BR102015012461A2 - microrganismo recombinante e método para produzir uma substância com uso do mesmo - Google Patents

Abstract

microrganismo recombinante e método para produzir uma substância com uso do mesmo. a presente invenção refere-se a um microrganismo recombinante no qual uma acil-coa redutase que exibe atividade excelente em uma reação de redução com uso de acil-coa como um substrato foi introduzida. tal microrganismo recombinante compreende um ácido nucléico que codifica uma acil-coa redutase que compreende qualquer uma dentre as sequências comuns de característica 1 a 3 introduzidas em um microrganismo hospedeiro.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "Ml- CRORGANISMO RECOMBINANTE E MÉTODO PARA PRODUZIR UMA SUBSTÂNCIA COM USO DO MESMO".

CAMPO TÉCNICO [0001] A presente invenção refere-se a um microrganismo recom- binante no qual um gene associado à produção de uma substância alvo foi introduzido e um método para produzir uma substância com uso de tal microrganismo recombinante.

TÉCNICA ANTERIOR [0002] Os microrganismos com capacidade para sintetizar um al- deído, um álcool ou um hidrocarboneto tais como alcano, alceno ou alcino, são conhecidos. O documento n- JP 2011-520455 A descreve um gene sintase de alcano e um gene de sintase de aldeído derivados de Synechococcus elongatus e também descreve um método para produzir um alcano ou um aldeído com uso de tais genes. [0003] O documento n- JP 2002-223788 A descreve a produção de um álcool com uso de uma planta transformada na qual o gene acil redutase foi introduzido e, como um substrato, um grupo acila alifático ligado à CoA e/ou ACP. Embora o documento n2 JP 2002-223788 A descreva que o gene acil redutase é isolado das algas verdes, o mes- mo não descreve que uma planta transformada é produzida atualmen- te. [0004] Além disso, o documento n2 JP 2013-528057 A descreve que a acil-CoA redutase alifática derivada de Clostridium kluyveri é preparada e transformada em uma cepa de E. coli junta mente com ou- tro gene de síntese associada de lipídio. [0005] Além disso, o documento n2 JP 2012-506715 A descreve um método para produzir um álcool alifático que compreende a ex- pressão de um gene que codifica um polipeptídeo biossintético de al- deído alifático que reduz o ácido carboxílico em um aldeído ou uma variante do mesmo em um hospedeiro, de modo a sintetizar um aldeí- do alifático e produzir um álcool a partir de um aldeído alifático. [0006] Além disso, o documento n- JP 2011-512848 A descreve um método para modificar geneticamente os microrganismos com ca- pacidade para produzir um álcool primário com uso de uma via meta- bólica de FAS independente de malonil-CoA e uma via metabólica de redução de acila. [0007] Além disso, o documento n- JP 2010-528627 A descreve um método para produzir um componente de óleo introduzindo-se ge- nes associados à produção de gordura e óleo em microalgas de Chlo- rella. [0008] O documento ng JP 2012-511928 A descreve microrganis- mos nos quais os ácidos nucléicos que codificam as enzimas de via de isopropanol tal como succinil-CoA:3-cetoácido-CoA transferase foram introduzidos e um método para produzir o isopropanol com uso de tais microrganismos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

OBJETIVOS A SEREM ALCANÇADOS PELA INVENÇÃO [0009] Não há conhecimento de acil-CoA redutases que exercem atividade excelente em microrganismos, e a produtividade tem sido desvantajosamente baixa em relação a um aldeído gerado através da redução da acil-CoA alifática como um substrato ou um álcool ou um hidrocarboneto gerado a partir desse aldeído como um substrato. [0010] Mediante as circunstâncias acima, é um objetivo da presen- te invenção fornecer um microrganismo recombinante no qual uma acil-CoA redutase que exerce atividade excelente em uma reação de redução com uso da acil-CoA como um substrato foi introduzida e é outro objetivo da presente invenção fornecer um método para produzir uma substância com uso de tal microrganismo recombinante.

MEIOS PARA ALCANÇAR OS OBJETIVOS [0011] Os presentes inventores conduziram estudos concentrados a fim de alcançar os objetivos acima. Como resultado, os mesmos constataram que um grupo de acil-CoA redutases que tem sequências de aminoácidos similares é altamente ativo em microrganismos. Isso levou à conclusão da presente invenção. (1) Um microrganismo recombinante que compreende um ácido nu- cléico que codifica uma acil-CoA redutase que compreende sequên- cias comuns que incluem as sequências de aminoácidos a seguir: GxGxxxFLxxKxxxxxGxTGFLxKVxl EKILRT xPxVxKxxxxl KAxxxxxAxxR- LxxxxxxxxxFxxLxxxxGxxYxxFxxxKLxPxxGxxxxxxxGxxxxxxxxxAxxV- DxxxNSAANTTFxERYDxAxxxNTxGxxxxMxxAxxxxxLKLFLxxSTAY- VNGQxQGxxxExPF (SEQ ID NO: 1), [26- 57 aa] G LxRAxxxG W Q DTYVFTKAM G E M xxxxxRxxxP VxxxRP S VIE ST xx xPFPGWMEGxRMMDPxxLxYGKGQLxGFxxDPxGVxDVVPAD- M VVN ATLAxxAxH G (SEQ ID NO: 2), [9- 18aa]YxxxSSxxNPLxFxxLxxxxxxHxxxxPxxDxxGxPlxVxxM (SEQ ID NO:3), and [39-48aa] VxQxxxLxxlYxPYTFxxGRFDNxNxxxLxxx- MxxxExxxFxFDVxxxxWxDYIxNVHIPGLxxxVxKG (SEQ ID NO: 4) in- troduzidas em um microrganismo hospedeiro. (2) O microrganismo recombinante de acordo com (1), em que as se- quências comuns incluem as sequências de aminoácidos a seguir: G(l/L)G(l/V)xxFLx(G/A)Kx(F/L)x(l/V)(T/S)G(A/G)TGFL(A/G)KV(L/F)IEKI LRTxP(D/N)V(G/N)K(l/M)(Y/F)x(L/V)IKA(K/E)xx(E/Q/D)(AA/)AxxRLx(N/ l/K)(E/D)(l/V)(l/V/L)(N/D)(A/T)(E/Q/D)(V/L/l)Fx(0/G/R)L(Q/R/K)x(A/l/V/ T)(Y/H)G(K/N/E)(S/D/Y/G)Y(Q/H/M/S/D)xF(M/V/l/A)(L/A/l)(S/A/R/N/K)K L(V/l)P(V/l)(A/L/V)Gx(V/l)(C/R)(G/E/D)x(S/N/D)(L/l/V)Gxxx(D/G/E)x(A/ S)xx(l/M)Ax(E/R/D/Q)VD(V/l)(l/F/V)(V/l)NSAANTTF(D/H)ERYD(l/T/V)A

x(D/N)(l/V)NTxG(P/T)x(H/R/N)(L/l)Mx(F/l)A(K/H/Q)x(C/F)x(K/R/N)LKLF L(Q/H)(V/l)STAYVNGQ(R/K/T)QG(R/V/L)(l/V)(M/L)E(K/R)PFxx(G/E)(D/ E/L)x(l/V)(A/R/E/l)x(E/D) (SEQ ID NO: 5), [17- 48aa]GL(E/Q)RAxxxGWQDTYVFTKAMGEM(V/M)(l/V)(D/N)x(M/L)R(G/ D)(E/D)(l/L/V)PV(V/A)x(l/M)RPSVIESTxx(E/D)PFPGWMEG(N/S)RMM

DP(l/V)(V/l)L(Y/0/W)YGKGQL(T/S)GF(V/L)(A/V)DP(N/Y/E/D)GV(L/l)D VVPADMVVNATLA(A/S)(M/I)A(R/K/W)HG (SEQ ID NO: 6), [8- 17 aa] (V/l) Y (Q/H )x(A/T /S )SS(V/T /A)(V/A)N PL( l/V/D/A)Fx( D/R/E )Lx(S/R/ D/K/T)(H/L/M/F)(F/L)xxHxx(S/R/G)(S/0)PxxDxxG(N/R/Q/T)PIxV(P/S)x M(K/R/S)(L/F)(F/L)x(S/T)(T/l/M/V/S)(E/D)x(F/L)(S/A)x(H/Y)(L/V/l)(W/E)( R/l )(D/Y)(A/V)xx(R/K)(S/R/C/A) (SEQ ID NO: 7), e [18- 26aa](K/R)(S/T)V(K/E)Q(A/T/L)(K/T/V)(Y/H)L(A/G)xlYxPYTF(Y/F)(G/P/ N)GRFDN(S/G)N(T/V)(Q/E)xL(M/L/I/F)xxM(0/S/T)(E/A/K/V/P)(E/K/A/N) E(K/R)xxFxFDVx(S/N/G)(l/L/V)(D/E)WxDYI(S/T)NVHIPGL(R/K)(R/K)(H /Y)V(M/L)KG (SEQ ID NO: 8). (3) O microrganismo recombinante de acordo com (1), em que a acil- CoA redutase é uma proteína (a) ou (b) abaixo: [0012] (a) uma proteína que compreende a sequência de aminoá- cido conforme mostrado em qualquer uma dentre as SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 e 36 ou [0013] (b) uma proteína que compreende uma sequência de ami- noácido que tem 70% ou mais de identidade com a sequência de ami- noácido conforme mostrado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 e 36 e que tem atividade de uma acil-CoA redutase. (4) O microrganismo recombinante de acordo com (1), em que as se- quências comuns incluem as sequências de aminoácidos a seguir: MDAGSLVLSQNGKSQA(E/D)I(L/V)VKDLVPY(D/G)G(P/T)T (SEQ ID NO: 9)[0-2aa]TLIG(V/L)ED (SEQ ID NO: 10), [0- 1aa]GIGIVKFL(G/R)GKKFFITGATGFLAKV(F/L)IEKILRTEPDVGKMY( L/I)LIKAKN(K/N)Q(A/V)AMERLQ(N/K)EIINT(E/Q)LFRCL(Q/R)(E/Q)IH

