼポリペプチドをコードする遺伝子は、宿主細胞内で別々に、または同じ宿主細胞内で一緒に形質転換させることができる。例えば、一部の実施形態では、1セットの宿主細胞を1つの操作されたトランスアミナーゼポリペプチドをコードする遺伝子で形質転換させることができ、別のセットを別の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドをコードする遺伝子で形質転換させることができる。両セットの形質転換細胞は、反応混合液の中で全細胞の形で、またはそれに由来する溶解物もしくは抽出物の形で一緒に利用することができる。他の実施形態では、宿主細胞は、複数の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドをコードする遺伝子で形質転換させることができる。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは分泌ポリペプチドの形で発現させることができ、分泌ポリペプチドを含有する培養培地はトランスアミナーゼ反応のために使用することができる。
本明細書に開示される操作されたトランスアミナーゼポリペプチドの活性および/または立体選択性の増強は、操作されたポリペプチドのより低い濃度でより高いパーセンテージの変換を達成することができるプロセスを提供する。このプロセスの一部の実施形態では、好適な反応条件は、約0.01~約50g/L;約0.05~約50g/L;約0.1~約40g/L;約1~約40g/L;約2~約40g/L;約5~約40g/L;約5~約30g/L;約0.1~約10g/L;約0.5~約10g/L;約1~約10g/L;約0.1~約5g/L;約0.5~約5g/L;または約0.1~約2g/Lの操作されたポリペプチド濃度を含む。一部の実施形態では、トランスアミナーゼポリペプチドは、約0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、15、20、25、30、35、40または50g/Lの濃度である。
アミノ基転移反応中に、反応混合液のpHが変化してもよい。反応混合液のpHは、所望のpHで、または所望のpH範囲内で維持することができる。これは、反応の前におよび/またはその経過中に酸または塩基を加えることによって実行することができる。あるいは、pHは緩衝液を用いて制御することができる。したがって、一部の実施形態では、反応条件は緩衝液を含む。所望のpH範囲を維持するのに好適な緩衝液は当技術分野で公知であり、例としては、ホウ酸塩、炭酸塩、リン酸塩、トリエタノールアミン(TEA)などが限定されずに含まれる。一部の実施形態では、緩衝液はホウ酸塩である。このプロセスの一部の実施形態では、好適な反応条件はTEAの緩衝溶液を含み、TEA濃度は約0.01~約0.4M、0.05~約0.4M、0.1~約0.3Mまたは約0.1~約0.2Mである。一部の実施形態では、反応条件は、約0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.07、0.1、0.12、0.14、0.16、0.18、0.2、0.3または0.4MのTEA濃度を含む。一部の実施形態では、反応条件は、緩衝剤のない好適な溶媒として水を含む。
このプロセスの実施形態では、反応条件は好適なpHを含むことができる。所望のpHまたは所望のpH範囲は、酸もしくは塩基、適当な緩衝液、または緩衝および酸もしくは塩基の添加の組合せの使用によって維持することができる。反応混合液のpHは、反応の前におよび/またはその経過中に制御することができる。一部の実施形態では、好適な反応条件は、約6~約12の溶液pH、約6~約10のpH、約6~約8のpH、約7~約10のpH、約7~約9のpHまたは約7~約8のpHを含む。一部の実施形態では、反応条件は、約6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5または12の溶液pHを含む。
本明細書のプロセスの実施形態では、例えばより高い温度での反応速度の増加、および反応時間中の酵素の活性を考慮して、反応条件のために好適な温度を使用することができる。例えば、本開示の操作されたポリペプチドは、天然に存在するトランスアミナーゼポリペプチド、例えば、配列番号2の野生型ポリペプチドまたは野生型ポリペプチドの操作されたバリアントと比較して増加した安定性を有し、そのことは、操作されたポリペプチドを変換速度の増加および向上した基質溶解特性のためにより高い温度で使用することを可能にする。したがって、一部の実施形態では、好適な反応条件は約10℃~約70℃、約10℃~約65℃、約15℃~約60℃、約20℃~約60℃、約20℃~約55℃、約30℃~約55℃、または約40℃~約50℃の温度を含む。一部の実施形態では、好適な反応条件は、約10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃または70℃の温度を含む。一部の実施形態では、酵素反応の間の温度は、反応の間中一定温度で維持することができるか、または反応の経過中に温度プロファイルにわたって調整することができる。
本明細書のプロセスは、溶媒中で一般的に実行される。好適な溶媒には、水、水性緩衝溶液、有機溶媒、ポリマー溶媒、および/または水性溶媒、有機溶媒および/もしくはポリマー溶媒を一般的に含む共存溶媒系が含まれる。水性溶媒(水または水性の共存溶媒系)は、pHが緩衝されてもよいか、緩衝されなくてもよい。一部の実施形態では、このプロセスは、有機溶媒(例えば、エタノール、イソプロパノール(IPA)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、酢酸エチル、酢酸ブチル、1-オクタノール、ヘプタン、オクタン、メチルt-ブチルエーテル(MTBE)、トルエンなど)、イオン性または極性の溶媒(例えば、1エチル4メチルイミダゾリウムテトラフルオロホウ酸塩、1ブチル3メチルイミダゾリウムテトラフルオロホウ酸塩、1ブチル3メチルイミダゾリウムヘキサフルオロホスフェート、グリセロール、ポリエチレングリコールなど)を含む水性の共存溶媒系で一般的に実行される。一部の実施形態では、共存溶媒は極性溶媒、例えばポリオール、ジメチルスルホキシド、DMSOまたは低級アルコールであってよい。水性共存溶媒系の非水性共存溶媒成分は水性成分と混和性であって単一の液相を提供することができるか、または水性成分と部分的に混和性であるか非混和性であって2つの液相を提供する可能性がある。例示的な水性共存溶媒系は、水ならびに有機溶媒、極性溶媒およびポリオール溶媒から選択される1つまたは複数の共存溶媒を含むことができる。一般に、水性共存溶媒系の共存溶媒成分は、それが反応条件の下でトランスアミナーゼ酵素を不利に不活性化しないように選択される。適当な共存溶媒系は、本明細書に記載されるものなどの酵素活性アッセイを利用して、候補溶媒系に規定の目的の基質を有する指定された操作されたトランスアミナーゼ酵素の酵素活性を測定することによって、容易に同定することができる。
