ES2650245T3 - Método enzimático para aminación (R)-selectiva - Google Patents

Abstract

Un método para la síntesis enzimática de una (R)-amina enriquecida enantioméricamente de fórmula general [1][c] **Fórmula** a partir de la cetona correspondiente de la fórmula general [1][a] **Fórmula** y un donante amino adecuado, en el que R1 y R2 son diferentes y son independientemente alifáticos lineales o ramificados, aromáticos, heteroaromáticos o forman una estructura cíclica, usando una transaminasa seleccionada del grupo que consiste en a. una proteína que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 1; b. una proteína que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 3; c. una proteína que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 5; d. una proteína que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 7; e. una proteína que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 9; f. una proteína que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 11; g. una proteína que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 13; h. una proteína que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 15; i. una proteína que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 17; j. una proteína que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 19; k. una proteína que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 21; l. una proteína que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 23; m. una proteína que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 25, y n. una proteína que tiene actividad de transaminasa y que puede obtenerse a partir de un organismo seleccionado del grupo que organismos que consiste en Rahnella aquatilis, Ochrobactrum anthropi, Ochrobactrum tritici, Sinorhizobium morelense, Curtobacterium pusilllum, Paecilomyces lilacinus, Microbacterium ginsengisoli, Microbacterium trichothecenolyticum, Pseudomonas citronellolis, Yersinia kristensenii, Achromobacter spanius, Achromobacter insolitus, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium frederiksbergense, Mycobacterium sacrum, Mycobacterium fluoranthenivorans, Burkholderia sp., Burkholderia tropica, Cosmospora episphaeria, y Fusarium oxysporum, con la condición de que las proteínas que se han mencionado anteriormente (es decir, la alternativa (a)) no consistan en una secuencia de aminoácidos idéntica a las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID no. 3 del documento WO2011/026556.

Description

Método enzimático para aminación (R)-selectiva

5 La presente invención se refiere a un método para la aminación (R)-selectiva de cetonas y a microorganismos depositados para su uso en este método.

Un número considerable de compuestos farmacéuticamente activos (existentes y en desarrollo) contienen una funcionalidad de amina quiral que no puede derivarse directamente de forma sintética de aminoácidos naturales.

10 Según los fabricantes farmacéuticos, la síntesis asimétrica de aminas de cetonas es una de las reacciones más deseables para el futuro (Constable et al., Green Chem. 2007, 9, 411). Además, es un objetivo de los fabricantes farmacéuticos confiar tanto como sea posible en rutas "verdes" en la síntesis de sus compuestos farmacéuticamente activos. Por lo tanto, se prefieren las conversiones biocatalíticas.

15 Una ruta atractiva para la producción biocatalítica de aminas quirales es la transaminación estereoselectiva a partir de una cetona y un donante de amina, de acuerdo con la reacción [1]:

20 Las enzimas estereoselectivas requeridas (denominadas indistintamente transaminasas, aminotransferasas o aminofrasas) se han indicado, por ejemplo, la ω-transaminasa (S)-selectiva de Vibrio fluvialis (Shin et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003, 61, 463), aunque las enzimas (S)-selectivas son mucho más abundantes que las enzimas (R)-selectivas.

25 Las transaminasas estereoselectivas se han descrito, por ejemplo, en las publicaciones de patentes europeas EP1038953 y EP987332.

El documento EP1038953 se refiere a un ADN que codifica una transaminasa capaz de sintetizar (R)-αmetilbencilamina ópticamente activa en presencia de sec-butilamina.

30 El documento EP987332 se refiere en particular a una transaminasa de una especie de Mycobacterium aurum que puede catalizar la transaminación estereoselectiva de acetofenona y sec-butilamina a una (R)-α-metilbencilamina enantioméricamente enriquecida y 2-butanona. La misma transaminasa también se usó para la resolución racémica

o (RS)-α-metilbencilamina para obtener (S)-α-metilbencilamina enantioméricamente enriquecida, así como la síntesis 35 de D-alanina y D-serina enantioméricamente enriquecidas.

El documento US7169592 se refiere a un ADN de una especie de Arthrobacter que codifica una transaminasa recombinante, que puede catalizar la transaminación (R)-estereoselectiva de varias cetonas en presencia de un donante de amino para producir (R)-aminas enantioméricamente enriquecidas.

40 Iwasaki et. al. (Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006 (69), 499-505) describen una transaminasa R-específica de Arthrobacter sp.

El documento WO 2011/026556 se refiere a una secuencia de aminoácidos de la ω-transaminasa de (R)-selectiva 45 de Aspergillus terreus, identificada por la SEQ ID No. 3.

1 masmdkvfag yaarqailes tettnpfakg iawvegelvp laeariplld qgfmhsdlty 61 dvpsvwdgrf frlddhitrl easctklrlr lplprdqvkq ilvemvaksg irdafveliv 121 trglkgvrgt rpedivnnly mfvqpyvwvm epdmqrvggs avvartvrrv ppgaidptvk

50 181 nlqwgdlvrg mfeaadrgat ypfltdgdah ltegsgfniv lvkdgvlytp drgvlqgvtr 241 ksvinaaeaf gievrvefvp velayrcdei fmcttaggim pittldgmpv nggqigpitk 301 kiwdgywamh ydaaysfeid ynern

Existe la necesidad de transaminasas estereoselectivas adicionales para poder aplicar reacciones de transaminación estereoselectivas a un espectro más amplio de compuestos.

La presente invención se refiere a un método para la síntesis enzimática de (R) -aminas enantioméricamente 5 enriquecidas de fórmula general [1][c] a partir de las correspondientes cetonas de fórmula general [1][a] usando transaminasas.

Estas transaminasas se seleccionan del grupo que consiste en

10 a) una proteína que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 1; b) una proteína que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 3; c) una proteína que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID

15 No. 5; d) una proteína que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 7; e) una proteína que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 9;

20 f) una proteína que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 11; g) una proteína que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 13; h) una proteína que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID

25 No. 15; i) una proteína que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 17; j) una proteína que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 19;

30 k) una proteína que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 21; l) una proteína que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 23; m) una proteína que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID

35 No. 25; n) una proteína que tiene actividad transaminasa y aislada de un microorganismo seleccionado del grupo de organismos que consiste en Rahnella aquatilis, Ochrobactrum anthropi, Ochrobactrum tritici, Sinorhizobium morelense, Curtobacterium pusilllum, Paecilomyces lilacinus, Microbacterium ginsengisoli, Microbacterium trichothecenolyticum, Pseudomonas citronellolis, Yersinia kristensenii, Achromobacter spanius,

40 Achromobacter insolitus, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium frederiksbergense, Mycobacterium sacrum, Mycobacterium fluoranthenivorans, Burkholderia sp., Burkholderia tropica, Cosmospora episphaeria, y Fusarium oxysporum, con la condición de que las proteínas que se han mencionado anteriormente (es decir, la alternativa (a)) no consistan en una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos n.º 3 del documento WO2011/026556.

45 De acuerdo con la presente invención, se ha encontrado, en estudios de alineamiento de secuencias usando alineamiento múltiple de secuencias de ClustalW2 en configuraciones predeterminadas (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2, Larkin et al., Bioinformatics 2007, 23, 2947), que las transaminasas de SEQ ID No. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 y 25 para su uso en esta invención varían en un amplio rango de

50 porcentaje de identidad con la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre de SEQ ID No. 1 de la transaminasa. Incluso en un porcentaje de identidad de aproximadamente el 30 % con respecto a la SEQ ID No. 1, se encuentran aún transaminasas muy adecuadas de acuerdo con la presente invención.

Los inventores han descubierto, sin embargo, que las transaminasas que pueden usarse en la presente invención (y

55 los mutantes derivados de las mismas) tienen todas en común, que tienen al menos 37 aminoácidos conservados, concretamente, A32, A44, D50, G52, D57, Y60, V65, G68, F71, L73, R79, V106, V116, R122, G123, P145, P177, K180, N181, W184, D186, E213, G216, N218, P230, L235, G237, R240, V243, E269, A276, G277, G278, P281, G296, W307, y Y321, cuando se comparan con la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre de la SEC ID No. 1 en las posiciones correspondientes a las posiciones anteriores en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 1.

Los residuos de aminoácidos de las secuencias de proteínas mutantes o de tipo silvestre correspondientes a las posiciones de los residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre de la transaminasa de SEQ ID No. 1 se pueden identificar realizando alineaciones de secuencia múltiple ClustalW2 en la configuración por

5 defecto. Los residuos de aminoácidos, que se colocan en la misma columna como un residuo de aminoácidos de la secuencia de transaminasa que se da en SEQ ID No. 1 en tales alineamientos, se definen como posiciones correspondientes a este residuo de aminoácidos respectivo de la secuencia de transaminasa de SEQ. ID No. 1.

Muestras de cada uno de los microorganismos Rahnella aquatilis, Ochrobactrum anthropi, Ochrobactrum tritici,

10 Sinorhizobium morelense, Curtobacterium pusilllum, Paecilomyces lilacinus, Microbacterium ginsengisoli, Microbacterium trichothecenolyticum, Pseudomonas citronellolis, Yersinia kristensenii, Achromobacter spanius, Achromobacter insolitus, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium frederiksbergense, Mycobacterium sacrum, Mycobacterium fluoranthenivorans, Burkholderia sp., Burkholderia tropica, Cosmospora episphaeria, y Fusarium oxysporum se depositaron en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ) en

15 Braunschweig, Alemania, el 13 de julio de 2010.

En las estructuras químicas anteriores [1][a] y [1][c], R1 y R2 son diferentes y pueden ser independientemente alifáticos lineales o ramificados, heteroalifáticos, aromáticos, heteroaromáticos o formar una estructura cíclica.

20 Más en particular, R1 y R2 son diferentes y R1 y R2 contienen independientemente de 1 a 30 átomos de carbono y R1 y R2 son alifáticos independientemente sustituidos o no sustituidos; alifáticos ramificados sustituidos o sin sustituir; alifáticos cíclicos sustituidos o sin sustituir; alifáticos heterocíclicos sustituidos o sin sustituir, que contienen al menos un átomo de oxígeno, azufre o nitrógeno; aromáticos sustituidos o sin sustituir; heteroaromáticos sustituidos o sin sustituir que contienen al menos un átomo de azufre, oxígeno o nitrógeno; o juntos forman una estructura cíclica o

25 una estructura heterocíclica sustituida o sin sustituir, que contiene al menos un átomo de oxígeno, azufre o nitrógeno; en donde los sustituyentes se seleccionan del grupo que consiste en, pero sin limitación, un átomo de halógeno, un grupo alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, grupo hidroxilo, grupo metoxi, monofluorometilo, difluorometilo y trifluorometilo.

30 Preferiblemente, la concentración final del producto de (R)-amina enantioméricamente enriquecida se encuentra entre el 1 y el 50 % en peso de la mezcla de reacción. Mucho más preferiblemente, la concentración final del producto de (R)-amina enantioméricamente enriquecida se encuentra entre el 5 y el 35 % en peso de la mezcla de reacción.

35 Un proceso de acuerdo con esta invención puede realizarse en una mezcla de reacción acuosa con todas las reacciones disueltas o en suspensiones con algunos de los reactivos al menos parcialmente disueltos y algunas de las reacciones al menos parcialmente como material sólido.

El uso de un disolvente no miscible en agua, tal como un disolvente orgánico que forma una segunda fase líquida

40 junto a la fase acuosa tamponada que contiene una transaminasa, puede ser ventajoso en reacciones de transaminasas frente a reacciones en suspensión meramente acuosas o acuosa, ya que el disolvente orgánico puede actuar como depósito para cetonas poco solubles el agua y donantes de amino. Puede aumentar la velocidad de transferencia de masa para la disolución de cetonas poco solubles en agua o donantes amino en la fase acuosa que contiene la transaminasa en comparación con las reacciones en suspensión (sólido-acuoso). Además, puede

45 reducir la inhibición potencial del sustrato o del producto mediante la eliminación por extracción de estos inhibidores potenciales. Además, dicha eliminación por extracción de al menos uno de los productos de reacción de transaminasa puede llevar el equilibrio de la reacción transaminasa en la fase acuosa al lado del producto, mejorando de este modo el rendimiento y/o la eficacia de la reacción catalizada por transaminasa.

50 Un proceso de acuerdo con esta invención puede realizarse en una mezcla de reacción que comprende una fase acuosa y una segunda fase orgánica. En caso de que se use una mezcla de reacción que comprenda una fase acuosa y una segunda fase orgánica, la mezcla de reacción comprende preferiblemente una fase acuosa y una segunda fase orgánica y la relación volumétrica de agua:fase orgánica está entre 100 y 0,01. Mas preferiblemente, la mezcla de reacción comprende una fase acuosa y una segunda fase orgánica, y la relación volumétrica del

55 agua:fase orgánica está entre 20 y 0,1. Mucho más preferiblemente, la mezcla de reacción comprende una fase acuosa y una segunda fase orgánica, y la relación volumétrica del agua:fase orgánica está entre 20 y 1.

Los disolventes orgánicos adecuados pueden seleccionarse, por ejemplo, del grupo de, pero sin limitación, ciclohexanona, diclorometano, pentano, heptano, MTBE (metil-terc-butiléter), tolueno, 2-metil-tetrahidrofurano,

acetato de butilo y acetato de etilo.

Las transaminasas a) a m) anteriores para su uso en esta invención se han identificado en búsquedas de bases de datos en bases de datos públicas de nucleótidos y polipéptidos como EMBL/GenBank/DDBJ, Swiss-Prot/UniProtKB

5 (lanzado el 15 de junio de 2010), RefSeq o no redundante a través de los servidores EMBL-EBI (http://www.ebi.ac.uk) o NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) anotados como "proteína hipotética" con la mayor similitud con las aminotransferasas de L-aminoácidos de cadena ramificada o 4-amino-4-desoxicorismato liasas (EC4.1.3.38) pertenecientes a la superfamilia de las enzimas dependientes de piridoxal 5'-fosfato de clase IV (PLPDE_IV). La actividad y expresión funcional hasta ahora no han sido informadas para soportar la anotación.