GKSYQAFMLSKLVP(V/I)VG(N/D)ICE(H/T)NLGLDE(G/D)(I/L)S(D/N)VI

A(E/D)EVDV(I/F)VNSAANTTFDERYDTAININT(I/R)GP(Q/S)RLM(N/A)I AKKCKKLKLFLHVSTAY- VNGQ(R/K)QGRIMERPFSIG(E/D)CIAREK(YL)IS(E/G)V(S/P)PKYLPT LDIE(G/N)EIN(L/M)V(S/L)(N/K)(Y/N)KG(D/N) [0014] (SEQ ID NO: 11) e [0- 1aa]IE(D/E)NLL(A/T)QKM(K/R)E(l/M)GLERA(R/K)RYGWQDTYVFTKA MGEMMID- KLR(G/D)DIPVV(V/I)(M/I)RPSVIEST(F/L)SEPFPGWMEGNRMMDP(I/ V)VL(C/W)YGKGQLTGFLVDPNGVLDVVPADMVVNATLAAMA(R/K)H

G(V/M)(S/N/I)QK(P/A)DINVYQIASSVVNPL(V/A)FQDL(A/T)RLLYEHYS

SSP(C/F)IDS(K/M)GRPIQVP(L/I)MK(L/F)FSS(T/S)EEFSGHLWRD(A/V

)I(Q/N)K(R/S)G(L/I)T(A/S)(V/M)ASSK(G/A)KMSQKLEN(M/I)CRKSVEQ

AKYLA(N/K)IVEPYTFYGGRFDNSNTQRLME(S/I)MSE(K/E)EK(R/T)EF (G/D)FDVK(S/G)IDW(N/T)DYITNVHIPGLRR(H/Y)VMKGRGM(G/S)(S/ N)Q (SEQ ID NO: 12). (5) O microrganismo recombinante de acordo com (1), em que a acil- CoA redutase é a proteína (a) ou (b) abaixo: [0015] (a) uma proteína que compreende a sequência de aminoá- cido conforme mostrado em qualquer uma dentre as SEQ ID NOs: 14, 16 e 18 ou [0016] (b) uma proteína que compreende uma sequência de ami- noácido que tem 70% ou mais de identidade com a sequência de ami- noácido conforme mostrado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 14, 16 e 18 e que tem atividade de uma acil-CoA redutase. (6) O microrganismo recombinante de acordo com (1), em que o mi- crorganismo hospedeiro é selecionado a partir do grupo que consiste em Escherichia coli, Corynebacterium e levedura. (7) O microrganismo recombinante de acordo com (1), que tem ativi- dade de aldeído descarbonilase para sintetizar um hidrocarboneto com uso de um aldeído como um substrato. (8) O microrganismo recombinante de acordo com (1), em que o mi- crorganismo hospedeiro compreende um ácido nucléico que codifica um aldeído descarbonilase que sintetiza um hidrocarboneto com uso de um aldeído como um substrato. (9) O microrganismo recombinante de acordo com (1), que produz um hidrocarboneto que compreende uma cadeia carbônica de 13 a 15 átomos de carbono. (10) Um microrganismo recombinante que compreende um ácido nu- cléico que codifica uma proteína (a) ou (b) abaixo introduzida em um microrganismo hospedeiro: [0017] (a) uma proteína que compreende a sequência de aminoá- cido conforme mostrado em qualquer uma dentre as SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 e 36 ou [0018] (b) uma proteína que compreende uma sequência de ami- noácido que tem 70% ou mais de identidade com a sequência de ami- noácido conforme mostrado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 e 36 e que tem atividade de uma acil-CoA redutase. (11) 0 microrganismo recombinante de acordo com (10), em que o mi- crorganismo hospedeiro é selecionado a partir do grupo que consiste em Escherichia coli, Corynebacterium e levedura. (12) O microrganismo recombinante de acordo com (10), que tem ati- vidade de aldeído descarbonilase para sintetizar um hidrocarboneto com uso de um aldeído como um substrato. (13) O microrganismo recombinante de acordo com (10), em que o mi- crorganismo hospedeiro compreende um ácido nucléico que codifica um aldeído descarbonilase que sintetiza um hidrocarboneto com uso de um aldeído como um substrato. (14) O microrganismo recombinante de acordo com (10), que produz um hidrocarboneto que compreende uma cadeia carbônica de 13 a 15 átomos de carbono. (15) Um método para produzir uma substância que compreende uma etapa de cultivar o microrganismo recombinante de acordo com qual- quer um dentre (1) a (14) em um meio que contém uma fonte de car- bono e uma etapa de recuperar uma substância alvo do microrganis- mo recombinante cultivado. (16) O método para produzir uma substância de acordo com (15), em que a substância alvo é pelo menos um membro selecionado a partir do grupo que consiste em um aldeído alifático, um álcool alifático e um hidrocarboneto.

EFEITOS DA INVENÇÃO [0019] O microrganismo recombinante de acordo com a presente invenção expressa uma acil-CoA redutase que exerce atividade exce- lente em uma reação de redução de uma acil-CoA alifática como um substrato. Consequentemente, tal microrganismo recombinante é ex- celente em termos de produtividade de um aldeído alifático causado pela redução de uma acil-CoA alifática com o auxílio da acil-CoA redu- tase, um álcool alifático convertido a partir do aldeído alifático e um hidrocarboneto. [0020] De acordo com o método para produzir uma substância da presente invenção, um microrganismo recombinante que é excelente em termos de produtividade de um aldeído alifático causado pela re- dução de uma acil-CoA alifática com o auxílio da acil-CoA redutase, um álcool alifático convertido a partir do aldeído alifático e um hidro- carboneto é usado. Desse modo, a produtividade de substâncias, que incluem um aldeído alifático, um álcool alifático e um hidrocarboneto, pode ser consideravelmente aprimorada.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0021] A Fig. 1 mostra um dendrograma preparado com uso de ClustalW com base nas informações de sequência de aminoácido em relação a uma acil-CoA redutase com nível alto de atividade para sin- tetizar um aldeído com uso de acil-CoA como um substrato. [0022] A Fig. 2-1 mostra os resultados de análises de alinhamento múltiplo das proteínas incluídas no dendrograma mostrado na Fig. 1. [0023] A Fig. 2-2 é uma continuação da Fig. 2-1, que mostra os resultados de análises de alinhamento múltiplo das proteínas incluídas no dendrograma mostrado na Fig. 1. [0024] A Fig. 2-3 é uma continuação da Fig. 2-2, que mostra os resultados de análises de alinhamento múltiplo das proteínas incluídas no dendrograma mostrado na Fig. 1. [0025] A Fig. 3 mostra os resultados de análises de alinhamento múltiplo de uma proteína que tem atividade superior de acil-CoA redu- tase dentre as proteínas incluídas no dendrograma mostrado na Fig. 1. [0026] A Fig. 4 mostra esquematicamente um vetor de expressão que contém o gene acil-CoA redutase e um vetor de expressão que contém o gene aldeído descarbonilase. [0027] A Fig. 5 mostra um diagrama de característica que mostra os resultados da análise de GC/MS quantitativa de tridecano e penta- decano das cepas de Escherichia coli recombinantes preparadas no exemplo. [0028] A Fig. 6 mostra um diagrama de característica que mostra os resultados da análise de GC/MS quantitativa de tetradecanol e he- xadecanol das cepas de Escherichia coli recombinantes preparadas no exemplo. [0029] A Fig. 7 mostra um diagrama de característica que mostra um gráfico que demonstra os resultados da análise GC/MS das cepas de Escherichia coli recombinantes preparadas no exemplo (isto é, a cepa de Gm2).