このプロセスの一部の実施形態では、好適な反応条件は水性共存溶媒を含み、共存溶媒は、約1%~約80%(v/v)、約1~約70%(v/v)、約2%~約60%(v/v)、約5%~約40%(v/v)、10%~約40%(v/v)、10%~約30%(v/v)または約10%~約20%(v/v)のDMSOを含む。このプロセスの一部の実施形態では、好適な反応条件は、少なくとも約1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%または80%(v/v)のDMSOを含む水性共存溶媒を含む。このプロセスの一部の実施形態では、好適な反応条件は約15%(v/v)~約45%(v/v)、約20%(v/v)~約30%(v/v)のDMSO、および一部の実施形態では約25%(v/v)のDMSO濃度を含む水性共存溶媒を含む。
このプロセスの一部の実施形態では、好適な反応条件は水性共存溶媒を含み、この共存溶媒はポリマーポリオール溶媒を含むことができる。好適なポリオール溶媒の例には、限定ではなく例として、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールメチルエーテル、ジエチレングリコールジメチルエーテル、トリエチレングリコールジメチルエーテルおよびポリプロピレングリコールが含まれる。一部の実施形態では、水性共存溶媒は異なる分子量で利用可能であるポリエチレングリコールを含む。PEG200~PEG600などの低分子量ポリエチレングリコールが特に有益である。したがって、一部の実施形態では、水性共存溶媒は、約1%~約40v/v%;約1%~約40v/v%;約2%~約40v/v%;約5%~約40v/v%;2%~約30v/v%;5%~約30v/v%;1~約20v/v%;約2%~約20v/v%;約5%~約20v/v%;約1%~約10v/v%;約2%~約10v/v%のPEG200を含むことができる。一部の実施形態では、好適な反応条件は、約1%、2%、5%、10%、15%、20%;25%;30%;35%;35%;または約40v/v%のPEG200を含む水性共存溶媒を含む。
アミノ基転移反応で使用される反応体の量は、所望の生成物の量、および同時に用いたトランスアミナーゼ基質の量によって一般的に異なる。当業者は、所望のレベルの生産性および生産規模に合わせるためにこれらの量を変える方法を容易に理解する。
一部の実施形態では、反応体の添加の順序は決定的でない。反応体は、溶媒(例えば、一相性溶媒、二相性水性共存溶媒系など)に同時に一緒に加えることができるか、代わりに、反応体のいくつかは別々に、いくつかは異なる時点で一緒に加えることができる。例えば、補因子、トランスアミナーゼおよびトランスアミナーゼ基質は、溶媒に最初に加えることができる。
固体反応体(例えば、酵素、塩、基質化合物等)は、粉末(例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥されたものなど)、溶液、乳濁液、懸濁液などを含む、様々な異なる形で反応へ供給することができる。当業者に公知である方法および装置を使用して、反応体は容易に凍結乾燥または噴霧乾燥することができる。例えば、タンパク質溶液は小さいアリコートで-80℃で凍結させ、次に予冷された凍結乾燥チャンバーに加え、続いて真空を適用することができる。
水性共存溶媒系を使用するときの混合効率の向上のために、トランスアミナーゼおよび補因子を先ず水相に加えて混合してもよい。有機相を次に加えて混合し、続いてトランスアミナーゼ基質を添加することができる。あるいは、トランスアミナーゼ基質は、水相への添加の前に有機相とプレミックスすることができる。
アミノ基転移反応は、一般的にケトン基質からアミン生成物へのさらなる変換が反応時間に伴って有意に変化しない頃まで、例えば、基質の10%未満が変換されるか、または基質の5%未満が変換されるまで進行させる。一部の実施形態では、基質ケトンから生成物アミンへの完全またはほとんど完全な変換があるまで、反応を進行させる。基質から生成物への転換は、基質および/または生成物を検出することによって公知の方法を使用してモニタリングすることができる。好適な方法には、ガスクロマトグラフィー、HPLCなどが含まれる。反応混合液中で生成されるキラルアミン生成物の変換収率は、一般的に約50%を超え、約60%を超えてもよく、約70%を超えてもよく、約80%を超えてもよく、90%を超えてもよく、約97%を超えてもよい。一部の実施形態では、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを好適な反応条件下で使用して化合物(3)を調製する方法は、ケトン基質、例えば化合物(2)の化合物のアミン生成物化合物、例えば化合物(3)への少なくとも約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれより高い変換を、約48時間またはそれ未満、約36時間またはそれ未満、約24時間またはそれ未満、またはさらにより短い時間内にもたらす。
プロセスの一部の実施形態では、好適な反応条件は少なくとも約20g/L、30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、70g/L、100g/Lまたはそれより多くの基質ローディングを含み、このプロセスは、基質化合物から生成物化合物への少なくとも約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれより大きな変換を約48時間またはそれ未満、約36時間またはそれ未満、または約24時間またはそれ未満の時間内にもたらす。