10 Sorprendentemente, se ha encontrado que las transaminasas a) a m) son de hecho ω-transaminasas (R)-selectivas en lugar de aminotransferasas de aminoácidos (S)-selectivas como se describirá a continuación. Además, las transaminasas a) a m) difieren en el espectro del sustrato de las (R)-transaminasas descritas en los documentos EP1038953, EP987332 y US7169592.

15 Las transaminasas a) a n) anteriores para su uso en esta invención se han caracterizado por su actividad y enantioselectividad en una o más de las siguientes conversiones de ω-transaminasas:

(i) Resolución racémica de (RS)-α-metilbencilamina. 20

La enantioselectividad de enzimas en general y las transaminasas específicamente, puede determinarse en una resolución racémica de una mezcla racémica de un sustrato que comprende un centro quiral. Una transaminasa (R)25 selectiva para su uso en esta invención es una enzima que somete a transaminación preferiblemente (R)-αmetilbencilamina (MBA) a partir de MBA racémico en presencia de un sustrato de cetona tal como ácido pirúvico. Una (R)-transaminasa para su uso en esta invención es una enzima que convierte preferiblemente el enantiómero

(R) en el enantiómero (S) de α-metilbencilamina en presencia de ácido pirúvico que da como resultado el enriquecimiento del enantiómero (S) restante con un exceso enantiomérico (e.e.) de al menos el 10 %. 30 Preferiblemente, el e.e. resultante de (S)-MBA es al menos del 50 %. Más preferiblemente, el e.e. es al menos del 60 %. Incluso más preferiblemente, el e.e. es al menos del 70 %. Incluso más preferiblemente, el e.e. es al menos del 80 %. Incluso más preferiblemente, el e.e. es al menos del 90 %. Incluso más preferiblemente, el e.e. es al menos del 95 %. Incluso más preferiblemente, el e.e. es al menos del 96 %. Incluso más preferiblemente, el e.e. es al menos del 97 %. Incluso más preferiblemente, el e.e. es al menos del 98 %. Mucho más preferiblemente, el e.e. es

35 al menos del 99 %.

Típicamente, se hacen reaccionar 80 mM de α-metilbencilamina (MBA) racémica con piruvato sódico 40 mM en tampón de fosfato de potasio 100 mM (KPi) a pH 7,0 que contiene piridoxal 5'-fosfato (PLP) 0,1 mM a 28 °C durante 20 h en presencia de una transaminasa. Las concentraciones y excesos enantioméricos de (R) y/o (S)-MBA pueden

40 determinarse, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) o cromatografía de gases (GC) con materiales de columna quirales adecuados. La formulación de la (R)-transaminasa no es crítica; se puede añadir como enzima (parcialmente) purificada, extracto libre de células (CFE) o extracto de células en bruto; forma líquida, en polvo o inmovilizada; células permeabilizadas, células enteras o caldo de cultivo que contienen células que comprenden la transaminasa o en cualquier otra forma.

(ii) Actividad y selectividad en los enantiómeros puros de α-metilbencilamina.

La enantioselectividad de una enzima también se caracteriza por sus actividades específicas hacia los enantiómeros individuales de un sustrato específico. Estos se pueden determinar en ensayos de actividad separados con las 50 formas enantiopuras individuales del sustrato. De acuerdo con esta invención, las actividades de transaminasa específicas hacia los dos enantiómeros de α-metilbencilamina (MBA) son una medida para la (R)-selectividad de una transaminasa. En el contexto de esta invención, la relación de las actividades específicas en (R)-MBA sobre las actividades específicas en (S)-MBA se define como el valor de enantioselectividad de transaminasa (TEV). Una

transaminasa (R)-selectiva se define como una transaminasa con un valor TEV de >1. Una buena (R)-selectividad de una transaminasa se define como una relación de actividad específica en (R) sobre (S)-MBA de TEV ≥10. Una alta (R)-selectividad de una transaminasa se define como una relación de actividad específica en (R) sobre (S)-MBA de TEV ≥100.

Las actividades específicas de transaminasas en (R) y (S)-MBA se determinan por separado usando un ensayo

10 espectrofotométrico. En un volumen de reacción final de 1 ml, se mezclan 50 μl de una dilución adecuada de una transaminasa en forma líquida en una cubeta con (R) o (S)-MBA 12,5 mM y piruvato sódico 5 mM en presencia de tampón KPi 50 mM a pH 7,5 que contiene PLP 0,1 mM. Las reacciones se inician mediante la adición de 10 μl de piruvato sódico 0,5 M (en tampón KPi 50 mM a pH 7,5, PLP 0,1 mM) a los otros componentes del ensayo, después de la preincubación a 30 °C durante 5 min. Después de la adición de piruvato sódico, se registra la absorción a 300

15 nm y la actividad transaminasa en las muestras se calcula según la ley de Lambert-Beer utilizando el coeficiente de extinción molar para acetofenona a 300 nm de ε = 0,28 cm2/μmol. Una unidad (U) de actividad transaminasa se define como 1 μmol de acetofenona formada a partir de (R)-MBA o (S)-MBA 12,5 mM y piruvato sódico 5 mM a 30 °C en tampón KPi 50 mM a pH 7,5 que contiene PLP 0,1 mM por minuto. Las actividades de transaminasas específicas del CFE (U/mg de proteína CFE total) se calculan dividiendo los valores de actividad volumétrica (U/ml

20 de CFE) por la concentración total de proteína en la muestra de transaminasa líquida. El valor de enantioselectividad de transaminasas (TEV) se calcula dividiendo la actividad volumétrica o específica en (R)-MBA por la actividad volumétrica o específica, respectivamente, en (S)-MBA.

Preferiblemente, la (R)-transaminasa tiene un TEV de al menos 1, más preferiblemente la (R) -transaminasa tiene un 25 TEV de al menos 10, incluso más preferiblemente la (R)-transaminasa tiene un TEV de al menos 100.

(iii) Síntesis de (R)-aminas enantioméricamente enriquecidas de las cetonas correspondientes y donantes de aminoácidos adecuados tales como bencilamina o α-metilbencilamina.

30 El resultado deseado típico de una reacción catalizada por una transaminasa (R)-selectiva es la formación de una (R)-amina enantioméricamente enriquecida de acuerdo con la fórmula 1[c] de un donante amino y un sustrato de cetona. Los donadores amino adecuados para las reacciones de transaminasas (R)-selectivas comprenden, por ejemplo, MBA racémica o (R)-MBA, 1-aminoindano racémico o (R)-1-aminoindano, 1-aminotetralina racémico o (R)1-aminotetralina, alanina racémica o D-alanina, isopropilamina, bencilamina, sec-butilamina racémica o (R)-sec

35 butilamina (2-aminobutano), β-alanina o ácido racémico o D-3-aminobutírico.

Generalmente, con una transaminasa particular, se prefieren ciertos donantes amino. Sorprendentemente, se ha encontrado que con la transaminasa de SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 21, SEQ NO ID 23, y SEQ ID No. 43 los donantes amino preferidos son

40 MBA racémicos o (R)-MBA o sec-butilamina racémica o (R)-sec-butilamina.

Típicamente 70 mM de donante amino se hace reaccionar con 70 mM de sustrato de cetona en presencia de una (R)-transaminasa en una mezcla de reacción acuosa tamponada con fosfato de potasio 100 mM (KPi) a pH 7,5 a 28 °C. Opcionalmente, se pueden usar disolventes miscibles con agua o inmiscibles para solubilizar el donante amino o 45 sustrato de cetona. Una transaminasa (R)-selectiva para su uso en esta invención mostrará al menos una baja conversión de al menos el 0,5 % a la (R)-amina enantioméricamente enriquecida deseada a partir de cantidades equimolares de donante amino y el sustrato cetona con (R)-amina enantioméricamente enriquecida que tiene un exceso enantiomérico de al menos el 50 % después de una reacción de una noche a 28 °C. La forma de la (R)

transaminasa no es importante; se puede agregar como una enzima (parcialmente) purificada, extracto libre de células, o extracto celular en bruto; forma líquida, en polvo o inmovilizada; células permeabilizadas, células enteras o caldo de cultivo que contiene células que comprenden la transaminasa o en cualquier otra forma.

5 Es conocido por el experto en la técnica que las reacciones de transaminasa son reacciones reversibles y el grado de conversión está influido por el equilibrio de los sustratos y productos específicos. Adicionalmente se conoce por el experto en la técnica que el grado de conversión de sustrato a concentraciones equimolares de donante de amino y sustrato de cetona pueden aumentarse, por ejemplo, mediante eliminación de producto in situ mediante la evaporación de uno de los productos de reacción o usando resinas, o adición de enzimas que adicionalmente

10 convierten uno de los productos de reacción tal como piruvato descarboxilasa o lactato deshidrogenasa. Adicionalmente se sabe que el grado de conversión del sustrato de cetona 1[a] en el producto de amina 1[c] puede aumentarse por un exceso de donante de amino 1[b].

Preferiblemente, la (R)-amina enantioméricamente enriquecida producida tiene un e.e. de al menos el 50 %. Más

15 preferiblemente, el e.e. es al menos del 60 %. Incluso más preferiblemente, el e.e. es al menos del 70 %. Incluso más preferiblemente, el e.e. es al menos del 80 %. Incluso más preferiblemente, el e.e. es al menos del 90 %. Incluso más preferiblemente, el e.e. es al menos del 95 %. Incluso más preferiblemente, el e.e. es al menos del 96 %. Incluso más preferiblemente, el e.e. es al menos del 97 %. Incluso más preferiblemente, el e.e. es al menos del 98 %. Incluso más preferiblemente, el e.e. es al menos del 99 %. Mucho más preferiblemente, la (R)-amina

20 enantioméricamente enriquecida producida tiene un e.e. de más del 99 %.

En la presente solicitud, "una proteína que tiene al menos el 90 % de identidad de secuencias con la secuencia de aminoácidos de (una secuencia de referencia)" significa que dicha proteína es un homólogo de la secuencia de referencia respectiva que tiene una secuencia de aminoácidos, que es para al menos el 90 % idéntica a la secuencia

25 de aminoácidos de la secuencia de referencia como se determina en alineamientos de secuencias realizados con herramientas de alineamiento de secuencias tales como BLASTP (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast), ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2) o Align Plus 5 (Scientific & Educational Software, Cary, NC, Estados Unidos).

El término "homólogo" se usa en el presente documento en particular para polinucleótidos o polipéptidos que tienen

30 una identidad de secuencias de al menos el 60 %, preferiblemente al menos el 65 %, más preferiblemente al menos el 70 %, más preferiblemente al menos el 75 %, más preferiblemente al menos el 80 %, en particular al menos el 85 %, más en particular al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %. El término homólogo también pretende incluir secuencias de ácidos nucleicos (secuencias de polinucleótidos) que se diferencian de otra

35 secuencia de ácidos nucleicos debido a la degeneración del código genético y codifican la misma secuencia de polipéptidos.

Identidad o similitud de secuencias se define en el presente documento como una relación entre dos o más secuencias de polipéptidos o dos o más secuencias de ácidos nucleicos, como se determina comparando las 40 secuencias. Normalmente, las identidades o similitudes de secuencia se comparan con respecto a la longitud completa de las secuencias, pero sin embargo, también pueden compararse sólo una parte de las secuencias que se alinean entre sí. En la materia, "identidad" o "similitud" también se refiere al grado de vinculación de secuencias entre secuencias de polipéptidos o secuencias de ácidos nucleicos, como pueda ser el caso, como se determina por el apareamiento entre dichas secuencias. Los métodos preferidos para determinar la identidad o similitud se diseñan 45 para dar el mayor apareamiento entre las secuencias ensayadas. En el contexto de esta invención, un método de programa informático preferido para determinar la identidad y similitud entre dos secuencias incluye BLASTP y BLASTN (Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 1990, 215, 403-410, públicamente disponible en NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCBI NLM NIH, Bethesda, MD, USA). Los parámetros preferidos para la comparación de secuencias de polipéptidos usando BLASTP son apertura de huecos 10,0, extensión de huecos 0,5,

50 matriz Blosum 62. Los parámetros preferidos para la comparación de secuencias de ácidos nucleicos usando BLASTN son apertura de huecos 10,0, extensión de huecos 0,5, matriz completa de ADN (matriz de identidad de ADN).

La transaminasa para su uso en esta invención puede usarse de cualquier forma. Por ejemplo, la transaminasa

55 puede usarse - por ejemplo en forma de una dispersión, una solución o en forma inmovilizada - como enzima bruta, como una enzima comercialmente disponible, como una enzima purificada adicionalmente a partir de una preparación comercialmente disponible, como una enzima obtenida de su fuente por una combinación de procedimientos de purificación conocidos, en células completas (opcionalmente permeabilizadas y/o inmovilizadas) que naturalmente o mediante modificación genética poseen la actividad de transaminasa requerida, o en un lisado

de células con tal actividad.

Una célula que comprende una transaminasa en un procedimiento de la invención puede construirse usando técnicas de biología molecular que se conocen en la técnica per se. Por ejemplo, si una transaminasa va a 5 producirse en un sistema heterólogo, tales técnicas pueden usarse para proporcionar un vector que comprende un gen que codifica una transaminasa.

Un gen que codifica un polipéptido con actividad de transaminasa puede adaptarse al uso de codón preferido de la célula huésped usada para la producción del polipéptido para mejorar el nivel de expresión del polipéptido. Un

10 procedimiento adecuado para lograr una adaptación tal es, por ejemplo, la optimización de pares de codones como se describe en el documento WO08000632.

Un vector que comprende un gen tal puede comprender uno o más elementos reguladores, por ejemplo, uno o más promotores, que pueden ligarse operativamente a un gen que codifica una transaminasa. Los ejemplos de tales

15 vectores comprenden plásmidos como pBAD/Myc-HisC, pBAD-DEST49, pET-DEST42 (todos de Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos), plásmidos de las series pET, por ejemplo, pET-26b(+) (Novagen, Nottingham, RU) o pMS470∆8 (Balzer et al., Nucleic Acids Research, 1992, 20 (8): 1851-1858).