MODALIDADES PARA EXECUTAR A INVENÇÃO [0030] Posteriormente, a presente invenção está descrita em mais detalhes com referência aos desenhos e aos exemplos. [0031] O microrganismo recombinante, de acordo com a presente invenção, compreende um ácido nucléico que codifica uma acil-CoA redutase que tem as sequências comuns particulares introduzidas no mesmo. O microrganismo recombinante, de acordo com a presente invenção, expressa a acil-CoA redutase para reduzir, desse modo, a acil-CoA (é ocasionalmente referenciado como "acil-CoA alifática"), que é um composto tioéster de um ácido alifático com CoA e produz um composto de aldeído com elevada eficiência. O composto de alde- ído produzido é oxidado na reação metabólica dentro do microrganis- mo e convertido em um álcool ou é usado como um substrato para sín- tese de hidrocarboneto por uma enzima que tem atividade de sinteti- zação de hidrocarboneto. Desse modo, o microrganismo recombinan- te, de acordo com a presente invenção, não tem apenas capacidade para produzir um aldeído com elevada eficiência, mas também tem capacidade para produzir um álcool e/ou hidrocarboneto a partir de tal composto de aldeído com elevada eficiência, através da expressão da acil-CoA redutase. [0032] O termo "ácido nucléico" se refere a um ácido nucléico exis- tente na natureza, tal como DNA ou RNA, ou um ácido nucléico artifi- cial, tal como uma molécula de ácido nucléico que resulta da modifica- ção química para PNA (ácido nucléico peptídico), um nucleotídeo, um açúcar ou uma porção química de diéster de fosfato. O termo "um áci- do nucléico que codifica uma acil-CoA redutase" refere-se tanto a uma região que compreende uma região regulatória de expressão e uma região de codificação no genoma e uma região que consiste em uma região de codificação no genoma. [0033] A acil-CoA é sintetizada a partir de um açúcar como resul- tado da reação metabólica em um microrganismo hospedeiro. Um açúcar é uma substância representada por uma fórmula química Cn(H20)m. Os exemplos do mesmo incluem um aldeído de um álcool poliídrico, um derivado de cetona de um álcool poliídrico e derivados e condensados de substâncias relacionados aos mesmos e os exemplos específicos incluem polissacarídeos, oligossacarídeos, dissacarídeos e monossacarídeos. Os exemplos específicos de monossacarídeos in- cluem glicose, frutose, galactose, manose, xilose, xilulose, ribose, eri- trose, treose, eritrulose, gliceraldeído e di-hidroxiacetona. Os exemplos específicos de dissacarídeos incluem sacarose, lactose, maltose, trea- lose e celobiose. ÍAcil-CoA redutasel [0034] Um exemplo de uma sequência comum na acil-CoA redu- tase descrita acima é a sequência de aminoácido conhecida abaixo: [0035] GxGxxxF LxxKxxxxxG xTG F LxKVx IE KIL RT x- PxVxKxxxxlKAxxxxxAxxRLxxxxxxxxxFxxLxxxxGxxYxxFxxxKLxPxx- GxxxxxxxGxxxxxxxxxAxxVDxxxNSAANTTFxERYDxAxxxNTxGxxxx- MxxAxxxxxLKLFLxxSTAYVNGQxQGxxxExPF(26- 57aa)GLxRAxxxGWQDTYVFTKAMGEMxxxxxRxxxPVxxxRPSVIESTxx xPFPGWMEGxRMMDPxxLxYGKGQLxGFxxDPxGVxDVVPAD- M VVN ATL AxxAxH G (9- 18aa)YxxxSSxxNPI_xFxxl_xxxxxxHxxxxPxxDxxGxPlxVxxM(39- 48aa)VxQxxxLxxlYxPYTFxxGRFDNxNxxxLxxxMxxxExxxFxFDVxxxxW xDYIxNVHIPGLxxxVxKG (Sequência comum 1). [0036] Na sequência de aminoácido acima, "x" representa um resí- duo de aminoácido arbitrário. Na sequência de aminoácido acima, uma notação composta de dois números separados por um hífen (-) e "aa" indica uma região que compreende um número arbitrário de interven- ção de resíduos de aminoácido entre tais dois números. Nessa descri- ção, as sequências de aminoácidos são representadas da maneira descrita acima. [0037] Em outras palavras, a sequência de aminoácido de Se- quência comum 1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, uma região de 26 a 57 de resíduos de aminoácido arbitrários, a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2, uma região de 9 a 18 de resíduos de aminoácido arbitrários, a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3, uma região de 39 a 48 de resíduos de aminoácido arbi- trários e a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4 ligadas naquela ordem do N terminal para o C terminal. [0038] A sequência comum 1 é determinada da maneira descrita abaixo. Isto é, uma acil-CoA redutase que tem nível alto de atividade para sintetizar um composto de aldeído com uso de acil-CoA como um substrato é identificada a partir diversos tipos de acil-CoA redutases, um dendrograma é preparado com uso de ClustalW com base nas in- formações de sequência de aminoácido em relação ao grupo identifi- cado de acil-CoA redutases (Fig. 1), um alinhamento múltiplo é prepa- rado (Fig. 2-1 a Fig. 2-3) e a Sequência comum 1 é determinada, en- tão, com base no dendrograma e no alinhamento múltiplo preparado. [0039] Especificamente, a Sequência comum 1 é uma sequência de aminoácido que caracteriza um grupo de acil-CoA redutases que tem nível alto de atividade para sintetizar um composto de aldeído com uso de acil-CoA como um substrato dentre diversos tipos de acil-CoA redutases. Em outras palavras, uma acil-CoA redutase que compreen- de a Sequência comum 1 tem maior atividade para sintetizar um com- posto de aldeído com uso de acil-CoA como um substrato do que uma acil-CoA redutase que não compreende a Sequência comum 1. A Se- quência comum 1 pode servir como um padrão evidente para distinguir um grupo de acil-CoA redutases que tem nível alto de atividade para sintetizar um composto de aldeído com uso de acil-CoA como um substrato das acil-CoA redutases que têm nenhum ou baixo nível de atividade para sintetizar um composto de aldeído com uso de acil-CoA como um substrato. [0040] Os exemplos específicos de acil-CoA redutases que com- preendem, cada uma, a Sequência comum 1 incluem os 12 tipos de acil-CoA redutases mostrados na Tabela 1. [0041] Os exemplos específicos de ácidos nucléicos que codificam acil-CoA redutases que compreendem Sequência comum 1 incluem o gene identificado com Gene ID: 101311020 derivado de Fragaria ves- ca (morango-silvestre), o gene identificado com Gene ID: 100776505 derivado de glicina max (soja), o gene identificado com Gene ID: 100801815 derivado de glicina max (soja), o gene identificado com Gene ID: POPTR_576417 derivado de Popuius trichocarpa (choupo preto), o gene identificado com Gene ID: 100245182 derivado de Vitis vinifera (videira), o gene identificado com Gene ID: 101510781 deriva- do de Cicer arietinum (grão-de-bico), o gene identificado com Gene ID: 101262598 derivado de Solanum lycopersicum (tomate), o gene identi- ficado com Gene ID: 101212401 derivado de Cucumis sativus (pepi- no), o gene identificado com Gene ID: 100845156 derivado de Bra- chypodium distachyon, o gene identificado com Gene ID: 101779750 derivado de Setaría italica (milho painço), o gene identificado com Ge- ne ID: SORBI_01g046030 derivado de Sorghum bicolor (sorgo) e o gene identificado com Gene ID: Os03t0167600-01 derivado de Oryza sativa japonica (arroz japonês). [0042] As Figs. 2-1 a 2-3 mostram os resultados de análise de ali- nhamento de sequências de aminoácidos de acil-CoA redutases deri- vados de várias espécies de planta mostradas na Tabela 1 com uso do programa de alinhamento de sequência múltipla de ClustalW, que está disponível no DDBJ do Instituto Nacional de Genética. As versões e vários parâmetros empregados para análise são descritos abaixo. -Versão ClustalW, 2.1 - Parâmetros de alinhamento em pares - Tipo de alinhamento, lento - Opções de alinhamento em pares lento - Matriz de peso de proteína, Gonnet - Abertura de lacuna, 10 - Extensão de lacuna, 0.1 - Parâmetros de alinhamento de sequência múltipla -Matriz de peso de proteína, Gonnet -Abertura de lacuna, 10 -Extensão de lacuna, 0.20 -Distâncias de lacunas, 5 - Sem lacunas de extremidade, não - Iteração, nenhuma - Numlter, 1 - Agrupamento, N J - Opções de saída - Formato, alinhamento com números - Ordem, Alinhada [0043] Conforme é verificado a partir das Figs. 2-1 a 2-3, as acil- CoA redutases mostradas na Tabela 1 compreendem a Sequência comum 1 descrita acima. Conforme mostrado nas Figs. 2-1 a 2-3, a Sequência comum 1 é determinada por meio da extração de resíduos de aminoácido que são perfeitamente consistentes entre as sequên- cias de aminoácidos da pluralidade de acil-CoA redutases mostrada na Tabela 1 e por meio da substituição de outros resíduos de aminoácido por aminoácidos arbitrários (denominados como "X"). [0044] Conforme mostrado nas Figs. 2-1 a 2-3, também, as se- quências de aminoácidos da pluralidade de acil-CoA redutases mos- trada na Tabela 1 compreendem resíduos de aminoácido que não são perfeitamente consistentes entre si, mas são similares uns aos outros.

Desse modo, a Sequência comum 2 que compreende tais resíduos de aminoácido similares ao invés da Sequência comum 1 pode ser defini- da. Especificamente, a Sequência comum 2, que está entre a plurali- dade de acil-CoA redutases mostrada na Tabela 1, é uma sequência de aminoácido que compreende resíduos de aminoácido que são per- feitamente consistentes entre a pluralidade de acil-CoA redutases mostrada na Tabela 1 e os resíduos de aminoácido que não são per- feitamente consistentes, mas são similares uns aos outros. [0045] Especificamente, a sequência de aminoácido de Sequência comum 2 é conforme mostrado abaixo. [0046] Sequência comum 2: [0047] G(l/L)G(l/V)xxFLx(G/A)Kx(F/L)x(l/V)(T/S)G(A/G)TGFL(A/G) KV(L/F)IEKILRTxP(D/N)V(G/N)K(l/M)(Y/F)x(L/V)IKA(K/E)xx(E/Q/D)(A/ V)AxxRLx(N/I/K)(E/D)(I/V)(I/V/L)(N/D)(A/T)(E/Q/D)(V/L/I)Fx(0/G/R)L(Q/ R/K)x(A/l/V/T)(Y/H)G(K/N/E)(S/D/Y/G)Y(Q/H/M/S/D)xF(M/V/l/A)(L/A/l)( S/A/R/N/K)KL(V/l)P(V/l)(A/L/V)Gx(V/l)(C/R)(G/E/D)x(S/N/D)(L/l/V)Gxxx (D/G/E)x(A/S)xx(l/M)Ax(E/R/D/Q)VD(V/l)(l/F/V)(V/l)NSAANTTF(D/H)E RYD(l/T/V)Ax(D/N)(l/V)NTxG(P/T)x(H/R/N)(L/l)Mx(F/l)A(K/H/Q)x(C/F)x (K/R/N)LKLFL(Q/H)(V/I)STAYVNGQ(R/K/T)QG(R/V/L)(I/V)(M/L)E(K/R) PFxx(G/E)(D/E/L)x(l/V)(A/R/E/l)x(E/D)(17- 48aa)GL(E/Q)RAxxxGWQDTYVFTKAMGEM(V/M)(l/V)(D/N)x(M/L)R(G

/D)(E/D)(l/L/V)PV(V/A)x(l/M)RPSVIESTxx(E/D)PFPGWMEG(N/S)RMM

DP(IA/)(V/l)L(Y/0/W)YGKGQL(T/S)GF(V/L)(A/V)DP(N/Y/E/D)GV(L/l)D VVPADMVVNATLA(A/S)(M/I)A(R/K/W)HG(8- 17aa)(V/l)Y(Q/H)x(A/T/S)SS(V/T/A)(V/A)NPL(l/V/D/A)Fx(D/R/E)Lx(S/R/ D/K/T)(H/L/M/F)(F/L)xxHxx(S/R/G)(S/0)PxxDxxG(N/R/Q/T)PIxV(P/S)x M(K/R/S)(L/F)(F/L)x(S/T)(T/l/M/V/S)(E/D)x(F/L)(S/A)x(H/Y)(LA//l)(W/E)( R/l)(D/Y)(A/V)xx(R/K)(S/R/C/A)(18- 26aa)(K/R)(S/T)V(K/E)Q(A/T/L)(K/T/V)(Y/H)L(A/G)xlYxPYTF(Y/F)(G/P/ N)GRFDN(S/G)N(T/V)(Q/E)xL(M/L/I/F)xxM(0/S/T)(E/A/K/V/P)(E/K/A/N) E(K/R)xxFxFDVx(S/N/G)(l/LA/)(D/E)WxDYI(S/T)NVHIPGL(R/K)(R/K)(H