好適な反応条件の下でキラルアミン化合物(3)を調製するプロセスで使用されるとき、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%または99.9% e.e.のキラルアミンの立体異性体過剰をもたらす。
このプロセスのさらなる実施形態では、好適な反応条件は、反応溶液への初期の基質ローディングを含むことができ、それは次にポリペプチドと接触する。この反応溶液には、その後追加の基質化合物が連続添加として、少なくとも約1g/L/時間、少なくとも約2g/L/時間、少なくとも約4g/L/時間、少なくとも約6g/L/時間またはそれより速い速度で経時的にさらに補われる。したがって、これらの好適な反応条件により、ポリペプチドは少なくとも約20g/L、30g/Lまたは40g/Lの初期基質ローディングを有する溶液へ加えられる。ポリペプチドのこの添加には、少なくとも約30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、70g/L、100g/L、150g/L、200g/Lまたはそれより多い、大いにより高い最終基質ローディングに到達するまで、約2g/L/時間、4g/L/時間または6g/L/時間の速度での溶液へのさらなる基質の連続添加が次に続く。したがって、このプロセスの一部の実施形態では、好適な反応条件は、少なくとも約20g/L、30g/Lまたは40g/Lの初期基質ローディングを有する溶液へのポリペプチドの添加、続いて少なくとも約30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、70g/L、100g/Lまたはそれより多い最終基質ローディングに到達するまでの、約2g/L/時間、4g/L/時間または6g/L/時間の速度での溶液へのさらなる基質の添加を含む。この基質補給反応条件は、ケトン基質からアミン生成物への少なくとも約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれより高い高率変換を維持しながら、より高い基質ローディングが達成されることを可能にする。このプロセスの一部の実施形態では、加えられるさらなる基質は、イソプロピルアミンまたは酢酸イソプロピルアミンを少なくとも約0.5M、少なくとも約1.0M、少なくとも約2.5M、少なくとも約5.0M、少なくとも約7.5M、少なくとも約10.0Mの濃度で含む溶液中にある。
プロセスの一部の実施形態では、アミノ基転移反応は以下の好適な反応条件を含むことができる:(a)約5g/L~200g/Lの基質ローディング;(b)約0.1~50g/Lの操作されたトランスアミナーゼポリペプチド;(c)約0.1~4Mのイソプロピルアミン(IPM);(d)約0.1~10g/Lのピリドキサールリン酸(PLP)補因子;(e)約6~11のpH;および(f)約30~60℃の温度。
プロセスの一部の実施形態では、アミノ基転移反応は以下の好適な反応条件を含むことができる:(a)約10g/L~150g/Lの基質ローディング;(b)約0.5~20g/Lの操作されたトランスアミナーゼポリペプチド;(c)約0.1~3Mのイソプロピルアミン(IPM);(d)約0.1~1.0g/Lのピリドキサールリン酸(PLP)補因子;(e)約0.05~0.1Mの炭酸またはホウ酸緩衝液;(f)約1%~約45%のDMSO;(g)約7.5~11のpH;および(h)約30~55℃の温度。
プロセスの一部の実施形態では、アミノ基転移反応は以下の好適な反応条件を含むことができる:(a)約20~100g/Lの基質ローディング;(b)約1~5g/Lの操作されたトランスアミナーゼポリペプチド;(c)約0.5~2.5Mのイソプロピルアミン(IPM);(d)約0.2~2g/Lのピリドキサールリン酸(PLP)補因子;(e)約0.1Mのホウ酸緩衝液;(f)約20%DMSO;(e)約10のpH;および(f)約45~60℃の温度。
一部の実施形態では、反応条件を補うために、追加の反応成分または追加の技術が実行される。これらには、酵素を安定化するかその不活性化を阻止するための、生成物阻害を低減させるための、および/または反応平衡を生成物アミン形成へシフトするための手段をとることを含めることができる。
したがって、キラルアミンなどのアミンを調製するためのプロセスの一部の実施形態では、アミノ受容体の追加の量を加えることができ(飽和まで)、および/または形成されたアミノ受容体(ケトン)を反応混合液から連続的に除去することができる。例えば、溶媒架橋または二相共存溶媒系を使用してアミン生成物を抽出溶液へ移動し、それによって、アミン生成物による阻害を低減し、さらに平衡を生成物形成の方へシフトすることができる(例えば、Yun and Kim, 2008, Biosci. Biotechnol. Biochem. 72(11):3030-3033を参照する)。
このプロセスの一部の実施形態では、好適な反応条件は、トランスアミナーゼ酵素の不活性化を制限する作用をすることができる還元された補因子、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)の存在を含む(例えば、van Ophem et al., 1998, Biochemistry 37(9):2879-88)。NADHが存在するそのような実施形態では、反応培地でNADHを再生するために、補因子再生系、例えばグルコースデヒドロゲナーゼ(GDH)およびグルコースまたはギ酸デヒドロゲナーゼおよびギ酸を使用することができる。