Como se usa en el presente documento, el término "operativamente ligado" se refiere a un enlace de elementos de

20 polinucleótido (o secuencias codificantes o secuencia de ácidos nucleicos) en una relación funcional. Una secuencia de ácidos nucleicos está "operativamente ligada" cuando se dispone en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, un promotor o potenciador está operativamente ligado a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia codificante.

25 Como se usa en el presente documento, el término "promotor" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que funciona para controlar la transcripción de uno o más genes, localizados en la dirección 5' con respecto a la dirección de transcripción del sitio de iniciación dé la transcripción del gen, y está estructuralmente identificado por la presencia de un sitio de unión para ARN polimerasa dependiente de ADN, sitios de iniciación de la transcripción y muchas otras secuencias de ADN que incluyen, pero sin limitación, sitios de unión a factor de transcripción, sitios de

30 unión a proteína represora y activadora y cualquier otras secuencias de nucleótidos conocidas para un experto en la materia por actuar directamente o indirectamente para regular la cantidad de transcripción del promotor. Un promotor "constitutivo" es un promotor que es activo bajo la mayoría de las condiciones medioambientales y en desarrollo. Un promotor "inducible" es un promotor que es activo bajo regulación medioambiental y en desarrollo. El término "homólogo" cuando se usa para indicar la relación entre una molécula de ácido nucleico o polipéptido (recombinante)

35 dada y un organismo huésped o célula huésped dada se entiende que significa que en la naturaleza la molécula de ácido nucleico o polipéptido es producida por una célula huésped u organismos de la misma especie, preferentemente de la misma variedad o cepa.

El promotor que podría usarse para lograr la expresión de las secuencias de nucleótidos que codifican una enzima

40 para su uso en un procedimiento de la invención, en particular una transaminasa, tal como se describe en el presente documento anteriormente, puede ser nativo a la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima a expresarse, o puede ser heterólogo a la secuencia de nucleótidos (secuencia codificante) con la que está operativamente ligado. Preferentemente, el promotor es homólogo, es decir, endógeno a la célula huésped.

45 Si se usa un promotor heterólogo (a la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima de interés), el promotor heterólogo puede producir preferentemente un mayor nivel en estado estacionario del transcrito que comprende la secuencia codificante (o puede producir más moléculas de transcrito, es decir, moléculas de ARNm, por unidad de tiempo) que el promotor que es nativo a la secuencia codificante. Los promotores adecuados en este contexto incluyen tanto promotores naturales constitutivos como inducibles, además de promotores manipulados, que son

50 muy conocidos para el experto en la técnica.

Un "promotor constitutivo fuerte" es uno que produce ARNm que va a iniciarse a alta frecuencia en comparación con una célula huésped nativa.

55 Los ejemplos de tales promotores constitutivos fuertes en microorganismos Gram-positivos incluyen SP01-26, SP0115, veg, pyc (promotor de piruvato carboxilasa) y amyE.

Los ejemplos de promotores inducibles en microorganismos Gram-positivos incluyen el promotor Pspac inducible con IPTG, el promotor PxylA inducible con xilosa.

Los ejemplos de promotores constitutivos e inducibles en microorganismos Gram-negativos incluyen, pero sin limitación, tac, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, laclq, T7, T5, T3, gal, trc, ara (PBAD), SP6, λ-PR, y λ-PL.

5 Los ejemplos de promotores constitutivos e inducibles en microorganismos eucariotas tales como levaduras y hongos incluyen, pero sin limitación, el promotor AOX, GAP y TEF.

El término "heterólogo" cuando se usa con respecto a un ácido nucleico (ADN o ARN) o proteína se refiere a un ácido nucleico o proteína que no se produce naturalmente como parte del organismo, célula, genoma o secuencia de 10 ADN o ARN en que el que está presente, o que se encuentra en una célula o localización o localizaciones en el genoma o secuencia de ADN o ARN que se diferencian de los que se encuentran en la naturaleza. Los ácidos nucleicos o proteínas heterólogos no son endógenos a la célula en la que se introducen, pero han sido obtenidos de otra célula o se producen sintéticamente o recombinantemente. Generalmente, aunque no es necesario, tales ácidos nucleicos codifican proteínas que normalmente no son producidas por la célula en la que el ADN se transcribe o

15 expresa. De forma similar, el ARN exógeno codifica proteínas normalmente no expresadas en la célula en la que el ARN exógeno está presente. Los ácidos nucleicos y proteínas heterólogos también pueden denominarse ácidos nucleicos o proteínas extraños. Cualquier ácido nucleico o proteína que un experto en la materia reconocerla como heterólogo o extraño a la célula en la que se expresa está englobado en el presente documento por el término ácido nucleico o proteína heteróloga.

20 La célula huésped o microorganismo puede seleccionarse en particular del grupo de géneros que consiste en Aspergillus, Bacillus, Corynebacterium, Escherichia, Saccharomyces, Pseudomonas, Gluconobacter, Penicillium, y Pichia. En particular, la cepa huésped y, por tanto, la célula huésped adecuada para la producción de una transaminasa, puede seleccionarse del grupo de células huésped de Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus

25 amyloliquefaciens, Corynebacterium glutamicum, Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum, y Pichia pastoris.

Las proteínas que tienen actividad de transaminasa mencionadas anteriormente en n) son producidas por microorganismos presentes en muestras de tierra recogidas de Países Bajos y Alemania. Estos microorganismos se enriquecieron de estas muestras de tierra en un medio de cultivo usando una (R)-amina como única fuente de

30 nitrógeno para el microorganismo para el crecimiento. Para este fin se usaron las seis siguientes (R)-aminas estructuralmente diversas como única fuente de nitrógeno: (R)-2-aminobutano, (R)-3,3-dimetil-2-aminobutano, (R) α-metilbencilamina, (R)-α-etilbencilamina, (R)-1-aminoindano y (R)-1-aminotetralina.

Posterior al enriquecimiento en medio líquido, los microorganismos se aislaron sobre placas de agar que contenían

35 la (R)-amina respectiva como única fuente de nitrógeno, de nuevo se cultivaron cultivos puros en el medio de enriquecimiento líquido respectivo y se usaron para reacciones de transaminasa en sistemas de células completas. Las conversiones y excesos enantioméricos resultantes de las (R)-aminas producidas se monitorizaron por análisis de HPLC o CG.

40 El resultado deseado típico de una reacción catalizada por una transaminasa (R)-selectiva es la formación de una (R)-amina enantioméricamente enriquecida de acuerdo con la fórmula 1[c] de un donante amino y un sustrato de cetona. Los donantes amino adecuados para las reacciones de transaminasas (R)-selectivas comprenden, por ejemplo, MBA racémica o (R)-MBA, 1-aminoindano racémico o (R)-1-aminoindano, 1-aminotetralina racémico o (R)1-aminotetralina, alanina racémica o D-alanina, isopropilamina, bencilamina, sec-butilamina racémica o (R)-sec

45 butilamina (2-aminobutano), β-alanina o ácido racémico o D-3-aminobutírico.

Típicamente se hacen reaccionar 80 mM de donante de amino con 40 mM de sustrato de cetona en presencia de una (R)-transaminasa en una mezcla de reacción acuosa tamponada con fosfato de potasio (KPi) 100 mM a pH 7,5 a 28 °C. Preferentemente, al menos 100 mM de sustrato de cetona se usan en presencia de una (R)-transaminasa en 50 una mezcla de reacción acuosa tamponada con fosfato de potasio 100 mM (KPi) a pH 7,5 a 28 °C. Opcionalmente pueden usarse disolventes miscibles o inmiscibles en agua para solubilizar el donante de amino o sustrato de cetona. Una transaminasa (R)-selectiva según la presente invención presentará al menos baja conversión del 0,5 % en la (R)-amina enantioméricamente enriquecida deseada a partir de cantidades equimolares de donante de amino y sustrato de cetona con la (R)-amina enantioméricamente enriquecida que tiene un exceso enantiomérico de al

55 menos el 50 % después de la reacción durante la noche a 28 °C.

La forma de la (R)-transaminasa no es crítica; se puede añadir como enzima (parcialmente) purificada, extracto libre de células o extracto de células en bruto; forma líquida, en polvo o inmovilizada; células permeabilizadas, células enteras o caldo de cultivo que contienen células que comprenden la transaminasa o en cualquier otra forma.

Es conocido por el experto en la técnica que las reacciones de transaminasa son reacciones reversibles y el grado de conversión está influido por el equilibrio de los sustratos y productos específicos. Adicionalmente se conoce por el experto en la técnica que el grado de conversión de sustrato a concentraciones equimolares de donante de amino y

5 sustrato de cetona pueden aumentarse, por ejemplo, mediante eliminación de producto in situ mediante la evaporación de uno de los productos de reacción o usando resinas, o adición de enzimas que adicionalmente convierten uno de los productos de reacción tal como piruvato descarboxilasa o lactato deshidrogenasa.

Preferiblemente, la (R)-amina enantioméricamente enriquecida producida tiene un e.e. de al menos el 50 %. Más

10 preferiblemente, el e.e. es al menos del 60 %. Incluso más preferiblemente, el e.e. es al menos del 70 %. Incluso más preferiblemente, el e.e. es al menos del 80 %. Incluso más preferiblemente, el e.e. es al menos del 90 %. Incluso más preferiblemente, el e.e. es al menos del 95 %. Incluso más preferiblemente, el e.e. es al menos del 96 %. Incluso más preferiblemente, el e.e. es al menos del 97 %. Mucho más preferiblemente, la (R)-amina enantioméricamente enriquecida producida tiene un e.e. de al menos el 99 %.

15 El resultado final fue una colección de 31 microorganismos, que se caracterizaron como se muestra en la Tabla 1.

Tabla 1. Los depósitos en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ) en Braunschweig, Alemania, se hicieron el 13 de julio de 2010

Código

Microorganismo (nombre científico) Número de depósito de DSMZ

3Na

Rahnella aquatilis DSM 23797

3Kb

Rahnella aquatilis no aplicable

3Ba

Ochrobactrum anthropi no aplicable

3Db

Ochrobactrum anthropi DSM 23793

3H1

Sinorhizobium morelense DSM 23794

5BaB

Curtobacterium pusillum DSM 23787

5BaS

Paecilomyces lilacinus DSM 23771

2A2

Microbacterium ginsengisoli no aplicable

2Ca

Microbacterium ginsengisoli no aplicable

2Cb

Ochrobactrum anthropi no aplicable

2M1

Pseudomonas citronellolis DSM 23795

2Da

Yersinia kristensenii DSM 23792

2K1

Ochrobactrum anthropi no aplicable

6Ab

Ochrobactrum tritici DSM 23786

6Bb

Mycobacterium fortuitum DSM 23789

6I

Achromobacter spanius DSM 23791

6F

Achromobacter spanius no aplicable

1Ea

Achromobacter insolitus DSM 23790

1Ia

Mycobacterium frederiksbergense DSM 23798

1Ib

Mycobacterium sacrum DSM 23785

1Eb

Mycobacterium fluoranthenivorans no aplicable

1A2

Mycobacterium fluoranthenivorans no aplicable

1Nb

Mycobacterium fluoranthenivorans DSM 23796

1Ja

Mycobacterium fluoranthenivorans no aplicable

1A1

Microbacterium ginsengisoli DSM 23784

4D1

Burkholderia sp. no aplicable

4F1

Burkholderia tropica DSM 23799

4Bd

Cosmospora episphaeria DSM 23772

4I

Rahnella aquatilis no aplicable

4Ba

Fusarium oxysporum DSM 23770

4Bc

Microbacterium trichothecenolyticum DSM 23788

20 Para la síntesis de (R)-aminotetralina enantioméricamente enriquecida a partir de tetralona se usa preferentemente el microorganismo Sinorhizobium morelense, Rahnella aquatilis u Ochrobactrum anthropi o una transaminasa obtenible de cualquiera de estas especies. Más preferentemente, el microorganismo Rahnella aquatilis u Ochrobactrum anthropi o una transaminasa obtenible de cualquiera de estas especies. Mucho más preferiblemente

25 se usa el microorganismo Ochrobactrum anthropi o una transaminasa obtenible de esta especie.

Para la síntesis de (R)-aminoindano enantioméricamente enriquecido a partir de indanona se usa preferentemente el microorganismo Paecilomyces lilacinus o Curtobacterium pusillum o una transaminasa obtenible de cualquiera de estas especies. Mucho más preferiblemente se usa el microorganismo Curtobacterium pusillum o una transaminasa

5 obtenible de esta especie.

Para la síntesis de (R)-α-etilbencilamina enantioméricamente enriquecida a partir de propiofenona se usa preferentemente el microorganismo Microbacterium ginsengisoli, Yersinia kristensenii, Pseudomonas citronellolis u Ochrobactrum anthropi o una transaminasa obtenible de cualquiera de estas especies. Más preferentemente se usa

10 el microorganismo Yersinia kristensenii, Pseudomonas citronellolis u Ochrobactrum anthropi o una transaminasa obtenible de cualquiera de estas especies. Incluso más preferiblemente se usa el microorganismo Pseudomonas citronellolis u Ochrobactrum anthropi o una transaminasa obtenible de cualquiera de estas especies. Mucho más preferiblemente se usa el microorganismo Ochrobactrum anthropi o una transaminasa obtenible de esta especie.

15 Para la síntesis de (R)-α-metilbencilamina enantioméricamente enriquecida a partir de acetofenona se usa preferentemente el microorganismo Mycobacterium fortuitum, Ochrobactrum tritici o Achromobacter spanius o una transaminasa obtenible de cualquiera de estas especies. Más preferentemente se usa el microorganismo Ochrobactrum tritici o Achromobacter spanius o una transaminasa obtenible de cualquiera de estas especies. Mucho más preferiblemente se usa el microorganismo Achromobacter spanius o una transaminasa obtenible de esta

20 especie.

Para la síntesis de (R)-3,3-dimetil-2-aminobutano enantioméricamente enriquecido a partir de 3,3-dimetil-2-butanona se usa preferiblemente un microorganismo del género Mycobacterium o una transaminasa obtenible de este género. Más preferiblemente se usa un microorganismo del grupo de Mycobacterium frederiksbergense, Mycobacterium

25 sacrum o Mycobacterium fluoranthenivorans, o una transaminasa obtenible de una de estas especies, respectivamente. Incluso más preferiblemente se usa el microorganismo Microbacterium ginsengisoli o Achromobacter insolitus o una transaminasa obtenible de cualquiera de estas especies. Mucho más preferiblemente se usa el microorganismo Achromobacter insolitus o una transaminasa obtenible de esta especie.