/Y)V(M/L)KG [0048] Nas sequências de aminoácidos descritas no presente do- cumento, uma notação composta de uma pluralidade de aminoácidos separados por barras diagonais "/" em parênteses indica que a posição representada através da mesma é qualquer uma de tal pluralidade de aminoácidos. [0049] Em outras palavras, a sequência de aminoácido de Se- quência comum 2 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 5, uma região de 17 a 48 de resíduos de aminoácido arbitrários, a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 6, uma região de 8 a 17 de resíduos de aminoácido arbitrários, a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 7, uma região de 18 a 26 de resíduos de aminoácido arbi- trários e a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 8 ligadas naquela ordem do N terminal para o C terminal. [0050] A sequência de aminoácido de Sequência comum 2 permite que uma acil-CoA redutase que tem nível alto de atividade para sinte- tizar um composto de aldeído com uso de acil-CoA como um substrato seja diferenciada mais precisamente de uma acil-CoA redutase que tem nenhuma ou baixo nível de atividade para sintetizar um composto de aldeído com uso de acil-CoA como um substrato dentre diversos tipos de acil-CoA redutases. [0051] Os resíduos de aminoácido que podem estar presentes em determinadas posições na Sequência comum 2 variam devido às se- guintes razões. Conforme descrito no Documento de Referência (1) (McKee Biochemistry, Terceira Edição, Capítulo 5: Amino acids, Pepti- des, and Proteins, 5.1: Amino acids, Atsushi Ichikawa (supervising edi- tor), Shinichi Fukuoka (supervising translator), Ryosuke Sone (publis- her), Kagaku-Dojin Publishing Company, Inc., ISBN4-7598-0944-9), sabe-se bem que os aminoácidos são classificados de acordo com as cadeias laterais que têm propriedades similares (propriedades quími- cas ou propriedades físicas). Além disso, sabe-se bem que as substi- tuições evolutivas moleculares ocorrem frequentemente entre os resí- duos de aminoácido classificados como membros de um determinado grupo enquanto mantém a atividade proteica. Com base nas mesmas, a matriz de pontuação de substituição de aminoácido (BLOSUM) mos- trada na Fig. 2 no Documento de Referência (2): Henikoff S., Henikoff J. G., Amino-acid substitution matrices from protein blocks, Proc. Natl.

Acad. Sei. U.S.A., 89, 10.915 a 10.919, 1992 foi proposta e tal técnica tem sido extensivamente empregada. O Documento de Referência (2) baseia-se na constatação de modo que a substituição entre os amino- ácidos que têm propriedades químicas de cadeira lateral similares re- duzia as alterações nas estruturas e funções que ocorrem ao longo de uma proteína. De acordo com os Documentos de Referência (1) e (2), um grupo de aminoácidos de cadeia lateral a serem considerados pelo alinhamento múltiplo pode ser basedo em indicatores tais como pro- priedades químicas e propriedades físicas. De acordo com a matriz de pontuação (BLOSUM) descrita no Documento de Referência (2), tal grupo de aminoácidos de cadeia lateral é indicado como um grupo de aminoácidos que têm uma classificação de 0 ou mais e, preferencial- mente, de 1 ou mais. Os exemplos de grupos representativos incluem os 8 grupos descritos abaixo. Os aminoácidos podem ser classificados em mais grupos específicos: por exemplo, um grupo de aminoácidos que têm um classificação de 0 ou mais; um grupo de aminoácidos que têm um classificação de 1 ou mais; e um grupo de aminoácidos que têm um classificação de 2 ou mais. 1) GRUPO DE AMINOÁCIDOS HIDROFÓBICOS ALIFÁTICOS (GRU- PO ILMV) [0052] Esse grupo consiste em aminoácidos que compreendem cadeias laterais hidrofóbicas alifáticas dentre os aminoácidos não pola- res neutros descritos no Documento de Referência (1); isto é, V (Vai, valina), L (Leu, leucina), I (lie, isoleucina) e M (Met, metionina). Dentre os aminoácidos que são classificados como os aminoácidos não pola- res neutros de acordo com o Documento de Referência (1), FGACWP não estão incluídos no "grupo de aminoácidos alifáticos hidrofóbicos" devido às seguintes razões. Isto é, o tamanho de G (Gly, glicina) ou A (Ala, alanina) é menor que ou igual àquele de um grupo metila e os efeitos de aminoácidos não polares são fracos. Além disso, C (Cys, cisteína) desempenha ocasionalmente um papel fundamental na liga- ção S-S e forma uma ligação de hidrogênio com um átomo de nitrogê- nio ou oxigênio. Além disso, os pesos moleculares de cadeia lateral de F (Phe, fenilalanina) e W (Trp, triptofano) são particularmente altos e os efeitos de aminoácidos aromáticos são fortes. Além disso, P (Pro, prolina) corrige o ângulo da cadeia principal de polipeptídeo devido aos seus efeitos de iminoácido fortes. 2) GRUPO DE AMINOÁCIDOS QUE TÊM GRUPOS HIDROXIMETI- LENO (GRUPO ST) [0053] Esse grupo consiste em aminoácidos que têm grupos hi- droximetileno nas cadeias laterais entre os aminoácidos polares neu- tros; isto é, S (Ser, serina) e T (Thr, treonina). Uma vez que os açúca- res se ligam nos sítios dos grupos hidroxila existentes nas cadeias la- terais S e T, tais sítios de grupos hidroxila são frequentemente impor- tantes para um determinado tipo de polipeptídeo (proteína) ter ativida- de particular. 3) GRUPO DE AMINOÁCIDOS ÁCIDOS (GRUPO DE) [0054] Esse grupo consiste em aminoácidos que têm grupos car- boxila ácidos nas cadeias laterais; isto é, D (Asp, ácido aspártico) e E (Glu, ácido glutâmico). 4) GRUPO DE AMINOÁCIDOS BÁSICOS (GRUPO KR) [0055] Esse grupo consiste em aminoácidos básicos; isto é, K (Lys, lisina) and R (Arg, arginina). K e R são carregados positivamente ao longo de uma faixa de pH extensiva e têm propriedades básicas.

Em contraste, H (His, histidina), classificada como um aminoácido bá- sico, não é substancialmente ionizada em pH 7 e não é consequente- mente classificada como um membro desse grupo. 5) GRUPO DE AMINOÁCIDOS QUE COMPREENDE GRUPO METI- LENO = GRUPO POLAR (GRUPO DHN) [0056] Todos os aminoácidos classificados como membros desse grupo compreendem grupos metileno ligados como cadeias laterais aos átomos de carbono na posição e grupos polares em sítios próxi- mos às extremidades dos mesmos. Os aminoácidos desse grupo são muito similares em termos de propriedades físicas de grupos metileno não polar e o grupo consiste em N (Asn, asparagina, com o grupo po- lar que é um grupo amida), D (Asp, ácido aspártico, com o grupo polar que é um grupo carboxila) e H (His, histidina, com o grupo polar que é um grupo imidazol). 6) GRUPO DE AMINOÁCIDOS QUE COMPREENDE GRUPO DIME- TILENO = GRUPO POLAR (GRUPO EKQR) [0057] Todos os aminoácidos classificados como membros desse grupo compreendem hidrocarbonetos lineares iguais a ou maiores que os grupos dimetileno ligados como cadeias laterais aos átomos de carbono na posição e grupos polares em sítios próximos às extremi- dades dos mesmos. Os aminoácidos desse grupo são muito similares em termos de propriedades físicas dos grupos dimetileno não polar e o grupo consiste em E (Glu, ácido glutâmico, com o grupo polar que é um grupo carboxila), K (Lys, lisina, com o grupo polar que é um grupo amino), Q (Gin, glutamina, com o grupo polar que é um grupo amida) e R (Arg, arginina, com os grupos polares que são grupos amino e imi- no). 7) GRUPO DE AMINOÁCIDOS AROMÁTICOS (GRUPO FYW) [0058] Esse grupo consiste em aminoácidos aromáticos que com- preendem núcleos benzeno nas cadeias laterais e que têm peculiares propriedades químicas para os aminoácidos aromáticos: isto é, F (Phe, fenilalanina), Y (Tyr, tirosina) e W (Trp, triptofano). 8) GRUPO DE AMINOÁCIDOS POLARES CÍCLICOS (GRUPO HY) [0059] Esse grupo consiste em aminoácidos que têm tanto estrutu- ras cíclicas quanto grupos polares nas cadeias laterais; isto é, Η (H, histidina, sendo que tanto a estrutura cíclica quanto o grupo polar são grupos imidazol) e Y (Tyr, tirosina, com a estrutura cíclica que é um núcleo benzeno e o grupo polar que é um grupo hidroxila). [0060] Com base nos grupos de aminoácidos descritos acima, po- de ser facilmente deduzido que as novas proteínas que têm as mes- mas funções são obtidas substituindo-se um resíduo de aminoácido na sequência de aminoácido de uma proteína que tem uma determinada função por outro resíduo de aminoácido do mesmo grupo. Com base no "1) grupo de aminoácidos hidrofóbicos alifáticos (grupo ILMV)" aci- ma, por exemplo, pode ser facilmente deduzido que as novas proteí- nas que têm as mesmas são obtidas até mesmo se um resíduo de iso- leucina na sequência de aminoácido de uma proteína que tem uma função particular for substituído por um resíduo de leucina. Quando há uma pluralidade de proteínas que têm funções particulares, as se- quências de aminoácidos são ocasionalmente descritas como sequên- cias consenso. Até mesmo em tais casos, pode ser facilmente deduzi- do que as novas proteínas que têm as mesmas funções são obtidas substituindo-se um resíduo de aminoácido particular por outro resíduo de aminoácido do mesmo grupo. Quando há uma pluralidade de prote- ínas que têm funções particulares e o resíduo de aminoácido na se- quência consenso determinada com base no mesmo é isoleucina ou leucina (L/l), por exemplo, pode ser facilmente deduzido que as novas proteínas que têm as mesmas funções são obtidas até mesmo se o resíduo de leucina ou isoleucina for substituído por um resíduo de vali- na ou metionina com base no "1) grupo de aminoácidos hidrofóbicos alifáticos (grupo ILMV)." [0061] Dentre os genes acil-CoA redutases mostrados na Tabela 1, o gene identificado com Gene ID: 100776505 derivado de glicina max (soja), o gene identificado com Gene ID: 100801815 derivado de glicina max (soja) e o gene identificado com Gene ID: 101510781 deri- vado de Cicer arietinum (grão-de-bico) codificam acil-CoA redutases que têm atividade significativamente maior para sintetizar um compos- to de aldeído com uso de acil-CoA como um substrato do que de ou- tras acil-CoA redutases. A Fig. 3 mostra os resultados da análise de alinhamento de três acil-CoA redutases codificadas pelo gene identifi- cado com Gene ID: 100776505 derivado de glicina max (soja), o gene identificado com Gene ID: 100801815 derivado de glicina max (soja) e o gene identificado com Gene ID: 101510781 derivado de Cicer arieti- num (grão-de-bico) com uso do programa de alinhamento de sequên- cia múltipla de ClustalW, que está disponível no DDBJ do Instituto Na- cional de Genética (as versões e vários parâmetros empregados para análise estão conforme descrito acima). [0062] Conforme mostrado na Fig. 3, essas 3 acil-CoA redutases altamente ativas têm sequências de aminoácidos muito similares. A

Sequência comum 3 pode ser definida como uma sequência de ami- noácido que caracteriza tais 3 acil-CoA redutases.