一部の実施形態では、プロセスは、アミノ基がアミノ基受容体へ転移されるときにアミノ基供与体から形成されるカルボニル副産物の除去をさらに含むことができる。in situでのそのような除去は、フォワード反応が支配し、その後より多くの基質が生成物に変換されるように、リバース反応の速度を低減することができる。カルボニル副産物の除去は、いくつかの方法で実行することができる。アミノ基供与体がアラニンなどのアミノ酸である場合、カルボニル副産物であるケト酸は、過酸化物との反応によって除去することができる(例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第2008/0213845号を参照する)。使用することができる過酸化物には、とりわけ、過酸化水素;ペルオキシ酸(過酸)、例えば過酢酸(CH3CO3H)、トリフルオロ過酢酸およびメタクロロペルオキシ安息香酸;t-ブチルペルオキシド((CH3)3COOH)などの有機過酸化物;またはテトラプロピルアンモニウム過ルテニウム酸塩、MnO2、KMnO4、四酸化ルテニウムおよび関連化合物などの他の選択的酸化体が含まれる。あるいは、ピルビン酸除去は、平衡を生成物アミンへシフトする乳酸デヒドロゲナーゼを用いることによる、乳酸塩へのその還元を通して達成することができる(例えば、Koszelewski et al., 2008, Adv. Syn. Catal. 350:2761-2766を参照する)。ピルビン酸除去は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ(例えば、Hohne et al., 2008, Chem BioChem 9:363-365を参照する)またはアセトラクテート合成酵素(例えば、前掲のYun and Kimを参照する)を用いることによるその脱炭酸を通して達成することもできる。
代わりに、アミノ酸がアミノ基供与体として使用される実施形態では、ケト酸カルボニル副産物は、アンモニアなどのアミン供与体の存在下で適当なデヒドロゲナーゼ酵素、例えばアミノ酸デヒドロゲナーゼを使用して、アンモニアおよびNADHとの反応によってアミノ酸へ再循環させ、それによってアミノ基供与体を補充することができる。
一部の実施形態では、アミノ供与体の選択が水より高い蒸気圧を有するカルボニル副産物(例えば、揮発性有機カルボニル化合物などの低沸騰副産物)をもたらす場合、カルボニル副産物は非反応性気体で反応溶液をスパージすることによって、または反応圧を下げるために真空を適用し、気相に存在するカルボニル副産物を除去することによって除去することができる。非反応性気体は、反応成分と反応しない任意の気体である。様々な非反応性気体には、窒素および希ガス(例えば、不活性気体)が含まれる。一部の実施形態では、非反応性気体は窒素ガスである。一部の実施形態では、プロセスで使用されるアミノ供与体はイソプロピルアミン(IPM)であり、それはアミノ基受容体へのアミノ基の転移によりカルボニル副産物アセトンを形成する。アセトンは窒素ガスでスパージすることによって、または反応溶液に真空を適用し、凝縮器または他のコールドトラップなどのアセトントラップによって気相からアセトンを除去することによって除去することができる。あるいは、アセトンはトランスアミナーゼを使用したイソプロパノールへの還元によって除去することができる。
キラルアミンを調製するプロセスの一部の実施形態では、工業プロセス条件の下でキラルアミンの変換および収量を増加させるために、アセトンを除去する窒素スイープが利用される。
カルボニル副産物が除去される上のプロセスの一部の実施形態では、アミノ基供与体を補充し、および/または反応のpHを維持するために、対応するアミノ基供与体をアミノ基転移反応の間に加えることができる。アミノ基供与体を補充することはまた、平衡を生成物形成の方へシフトし、それによって基質から生成物への変換を増加させる。したがって、アミノ基供与体がイソプロピルアミンであり、アセトン生成物がin situで除去される一部の実施形態では、アセトン除去の間に失われるアミノ基供与体を補充し、反応のpHを維持するために、イソプロピルアミンを溶液に加えることができる。
さらなる実施形態では、基質化合物から生成物化合物への変換のための上記プロセスのいずれも、以下から選択される1つまたは複数のステップを含むこともできる:生成物化合物の抽出、単離、精製および結晶化。上記の開示された方法によって生成される生体触媒反応混合液から生成物アミンを抽出、単離、精製および/または結晶化するための方法、技術およびプロトコールは通常の熟練者に公知であり、および/またはルーチン実験を通してアクセスされる。さらに、例示的な方法は、下の実施例で提供される。
本開示の様々な特徴および実施形態は、例示を目的としており限定するものではない以下の代表的な実施例で例示される。
6.実施例
実験および達成された結果を含む以下の実施例は、例示目的のためにだけ提供され、本発明を限定するものと解釈すべきでない。実際、下で記載される試薬および装置の多くのために、様々な好適な供給源がある。本発明は、任意の試薬または装置項目のためのいかなる特定の供給源にも限定されるものでない。
実験および達成された結果を含む以下の実施例は、例示目的のためにだけ提供され、本発明を限定するものと解釈すべきでない。実際、下で記載される試薬および装置の多くのために、様々な好適な供給源がある。本発明は、任意の試薬または装置項目のためのいかなる特定の供給源にも限定されるものでない。
下の実験の開示では、以下の略記号が適用される:M(モル);mM(ミリモル)、uMおよびμΜ(マイクロモル);nM(ナノモル);mol(モル);gmおよびg(グラム);mg(ミリグラム);ugおよびμg(マイクログラム);Lおよびl(リットル);mlおよびmL(ミリリットル);cm(センチメートル);mm(ミリメートル);umおよびμ(マイクロメートル);sec.(秒);min(分);hおよびhr(時間);U(単位);MW(分子量);rpm(毎分回転数);psiおよびPSI(平方インチあたりのポンド);℃(摂氏温度);RTおよびrt(室温);RH(相対湿度);CV(変動係数);CAMおよびcam(クロラムフェニコール);PMBS(硫酸ポリミキシンB);IPTG(イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド);LB(Luria培養液);TB(terrific broth);SFP(振盪フラスコ粉末);CDS(コード配列);DNA(デオキシリボ核酸);RNA(リボ核酸);nt(ヌクレオチド;ポリヌクレオチド);aa(アミノ酸;ポリペプチド);E.coli W3110(一般的に使用する実験用E.coli株、Coli Genetic Stock Center[CGSC]、New Haven、CTから入手可能);HTP(高スループット);HPLC(高圧液体クロマトグラフィー);HPLC-UV(HPLC-紫外線可視検出器);1H NMR(プロトン核磁気共鳴分光法);FIOPC(陽性対照に対する向上倍率);SigmaおよびSigma-Aldrich(Sigma-Aldrich、St.Louis、MO);Difco(Difco Laboratories、BD Diagnostic Systems、Detroit、MI);Microfluidics(Microfluidics、Westwood、MA);Life Technologies(Life Technologies、Fisher Scientific、Waltham、MAの一部門);Amresco(Amresco,LLC、Solon、OH);Carbosynth(Carbosynth,Ltd.