30 Para la síntesis de (R)-2-aminobutano enantioméricamente enriquecido a partir de 2-butanona se usa preferentemente un microorganismo del género Burkholderia o una transaminasa obtenible de este género. Más preferentemente se usa un microorganismo del grupo de Cosmospora episphaeria o Fusarium oxysporum o una transaminasa obtenible de cualquiera de estas especies, respectivamente. Incluso más preferiblemente se usa el microorganismo Microbacterium trichothecenolyticum o una transaminasa obtenible de esta especie. Mucho más

35 preferiblemente se usa un microorganismo del grupo de Burkholderia sp., Burkholderia tropica o Rahnella aquatilis, o una transaminasa obtenible de cualquiera de estas especies, respectivamente.

El reaislamiento de los microorganismos individuales de los conjuntos depositados puede lograrse sembrando diluciones adecuadas de los microorganismos reunidos y volviendo a extender sobre el medio de enriquecimiento

40 selectivo que contiene la (R)-amina respectiva, en la que se han enriquecido originalmente. El volver a extender de forma repetida sobre la (R)-amina respectiva que contiene medio de enriquecimiento selectivo se realiza hasta que sólo se obtienen colonias de morfología uniforme. Posteriormente se realiza la secuenciación de ARNr 16S o ARNr D2-LSU, por ejemplo, usando el sistema MicroSEQ® validado (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA), para identificar de nuevo los microorganismos individuales.

45 Las transaminasas obtenibles de las cepas en la Tabla 1 incluyen enzimas derivadas de secuencias de genes de transaminasa de las cepas en la Tabla 1. Estas secuencias de genes pueden identificarse y aislarse por diversos métodos conocidos para el experto en la técnica, tales como secuenciación del genoma y comparación de secuencias con secuencias de transaminasa conocidas, aislamiento de ADN y usando sondas con secuencias de

50 ADN que tienen un alto grado de identidad (al menos el 80 %) con genes de transaminasa conocidos, purificación de enzimas y secuenciación de enzimas, transformación de ADN derivado de estas cepas en otros organismos huésped y selección para el crecimiento sobre (R)-aminas seguido de secuenciación de ADN, o combinaciones de estos enfoques (Ausubel et al., eds., "Current protocols in molecular biology", Green Publishing and Wiley Interscience, Nueva York 1987).

55 Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un microorganismo depositado que comprende una enzima que tiene actividad (R)-transaminasa del grupo de organismos que consiste en Ochrobactrum anthropi (depositado como DSM 23793), Ochrobactrum tritici (depositado como DSM 23786), Sinorhizobium morelense (depositado como DSM 23794), Curtobacterium pusilllum (depositado como DSM 23787), Paecilomyces lilacinus

(depositado como DSM 23771), Microbacterium ginsengisoli, Microbacterium trichothecenolyticum (depositado como DSM 23788), Pseudomonas citronellolis (depositado como DSM 23795), Yersinia kristensenii (depositado como DSM 23792), Achromobacter insolitus (depositado como DSM 23790), Mycobacterium fortuitum (depositado como DSM 23789), Mycobacterium frederiksbergense (depositado como DSM 23798), Mycobacterium sacrum (depositado

5 como DSM 23785), Mycobacterium fluoranthenivorans (depositado como DSM 23796), Burkholderia sp., Burkholderia tropica (depositado como DSM 23799), Cosmospora episphaeria (depositado como DSM 23772), y Fusarium oxysporum (depositado como DSM 23770).

Por consiguiente, un aspecto adicional de la descripción se refiere a un microorganismo que comprende una enzima

10 que tiene actividad (R)-transaminasa seleccionada del grupo que consiste en Cpu-TA1 [SEQ ID No.30], Cpu-TA2 [SEQ ID No.33], Cpu-TA3 [SEQ ID No.35], Raq-TA2 [SEQ ID No.38], Raq-TA3 [SEQ ID No.40], Asp-TA1 [SEQ ID No.43] y Mgi-TA1 [SEQ ID No. 46] o una proteína que tiene al menos un 90 %, preferiblemente al menos un 91 %, preferiblemente al menos un 92 %, preferiblemente al menos un 93 %, preferiblemente al menos un 94 %, preferiblemente al menos un 95 %, preferiblemente al menos un 96 %, preferiblemente al menos un 97 %,

15 preferiblemente al menos un 98 %, preferiblemente al menos un 99 % de identidad con cualquiera de estas secuencias de aminoácidos.

Por consiguiente, un aspecto adicional se refiere a un polipéptido que tiene actividad (R)-transaminasa y puede obtenerse a partir de un organismo seleccionado del grupo que organismos que consiste en Rahnella aquatilis 20 (depositado como DSM 23797), Ochrobactrum anthropi (depositado como DSM 23793), Ochrobactrum tritici (depositado como DSM 23786), Sinorhizobium morelense (depositado como DSM 23794), Curtobacterium pusilllum (depositado como DSM 23787), Paecilomyces lilacinus (depositado como DSM 23771), Microbacterium ginsengisoli, Microbacterium trichothecenolyticum (depositado como DSM 23788), Pseudomonas citronellolis (depositado como DSM 23795), Yersinia kristensenii (depositado como DSM 23792), Achromobacter spanius (depositado como DSM

25 23791), Achromobacter insolitus (depositado como DSM 23790), Mycobacterium fortuitum (depositado como DSM 23789), Mycobacterium frederiksbergense (depositado como DSM 23798), Mycobacterium sacrum (depositado como DSM 23785), Mycobacterium fluoranthenivorans (depositado como DSM 23796), Burkholderia sp., Burkholderia tropica (depositado como DSM 23799), Cosmospora episphaeria (depositado como DSM 23772), y Fusarium oxysporum (depositado como DSM 23770).

30 Por consiguiente, un aspecto adicional se refiere a un polipéptido que tiene actividad (R)-transaminasa y al menos un 90 %, preferiblemente al menos un 91 %, preferiblemente al menos un 92 %, preferiblemente al menos un 93 %, preferiblemente al menos un 94 %, preferiblemente al menos un 95 %, preferiblemente al menos un 96 %, preferiblemente al menos un 97 %, preferiblemente al menos un 98 %, preferiblemente al menos un 99 % de

35 identidad de secuencia con un polipéptido que tiene actividad (R)-transaminasa y obtenible a partir de organismo seleccionado del grupo que organismos que consisten en Rahnella aquatilis (depositado como DSM 23797), Ochrobactrum anthropi (depositado como DSM 23793), Ochrobactrum tritici (depositado como DSM 23786), Sinorhizobium morelense (depositado como DSM 23794), Curtobacterium pusilllum (depositado como DSM 23787), Paecilomyces lilacinus (depositado como DSM 23771), Microbacterium ginsengisoli, Microbacterium

40 trichothecenolyticum (depositado como DSM 23788), Pseudomonas citronellolis (depositado como DSM 23795), Yersinia kristensenii (depositado como DSM 23792), Achromobacter spanius (depositado como DSM 23791), Achromobacter insolitus (depositado como DSM 23790), Mycobacterium fortuitum (depositado como DSM 23789), Mycobacterium frederiksbergense (depositado como DSM 23798), Mycobacterium sacrum (depositado como DSM 23785), Mycobacterium fluoranthenivorans (depositado como DSM 23796), Burkholderia sp., Burkholderia tropica

45 (depositado como DSM 23799), Cosmospora episphaeria (depositado como DSM 23772), and Fusarium oxysporum(depositado como DSM 23770).

Por consiguiente, un aspecto adicional se refiere a un polipéptido que tiene actividad (R)-transaminasa seleccionada del grupo que consiste en Cpu-TA1 [SEQ ID No.30], Cpu-TA2 [SEQ ID No.33], Cpu-TA3 [SEQ ID No.35], Raq-TA2

50 [SEQ ID No.38], Raq-TA3 [SEQ ID No.40], Asp-TA1 [SEQ ID No.43] y Mgi-TA1 [SEQ ID No. 46] o una proteína que tiene al menos un 90 %, preferiblemente al menos un 91 %, preferiblemente al menos un 92 %, preferiblemente al menos un 93 %, preferiblemente al menos un 94 %, preferiblemente al menos un 95 %, preferiblemente al menos un 96 %, preferiblemente al menos un 97 %, preferiblemente al menos un 98 %, preferiblemente al menos un 99 % de identidad con cualquiera de estas secuencias polipeptídicas.

55 Por consiguiente, un aspecto adicional se refiere a un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que tiene actividad (R)-transaminasa y al menos un 90 %, preferiblemente al menos un 91 %, preferiblemente al menos un 92 %, preferiblemente al menos un 93 %, preferiblemente al menos un 94 %, preferiblemente al menos un 95 %, preferiblemente al menos un 96 %, preferiblemente al menos un 97 %,

preferiblemente al menos un 98 %, preferiblemente al menos un 99 % de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene actividad (R)-transaminasa y obtenible a partir de organismo seleccionado del grupo que organismos que consisten en Rahnella aquatilis (depositado como DSM 23797), Ochrobactrum anthropi (depositado como DSM 23793), Ochrobactrum tritici (depositado como DSM 23786), Sinorhizobium morelense (depositado como DSM 5 23794), Curtobacterium pusilllum (depositado como DSM 23787), Paecilomyces lilacinus (depositado como DSM 23771), Microbacterium ginsengisoli, Microbacterium trichothecenolyticum (depositado como DSM 23788), Pseudomonas citronellolis (depositado como DSM 23795), Yersinia kristensenii (depositado como DSM 23792), Achromobacter spanius (depositado como DSM 23791), Achromobacter insolitus (depositado como DSM 23790), Mycobacterium fortuitum (depositado como DSM 23789), Mycobacterium frederiksbergense (depositado como DSM

10 23798), Mycobacterium sacrum (depositado como DSM 23785), Mycobacterium fluoranthenivorans (depositado como DSM 23796), Burkholderia sp., Burkholderia tropica (depositado como DSM 23799), Cosmospora episphaeria (depositado como DSM 23772), and Fusarium oxysporum(depositado como DSM 23770). Por consiguiente, un aspecto adicional se refiere a un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que tiene actividad (R)-transaminasa seleccionada del grupo que consiste en Cpu-TA1 [SEQ ID No.30],

15 Cpu-TA2 [SEQ ID No.33], Cpu-TA3 [SEQ ID No.35], Raq-TA2 [SEQ ID No.38], Raq-TA3 [SEQ ID No.40], Asp-TA1 [SEQ ID No.43] y Mgi-TA1 [SEQ ID No. 46] o una proteína que tiene al menos un 90 %, preferiblemente al menos un 91 %, preferiblemente al menos un 92 %, preferiblemente al menos un 93 %, preferiblemente al menos un 94 %, preferiblemente al menos un 95 %, preferiblemente al menos un 96 %, preferiblemente al menos un 97 %, preferiblemente al menos un 98 %, preferiblemente al menos un 99 % de identidad con cualquiera de estas

20 secuencias polipeptídicas.

Las enzimas derivadas de secuencias génicas de las cepas en la tabla 1 también incluyen enzimas con identidades de secuencia de al menos un 90 %, preferiblemente al menos un 91 %, preferiblemente al menos un 92 %, preferiblemente al menos un 93 %, preferiblemente al menos un 94 %, preferiblemente al menos un 95 %, 25 preferiblemente al menos un 96 %, preferiblemente al menos un 97 %, preferiblemente al menos un 98 %, preferiblemente al menos un 99 % que se obtienen por mutagénesis de genes obtenidos a partir de cepas en la tabla

1. Los métodos de mutagénesis se conocen por el experto en la técnica e incluyen síntesis de genes, además de procedimientos de mutagénesis usando cebadores mutagénicos (Bloom & Arnold, Proc Natl Acad Sci USA 2009, 106, 9995).

Ejemplos

General

35 Medio de crecimiento microbiano

Medio LB (Luria Bertani)

10 g/l de Triptona Bacto (BD, Le Pont de Claix, Francia)

40 5 g/l de de Extracto de Levadura Bacto Triptona (BD, Le Pont de Claix, Francia) 5 g/l de NaCl (Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemania) 15 g/l de agar Bacto (para medio sólido, BD, Le Pont de Claix, Francia)

Los componentes se disolvieron en agua desmineralizada y, si fue necesario, el pH se ajustó a 7,0. Los medios se

45 esterilizaron en autoclave durante 20 min a 121 °C. Para medios sólidos se añadió agar antes de la esterilización en autoclave. Los antibióticos se añadieron después de que el medio esterilizado en autoclave se hubiera enfriado a 60 °C.

Medio de enriquecimiento selectivo (SEM)

50 10 g/l de base de carbono de levadura Difco (YCB, BD, Sparks, MD, Estados Unidos) Glicerol 55 mM (Merck, Darmstadt, Alemania) Ácido pirúvico 10 mM (Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemania) Sustrato de (R)-amina 5 mM

55 15 g/l de agar noble Difco (BD, Le Pont de Claix, Francia)

Se preparó una solución madre de medio YCB (100 g/l), glicerol 550 mM y ácido pirúvico 100 mM en agua MilliQ (Millipore, Billerica, MA, Estados Unidos) y se esterilizó por filtración a través de filtros estériles de 0,22 µm. Se prepararon medios de enriquecimiento líquido añadiendo un sustrato de (R)-amina seleccionado del grupo (R)-2

aminobutano, (R)-3,3-dimetil-2-aminobutano, (R)-α-metilbencilamina, (R)-α-etilbencilamina, (R)-1-aminoindano y (R)1-aminotetralina a 1:10 con solución madre de medio de enriquecimiento diluida con agua MilliQ estéril. Los medios de enriquecimiento sólidos se prepararon por consiguiente con agua MilliQ esterilizada en autoclave que contenía agar noble para obtener una concentración final de 15 g/l.