Sequência comum 3: MDAGSLVLSQNGKSQA(E/D)l(L/V)VKDLVPY(D/G)G(P/T)T(0- 2aa)TLIG(V/L)ED(0- 1aa)GIGIVKFL(G/R)GKKFFITGATGFLAKV(F/L)IEKILRTEPDVGKMY( L/I)LIKAKN(K/N)Q(A/V)AMERLQ(N/K)EIINT(E/Q)LFRCL(Q/R)(E/Q)IH

GKSYQAFMLSKLVP(V/I)VG(N/D)ICE(H/T)NLGLDE(G/D)(I/L)S(D/N)VI A(E/D)EVDV(l/F)VNSAANTTFDERYDTAININT(l/R)GP(0/S)RLM(N/A)l AKKCKKLKLFLHVSTAY- VNGQ(R/K)QGRIMERPFSIG(E/D)CIAREK(YL)IS(E/G)V(S/P)PKYLPT LDIE(G/N)EIN(L/M)V(S/L)(N/K)(Y/N)KG(D/N)(0-1 aa)IE(D/E)NLL(A/T)QKM(K/R)E(l/M)GLERA(R/K)RYGWQDTYVFTKA MGEMMID- KLR(G/D)DIPVV(V/I)(M/I)RPSVIEST(F/L)SEPFPGWMEGNRMMDP(I/ V)VL(C/W)YGKGQLTGFLVDPNGVLDVVPADMVVNATLAAMA(R/K)H

G(V/M)(S/N/I)QK(P/A)DINVYQIASSVVNPL(V/A)FQDL(A/T)RLLYEHYS

SSP(C/F)IDS(K/M)GRPIQVP(L/I)MK(L/F)FSS(T/S)EEFSGHLWRD(A/V

)I(Q/N)K(R/S)G(L/I)T(A/S)(V/M)ASSK(G/A)KMSQKLEN(M/I)CRKSVEQ

AKYLA(N/K)IVEPYTFYGGRFDNSNTQRLME(S/I)MSE(K/E)EK(R/T)EF (G/D)FDVK(S/G)IDW(N/T)DYITNVHIPGLRR(H/Y)VMKGRGM(G/S)(S/ N)Q [0063] A sequência de aminoácido de Sequência comum 3 é re- presentada da mesma maneira como nos casos das Sequências co- muns 1 e 2. Em outras palavras, a sequência de aminoácido de Se- quência comum 3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9, uma região de 0 a 2 resíduos de aminoácido arbitrários, a se- quência de aminoácido de SEQ ID NO: 10, uma região de 0 ou 1 resí- duos de aminoácido arbitrários, a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 11, uma região de 0 ou 1 resíduos de aminoácido arbitrários e a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 12 ligadas naquela ordem do N terminal para o C terminal. [0064] A sequência de aminoácido de Sequência comum 3 permite que uma acil-CoA redutase que tem nível particularmente alto de ativi- dade para sintetizar um composto de aldeído com uso de acil-CoA como um substrato seja diferenciada de uma acil-CoA redutase que tem nenhuma ou baixo nível de atividade para sintetizar um composto de aldeído com uso de acil-CoA como um substrato entre vários tipos de acil-CoA redutases. [0065] Quando uma acil-CoA redutase que compreende a Se- quência comum 3 é expressa em um microrganismo hospedeiro, es- pecificamente, o mesmo reduz a acil-CoA para produzir um composto de aldeído com maior eficiência. Desse modo, um álcool e/ou hídro- carboneto podem ser produzidos a partir do composto de aldeído com maior eficiência. [0066] Conforme descrito acima, um ácido nucléico que codifica uma acil-CoA redutase que pode ser usada na presente invenção não é particularmente limitada, desde que a mesma codifique uma acil- CoA redutase que compreende a Sequência comum 1, 2 ou 3. Em ou- tras palavras, tal ácido nucléico não é limitado aos genes acil-CoA re- dutases especificamente exemplificados na Tabela 1 e os ácidos nu- cléicos que codificam acil-CoA redutases derivadas de espécies de planta que se diferem daquelas exemplificadas na Tabela 1 também estão dentro do escopo de tal ácido nucléico. Por exemplo, um ácido nucléico que codifica uma acil-CoA redutase derivada de uma espécie de planta com informações de sequência que não são armazenadas em GenBank ou outros bancos de dados e que compreende as Se- quências comuns 1,2 ou 3 pode ser usado. [0067] Os exemplos específicos de acil-CoA redutases que podem ser usadas na presente invenção incluem proteínas que compreendem sequências de aminoácidos conforme mostrado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 e 36 mostradas na Tabela 1. Uma proteína que compreende uma sequência de ami- noácido conforme mostrado em qualquer uma das SEQ ID NO: 14, 16 ou 18 é particularmente preferencial como uma acil-CoA redutase. [0068] Os ácidos nucléicos que codificam acil-CoA redutases que podem ser usados na presente invenção não são limitados aos ácidos nucléicos que codificam as acil-CoA redutases identificadas com nú- meros de identificação de sequência particular, conforme descrito aci- ma. Qualquer ácido nucléico pode ser usado, desde que codifique uma acil-CoA redutase que compreende a Sequência comum 1,2 ou 3. Um ácido nucléico que codifica uma acil-CoA redutase tem atividade de modo que uma proteína codificada através do mesmo reduza a acil- CoA e gere um composto de aldeído. [0069] Caso uma acil-CoA redutase que pode ser usada na pre- sente invenção compreenda a Sequência comum 1, 2 ou 3 ou não e caso um ácido nucléico que codifica tal proteína codifique ou não uma proteína que compreende a Sequência comum 1, 2 ou 3 pode ser fa- cilmente determinado comparando-se a sequência de aminoácido da proteína de interesse ou uma sequência de aminoácido codificada pela ácido nucléico com a sequência de aminoácido de Sequência comum 1, 2 ou 3. [0070] Por exemplo, uma acil-CoA redutase que compreende uma sequência de aminoácido que é diferente da sequência de aminoácido conforme mostrado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 e 36 e que compreende a Sequência comum 1, 2 ou 3 pode codificar uma proteína que compreende uma sequência de aminoácido derivada da sequência de aminoácido conforme mos- trado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 e 36 mediante a deleção, substituição, adição ou inser- ção de 1 ou uma pluralidade de aminoácidos e que compreende a Se- quência comum 1, 2 ou 3 e que tem a atividade de uma acil-CoA redu- tase. Uma pluralidade de aminoácidos é, por exemplo, 1 a 20, prefe- rencialmente, 1 a 10, mais preferencialmente, 1 a 7, ainda preferenci- almente, 1 a 5 e, particularmente preferencial, 1 a 3 aminoácidos. A deleção, substituição ou adição de aminoácido pode ser realizada mo- dificando-se a sequência de nucleotídeos do ácido nucléico que codifi- ca a acil-CoA redutase de acordo com uma técnica conhecida na téc- nica. Uma mutação pode ser introduzida em uma sequência de nu- cleotídeos por meio de técnicas convencionais, tal como método de Kunkel ou o método de duplex de DNA incompleto (Gapped) ou uma técnica de acordo com os mesmos. Por exemplo, um kit de mutagêne- se de sítio direcionado (por exemplo, Mutante-K ou Mutante-G (nomes comerciais); fabricado por TAKARA Bio) pode ser usado. Alternativa- mente, uma mutação pode ser introduzida com uso de kit de série de mutagênese LA PCR in vitro (nome comercial: fabricado por TAKARA

Bio). Além disso, a mutagênese pode ser executada com o uso de um mutagênico químico. Os exemplos representativos de mutagênicos químicos incluem EMS (etilmetanossulfonato), 5-bromouracil, 2- aminopurina, hidroxilamina, N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina e ou- tros compostos carcinogênicos. Além disso, os mesmos podem ser executados por meio da aplicação de radiação e processamento ultra- violeta com o uso de x raios, raios a, raios β, raios you feixes de íon. [0071] Por exemplo, uma acil-CoA redutase que compreende uma sequência de aminoácido que é diferente da sequência de aminoácido conforme mostrado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 e 36 e que compreende a Sequência comum 1, 2 ou 3 pode codificar uma proteína que compreende uma sequência de aminoácido que tem 70% ou mais, preferencialmente, 80% ou mais, mais preferencialmente, 90% ou mais e, com ainda mais prefe- rência, 95% ou mais similaridade ou identidade à sequência de amino- ácido conforme mostrado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 e 36 e que compreende a Sequência comum 1, 2 ou 3 e que tem atividade de uma acil-CoA redutase. O grau de similaridade ou identidade é determinado com uso de um pro- grama de computador equipado com o programa de ferramenta de busca de alinhamento local básico (BLAST) e um banco de dados que armazena as informações de sequência de gene por padrão. [0072] Um ácido nucléico que compreende uma sequência de aminoácido que é diferente da sequência de aminoácido conforme mostrado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 e 36 e que codifica uma acil-CoA redutase que com- preende a Sequência comum 1, 2 ou 3 pode ser identificado extraindo- se os ácidos nucléicos de uma planta alvo e da isolando-se um ácido nucléico que é hibridizado sob condições estringentes para um ácido nucléico que codifica a sequência de aminoácido conforme mostrado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 e 36, quando as informações de genoma de planta não são evi- dentes. Sob condições estringentes, a saber, um híbrido específico é formado, mas um híbrido não específico não é formado. Por exemplo, tais condições compreendem a hibridização a 45 O com 6x SSC (ci- trato de sódio/cloreto de sódio), seguida por lavagem a 50 O a 65 O com 0,2 a 1* SSC e 0,1% SDS. Alternativamente, tais condições com- preendem hibridização a 65 O a 70 O com 1* SSC, s eguida por la- vagem a 65 Ό a 70 Ό com 0,3* SSC. A hibridização pode ser execu- tada por uma técnica convencional, tal como o método descrito em J.

Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, 1989. [0073] Desse modo, a acil-CoA redutase usada na presente inven- ção foi definido como que compreende a Sequência comum 1, 2 ou 3, embora o mesmo não seja limitado a uma proteína que compreende a Sequência comum 1,2 ou 3. [0074] Especificamente, uma acil-CoA redutase usada na presente invenção pode codificar uma proteína que compreende uma sequência de aminoácido derivada da sequência de aminoácido conforme mos- trado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 e 36 por meio de deleção, substituição, adição ou inser- ção de um ou uma pluralidade de aminoácidos e que tem atividade de uma acil-CoA redutase. Uma pluralidade de aminoácidos é, por exem- plo, 1 a 20, preferencialmente, 1 a 10, mais preferencialmente, 1 a 7, ainda preferencialmente, 1 a 5 e, particularmente preferencial, 1 a 3 aminoácidos. A deleção, substituição ou adição de aminoácido pode ser realizada modificando-se a sequência de nucleotídeos do ácido nucléico que codifica a acil-CoA redutase de acordo com uma técnica conhecida na técnica. Uma mutação pode ser introduzida em uma se- quência de nucleotídeos pelo método descrito acima. [0075] Uma acil-CoA redutase pode codificar, por exemplo, uma proteína que compreende uma sequência de aminoácido que tem 70% ou mais, preferencialmente, 80% ou mais, mais preferencialmente, 90% ou mais e, com ainda mais preferência, 95% ou mais similaridade ou identidade para a sequência de aminoácido conforme mostrado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 e 36 e que tem atividade de uma acil-CoA redutase. Os graus de similaridade ou identidade podem ser determinados pelo método des- crito acima. [0076] Além disso, uma acil-CoA redutase pode codificar uma pro- teína codificada por um ácido nucléico que é hibridizado sob condições estringentes para, por exemplo, um ácido nucléico que codifica a se- quência de aminoácido conforme mostrado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 e 36 e que tem acil- CoA redutase. As condições estringentes são conforme descrito aci- ma. [0077] Se um ácido nucléico que compreende uma sequência de nucleotídeos particular codifica ou não a acil-CoA redutase, pode ser determinado preparando-se um vetor de expressão que compreende o ácido nucléico incorporado a um sítio entre um promotor adequado e um terminador, que transforma um hospedeiro adequado com uso do vetor de expressão preparado e ensaio da atividade de acil-CoA redu- tase da proteína expressada. A atividade de acil-CoA redutase pode ser ensaiada através da cultura do transformante em um meio que contém uma fonte de carbono e que analisa o composto de aldeído sintetizado ou um álcool derivado do composto de aldeído através da cromatografia a gás, análise em massa ou outros meios. Ao cultivar o transformante, a acil-CoA pode ser adicionada ao meio.

VETOR DE EXPRESSÃO E MICRORGANISMO HOSPEDEIRO [0078] O ácido nucléico que codifica a acil-CoA redutase descrita acima é incorporado a um vetor de expressão adequado e é introduzi- do, desse modo, em um microrganismo hospedeiro. Um microrganis- mo hospedeiro não é particularmente limitado, desde que tenha capa- cidade para expressar uma acil-CoA redutase. Os exemplos de mi- crorganismos hospedeiros incluem: bactéria de Escheríchia tal como Escherichia coli, Corynebacteriumta\ como Corynebacterium glutami- cum, Bacillus tal como Bacillus subtilis, Pseudomonas tal como Pseu- domonas putida e Rhizobium tal como Rhizobium meliloti e fungi que inclui levedura e filamentos fungi, tais como Saccharomyces cerevisi- ae, Schizosaccharomyces pombe e Pichia pastoris. [0079] Quando as bactérias tal como Escherichia coli são usadas para microrganismos hospedeiros, é preferível que um vetor de ex- pressão tenha capacidade de replicação autônoma em tal bactéria e seja composto de um promotor, uma sequência de ligação de ribos- somo, o(s) gene(s) descrito(s) acima e uma sequência de terminador de transcrição. Além disso, um vetor de expressão pode compreender um gene que regula a atividade de promotor. [0080] Podem ser usadas quaisquer cepas de Escherichia coli que são conhecidas, até aqui, e os exemplos das mesmas incluem a cepa de Escherichia coli BL21 (DE3), cepa de K12, cepa de DH1 e cepa de JM109. Como as cepas de Escherichia coli, em particular, as cepas de K12 e as cepas preparadas a partir das mesmas - ou seja, denomina- das cepas de K - podem ser usadas. Um exemplo da cepa de Bacillus subtilis é a cepa de Bacillus subtilis 168. [0081] Qualquer promotor pode ser usado, desde que permita que um gene de interesse seja expresso em um hospedeiro tal como Es- cherichia coli. Os exemplos do mesmo incluem promotores derivados de Escherichia coli, tais como promotores trp, promotores lac, promo- tores PL e promotores PR e promotores derivados de fago, tal como promotores T7. Os promotores artificialmente modificados e/ou proje- tados, tal como promotores tac, também podem ser usados. [0082] Um vetor de expressão pode ser introduzido por qualquer método, desde que tal método seja destinado a introduzir o DNA na bactéria. Os exemplos dos mesmos incluem um método que envolve o uso de íons de cálcio (Cohen, S. N. et al., Proc. Natl. Acad. Sei., EUA., 69: 2110 a 2114, 1972) e eletroporação. [0083] Os exemplos de cepas de levedura que podem ser usados para microrganismos hospedeiros incluem, mas não são particular- mente limitados a, cepas de Candida levedura strains, tal como Candi- da Shehatae, cepas de Pichia levedura, tal como Pichia stipites, cepas de levedura de Pachysolen, tal como Pachysolen tannophitus, cepas de levedura de Saccharomyces, tal como Saccharomyces cerevisiae e cepas de levedura de Schizosaccharomyces, tal como Schizosaccha- romyces pombe com Saccharomyces cerevisiae que é particularmente preferencial. [0084] Quando o nível de expressão da acil-CoA redutase precisa ser aumentado, um promotor adequado com alta atividade transcricio- nal é usado. Os exemplos de promotores que podem ser usados in- cluem, mas não são particularmente limitados a, promotores de gene gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (TDH3), promotores de gene 3- fosfoglicerato quinase (PGK1) e promotores de gene hiperosmolarida- de-responsivo 7 (HOR7). Os promotores de gene piruvato decarboxi- lase (PDC1) são particularmente preferenciais devido à sua elevada capacidade para aumentar o nível de expressão dos genes a jusante alvo. Além disso, promotores gal 1, promotores gal10, promotores de proteína de choque térmico, promotores MFa1, promotores PH05, promotores GAP, promotores ADH, ou promotores AOX1 podem ser usados, de modo que o nível de expressão dos genes a jusante possa ser aumentado. [0085] Como os métodos para introduzir os genes descritos acima, quaisquer técnicas convencionais que são conhecidas como técnicas de transformação de levedura podem ser empregadas. Os exemplos específicos incluem, mas sem limitação, ao método de eletroporação (Meth. Enzym., 194, p. 182, 1990), ao método esferoplasto (Proc. Natl.

Acad. Sei., U.S.A., 75, p. 1929, 1978), ao método de acetato de lítio (J.

Bacteriology, 153, p. 163, 1983) e aos métodos descritos em Proc.

Natl. Acad. Sei., U.S.A., 75, p. 1929, 1978 e Methods in Yeast Genet- ics, 2000 Edição: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. [0086] O ácido nucléico que codifica a acil-CoA redutase é preferi- velmente introduzido em um microrganismo com capacidade de sínte- se de hidrocarboneto com o uso de um composto de aldeído como um substrato. Em tal caso, um microrganismo recombinante que expressa a acil-CoA redutase pode produzir um hidrocarboneto a partir de um composto de aldeído com eficiência elevada. Por exemplo, um ácido nucléico que codifica uma enzima que tem atividade de decarbonilase (isto é, uma decarbonilase) pode ser introduzido no microrganismo e um microrganismo recombinante com capacidade de síntese de hidro- carboneto de um composto de aldeído pode, então, ser produzido. O microrganismo recombinante, então, obtido ou um microrganismo que inerentemente tem atividade de decarbonilase pode ser usado como um hospedeiro, a acil-CoA redutase pode ser introduzida em tal hos- pedeiro e a síntese de hidrocarboneto pode ser executada, então, com eficiência muito elevada. [0087] As enzimas que têm atividade de decarbonilase não são particularmente limitadas e as enzimas convencionais podem ser usa- das. Por exemplo, o documento n- WO 2006/109558 revelou um mé- todo no qual as novas microalgas, Pseudochoricystis ellipsoidea, com capacidade de produção de hidrocarboneto ou microalgas de Pseudo- choricystis ou Choricystis com capacidade de produção de hidrocarbo- neto são cultivadas e um hidrocarboneto é coletado a partir do produto de cultura. Um ácido nucléico que codifica uma enzima que tem ativi- dade de decarbonilase pode ser isolado de tal organismo e usado.

Além disso, o gene que converte um aldeído em um alcano descrito no documento n2 JP 2010-528627 A e o gene de sintase de alcano ou o gene de sintase de derivados de Synechococcus elongatus descrito no documento n2 JP 2011-520455 A pode ser usado. Além disso, um ge- ne que codifica uma proteína envolvida com atividade de decarbonila- se de aldeído alifático derivado de Arabidopsis thaliana revelado no documento n2 JP H09-322780 A (1997) pode ser usado. [0088] Além disso, o documento n2 WO 2013/129393 revelou um gene de sintase de hidrocarboneto que codifica uma enzima que com- preende uma determinada sequência de motivo e que tem atividade de decarbonilase. Com o uso do gene de sintase de hidrocarboneto reve- lado no documento n-WO 2013/129393, os hidrocarbonetos conforme descrito acima podem ser produzidos com eficiência elevada. [0089] Um microrganismo recombinante que compreende um áci- do nucléico introduzido que codifica descarbonilase (por exemplo, Es- cherichia coli recombinante ou levedura recombinante) teria capacida- de para sintetizar um hidrocarboneto de um composto de aldeído na presença de um composto de aldeído e uma coenzima, tal como NADH, através da expressão da descarbonilase. [0090] Os exemplos de hidrocarbonetos que podem ser sintetiza- dos incluem um hidrocarboneto que tem uma estrutura de cadeia (isto é, um hidrocarboneto em cadeia) e um hidrocarboneto que tem uma estrutura cíclica (isto é, um hidrocarboneto cíclico). Um hidrocarboneto em cadeia pode ter um ou mais ramificações. Os exemplos de ramifi- cações incluem grupos alquila, tais como grupos metila, etila, propila e butila (que incluem tert-butila), grupos alquinila e grupos alquenila. Os exemplos adicionais de ramificações incluem grupos clorometila, aceti- la, 2-piridila, hidroxifenila, aminoacetila, metóxi, fenóxi, metiltio e fenil- tio. Além disso, os hidrocarbonetos para serem sintetizados podem ser hidrocarbonetos saturados (alcano) ou hidrocarbonetos insaturados (alceno e alcino). [0091] É preferível que um hidrocarboneto a ser sintetizado tenha cerca de 5 a 20 átomos de carbono, que é líquido a temperatura ambi- ente, embora o número de átomos de carbono não seja limitado. Um hidrocarboneto a ser sintetizado é preferencialmente um hidrocarbone- to saturado que tem 10 a 20 átomos de carbono, mais preferencial- mente, 12 a 14 átomos de carbono e, com ainda mais preferência, 13 átomos de carbono, a partir do ponto de vista da aplicação dos mes- mos para um combustível diesel. Os exemplos específicos de hidro- carbonetos a serem sintetizados incluem dodecano que tem 12 áto- mos de carbono, tridecano que tem 13 átomos de carbono e tetrade- cano que tem 14 átomos de carbono.

MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE SUBSTÂNCIA [0092] Conforme descrito acima, o microrganismo recombinante de acordo com a presente invenção tem atividade excelente para sin- tetizar um composto de aldeído com uso de acil-CoA como um subs- trato. Portanto, com o uso do microrganismo recombinante de acordo com a presente invenção pelo menos um composto selecionado a par- tir do grupo que consiste em um composto de aldeído e um álcool e um hidrocarboneto sintetizado a partir de um composto de aldeído po- de ser produzido. [0093] Por exemplo, o microrganismo recombinante de acordo com a presente invenção é cultivado em um meio que contém uma fonte de carbono, tal como glicose, frutose, galactose, manose, xilose, xilulose, ribose, eritrose, treose, eritrulose, gliceraldeído, di- hidroxiacetona, sacarose, lactose, maltose, trealose ou celobiose.

Desse modo, uma substância alvo, tal como o composto de aldeído, álcool ou hidrocarboneto conforme descrito acima, pode ser produzido. [0094] O microrganismo recombinante de acordo com a presente invenção também pode ser usado para um método para produzir uma substância alvo in vitro. Por exemplo, o microrganismo recombinante de acordo com a presente invenção é triturado, a solução resultante que contém o microrganismo triturado é usada e uma substância alvo pode ser, então, sintetizada in vitro. Especificamente, a acil-CoA (uma coenzima tal como NADH, se necessário) é adicionada como um subs- trato à solução e uma substância alvo pode ser, então, sintetizada in vitro. [0095] Uma substância alvo, tal como um hidrocarboneto sinteti- zado, pode ser isolada de acordo com uma técnica convencional. Por exemplo, a levedura recombinante é cultivada em um meio para pro- duzir um hidrocarboneto. Uma vez que um hidrocarboneto é sintetiza- do em um meio, as cepas são separadas do meio através da centrifu- gação ou outros meios e a substância alvo pode ser, então, isolada da fração supernadante. Um hidrocarboneto pode ser isolado da fração supernadante, por exemplo, adicionando-se um solvente orgânico, tal como acetate de etila ou metanol, à fração supernadante e agitando- se completamente a solução. A fase aquosa é separada da fase de solvente e um hidrocarboneto pode ser extraído da fase de solvente.

EXEMPLOS [0096] Posteriormente, a presente invenção é descrita em maiores detalhes com referência aos exemplos, embora o scope técnico da presente invenção não é limitado a esses exemplos. EXEMPLO 1 [0097] Nesse exemplo, um vetor de expressão que compreende o gene aldeído descarbonilase (Gene ID: Npun R1711) derivado de Nos- toc punctiform e vetores de expressão que compreendem gene acil- CoA redutases derivados de várias espécies de planta foram introdu- zidos em cepas de Escherichia coli e a produtividade de alcano das cepas de Escherichia coli recombinantes resultantes foi avaliada. A

Tabela 2 mostra os genes acil-CoA redutases usados nesse exemplo. [0098] Os genes acil-CoA redutases e os genes aldeído descarbo- nilases usados nesse exemplo foram artificialmente sintetizados com base nas informações de sequência de nucleotídeos armazenadas no banco de dados. SEQ ID NO: 67 e 68 mostram a sequência de nucleo- tídeos e a sequência de aminoácido do gene aldeído descarbonilase (Gene ID: Npun R1711), respectivamente. [0099] O gene acil-CoA redutase artificialmente sintetizado foi in- serido no sítio Nde\-Xho\ do vetor pCDFDuet-1 (Novagen) e o gene aldeído descarbonilase artificialmente sintetizado foi inserido no sítio Pst 1 do vetor pRSFDuet-1 (Novagen) (consulte a Fig. 4). Ao sintetizar artificialmente o gene acil-CoA redutase, a sequência: TACCATGGG- C AT AC AT AT G G C C AT C AT AACG GTT CT G G C AAAT ATT CT G AAA- TGAGCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAA- TTGT G AG CG G AT AAC AATTT C AC AC AAG G AG AT AT AC G (SEQ ID NO: 69) que compreende a sequência de reconhecimento de NdeI foi adicionada ao terminal 5’ e a sequência: TAATTAACCTAGGCTG- CTG CC ACC G CTG AG C AATAACT AG C AT AAC CCCTTG G G G C CTC- TAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCCCTCGAGTCCGGCCG- CATGCGGCCGCAT (SEQ ID NO: 70) que compreende a sequência de reconhecimento de Xho\ foi adicionada ao terminal 3’. [00100] De modo subsequente, os dois tipos de vetores de expres- são preparados foram transformados em cepa de E. coli BL21 (DE3). A transformação foi executada preparando-se as células competentes de E. coli BL21 (DE3) com referência ao Protocolo de Usuário TB009 Rev. F0104 (Novagen). [00101] De modo subsequente, o transformante resultante foi sub- metido à cultura de agitação em 0,5 ml de meio LB, que contém 30 mg/ml de estreptomicina e 50 mg/ml de canamicina a 37 Ό e 130 rpm durante a noite. A solução de cultura foi inoculada em 2 ml de meio M9, que contém 2% de glicose, 0,1% de extrato de levedura, 30 mg/ml estreptomicina e 50 mg/ml de canamicina, a uma quantidade de 1%, em volume, na mesma e cultura de agitação foi conduzida a 37 Ό e 130 rpm por cerca de 4 horas (absorção final: OD 600 de 0,4 a 0,6). O

Isopropil β-D-l-tiogalactopiranósido (IPTG) foi adicionado à solução de cultura a uma concentração final de 1 mM no mesmo e a cultura foi conduzida a 37 Ό e 130 rpm por 3 dias. [00102] A solução de cultura (1 ml) foi ensaiado em um tubo Ep- pendorf de 1,5 ml, as cepas bacterianas foram coletadas com uso de uma centrífuga (6.000 rpm, 1 minuto, temperatura ambiente), e o ten- soativo foi removido. O acetato de etila (100 ml) foi adicionado aos pé- letes e uma suspensão foi preparada através de vórtice para cerca de 1 minuto. O resultante foi centrifugado a 10.000 rpm por 1 minuto a temperatura ambiente e o tensoativo resultante foi submetido, então, à análise de GC/MS. As condições para análise de GC/MS são mostra- das na Tabela 3. TABELA 3 [Condições de análise de GC/MS] Coluna: HP-5MS (Agilent: 19091S-433) Temperatura de entrada: 260 Ό Temperatura de detector: 260 Ό Razão de divisão: 1/20* Gás carreador: He 1,0 ml/min Sob condições de aquecimento 60 Ό, 1 min Elevado para 260 Ό a 50 O/min 260 Ό, 1 min [00103] A Fig. 5 mostra os resultados de análise de GC/MS quanti- tativa de tridecano e pentadecano dos 27 tipos de cepas de Escheri- chia coli recombinantes preparadas nesse exemplo e a Fig. 6 mostra os resultados de análise de GC/MS quantitativa de tetradecanol e he- xadecanol da mesma. A Fig. 7 mostra um gráfico que mostra os resul- tados de análise de GC/MS da cepa de Gm2 entre os 27 tipos de ce- pas de Escherichia coli recombinantes. A Tabela 4 mostra um sumário dos resultados da quantificação mostrada nas Figuras 5 e 6. [00104] Com base nos resultados mostrados nas Figuras 5 e 6 e Tabela 4, 12 tipos de cepas de Escherichia coli recombinantes: isto é, a cepa de Fv1, a cepa de Gm1, a cepa de Gm2, a cepa de Pt1, a cepa de Vv1, a cepa de Ca1, a cepa de SI3, a cepa de Cc1, a cepa de Bd1, a cepa de Si 1, a cepa de Sb1 e a cepa de Os1, foram observados co- mo tendo capacidade de produção de alcano e álcool. Os resultados demonstram que esses 12 tipos de cepas de Escherichia coli recombi- nantes têm alcançado a capacidade para produzir um composto de aldeído a partir da acil-CoA mediante a introdução do gene acil-CoA redutase. Em outras palavras, os genes acil-CoA redutases nesses 12 tipos de cepas de Escherichia coli recombinantes foram observados como codificando acil-CoA redutases que têm atividade para reduzir acil-CoA para gerar um composto de aldeído nos microrganismos hos- pedeiros. [00105] Nesse exemplo, mais especificamente, o gene identificado com Gene ID: 101311020 derivado de Fragaria vesca (morango- silvestre), o gene identificado com Gene ID: 100776505 derivado de glicina max (soja), o gene identificado com Gene ID: 100801815 deri- vado de glicina max (soja), o gene identificado com Gene ID: PO- PTR_576417 derivado de Populus trichocarpa (choupo preto), o gene identificado com Gene ID: 100245182 derivado de Vitis vinifera (videi- ra), o gene identificado com Gene ID: 101510781 derivado de Cicer arietinum (grão-de-bico), o gene identificado com Gene ID: 101262598 derivado de Solanum lycopersicum (tomate), o gene identificado com Gene ID: 101212401 derivado de Cucumis sativus (pepino), o gene identificado com Gene ID: 100845156 derivado de Brachypodium dis- tachyon, o gene identificado com Gene ID: 101779750 derivado de Se- taria italica (milho painço), o gene identificado com Gene ID: SOR- Bl_01g046030 derivado de sorghum bicolor (sorgo) e o gene identifi- cado com Gene ID: Os03t0167600-01 derivado de Oryza sativa japo- nica (arroz japonês) foram observados como codificando as acil-CoA redutases que têm atividade para reduzir a acil-CoA para gerar um composto de aldeído nos microrganismos hospedeiros. As sequências comuns 1 e 2 caracterizam as acil-CoA redutases codificadas por es- ses 12 tipos de genes. [00106] Em particular, os resultados mostrados nas Figuras 5 e 6 e Tabela 4 demonstram que o gene identificado com Gene ID: 100776505 derivado de glicina max (soja), o gene identificado com Gene ID: 100801815 derivado de glicina max (soja) e o gene identifi- cado com Gene ID: 101510781 derivado de Cicer arietinum (grão-de- bico) codificam as acil-CoA redutases que têm a atividade descrita acima, que é particularmente notável. A Sequência comum 3 caracte- riza as acil-CoA redutases codificadas por esses 3 tipos de genes. [00107] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente cita- dos no presente documento estão incorporados em sua totalidade a título de referência.