、Berkshire、UK);Varian(Varian Medical Systems、Palo Alto、CA);Agilent(Agilent Technologies,Inc.、Santa Clara、CA);Infors(Infors USA Inc.、Annapolis Junction、MD);およびThermotron(Thermotron,Inc.、Holland、MI)。
(実施例1)
組換えトランスアミナーゼ遺伝子を含有するE.coli発現宿主
(実施例1)
組換えトランスアミナーゼ遺伝子を含有するE.coli発現宿主
本発明のバリアントを生成するために使用した初期のトランスアミナーゼ酵素は、発現ベクターpCK110900にクローニングされ(米国特許出願公開第2006/0195947号の図3を参照する)、laclリプレッサーの制御下のlacプロモーターに作動可能に連結された配列番号4であった。発現ベクターは、P15a複製起点およびクロラムフェニコール(CAM)抵抗性遺伝子も含有する。生じたプラスミドは、当技術分野で公知の標準方法を使用してE.coli W3110に形質転換させた。当技術分野で公知であるように、細胞をクロラムフェニコール選択にかけることによって、形質転換体を単離した(例えば、米国特許第8,383,346号および国際公開第2010/144103号を参照する)。
(実施例2)
HTPトランスアミナーゼ含有湿性細胞ペレットの調製
(実施例2)
HTPトランスアミナーゼ含有湿性細胞ペレットの調製
モノクローナルコロニーからの組換えトランスアミナーゼコード遺伝子を含有するE.coli細胞を、96ウェル浅型ウェルマイクロタイタープレートのウェル中の1%グルコースおよび30μg/mLのCAMを含有する180μLのLBに接種した。プレートをO2透過性シールで密封し、培養は30℃、200rpmおよび85%湿度で一晩増殖させた。次に、細胞培養の各々の10μLを、390mLのTBおよび30μg/mLのCAMを含有する96ウェル深型ウェルプレートのウェルに移した。深型ウェルプレートをO2透過性シールで密封し、0.6~0.8のOD600に到達するまで30℃、250rpmおよび85%湿度でインキュベートした。細胞培養はIPTGによって1mMの最終濃度へ次に誘導し、本来使用されるのと同じ条件の下で一晩インキュベートした。細胞は、4,000rpmで10分間の遠心分離を使用して次にペレットにした。上清を廃棄し、ペレットは溶解の前まで-80℃で冷凍した。
(実施例3)
HTPトランスアミナーゼ含有細胞溶解物の調製
(実施例3)
HTPトランスアミナーゼ含有細胞溶解物の調製
最初に、100mMトリエタノールアミン緩衝液pH7.5、0.5mg/mLのPLP、1mg/mLのリゾチームおよび0.5mg/mLのPMBSを含有する400μlの溶解緩衝液を、実施例2に記載されているように生成された各ウェルの細胞ペーストに加えた。細胞は、ベンチトップ振盪機の上で振盪させながら室温で2時間溶解した。プレートは、次に4,000rpmおよび4℃で10分間、遠心分離した。それらの活性レベルを決定するために、透明な上清を生体触媒反応で使用した。
(実施例4)
振盪フラスコ(SF)培養からの凍結乾燥溶解物の調製
(実施例4)
振盪フラスコ(SF)培養からの凍結乾燥溶解物の調製
前記のように増殖させた選択されたHTP培養は、1%グルコースおよび30μg/mlのCAMを有するLB寒天プレートの上へプレーティングし、37℃で一晩増殖させた。各培養からの単一のコロニーを、1%グルコースおよび30μg/mlのCAMを有する6mlのLBへ移した。培養は30℃、250rpmで18時間増殖させ、0.05の最終OD600まで30μg/mlのCAMを含有するTBの250mlに、概ね1:50で継代培養した。培養は0.6~0.8の間のOD600まで30℃および250rpmで概ね195分間増殖させ、1mMのIPTGで誘導した。培養は、次に30℃および250rpmで20時間増殖させた。培養は、4,000rpmで20分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットは30mlの10mMトリエタノールアミン緩衝液pH7.5に再懸濁させた。細胞をペレットにし(4,000rpmで20分間)、-80℃で120分間冷凍した。冷凍ペレットは30mlの10mMトリエタノールアミン緩衝液pH7.5に再懸濁させ、18,000psiでMicrofluidizerシステム(Microfluidics)を使用して溶解した。溶解物をペレットにし(10,000rpmで60分間)、上清を冷凍し、凍結乾燥して振盪フレーク(SF)酵素を生成した。
(実施例5)
化合物(3)の生成における配列番号4から向上したトランスアミナーゼ活性
(実施例5)
化合物(3)の生成における配列番号4から向上したトランスアミナーゼ活性
配列番号4は、ケトン基質のアミノ基転移のためにバリアントをスクリーニングした後に親酵素として選択された。配列番号4と比較した活性(FIOP変換)は、配列番号4によってもたらされ、表5.1に示すパーセント変換に対する、バリアントによって形成された生成物のパーセント変換として計算した。パーセント変換は、生成物ピークの面積をHPLC-UV分析(実施例7)によって観察される基質および生成物ピークの合計面積で割ることによって計算し、エナンチオ選択性は正常相HPLC-UV分析(実施例8)を使用して確認した。