5 Antibióticos

Se usó medio LB que contenía carbenicilina o neomicina en concentraciones finales de 100 µg/ml para seleccionar y cultivar cepas de Escherichia coli recombinantes que contenían vectores de expresión que comprenden [SEC IDs

10 No. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26] para mantener los plásmidos. Las soluciones madre (50 mg/ml) de carbenicilina y neomicina se esterilizaron por filtración a través de filtros estériles de 0,22 µm.

Técnicas moleculares y

15 Técnicas genéticas y de biología molecular convencionales son generalmente conocidas en la técnica y se han descrito previamente (Maniatis et al. 1982 "Molecular cloning: a laboratory manual". Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.; Miller 1972 "Experiments in molecular genetics", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor; Sambrook and Russell 2001 "Molecular cloning: a laboratory manual" (3ª edición), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press; F. Ausubel et al, eds., "Current protocols in molecular biology",

20 Green Publishing and Wiley Interscience, Nueva York 1987).

Plasmidos y cepas

Se usaron cepas TOP10 de E. coli (Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos) para todos los procedimientos de

25 clonación. También se usó E. coli para la expresión de proteínas. Para la inducción de expresión génica se usó Larabinosa a una concentración final del 0,02 % (peso/volumen).

Clonación de genes diana

30 Los genes diana de acuerdo con las [SEQ IDs No. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26] se optimizaron por pares de codones de acuerdo con un procedimiento descrito en el documento WO08000632. Se añadieron los sitios attB a todos los genes en la dirección 5' del sitio de unión ribosómico y codón de iniciación y en la dirección 3' del codón de terminación para facilitar la clonación usando la tecnología Gateway (Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos). Se obtuvieron genes sintéticos de Geneart (Regensburg, Alemania). Las construcciones génicas se

35 clonaron en un vector de expresión derivado de pBAD/Myc-HisC (Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos) usando la tecnología Gateway (Invitrogen) mediante los sitios attB introducidos y pDONR201 (Invitrogen) como vector de entrada como se describe en los protocolos del fabricante (www.invitrogen.com). De esta forma se obtuvieron los vectores de expresión pBAD, respectivamente. Las cepas de expresión correspondientes se obtuvieron por transformación de células de E. coli químicamente competentes con los vectores de expresión de pBAD respectivos.

Identificación de plásmidos

Los plásmidos que llevan los diferentes genes se identificaron por medios genéticos, bioquímicos y/o fenotipicos generalmente conocidos en la técnica, tales como resistencia de transformantes a antibióticos, análisis de

45 diagnóstico por PCR de transformante o purificación de ADN de plásmido, análisis de restricción del ADN de plásmido purificado o análisis de secuencias de ADN.

Determinación de concentraciones de proteína en solución

50 Las concentraciones de proteínas en disoluciones tales como extractos libres de células (CFE) se determinaron usando un procedimiento de unión a colorante de proteína modificado como se describe por Bradford in Anal. Biochem. 72: 248-254 (1976). De cada muestra, se incubaron 50 µl en una dilución apropiada se incubaron con 950 µl de reactivo (100 mg de Brilliant Blue G250 disuelto en 46 ml de etanol y 100 ml de ácido orto-fosfórico al 85 %, se llenó hasta 1.000 ml con agua Milli-Q) durante al menos cinco minutos a temperatura ambiente. La absorción de

55 cada muestra a una longitud de onda de 595 nm se midió en un espectrofotómetro de UV/VIS Perkin Elmer Lambda20 o Lambda35. La concentración de proteína en las muestras se calculó usando una recta de calibración determinada con soluciones que contenían concentraciones conocidas de albúmina de suero bovino (BSA, que variaban de 0,0125 mg/ml a 0,20 mg/ml).

Análisis

Análisis de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC)

5 Las cetonas y aminas que contienen grupos aromáticos se analizaron en una columna Prevail C18 de 15 cm. Para la separación y cuantificación de los enantiómeros de α-metilbencilamina, α-etilbencilamina, 2-aminotetralina se usó una columna Crownpak Cr (+) (Daicel) con derivatización postcolumna de las aminas usando o-ftalaldehído más mercaptoetanol y detección con fluorescencia. Para la separación y cuantificación de los enantiómeros de 1aminotetralina y 1-aminoindano se usaron Prevail C18 de 15 cm más columnas Crownpak Cr (+) con derivatización

10 postcolumna de las aminas usando o-ftalaldehído más mercaptoetanol y se usó detección con fluorescencia.

Cromatografía de gases

Las alquilcetonas y alquilaminas tales como 2-butanona, 2-aminobutano, 3,3-dimetil-butanona y 3,3-dimetil-2

15 aminobutano se analizaron en una columna CP-Sil 8 CB (Varian) para columna de aminas usando materiales de referencia comercialmente disponibles (Sigma-Aldrich). Para la separación y cuantificación de las (R)- y (S)alquilaminas se usó una columna Chiralsil-CB (Agilent).

EJEMPLO 1 - Enriquecimiento de microorganismos en (R)-aminas como única fuente de nitrógeno

20 Las muestras de tierra de diversos sitios en Países Bajos y Alemania se suspendieron en tampón fosfato de potasio (KPi) 100 mM a pH 7,0 y se incubaron con agitación a 180 rotaciones por minuto (rpm) y 28 °C durante 1 hora. Las suspensiones se filtraron a través de papel de filtro Whatman. Se usaron 100 µl de filtrado, cada uno, para inocular matraces Erlenmeyer de 100 ml que contenían 10 ml de SEM que contenía una de las seis (R)-aminas

25 seleccionadas del grupo (R)-2-aminobutano, (R) -3,3-dimetil-2-aminobutano, (R)-α-metilbencilamina, (R)-αetilbencilamina, [R)-1-aminoindano y (R)-1-aminotetralina. Los matraces se incubaron con agitación en un agitador orbital a 180 rpm y 28 °C. Cuando el crecimiento microbiano se obtuvo en forma de turbidez significativa del medio de cultivo o "agregados celulares", 100 µl de este medio de cultivo se usaron para inocular SEM que contenía 5 mM de la misma (R)-amina. Después de dos de dichos pases, 100 µl de una dilución 1:100 del último medio de cultivo se

30 sembraron sobre placas de agar de SEM que contenían 5 mM de la (R)-amina correspondiente. Adicionalmente, aproximadamente 10 µl del cultivo sin diluir se extendieron sobre placas de agar de SEM que contenían 5 mM de la (R)-amina correspondiente. Las placas de agar inoculadas se incubaron a 28 °C hasta que se observó el crecimiento. Las colonias con diferente morfología se volvieron a extender sobre placas de SEM frescas para separar diferentes especies microbianas. La extensión continuó hasta que se obtuvieron cultivos puros con

35 morfologías uniformes después de la incubación a 28 °C y almacenamiento a 4 °C.

Los microorganismos seleccionados se enviaron para identificación por MicroSEQ® (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, Estados Unidos) a BaseClear (Leiden, Países Bajos). Las secuencias de ARNr 16S o D2-LSU bacterianos o fúngicos obtenidas se compararon con la base de datos de secuencias MicroSEQ® validada (en BaseClear, Leiden,

40 Países Bajos) y en el caso de que no se obtuviera identidad superior al 99 % se comparó con la base de datos de nucleótidos no redundante (nr) usando el algoritmo BlastN en la página de inicio de NCBI Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Una visión general de los resultados de estos análisis de secuencias se facilita en la Tabla 2.

45 Tabla 2: Identificación de cepas aisladas por enriquecimiento por identificación por MicroSeq

(R)-amina

Aislado Género especie % de coincidencia

1-aminotetralina

3Na Rahnella aquatilis 99,8

1-aminotetralina

3Kb Rahnella aquatilis 99,8

1-aminotetralina

3Ba Ochrobactrum anthropi 100

1-aminotetralina

3Db Ochrobactrum anthropi 100

1-aminotetralina

3H1 Sinorhizobium morelense 100

1-aminoindano

5BaB Curtobacterium pusillum 100

1-aminoindano

5BaS Paecilomyces lilacinus 100

α-etilbencilamina

2A2 Microbacterium ginsengisoli 99,8

α-etilbencilamina

2Ca Microbacterium ginsengisoli 99,8

α-etilbencilamina

2Cb Ochrobactrum anthropi 100

α-etilbencilamina

2M1 Pseudomonas citronellolis 99,0

α-etilbencilamina

2Da Yersinia kristensenii 99,1

α-etilbencilamina

2K1 Ochrobactrum anthropi 100

α-metilbencilamina

6Ab Ochrobactrum tritici 100

α-metilbencilamina

6Bb Mycobacterium fortuitum 99,3

α-metilbencilamina

6I Achromobacter spanius 100

α-metilbencilamina

6F Achromobacter spanius 100

3,3-dimetil-2-aminobutano

1Ea Achromobacter insolitus 99,6

3,3-dimetil-2-aminobutano

1Ia Mycobacterium frederiksbergense 99,4

3,3-dimetil-2-aminobutano

1Ib Mycobacterium sacrum 99,4

3,3-dimetil-2-aminobutano

1Eb Mycobacterium fluoranthenivorans 100

3,3-dimetil-2-aminobutano

1A2 Mycobacterium fluoranthenivorans 99,8

3,3-dimetil-2-aminobutano

1Nb Mycobacterium fluoranthenivorans 100

3,3-dimetil-2-aminobutano

1Ja Mycobacterium fluoranthenivorans 100

3,3-dimetil-2-aminobutano

1A1 Microbacterium ginsengisoli 99,8

2-aminobutano

4D1 Burkholderia sp. 100

2-aminobutano

4F1 Burkholderia tropica 100

2-aminobutano

4Bd Cosmospora episphaeria 99,0

2-aminobutano

4I Rahnella aquatilis 99,8

2-aminobutano

4Ba Fusarium oxysporum 100

2-aminobutano

4Bc Microbacterium trichothecenolyticum 99,8

EJEMPLO - 2 Detección de actividad de (R)-transaminasa en aislados de enriquecimiento

De los cultivos puros de las cepas aisladas por enriquecimiento sobre placas de agar de SEM, se inocularon 25 ml

5 de cultivos de SEM líquidos que contenían 5 mM de la (R)-amina respectiva, en la que los microorganismos se habían enriquecido, y se cultivaron en un agitador orbital a 180 rotaciones por minuto (rpm) y a 28 °C hasta que los cultivos se volvieron turbios. Posteriormente, los cultivos se transfirieron a tubos de centrífuga de 50 ml y se centrifugaron durante 10 min a 50.000x g en el rotor JA-25.50 en la centrífuga Beckman Avanti J-20 XPI (Beckman-Coulter, Woerden, Países Bajos). Los sedimentos de células se resuspendieron en 2 ml de tampón fosfato de

10 potasio (KPi) 100 mM a pH 7,0 que contenía piridoxal 5'-fosfato (PLP) 0,1 mM. Las suspensiones de células se usaron para determinar la actividad de (R)-transaminasa usando 40 mM de donante de amino y sustrato de cetona. Las suspensiones de células de cepas aisladas por enriquecimiento 3Kb, 3Na, 3Ba, 3Db y 3H1 se probaron con (R)α-metilbencilamina 40 mM como donante de amina y 1-tetralona como sustrato de cetona dando acetofenona y 1aminotetralina como productos. Las suspensiones de células de cepas aisladas por enriquecimiento 5BaB y 5BaS se

15 ensayaron con (R)-α-metilbencilamina 40 mM como donante de amina y 1-aminoindano como sustrato de cetona dando acetofenona y 1-aminoindano como productos. Las suspensiones de células de cepas aisladas por enriquecimiento 2A2, 2Ca, 2Cb, 2M1, 2Da y 2K1 se probaron con [R) -α-metilbencilamina 40 mM como donante de amina y propiofenona como sustrato de cetona dando acetofenona y α-etilbencilamina como productos. Las suspensiones de células de cepas aisladas por enriquecimiento 5BaB y 5BaS se ensayaron con (R)-α

20 metilbencilamina 40 mM como donante de amina y 1-aminoindano como sustrato de cetona dando acetofenona y 1aminoindano como productos. Las suspensiones de células de cepas aisladas por enriquecimiento 6Ab, 6Bb, 61 y 6F se ensayaron con bencilamina 40 mM como donante de amina y acetofenona como sustrato de cetona dando benzaldehído y α-metilbencilamina como productos. Las concentraciones y el exceso enantiomérico (e.e.) de los productos de amina formados se determinaron por HPLC como se describe en la parte general. Los resultados de

25 los análisis por HPLC se resumen en la Tabla 3.

Tabla 3: Concentraciones y excesos enantioméricos de (R)-aminas producidas por los microorganismos enriquecidos de donantes de amino y sustratos de cetona.

(R)-amina producida

Aislado Producto amina [g/l] e.e. (R)

1-aminotetralina

3Na 0,31 99

1-aminotetralina

3Kb 0,24 99,6

1-aminotetralina

3Ba 0,40 98

1-aminotetralina

3Db 0,41 99

1-aminotetralina

3H1 0,12 88

1-aminoindano

5BaB 0,17 99,8

1-aminoindano

5BaS 0,17 99,8

α-etilbencilamina

2A2 0,32 95

α-etilbencilamina

2Ca 0,29 98

α-etilbencilamina

2Cb 0,25 98

α-etilbencilamina

2M1 0,33 98

α-etilbencilamina

2Da 0,34 96

α-etilbencilamina

2K1 0,30 98

α-metilbencilamina

6Ab 0,08 94

α-metilbencilamina

6Bb 0,17 64

α-metilbencilamina

6I 0,09 94

α-metilbencilamina

6F 0,10 70

Estos resultados demuestran la presencia de transaminasas con (R)-selectividad de buena a excelente en los microorganismos enriquecidos.

5 EJEMPLO 3 - Expresión de (R)-transaminasas de bases de datos públicas

Los genes optimizados por pares de codones que codifican los polipéptidos de las transaminasas putativas como se resume en la Tabla 4 se clonaron en un vector de expresión derivado de pBAD/Myc-HisC (como se describe en el documento EP1513946) usando la tecnología Gateway (Invitrogen) de acuerdo con los protocolos del fabricante

10 (www.invitrogen.com) como se describe en la parte general.