表5.1の操作されたポリペプチドを生成するために、配列番号4のトランスアミナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド(配列番号3)を使用した。これらのポリペプチドは、出発ポリペプチドと比較して所望の条件下で(例えば、ケトン基質、化合物(2)、1-イミダゾ[1,2-a]ピリジン-6-イルエタノンから生成物、化合物(3)、(1S)-1-イミダゾ[1,2-a]ピリジン-6-イルエタンアミン)向上したトランスアミナーゼ活性を示した。偶数の配列識別子のアミノ酸配列を有する操作されたポリペプチドは、下記のHTPアッセイ、および表7.1に示す分析法を使用して記載され、同定された、配列番号4の「主鎖」アミノ酸配列から生成された。
指向性進化は、配列番号3に示すポリヌクレオチドから開始した。様々な周知の技術(例えば、飽和突然変異誘発、前もって同定された有益なアミノ酸差の組換え)を使用して操作されたポリペプチドのライブラリーを生成し、下のHTPアッセイおよび表7.1に記載される分析法を使用してスクリーニングした。
酵素アッセイは、96ウェル深型ウェル(2mL)プレートの100μL全量/ウェルで実行した。反応は、15μLのHTP溶解物、30g/Lのケトン基質、0.26g/LのPLP、1MのIPM、20%(v/v)のDMSO、100mMの炭酸緩衝液pH10.0を使用して実行した。反応は、以下を加えることによって設定した:1)DMSO中の20μLの150g/L基質ケトン、2)1.6MのIPM pH10.0、160mMの炭酸緩衝液pH10.0および0.4g/LのPLPを含有する65μLのマスターミックス溶液、3)15μLのHTP溶解物。反応プレートは、180℃で2秒間ヒートシールした。プレートは、次に50℃で20時間、600rpmで振盪させた。
20時間のインキュベーションの後、300μLのアセトニトリルを各ウェルに加え、プレートを再密封し、室温で10分間振盪し、続いて4℃で10分間遠心分離した。新規のプレートで、水:アセトニトリルの1:1の混合液の180μLを加えることによって、上記のプレートからの試料の20μLをさらに希釈した。プレートを密封し、実施例7に記載されるアキラルHPLC分析前の1分間、室温で混合した。
キラル分析のために、一次分析からの選択されたヒットからのアセトニトリルクエンチの100μLをエッペンドルフ管にとり、溶媒を30~60分間speedvacで蒸発させた。生じた残留物を0.5%ジエチルアミン(DEA)を含有する100μLのイソプロパノールで復元し、実施例8に記載される正常相HPLC方法を使用して試料を分析した。
ヒットバリアントは250mL振盪フラスコで増殖させ、振盪フラスコ粉末を生成した。SFPの活性は、0.9~7.5g/LのSF粉末、30g/Lのケトン基質、0.26g/LのPLP、1MのIPM、20%(v/v)のDMSO、100mMの炭酸緩衝液pH10.0で評価した。反応は、前記のものと類似した手順を使用して設定した。
(実施例6)
化合物(3)の生産における配列番号6から向上したトランスアミナーゼ活性
化合物(3)の生産における配列番号6から向上したトランスアミナーゼ活性
配列番号6を、次のラウンドの進化のための親酵素として選択した。配列番号6と比較した活性(FIOP変換)は、配列番号6によってもたらされ、表6.1に示すパーセント変換に対する、バリアントによって形成された生成物のパーセント変換として計算した。パーセント変換は、生成物ピークの面積をHPLC-UV分析(実施例7)によって観察される基質および生成物ピークの合計面積で割ることによって計算し、エナンチオ選択性は正常相HPLC-UV分析(実施例8)を使用して確認した。
表6.1の操作されたポリペプチドを生成するために、配列番号6のトランスアミナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド(配列番号5)を使用した。これらのポリペプチドは、出発ポリペプチドと比較して所望の条件下で(例えば、ケトン基質、化合物(2)、1-イミダゾ[1,2-a]ピリジン-6-イルエタノンから生成物、化合物(3)、(1S)-1-イミダゾ[1,2-a]ピリジン-6-イルエタンアミン)向上したトランスアミナーゼ活性を示した。偶数の配列識別子のアミノ酸配列を有する操作されたポリペプチドは、下記のHTPアッセイ、および表7.1に示す分析法を使用して記載され、同定された、配列番号6の「主鎖」アミノ酸配列から生成された。
指向性進化は、配列番号5に示すポリヌクレオチドから開始した。様々な周知の技術(例えば、飽和突然変異誘発、前もって同定された有益なアミノ酸差の組換え)を使用して操作されたポリペプチドのライブラリーを生成し、下のHTPアッセイおよび表7.1に記載される分析法を使用してスクリーニングした。
酵素アッセイは、96ウェル深型ウェル(2mL)プレートの100μL全量/ウェルで実行した。反応は、20μLの10×希釈HTP溶解物、35g/Lのケトン基質、0.24g/LのPLP、1MのIPM、20%(v/v)のDMSO、100mMのホウ酸緩衝液pH10.0を使用して実行した。反応は、以下のものを添加することによって設定した:1)DMSO中の20μLの175g/Lの基質ケトン、2)1.65MのIPM pH10.0、170mMのホウ酸緩衝液pH10.0および0.4g/LのPLPを含有する60μLのマスターミックス溶液、3)20μLのHTP溶解物。反応プレートは、180℃で2秒間ヒートシールした。プレートは、次に50℃で20時間、600rpmで振盪させた。
20時間のインキュベーションの後、300μLのアセトニトリルを各ウェルに加え、プレートを再密封し、室温で10分間振盪し、続いて4℃で10分間遠心分離した。新規のプレートで、水:アセトニトリルの1:1の混合液180μLを加えることによって、上記のプレートからの試料の20μLをさらに希釈した。プレートを密封し、実施例7に記載されるアキラルHPLC分析前の2分間、室温で混合した。
キラル分析のために、一次分析からの選択されたヒットからのアセトニトリルクエンチの100μLをエッペンドルフ管にとり、溶媒を30~60分間speedvacで蒸発させた。生じた残留物を0.5%ジエチルアミン(DEA)を含有する100μLのイソプロパノールで復元し、実施例8に記載される正常相HPLC方法を使用して試料を分析した。
ヒットバリアントは250mL振盪フラスコで増殖させ、振盪フラスコ粉末を生成した。SFPの活性は、0.9~7.5g/LのSF粉末、35g/Lのケトン基質、0.26g/LのPLP、1MのIPM、20%(v/v)のDMSO、100mMのホウ酸緩衝液pH10.0で評価した。反応は、前記のものと類似した手順を使用して設定した。
(実施例7)
HPLC-UVによる生成物1-イミダゾ[1,2-a]ピリジン-6-イルエタンアミンの分析的検出
HPLC-UVによる生成物1-イミダゾ[1,2-a]ピリジン-6-イルエタンアミンの分析的検出
実施例5および6に記載されるデータは、表7.1で提供される分析法を使用して収集した。本明細書で提供される方法は、本発明を使用して生成されるバリアントの分析で有用である。しかし、本発明は、本明細書に記載される方法に限定されるものではなく、その理由は、本明細書で提供される、および/または本明細書で提供される方法を使用して生成されるバリアントの分析に適用可能である、当技術分野で公知の他の好適な方法があるからである。
(実施例8)
正常相HPLC-UVによる(1S)-1-イミダゾ[1,2-a]ピリジン-6-イルエタンアミンの分析的検出
正常相HPLC-UVによる(1S)-1-イミダゾ[1,2-a]ピリジン-6-イルエタンアミンの分析的検出
実施例5および6に記載されるデータは、表7.1で提供される分析法を使用して収集し、ヒットバリアントのキラル同一性は、ここの表8.1で提供される分析法を使用して検証した。本明細書で提供される方法は、本発明を使用して生成される生成物異性体の分離および同定で有用である。しかし、本発明は、本明細書に記載される方法に限定されるものではなく、その理由は、本明細書で提供される、および/または本明細書で提供される方法を使用して生成されるバリアントの分析に適用可能である、当技術分野で公知の他の好適な方法があるからである。
本出願で引用される全ての刊行物、特許、特許出願および他の文書は、各個々の刊行物、特許、特許出願または他の文書が全ての目的のために参照により組み込まれていることが個々に示されているのと同じ程度に、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
様々な具体的な実施形態が例示され、記載されたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な変更を加えることができることが理解されるであろう。
Claims (17)
- 配列番号4および/または6またはその機能的断片と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む操作されたトランスアミナーゼであって、前記操作されたトランスアミナーゼは前記ポリペプチド配列中に少なくとも1つの置換または置換のセットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置は配列番号4および/または6に関して番号付けされる、操作されたトランスアミナーゼ。
- 前記ポリペプチド配列が配列番号4と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を有し、前記操作されたトランスアミナーゼが、前記ポリペプチド配列中に少なくとも1つの置換または置換のセットを227、41/227/417/443、13、41/57/130/415/419、41/113/415、53/57、88、88/89、97/415、148、260、302、355/415/419、362、417および443から選択される1つまたは複数の位置で含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が配列番号4に関して番号付けされる、請求項1に記載の操作されたトランスアミナーゼ。
- 前記ポリペプチド配列が配列番号6と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を有し、前記操作されたトランスアミナーゼが前記ポリペプチド配列中に少なくとも1つの置換または置換のセットを13、13/41/57/88/130/415/417、13/41/57/89/97/417、13/41/57/97/130/415/417、13/41/57/97/130/415/417/443、13/41/57/97/443、13/41/57/130/417、13/41/57/417、13/41/88、13/41/88/89、13/41/88/89/97/415/443、13/41/88/89/417、13/41/88/97、13/41/88/130/415/443、13/41/88/443、13/41/89/130/148/443、13/41/89/417、13/41/89/443、13/41/97/130/417、13/41/97/415、13/41/97/415/417、13/41/97/417、13/41/97/417/443、13/41/130/415/443、13/41/415、13/41/415/417、13/41/415/443、13/41/417、13/41/417/443、13/57/88/89/130/415/443、13/57/88/97、13/57/88/97/415/443、13/57/88/130/415、13/57/88/130/417/443、13/57/88/415、13/57/97/130/415/417/443、13/57/97/417、13/88/89/415/417、13/88/89/415/417/443、13/88/130/443、13/88/415、13/89/97/415/417、13/89/97/417、13/89/417、13/97/148/415、13/97/415、13/97/415/417、13/97/417、13/130/415、13/130/415/417、13/130/417、13/130/417/443、13/415、13/415/417、13/415/417/443、13/415/443、13/417、13/417/443、13/443、23/53/162/233/277/315/415/418/432、23/53/315/417/418、23/277/315/395/415/417/432、23/277/395/417/418、23/395/418、23/418、41、41/57/88、41/57/88/415/443、41/57/130/148/415/417、41/57/130/443、41/57/415/417