Tabla 4: Visión general de las secuencias de polipéptidos, nucleótidos y números de acceso

Polipéptido (secuencia de aminoácidos)

Nucleótido (gen optimizado por pares de codones) Número de acceso a la proteína Nombre del plásmido

SEQ ID No. 1

SEQ ID No. 2 XP_001209325 pBADXP_001209325

SEQ ID No. 3

SEQ ID No. 4 XP_002564064 pBADXP_002564064

SEQ ID No. 5

SEQ ID No. 6 EEU44019 pBAD-EEU44019

SEQ ID No. 7

SEQ ID No. 8 XP_001402221 pBADXP_001402221

SEQ ID No. 9

SEQ ID No. 10 YP_761201 pBAD-YP_761201

SEQ ID No. 11

SEQ ID No. 12 YP_838940 pBAD-YP_838940

SEQ ID No. 13

SEQ ID No. 14 YP_955297 pBAD-YP_955297

SEQ ID No. 15

SEQ ID No. 16 EDI73966 pBAD-EDI73966

SEQ ID No. 17

SEQ ID No. 18 NP_085750 pBAD-NP_085750

SEQ ID No. 19

SEQ ID No. 20 EDH25885 pBAD-EDH25885

SEQ ID No. 21

SEQ ID No. 22 EBP64591 pBAD-EBP64591

SEQ ID No. 23

SEQ ID No. 24 ECU93014 pBAD-ECU93014

SEQ ID No. 25

SEQ ID No. 26 YP_366475 pBAD-YP_366475

Adicionalmente, los genes sintéticos optimizados por pares de codones que codifican los polipéptidos L-treonina

15 aldolasa (LTA_SAV, número de acceso Q82N15) de Streptomyces avelmitilis (como control negativo) y (R)transaminasas ABN35871 (secuencia 2 del documento US7169592) y AAN21261 (Secuencia 1 del documento US6413752) se ordenaron y clonaron como se ha descrito anteriormente. Después de la transformación de células TOP10 de E. coli competentes y siembra sobre placas de LB-agar selectivo que contenían 100 µg/ml de antibiótico se obtuvieron las cepas pBAD de E. coli recombinantes respectivas como se facilita en la Tabla 4. 5 ml de

20 precultivos de LB más 50 µg/ml de precultivos de antibiótico se inocularon con las placas de agar respectivas y se cultivaron durante la noche a 28 °C y 180 rpm en un agitador orbital. A partir de dichos precultivos, los cultivos de expresión se inocularon en matraces Erlenmeyer que contenían 50 - 100 ml de LB más 50 µg/ml de antibiótico a una densidad de células inicial de OD620 = 0,05. Estos cultivos se incubaron a 28 °C y 180 rpm en un agitador orbital. En la mitad de la fase de crecimiento exponencial (OD620 de aproximadamente 0,6), la expresión de los genes diana se

25 indujo mediante la adición de 0,02 % (peso/volumen) de L-arabinosa a los matraces de cultivo. Después de la inducción, el cultivo continuó a 28 °C y 180 rpm en un agitador orbital durante la noche (aproximadamente 20 h). Posteriormente, las células se recogieron por centrifugación a 5.000x g durante 10 min a 4 °C. El sobrenadante se desechó y las células se resuspendieron y se pesaron. Los sedimentos de células se resuspendieron en dos veces el volumen del peso húmedo de tampón KPi 50 mM frío en hielo a pH 7,5 que contenía PLP 0,1 mM. Los extractos

30 libres de células (CFE) se obtuvieron por sonicación de las suspensiones de células usando un sonicador Vibra-Cell VCX130 de Sonics (Meirin/Satigny, Suiza) (salida 100 %, 10 s encendido/10 s apagado, durante 10 min) con enfriamiento en un baño de hielo/acetona y centrifugación en una centrífuga 5415R Eppendorf (Hamburgo,

Alemania) a 13.000x g y 4 °C durante 30 min. Los sobrenadantes (= CFE) se transfirieron a tubos frescos y se guardaron sobre hielo para uso inmediato o se guardaron a -20 °C. Las concentraciones de proteína en los CFE se determinaron usando un procedimiento modificado según Bradford como se describe en la parte general.

5 EJEMPLO 4 - (i) Resolución racémica de (RS)-α-metilbencilamina

Los extractos libres de células (CFE) con transaminasas expresadas en E. coli de forma heteróloga XP_001209325 y EDH25885 se probaron para determinar la actividad de (R)-transaminasa y se compraron con CFE que contenían L-treonina aldolasa expresada en E. coli de forma heteróloga (LTA_SAV, número de acceso Q82N15) a partir de 10 Streptomyces avelmitilis (como control negativo), y (R)-transaminasas ABN35871 (Secuencia 2 del documento US7169592) y AAN21261 (Secuencia 1 del documento EP987332) en la resolución racémica de (RS)-αmetilbencilamina. En un volumen de reacción total de 0,25 ml, se mezclaron 0,1 ml de los CFE con (RS) -αmetilbencilamina (MBA) 80 mM, piruvato de sodio 40 mM en tampón KPi 100 mM que contiene PLP 0,1 mM y se incubaron a 28 °C durante 20 h. Las reacciones se detuvieron mediante la adición de 0,9 ml de reactivo de parada

15 (50 % (v/v) de acetonitrilo en H2O que contenía ácido fórmico al 0,1 % (v/v)) a 0,1 ml de volumen de reacción y se analizaron por HPLC sobre una fase quiral como se describe en la parte general. Los resultados de los análisis de HPLC se dan en la Tabla 5.

Tabla 5: Concentración y e.e. de α-MBA en reacciones de transaminasa

Enzima

% de e.e. (S)-α-MBA (S)-α-MBA [g/l] (R)-α-MBA [g/l]

ABN35871

63 0,5 0,1

AAN21261

22 0,5 0,3

EDH25885

10 0,5 0,4

XP_001209325

>99 0,5 <0,01

LTA_SAV

<2 0,5 0,5

20 Estos resultados muestran que XP_001209325 es una (R)-transaminasa muy eficaz y selectiva, debido a que convirtió selectivamente toda la (R)-α-MBA, pero no (S)-α-MBA. Otras (R)-transaminasas como ABN35871 o AAN21261 también fueron selectivas, pero a productividades claramente inferiores produciendo menores e.e. en la resolución racémica de (RS)-α-MBA. EDH25885 también presentó baja actividad de (R)-transaminasa selectiva en

25 (RS)-α-MBA.

EJEMPLO 5 - Síntesis de (R)-aminas enriquecidas enantioméricamente

En un volumen final de 0,25 µl tamponados con fosfato de potasio (KPi) 100 mM a pH 7,5 se hicieron reaccionar

30 cantidades equimolares de 70 mM de donante de amino y 70 mM de sustrato de cetona en presencia de 0,1 ml de CFE de una transaminasa a 28 °C durante 24 h. El CFE que comprende transaminasas XP_001209325, AAN21261 y ABN35871, respectivamente, se incubó con bencilacetona y α-metilbencilamina dando 4-fenil-2-butilamina y acetofenona; propiofenona y α-metilbencilamina dando α-etilbencilamina y acetofenona; 1-indanona y αmetilbencilamina dando 1-aminoindano y acetofenona; 1-tetralona y α-metilbencilamina dando 1-aminotetralina y

35 acetofenona; 2-tetralona y α-metilbencilamina dando 2-aminotetralina y acetofenona; butanona y α-metilbencilamina dando 2-aminobutano y acetofenona; y 3,3-dimetil-2-butanona y α-metilbencilamina dando 3,3-dimetil-2aminobutano y acetofenona, respectivamente. Las reacciones se detuvieron mediante adición de 0,75 ml de reactivo de parada (50 % (v/v) de acetonitrilo en H2O que contenía 0,1 % (v/v) de ácido fórmico) a 0,25 ml de volumen de reacción. Las concentraciones de producto y excesos enantioméricos se analizaron por HPLC como se describe en

40 la parte general. Los resultados de los análisis de HPLC se dan en la Tabla 6.

Tabla 6: Concentraciones de productos de amina y e.e. con transaminasa XP_001209325 en comparación con transaminasas AAN21261 y ABN35871. n.d.: no determinado

Producto de (R)-amina

XP_001209325 AAN21261 ABN35871

amina [mM]

e.e. [%] amina [mM] e.e. [%] amina [mM] e.e. [%]

4-fenil-2-butilamina

16,0 n.d. <0,1 n.d. <0,1 n.d.

2-aminobutano

6,2 69 0,9 n.d. 6,9 -27

3,3-dimetil-butilamina

0,7 50 0,3 n.d. 6,4 97

1-aminoindano

<0,1 n.d. <0,1 n.d. <0,1 n.d.

α-etilbencilamina

1,7 99 7,9 99 2,3 99

1-aminotetralina

<0,1 n.d. <0,1 n.d. <0,1 n.d.

2-aminotetralina

0,4 96 0,7 61 0,3 97

Adicionalmente, el CFE que comprende la transaminasa YP_955297 se incubó con propiofenona y αmetilbencilamina dando α-etilbencilamina y acetofenona. La reacción se detuvo mediante adición de 0,75 ml de reactivo de parada (50 % (v/v) de acetonitrilo en H2O que contenía 0,1 % (v/v) de ácido fórmico) a 0,25 ml de

5 volumen de reacción. La concentración de producto y el exceso enantiomérico se analizaron por HPLC como se describe en la parte general. Después de 24 h de incubación a 28 °C se obtuvieron 0,87 mmol/l de (R)-αetilbencilamina con un e.e. del 99 %.

Los resultados anteriores muestran que las transaminasas XP_001209325 e YP_955297 son (R)-transaminasas

10 altamente selectivas. Adicionalmente es evidente que XP_001209325 tiene un espectro de sustrato diferente que las transaminasas AAN21261 y ABN35871: 4-fenil-2-butilamina se formó en concentraciones significativas por XP_001209325, pero no por las transaminasas AAN21261 y ABN35871 (Tabla 6). Adicionalmente, XP_001209325 produjo (R)-2-aminobutano enantioméricamente enriquecido a partir de 2-butanona, mientras que ABN35871 liberó (S)-2-aminobutano enantioméricamente enriquecido (Tabla 6).

15 EJEMPLO 6 - Selectividad de (R)-transaminasas por α-metilbencilaminas quirales

Para examinar la enantioselectividad de (R)-transaminasas, se probaron en la conversión de las formas de enantiómeros puros de α-metilbencilamina (MBA). Los extractos libres de células que contenían transaminasas

20 como se prepararon en el EJEMPLO 3 se probaron por separado en su actividad por (R)-MBA y (S)-MBA, respectivamente, con piruvato como sustrato de cetona en un ensayo espectrofotométrico en un espectrofotómetro de UV/VIS Perkin Elmer Lambda35 termostatizado a 30 °C a una longitud de onda de 300 nm.

En un volumen final de reacción de 1 ml, se mezclaron 50 µl de una dilución adecuada de un CFE que contenía

25 transaminasa en cubetas UV de plástico desechables o de cuarzo con (R) o (S)-MBA 12,5 mM y piruvato de sodio 5 mM en presencia de tampón KPi 50 mM a pH 7,5 que contenía PLP 0,1 mM. Las reacciones se iniciaron mediante la adición de 10 µl de piruvato de sodio 0,5 M (en tampón KPi 50 mM a pH 7,5, PLP 0,1 mM) a los otros componentes de ensayo que habían sido previamente incubados en el fotómetro a 30 °C durante 5 min. Después de la adición de piruvato de sodio, se registró la absorción a 300 nm y la actividad de transaminasa en las muestras (CFE) se calculó

30 según la ley de Lambert-Beer con un coeficiente de extinción molar para acetofenona de ε = 0,28 cm2/µmol. Una unidad (U) de actividad transaminasa se define como 1 μmol de acetofenona formada a partir de (R)-MBA o (S)-MBA 12,5 mM y piruvato sódico 5 mM a 30 °C en tampón KPi 50 mM a pH 7,5 que contiene PLP 0,1 mM por minuto. Las actividades de transaminasa específicas de los CFE (U/mg de proteína de CFE total) se calcularon dividiendo los valores de la actividad volumétrica (U/ml de CFE) entre la concentración total de proteína como se determina según

35 los procedimientos generales. La relación de actividades de transaminasa especifica en (R) con respecto a (S)-MBA se define como el valor de enantioselectividad de transaminasa (TEV). Una transaminasa (R)-selectiva se define como una transaminasa con un valor TEV de >1. Una buena (R)-selectividad se define como una relación de actividad específica en (R) sobre (S)-MBA de TEV ≥5. Una alta (R)-selectividad se define como una relación de actividad específica en (R) sobre (S)-MBA de TEV ≥10. Las actividades específicas de las transaminasas en los CFE

40 en (R) y (S)-MBA y los TEV como se determinan en estos experimentos se facilitan en la Tabla 7.

Tabla 7: Actividades de transaminasa especifica en (R) y (S)-MBA y TEV

Transaminasa

Actividad de (R)-MBA Actividad de (S)-MBA TEV

[mU/mg]

[mU/mg]

XP_001209325

559 38 15

XP_002564064

12 0,9 13

YP_761201

32 7,2 4

YP_955297

210 26 8

NP_085750

4,6 0,6 8

EBP64591

18 13 1,3

EDI73966

15 14 1,1

ABN35871

1111 20 56

AAN21261

578 39 15

Como es evidente a partir de este experimento, las transaminasas XP_001209325, XP_002564064, YP_761201,

45 YP_955297, NP_085750, EBP64591, y EDI73966 son transaminasas (R)-selectivas como son las transaminasas ABN35871 y AAN21261. Las transaminasas YP_955297 y NP_085750 presentaron buena (R)-selectividad con TEV superiores a 5, mientras que XP_001209325 y XP_002564064 incluso mostraron alta (R)-selectividad con TEV

superiores a 10.