、41/88/89/97/130/415、41/88/89/415/417、41/88/97/130/417、41/88/130/415/417、41/88/443、41/97/130/148/415/417/443、41/97/417、41/97/417/443、41/130/415、41/130/415/417/443、41/130/415/443、41/415/443、41/417、41/417/443、53/162、53/162/395/417、53/162/418/432、53/233、53/277/395、53/277/395/417/418、53/277/415/417、57/88/97/130/415/443、57/88/97/130/417、57/88/97/417、57/97/130/148/417/443、57/417、88、88/89/130/417、88/97/415/417/443、88/130/417/443、88/148/417/443、88/415、88/415/417、88/415/417/443、88/417、89/97/415/417、89/97/417、89/443、97、97/130、97/148/415、97/415、97/415/417、97/417、130、130/415、130/417、130/443、162/233/415/417、162/395/415/417、162/418、233/315/415/417、233/315/417、277/395/415/418/432、315、315/415/418/432、395/418、415、415/417、415/417/418、415/417/418/432、415/417/443、415/443、417および443から選択される1つまたは複数の位置に含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が配列番号6に関して番号付けされる、請求項1に記載の操作されたトランスアミナーゼ。
- 残基位置13、41/57/130/415/419、41/113/415、53/57、88、88/89、97/415、148、227、260、302、355/415/419、362、417および443での前記残基差が、13A、13E、13G、13K、13S、41V/57Y/130Y/415F/419D、41V/113F/415F、53M/57W、88K、88R、88R/89L、88V、97A/415S、148E、148G、227A、227C、260T、302N、355C/415S/419D、362G、417A、417I、417V、443Eおよび443Mから選択される、請求項2に記載の操作されたポリペプチド。
- 前記アミノ酸配列が、配列番号4と比較して
T13A;
T13E;
T13G;
T13K;
T13S;
I41V、F57Y、F130Y、R415FおよびQ419D;
I41V、V113FおよびR415F;
N53MおよびF57W;
L88K;
L88R;
L88RおよびM89L;
L88V;
S97AおよびR415S;
Q148E;
Q148G;
G227A;
G227C;
C260T;
E302N;
R355C、R415SおよびQ419D;
H362G;
L417A;
L417I;
L417V;
K443E;および
K443M
から選択される残基差の組合せをさらに含む、請求項1に記載の操作されたポリペプチド。 - 前記トランスアミナーゼが化合物(2)から化合物(3)への変換において配列番号4のポリペプチドと比較して少なくとも1.2倍増加した活性を有する、請求項1に記載の操作されたポリペプチド。
- 前記トランスアミナーゼが化合物(2)から化合物(3)への変換において配列番号4のポリペプチドと比較して増加したエナンチオ選択性を有する、請求項1に記載の操作されたポリペプチド。
- 前記アミノ酸配列が配列番号4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38,40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356および358から選択される配列を含む、請求項1に記載の操作されたポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが固体支持体の上に固定化される、請求項1~8のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
- 前記固体支持体が、エポキシド官能基を有するポリメタクリレート、アミノエポキシド官能基を有するポリメタクリレート、スチレン/DVBコポリマーまたはオクタデシル官能基を有するポリメタクリレートを含むビーズまたは樹脂である、請求項9に記載の操作されたポリペプチド。
- 請求項1~10のいずれか一項に記載の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項1に記載の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、配列番号3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355および357から選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
- 請求項11または12に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 制御配列を含む請求項13に記載の発現ベクター。
- 請求項11もしくは12に記載のポリヌクレオチドまたは請求項13もしくは14に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
- 請求項1~10のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチドを調製する方法であって、前記ポリペプチドの発現のために好適な条件の下で請求項15に記載の宿主細胞を培養することを含む方法。
- 前記操作されたポリペプチドを単離することをさらに含む、請求項16に記載の方法。
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