EJEMPLO 7 - Re-aislamiento de microorganismos de depósitos reunidos

5 El re-aislamiento de los microorganismos individuales del depósito reunido se logra sembrando 1:1000, 1:10.000 y otras diluciones del depósito reunido sobre placas de agar de medio de enriquecimiento selectivo (SEM) que contenían una de las seis (R)-aminas como única fuente de nitrógeno como se describe en la parte general y el EJEMPLO 1. Se obtienen cultivos puros volviendo a extender repetidamente sobre las placas de agar de SEM que contienen la (R)-amina respectiva, en la que se han enriquecido originalmente. El volver a extender de forma

10 repetida sobre la (R)-amina respectiva que contiene medio de enriquecimiento selectivo se realiza hasta que sólo se obtienen colonias de morfología uniforme. Posteriormente se realiza la secuenciación de ARNr 16S o ARNr D2-LSU usando el sistema MicroSEQ® validado (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA), para identificar de nuevo los microorganismos individuales.

15 EJEMPLO 8 - Transaminación enzimática de fenoxiacetona

Extracto libre de células con (R) -transaminasa XP_001209325 heterólogamente expresada en E. coli [SEC ID No. 1] (2 U/ml) como se produce y se ensaya como en el EJEMPLO 3 y EJEMPLO 6 se incubó con 0,1 M de sustrato de cetona fenoxiacetona y 0,5 M del donante de amino isopropilamina, (RS)-2-butilamina (eficazmente (R)-2-butilamina

20 0,25 M) y (RS)-α-metilbencilamina (eficazmente (R)-MBA 0,25 M), respectivamente, en tampón KPi 50 mM a pH 7,5 que contenía PLP 0,1 mM a 30 °C durante 24 h. La cantidad de 1-fenoxi-2-propilamina formada se midió por análisis de HPLC. Las condiciones de HPLC fueron del siguiente modo:

50 µl de mezcla de reacción se añadieron a 950 µl de una mezcla 50:50 de acetonitrilo/agua con ácido 25 fórmico al 0,01 % (v/v) y se centrifugaron durante 5 min a 13.000 rpm.

Condiciones de HPLC:

Columna: Purospher Star RP C18 (250 x 4,0, 5 µm)

30 Eluyente A: ácido fórmico al 0,01 % en agua Eluyente B: Acetonitrilo Flujo: 0,8 ml/min Temperatura de columna: 30 °C Volumen de inyección: 4 µl

35 Detección: UV 210 nm (o 254 nm)

Los resultados de estos experimentos se dan en la tabla 8.

Tabla 8: Conversión de fenoxiacetona en 1-fenoxi-2-propilamina catalizada por la (R)-transaminasa XP_001209325 40 [SEQ ID No.1]

Donante

Conversión de cetona 1-Fenoxi-2-propilamina

[%]

[mol/l] [% en peso]

2-butilamina

64 0,064 1,0

MBA

32 0,032 0,5

isopropilamina

31 0,031 0,5

2-butilamina y MBA son donantes de amino eficazmente mejores que la isopropilamina para la (R)-transaminasa selectiva XP_001209325 [SEC ID No. 1] ya que la presente concentración de (R)-2-butilamina y (R)-MBA son 0,25 M en comparación con 0,5 M del donante de amino aquiral isopropilamina. Por lo tanto, se obtienen conversiones

45 comparables o incluso mejores con los donantes de amino 2-butilamina y MBA, respectivamente, a concentraciones de donante de amino relativamente menores en comparación con el donante de amino isopropilamina. Se obtuvieron concentraciones de producto incluso altas del 1,0 % en peso (con 2-butilamina como donante de amino).

EJEMPLO 9 - Transaminación de bencilacetona en presencia de una segunda fase de disolvente orgánico

El extracto libre de células con (R)-transaminasa XP_001209325 heterólogamente expresada en E. coli [SEC ID No. 1] (2 U/ml) según se produce y se ensaya como en el EJEMPLO 3 y EJEMPLO 6 se incubó con 0,1 M de sustrato de cetona bencilacetona y 0,25 M del donante de amino (RS)-α-metilbencilamina en tampón KPi 50 mM a pH 7,5 que contenía PLP 0,5 mM a 30 °C durante 24 h. Las reacciones se realizaron en presencia y ausencia de 15 % (v/v) del

disolvente orgánico no miscible en agua ciclohexano. La cantidad de 4-fenil-2-propilamina formada y el exceso enantiomérico (e.e.) de las reacciones se midieron por análisis de HPLC como se describe en el EJEMPLO 8. La determinación de los excesos enantioméricos se realizó por análisis de HPLC sobre una fase estacionaria quiral del siguiente modo:

5 20 µl de la mezcla de reacción se mezclaron con 50 µl de disolución de reactivo de Marfey (1 % en p/v de N-α-[2,4-dinitrofenil-5-fluorofenil] -L-alanina-amida en acetona) y 10 µl de disolución saturada de NaHCO3. Después de la incubación de la mezcla a 40 °C durante 1 hora se añadieron 10 µl de HCl 2 N y 920 µl de acetonitrilo y la muestra se centrifugó durante 5 min antes de la inyección.

Condiciones de HPLC:

Columna: Purospher Star RP C18 (250 x 4,0, 5 µm) Eluyente A: ácido fórmico al 0,01 % en agua

15 Eluyente B: Acetonitrilo Flujo: 1 ml/min Temperatura de columna: 30 °C Volumen de inyección: 2 µl Detección: UV 338,1 nm

20 50/50 isocrático de eluyente A/eluyente B

Los resultados de estos experimentos se dan en la tabla 9.

Tabla 9: Conversión y e.e. de (R)-4-fenil-2-propilamina formada por XP_001209325 [SEQ ID No.1] d bencilacetona 25 en presencia y ausencia del disolvente orgánico no miscible en agua ciclohexano

Condición

Conversión en 4-fenil-2-propilamina [%] e.e. (R)-4-fenil-2-propilamina [%]

sin disolvente orgánico

32 >99,9

ciclohexano al 15 % (v/v)

22 >99,9

Estos resultados muestran que la (R)-transaminasa selectiva XP_001209325 [SEC ID No. 1] tolera bien la presencia del disolvente orgánico no miscible en agua ciclohexano y que su presencia no afecta la enantioselectividad de la reacción enzimática.

30 EJEMPLO 10 - (R)-Transaminasas recombinantes de genomas de los microorganismos enriquecidos

De las seis cepas, que se enriquecieron sobre medios selectivos para su actividad de (R)-transaminasa selectiva (EJEMPLO 1 y 2), ADN genómico de 3 Kb de Rahnella aquatilis, 1A1 DSM 23784 de Microbacterium ginsengisoli, 35 3H1 DSM 23794 de Sinorhizobium morelense, 5BaB DSM 23787 de Curtobacterium pusillum, 1Ia DSM 23798 de Mycobacterium frederiksbergense y 61 DSM 2 37 91 de Achromobacter spanius se aisló con el kit Easy-DNA (Invitrogen) según el manual del fabricante y finalmente se eluyó con tampón TE. La calidad del ADN se comprobó fotométricamente, además de por digestión con Bspl43I o BamHI (Fermentas, St. Leon-Rot) seguido de electroforesis en gel de agarosa. Las muestras de ADN genómico aisladas de este modo de 3 Kb de Rahnella

40 aquatilis, 1A1 DSM 23784 de Microbacterium ginsengisoli, 5BaB DSM 23787 de Curtobacterium pusillum, 61 DSM 23791 de Achromobacter spanius y 1A1 DSM 23784 de Microbacterium ginsengisoli se usaron para la secuenciación del genoma.

Estas secuencias genómicas se cargaron a un servidor y se realizaron búsquedas con BLAST por comparación con

45 las secuencias de (R)-transaminasa conocidas SEC ID No. 1 y por comparación con los éxitos encontrados en uno de los genomas. Se identificaron varios éxitos con diferente grado de similitud y se eligieron para la posterior clonación de NdeI/HindIII en pMS470∆8 (Balzer et al., Nucleic Acids Research, 1992, 20 (8): 1851-1858) y expresión en E. coli. Tres de los genes no pudieron amplificarse por PCR y uno contuvo Ndel y HindIII en la secuencia nativa y, por tanto, Asp-TAl, Cpu-TAl, Cpu-TA3 Raq-TA2 y Mgi-TAl se optimizaron por codones ordenados para determinar la

50 expresión en E. coli a partir de tecnologías Geneart/life (Regensburg, Alemania).

Tabla 10: Identidad por búsqueda con BLAST con la (R)-transaminasa de SEC ID No. 1

proteína

Organismo de origen SEQ ID No. Identidad de secuencia para SEQ ID No.1

Cpu-TA1

Curtobacterium pusillum 5BaB DSM 23787 30 26 %

Cpu-TA2

Curtobacterium pusillum 5BaB DSM 23787 33 32 %

Cpu-TA3

Curtobacterium pusillum 5BaB DSM 23787 35 27 %

Raq-TA2

Rahnella aquatilis 3Kb 38 27 %

Raq-TA3

Rahnella aquatilis 3Kb 40 22 %

Asp-TA1

Achromobacter spanius 61 DSM 23791 43 27 %

Mgi-TA1

Micro bacterium ginsengisoli 1A1 DSM 23784 46 24 %

Los 6 genes diana se expresaron en TOP10F' de E. coli en medio LB complementado con ampicilina (100 µg/ml) después de la inducción con IPTG 0,5 mM a 25 °C durante la noche. Como control sirvió un cultivo de TOP10F' de

E. coli que contenía un vector pMS470 sin un gen de transaminasa insertado. Las células se recogieron y se usaron

5 por sonicación en tampón KPi 50 mM a pH 7,5 que contenía PLP 0,1 mM y se centrifugaron. Los usados se concentraron usando concentradores VivaSpin (Sartorius, Viena, Austria). Las concentraciones de proteína de los usados se determinaron por el ensayo de proteínas de Bradford.

Todos los lisados se probaron en reacciones de transaminación usando las aminas en bruto correspondientes en las

10 que el microorganismo donante se había enriquecido como un donante y piruvato como un aceptor. Se usó un exceso de cinco veces de una amina racémica o enantiopura (50 mM) con respecto a ácido pirúvico (10 mM) en tampón KPi 50 mM a pH 7,5 que contenía PLP 0,1 mM a 30 °C durante 24 h. En las reacciones con Mgi-TAl, 10 mM de ácido pirúvico y 10 mM de donante de amino MBA o 1-aminotetralina, respectivamente, se aplicaron en tampón KPi 50 mM a pH 7,5 que contenía PLP 0,1 mM a 30 °C durante 19 h. La formación de la cetona correspondiente se

15 detectó en HPLC como se ha descrito en los EJEMPLOS 8 y 9. La selectividad de las nuevas transaminasas se determinó por la formación de L o D-alanina y la reactividad de diferentes enantiómeros de las aminas respectivas. Las nuevas transaminasas Cpu-TA1 [SEQ ID No.30], Cpu-TA2 [SEQ ID No.33], Cpu-TA3 [SEQ ID No.35], Raq-TA2 [SEQ ID No.38], Raq-TA3 [SEQ ID No.40], Asp-TA1 [SEQ ID No.43], y Mgi-TA1 [SEQ ID No. 46] mostraron (R)selectividad (Tabla 11). Cpu-TA2 también se probó con MBA y alanina como donantes de amino y fenoxiacetona y

20 acetofenona como cetonas aceptoras, respectivamente. Los productos de amina de estas dos reacciones fueron (R)1-fenoxi-2-propilamina y (R)-MBA enantioméricamente enriquecidas, respectivamente (Tabla 11).

Estos resultados muestran que las nuevas transaminasas Cpu-TA1 [SEQ ID No. 30], Cpu-TA2 [SEQ ID No. 33], Cpu-TA3 [SEQ ID No. 35], Raq-TA2 [SEQ ID No. 38], Raq-TA3 [SEQ ID No. 40], Asp-TA1 [SEQ ID No. 43] y Mgi

25 TA1 [SEQ ID No. 46] son de hecho transaminasas (R)-selectivas.

Tabla 11: Reacciones de transaminación catalizadas por nuevas transaminasas y sus selectividades.

Enzima

Donante amino Aceptor cetona Conversión en cetona [%] Producto Selectividad del producto

Asp-TA1

MBA Piruvato 1,5 alanina (R) (= D)

Cpu-TA1

1-aminoindano Piruvato 89,0 alanina (R) (= D)

(R)-1aminoindano

Piruvato 96,7 alanina (R) (= D)

Cpu-TA2

1-aminoindano Piruvato 15,4 alanina (R) (= D)

MBA

Fenoxiacetona 1,1 1-fenoxi-2propilamina (R)

alanina

Acetofenona 1,3 MBA (R)

Cpu-TA3

1-aminoindano Piruvato 26,6 alanina (R) (= D)

(R)-1aminoindano

Piruvato 17,4 alanina (R) (= D)

Raq-TA2

1aminotetralina Piruvato 19,2 alanina (R) (= D)

(R)-1aminotetralina

Piruvato 17,9 alanina (R) (= D)

Raq-TA3

1aminotetralina Piruvato 17,0 alanina (R) (= D)

(R)-1aminotetralina

Piruvato 62,5 alanina (R) (= D)

(S)-1aminotetralina

Piruvato 6,5 alanina (R) (= D)

Mgi-TA1

MBA Piruvato 21,0 alanina (R) (= D)

1-

Piruvato 34,0 alanina (R) (= D)

aminotetralina

vector pMS sin inserción de transaminasa (- control)

MBA Piruvato 0,6

EJEMPLO 11 - Síntesis de 4-fenil-2-propilamina a partir de bencilacetona y (R)-α-metilbencilamina en presencia de disolvente orgánico no miscible en agua

5 Extracto libre de células con (R)-transaminasa XP_001209325 [SEC ID N° 1] heterólogamente expresada en E. coli como se produce y se ensaya como en el EJEMPLO 3 y EJEMPLO 6 se incubó con 0,08 M del donante de amino (R)-α-metilbencilamina (MBA) y un exceso de 1,5 veces el sustrato de cetona bencilacetona (0,12 M) en tampón KPi 50 mM a pH 7,5 que contenía PLP 0,1 mM a 28 °C durante 20 h. Las reacciones se realizaron en presencia y ausencia de 10 % (v/v) del disolvente orgánico no miscible en agua ciclohexano. La cantidad de 4-fenil-2-propilamina

10 formada se midió por análisis de HPLC como se describe en la parte general.

Sin adición de ciclohexanona se formó 4-fenil-2-propilamina 42,8 mM, mientras que con el 10 % (v/v) de ciclohexanona se formó una concentración incluso mayor de 4-fenil-2-propilamina 44,3 mM a partir de bencilacetona con (R)-MBA como donante de amino.

15 EJEMPLO 12 - Síntesis enzimática de (R)-sec-butilamina a partir de (R)-α-metilbencilamina

Las transaminasas XP_001209325 [SEQ ID No. 1], XP_002564064 [SEQ ID No. 3], EEU44019 [SEQ ID No. 5], XP_001402221 [SEQ ID No. 7], YP_761201 [SEQ ID No. 9], YP_838940 [SEQ ID No. 11], YP_955297 [SEQ ID No. 20 13], EDI73966 [SEQ ID No. 15], NP_085750 [SEQ ID No. 17], EDH25885 [SEQ ID No. 19], EBP64591 [SEQ ID No. 21], y ECU93014 [SEQ ID No. 23], así como ABN35871 y AAN21261 se produjeron como se ha descrito en el EJEMPLO 3. Los extractos libres de células que contenían las transaminasas heterólogamente expresadas se hicieron reaccionar con butanona 25 mM y (R)-α-metilbencilamina 50 mM a 28 °C con agitación a 400 rpm durante 24 h en tampón KPi 100 mM a pH 7,5 que contenía PLP 0,1 mM en un volumen total de 1 ml. Después de 20 h, las

25 reacciones se inactivaron mediante la adición de una muestra de 100 µl de cada reacción a 50 µl de disolución de 2hexanona y 850 µl de acetonitrilo y centrifugación durante 10 min a 3000 x g. Las muestras se analizaron por detección CG-FID sobre CpSil 8 para columna de aminas (30 m x 0,25 x 0,5) usando MBA comercial, acetofenona, butanona y sec-butilamina como referencia (Sigma-Aldrich). Los resultados se resumen en la Tabla 12.

30 Tabla 12: Concentración de sec-butilamina en mM formada a partir de (R)-MBA y butanona después de 24 h usando las transaminasas respectivas

Transaminasa

sec-Butilamina [mM]

ABN35871

0,99

AAN21261

7,96

YP_955297

1,52

YP_838940

0,45

XP_001209325

15,74

EBP64591

0,06

EDI73966

0,42

XP_002564064 b

0,63

YP_761201

0,42

EEU44019 b

0,23

XP_001402221

0,71

NP_085750 b

0,08

EJEMPLO 13 - Síntesis enzimática de (R)-3,3-dimetil-2-butilamina a partir de (R)-MBA y 3,3-dimetil-butanona

35 Los extractos libres de células que contenían las transaminasas XP_001209325 [SEQ ID No. 1], YP_955297 [SEQ ID No. 13], ABN35871 y AAN21261 heterólogamente expresadas producidas como se describe en el EJEMPLO 3 se hicieron reaccionar con 3,3-dimetil-butanona 25 mM y (R)-α-metilbencilamina 50 mM a 28 °C con agitación a 400 rpm durante 24 h en tampón KPi 100 mM a pH 7,5 que contenía PLP 0,1 mM en un volumen total de 1 ml. Después de 20 h, las reacciones se inactivaron mediante la adición de una muestra de 100 µl de cada reacción a 50 µl de

40 disolución de 2-hexanona y 850 µl de acetonitrilo y centrifugación durante 10 min a 3000 x g. Las muestras se analizaron por detección CG-FID sobre CpSil 8 para columna de aminas (30 m x 0,25 x 0,5) usando MBA comercial,

acetofenona, butanona y sec-butilamina como referencia (Sigma-Aldrich). Los resultados se resumen en la Tabla 13.

Tabla 13: Concentración de sec-butilamina en mM formada a partir de (R)-MBA y 3,3-dimetil-butanona después de 24 h usando las transaminasas respectivas

Transaminasa

3,3-dimetil-2-butilamina [mM]

ABN35871

0,00

AAN21261

3,28

YP_955297

0,34

XP_001209325

1,49

LISTA DE SECUENCIAS

<110> DSM IP Assets B.V. 10 <120> Aminación R-selectiva

<130> 27644-PCT

<150> EP10169573.2 15 <151>

<160> 46

<170> PatentIn versión 3.3 20

<210> 1

<211> 325

<212> PRT

<213> Aspergillus terreus 25

<400> 1

<210> 2

<211> 978 5 <212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia optimizada por codón que codifica la SEQ ID 1 10

<400> 2

<210> 3

<211> 319

<212> PRT

<213> Penicillium chrysogenum

<400> 3

<210> 4

<211> 960 5 <212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia optimizada por codón que codifica la SEQ ID 3 10

<400> 4

<210> 5

<211> 320

<212> PRT

<213> Nectria haematococca

<400> 5

<210> 6

<211> 963 5 <212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia optimizada por codón que codifica la SEQ ID 5 10

<400> 6

<210> 7

<211> 327

<212> PRT

<213> Aspergillus niger

<400> 7

<210> 8

<211> 984

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia optimizada por codón que codifica la SEQ ID 7

<210> 9

<211> 321

<212> PRT

<213> Hyphomonas neptunium

<400> 9

<210> 10

<211> 966

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia optimizada por codón que codifica la SEQ ID 9

<400> 10

<210> 11

<211> 317

<212> PRT

<213> Burkholderia cenocepacia 15

<400> 11

<210> 12

<211> 954 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia optimizada por codón que codifica la SEQ ID 11 10

<400> 12

<210> 13

<211> 337

<212> PRT

<213> Mycobacterium vanbaalenii

<400> 13

<210> 14

<211> 1014 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia optimizada por codón que codifica la SEQ ID NO 13 10

<400> 14

<210> 15

<211> 305

<212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Organismo aislado del suelo

<400> 15

<210> 16

<211> 915 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia optimizada por codón que codifica la SEQ ID NO 15 10

<400> 16

<210> 17

<211> 291

<212> PRT

<213> Mesorhizobium loti

<400> 17

<210> 18

<211> 876 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia optimizada por codón que codifica la SEQ ID NO 17 10

<400> 18

<210> 19

<211> 299 5 <212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Organismo aislado del suelo 10

<400> 19

<210> 20

<211> 900 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia optimizada por codón que codifica la SEQ ID NO 19 10

<400> 20

<210> 21

<211> 299 5 <212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Organismo aislado del suelo 10

<400> 21

<210> 22

<211> 900 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia optimizada por codón que codifica la SEQ ID NO 21 10

<400> 22

<210> 23

<211> 326 5 <212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Organismo aislado del suelo 10

<400> 23

<210> 24

<211> 981 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia optimizada por codón que codifica la SEQ ID NO 23 10

<400> 24

<210> 25

<211> 326

<212> PRT

<213> Burkholderia sp. 383

<400> 25

<210> 26

<211> 981 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia optimizada por codón que codifica la SEQ ID NO 25 10

<400> 26

<210> 27

<211> 283

<212> PRT

<213> Bacillus sp. YM-1

<400> 27

<210> 28

<211> 852 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia optimizada por codón que codifica la SEQ ID NO 27 10

<400> 28

<210> 29

<211> 918 5 <212> ADN

<213> Curtobacterium pusillum

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(918)

<400> 29

<210> 30

<211> 305

<212> PRT

<213> Curtobacterium pusillum

<400> 30

<210> 31

<211> 918 5 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Secuencia optimizada por codón que codifica la SEQ ID NO 30 10

<400> 31

<210> 32 15 <211> 1131

<212> ADN

<213> Curtobacterium pusillum

<220> 20 <221> CDS

<222> (1)..(1131)

<400> 32

<210> 33

<211> 376

<212> PRT

<213> Curtobacterium pusillum

<400> 33

<210> 34

<211> 795 5 <212> ADN

<213> Curtobacterium pusillum

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(795)

<400> 34

<210> 35

<211> 264

<212> PRT

<213> Curtobacterium pusillum

<400> 35

<210> 36

<211> 795 5 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Secuencia optimizada por codón de la SEQ ID NO 35 10

<400> 36

<210> 37

<211> 930 5 <212> ADN

<213> Rahnella aquatilis

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(930)

<400> 37

<210> 38

<211> 309

<212> PRT

<213> Rahnella aquatilis

<400> 38

<210> 39

<211> 930

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Secuencia optimizada por codón que codifica la SEQ ID NO 38

<400> 39

<210> 40

<211> 798

<212> ADN 15 <213> Rahnella aquatilis

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(798) 20

<400> 40

<210> 41

<211> 265

<212> PRT

<213> Rahnella aquatilis

<400> 41

<210> 42

<211> 867 5 <212> ADN

<213> Achromobacter spanius

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(867)

<400> 42

<210> 43

<211> 288

<212> PRT

<213> Achromobacter spanius

<400> 43

<210> 44

<211> 867 5 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Secuencia optimizada por codón que codifica la SEQ ID NO 43 10

<400> 44 <210> 45

<211> 885 5 <212> ADN

<213> Microbacterium ginsengisoli

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(885)

<400> 45

<210> 46

<211> 294

<212> PRT

<213> Microbacterium ginsengisoli

<400> 46

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un método para la síntesis enzimática de una (R)-amina enriquecida enantioméricamente de fórmula general [1][c]

   a partir de la cetona correspondiente de la fórmula general [1][a]

   y un donante amino adecuado, en el que R1 y R2 son diferentes y son independientemente alifáticos lineales o ramificados, aromáticos, heteroaromáticos o forman una estructura cíclica, usando una transaminasa seleccionada del grupo que consiste en

   a.

   una proteína que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 1;

   b.

   una proteína que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 3;

   20 c. una proteína que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 5;

   d. una proteína que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 7;

   e. una proteína que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID 25 No. 9;

   f.

   una proteína que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 11;

   g.

   una proteína que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 13;

   30 h. una proteína que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 15;

   i. una proteína que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 17;

   j. una proteína que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 35 19;

   k.

   una proteína que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 21;

   l.

   una proteína que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 23;

   40 m. una proteína que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 25, y

   n. una proteína que tiene actividad de transaminasa y que puede obtenerse a partir de un organismo seleccionado del grupo que organismos que consiste en Rahnella aquatilis, Ochrobactrum anthropi, Ochrobactrum tritici, Sinorhizobium morelense, Curtobacterium pusilllum, Paecilomyces lilacinus, 45 Microbacterium ginsengisoli, Microbacterium trichothecenolyticum, Pseudomonas citronellolis, Yersinia kristensenii, Achromobacter spanius, Achromobacter insolitus, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium frederiksbergense, Mycobacterium sacrum, Mycobacterium fluoranthenivorans, Burkholderia sp., Burkholderia tropica, Cosmospora episphaeria, y Fusarium oxysporum, con la condición de que las proteínas que se han mencionado anteriormente (es decir, la alternativa (a)) no consistan en una secuencia

   50 de aminoácidos idéntica a las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID no. 3 del documento WO2011/026556.

2. 2.

   Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que R1 y R2 contienen independientemente de 1 a 30 átomos de carbono y R1 y R2 son alifáticos independientemente sustituidos o no sustituidos; alifáticos ramificados sustituidos o sin sustituir; alifáticos cíclicos sustituidos o sin sustituir; alifáticos heterocíclicos sustituidos o sin sustituir, que contienen al menos un átomo de oxígeno, azufre o nitrógeno; aromáticos sustituidos o sin sustituir; heteroaromáticos sustituidos o sin sustituir que contienen al menos un átomo de azufre, o nitrógeno; o juntos forman una estructura cíclica o una estructura heterocíclica sustituida o sin sustituir, que contiene al menos un átomo de oxígeno, azufre o nitrógeno; en donde los sustituyentes se seleccionan del grupo que consiste en, pero sin limitación, un átomo de halógeno, un grupo alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, grupo hidroxilo, grupo metoxi, monofluorometilo, difluorometilo y trifluorometilo.

3. 3.

   Un método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, caracterizado por que la concentración final del producto de (R)-amina enantioméricamente enriquecida se encuentra entre el 1 y el 50 % en peso de la mezcla de reacción.

4. 4.

   Un método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la transaminasa es una proteína que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 1.

5. 5.

   Un método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el donante amino es α-metilbencilamina.

6. 6.

   Un método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el donante amino es sec-butilamina.

7. 7.

   Un método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, caracterizado por que la concentración final del producto de (R)-amina enantioméricamente enriquecida se encuentra entre el 5 y el 35 % en peso de la mezcla de reacción.

8. 8.

   Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la mezcla de reacción comprende una fase acuosa y una segunda fase orgánica.

9. 9.

   Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la mezcla de reacción comprende una fase acuosa y la segunda fase orgánica, y la relación volumétrica del agua:fase orgánica está entre 100 y 0,01.

10. 10.

    Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la mezcla de reacción comprende una fase acuosa y la segunda fase orgánica, y la relación volumétrica del agua:fase orgánica está entre 20 y 0,1.

11. 11.

    Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la mezcla de reacción comprende una fase acuosa y la segunda fase orgánica, y la relación volumétrica del agua:fase orgánica está entre 20 y 1.

12. 12.

    Un microorganismo depositado que comprende una enzcima que tiene actividad (R)-transaminasa del grupo que organismos que consisten en Ochrobactrum anthropi (depositado como DSM 23793), Ochrobactrum tritici (depositado como DSM 23786), Sinorhizobium morelense (depositado como DSM 23794), Curtobacterium pusilllum (depositado como DSM 23787), Paecilomyces lilacinus (depositado como DSM 23771), Microbacterium ginsengisoli (depositado como DSM 23784), Microbacterium trichothecenolyticum(depositado como DSM 23788), Pseudomonas citronellolis (depositado como DSM 23795), Yersinia kristensenii (depositado como DSM 23792), Achromobacter insolitus (depositado como DSM 23790), Mycobacterium fortuitum (depositado como DSM 23789), Mycobacterium frederiksbergense (depositado como DSM 23798), Mycobacterium sacrum (depositado como DSM 23785), Mycobacterium fluoranthenivorans (depositado como DSM 23796), Burkholderia tropica (depositado como DSM 23799), Cosmospora episphaeria (depositado como DSM 23772), y Fusarium oxysporum (depositado como DSM 23770).