Claims (16)

1. Microrganismo recombinante que compreende um ácido nucléico que codifica uma acil-CoA redutase caracterizado pelo fato de que compreende as sequências comuns que incluem as sequências de aminoácidos a seguir: GxGxxxFLxxKxxxxxGxTGFLxKVxIEKILRTx- PxVxKxxxxlKAxxxxxAxxRLxxxxxxxxxFxxLxxxxGxxYxxFxxxKLxPxx- GxxxxxxxGxxxxxxxxxAxxVDxxxNSAANTTFxERYDxAxxxNTxGxxxx- MxxAxxxxxLKLFLxxSTAYVNGQxQGxxxExPF (SEQ ID NO: 1), [26- 57aa] G LxRAxxxG W Q DTYVFTKAM G E M xxxxxRxxxP VxxxRP S VIE ST xx xPFPGWMEGxRMMDPxxLxYGKGQLxGFxxDPxGVxDVVPAD- M VVN ATLAxxAxH G (SEQ ID NO: 2), [9- 18aa]YxxxSSxxNPLxFxxLxxxxxxHxxxxPxxDxxGxPlxVxxM (SEQ ID NO:3), e [39-48aa] VxQxxxLxxlYxPYTFxxGRFDNxNxxxLxxx- MxxxExxxFxFDVxxxxWxDYIxNVHIPGLxxxVxKG (SEQ ID NO: 4) in- troduzidas em um microrganismo hospedeiro.

2. Microrganismo recombinante, de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizado pelo fato de que as sequências comuns inclu- em as sequências de aminoácidos a seguir: G(l/L)G(IA/)xxFLx(G/A)Kx(F/L)x(l/V)(T/S)G(A/G)TGFL(A/G)KV(L/F)IEKI LRTxP(D/N)V(G/N)K(l/M)(Y/F)x(L/V)IKA(K/E)xx(E/Q/D)(A/V)AxxRLx(N/ l/K)(E/D)(l/V)(IA//L)(N/D)(A/T)(E/Q/D)(V/L/l)Fx(0/G/R)L(Q/R/K)x(A/l/V/ T)(Y/H)G(K/N/E)(S/D/Y/G)Y(Q/H/M/S/D)xF(MA//l/A)(L/A/l)(S/A/R/N/K)K L(V/l)P(V/l)(A/L/V)Gx(V/l)(C/R)(G/E/D)x(S/N/D)(L/l/V)Gxxx(D/G/E)x(A/ S)xx(l/M)Ax(E/R/D/Q)VD(V/l)(l/FA/)(V/l)NSAANTTF(D/H)ERYD(l/T/V)A x(D/N)(l/V)NTxG(P/T)x(H/R/N)(L/l)Mx(F/l)A(K/H/Q)x(C/F)x(K/R/N)LKLF L(Q/H)(V/l)STAYVNGQ(R/K/T)QG(RA//L)(IA/)(M/L)E(K/R)PFxx(G/E)(D/ E/L)x(l/V)(A/R/E/l)x(E/D) (SEQ ID NO: 5), [17- 48aa]GL(E/Q)RAxxxGWQDTYVFTKAMGEM(V/M)(l/V)(D/N)x(M/L)R(G/ D)(E/D)(l/L/V)PV(V/A)x(l/M)RPSVIESTxx(E/D)PFPGWMEG(N/S)RMM DP(l/V)(V/l)L(Y/0/W)YGKGQL(T/S)GF(V/L)(AA/)DP(N/Y/E/D)GV(L/l)D VVPADMVVNATLA(A/S)(M/I)A(R/K/W)HG (SEQ ID NO: 6), [8- 17aa](V/l)Y(Q/H)x(A/T/S)SS(V/T/A)(V/A)NPL(IA//D/A)Fx(D/R/E)Lx(S/R/ D/K/T)(H/L/M/F)(F/L)xxHxx(S/R/G)(S/0)PxxDxxG(N/R/Q/T)PlxV(P/S)x M(K/R/S)(L/F)(F/L)x(S/T)(T/l/M/V/S)(E/D)x(F/L)(S/A)x(H/Y)(L/V/l)(W/E)( R/l )(D/Y)(A/V)xx(R/K)(S/R/C/A) (SEQ ID NO: 7), e [18- 26aa](K/R)(S/T)V(K/E)Q(A/T/L)(K/TA/)(Y/H)L(A/G)xlYxPYTF(Y/F)(G/P/ N)GRFDN(S/G)N(T/V)(Q/E)xL(M/L/I/F)xxM(0/S/T)(E/A/K/V/P)(E/K/A/N) E(K/R)xxFxFDVx(S/N/G)(l/L/V)(D/E)WxDYI(S/T)NVHIPGL(R/K)(R/K)(H /Y)V(M/L)KG (SEQ ID NO: 8).

3. Microrganismo recombinante, de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizado pelo fato de que a acil-CoA redutase é uma pro- teína (a) ou (b) abaixo: (a) uma proteína que compreende a sequência de aminoá- cido conforme mostrado em qualquer uma dentre as SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 e 36 ou (b) uma proteína que compreende uma sequência de ami- noácido que tem 70% ou mais de identidade com a sequência de ami- noácido conforme mostrado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 e 36 e que tem atividade de uma acil-CoA redutase.

4. Microrganismo recombinante, de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizado pelo fato de que as sequências comuns inclu- em as sequências de aminoácidos a seguir: MDAGS- LVLSQNGKSQA(E/D)I(L/V)VKDLVPY(D/G)G(P/T)T (SEQ ID NO: 9)[0- 2aa]TLIG(V/L)ED (SEQ ID NO: 10), [0- 1aa]GIGIVKFL(G/R)GKKFFITGATGFLAKV(F/L)IEKILRTEPDVGKMY(L /l)LIKAKN(K/N)Q(A/V)AMERLQ(N/K)EIINT(E/Q)LFRCL(Q/R)(E/Q)IHG KSYQAFMLSKLVP(V/I)VG(N/D)ICE(H/T)NLGLDE(G/D)(I/L)S(D/N)VIA( E/D)EVDV(l/F)VNSAANTTFDERYDTAININT(l/R)GP(0/S)RLM(N/A)IA KKCKKLKLFLHVSTAY- VNGQ(R/K)QGRIMERPFSIG(E/D)CIAREK(YL)IS(E/G)V(S/P)PKYLPT LDIE(G/N)EIN(L/M)V(S/L)(N/K)(Y/N)KG(D/N) (SEQ ID NO: 11) e [0- 1aa]IE(D/E)NLL(A/T)QKM(K/R)E(l/M)GLERA(R/K)RYGWQDTYVFTKA MGEMMID- KLR(G/D)DIPVV(V/I)(M/I)RPSVIEST(F/L)SEPFPGWMEGNRMMDP(I/ V)VL(C/W)YGKGQLTGFLVDPNGVLDVVPADMVVNATLAAMA(R/K)HG (V/M)(S/N/I)QK(P/A)DINVYQIASSVVNPL(V/A)FQDL(A/T)RLLYEHYSS SP(C/F)IDS(K/M)GRPIQVP(L/I)MK(L/F)FSS(T/S)EEFSGHLWRD(A/V)I (Q/N)K(R/S)G(L/I)T(A/S)(V/M)ASSK(G/A)KMSQKLEN(M/I)CRKSVEQA KYLA(N/K)IVEPYTFYGGRFDNSNTQRLME(S/I)MSE(K/E)EK(R/T)EF( G/D)FDVK(S/G)IDW(N/T)DYITNVHIPGLRR(H/Y)VMKGRGM(G/S)(S/N )Q (SEQ ID NO: 12).

5. Microrganismo recombinante, de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizado pelo fato de que a acil-CoA redutase é a proteí- na (a) ou (b) abaixo: (a) uma proteína que compreende a sequência de aminoá- cido conforme mostrado em qualquer uma dentre as SEQ ID NOs: 14, 16 e 18 ou (b) uma proteína que compreende uma sequência de ami- noácido que tem 70% ou mais de identidade com a sequência de ami- noácido conforme mostrado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 14, 16 e 18 e que tem atividade de uma acil-CoA redutase.

6. Microrganismo recombinante, de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizado pelo fato de que o microrganismo hospedeiro é selecionado a partir do grupo que consiste em Escherichia coli, Corynebacterium e levedura.

7. Microrganismo recombinante, de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizado pelo fato de que tem atividade de aldeído des- carbonilase para sintetizar um hidrocarboneto com uso de um aldeído como um substrato.

8. Microrganismo recombinante, de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizado pelo fato de que o microrganismo hospedeiro compreende um ácido nucléico que codifica um aldeído descarbonila- se que sintetiza um hidrocarboneto com uso de um aldeído como um substrato.

9. Microrganismo recombinante, de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizado pelo fato de que produz um hidrocarboneto que compreende uma cadeia carbônica de 13 a 15 átomos de carbono.

10. Microrganismo recombinante caracterizado pelo fato de compreende um ácido nucléico que codifica uma proteína (a) ou (b) abaixo introduzida em um microrganismo hospedeiro: (a) uma proteína que compreende a sequência de aminoá- cido conforme mostrado em qualquer uma dentre as SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 e 36 ou (b) uma proteína que compreende uma sequência de ami- noácido que tem 70% ou mais de identidade com a sequência de ami- noácido conforme mostrado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 e 36 e que tem atividade de uma acil-CoA redutase.

11. Microrganismo recombinante, de acordo com a reivindi- cação 10, caracterizado pelo fato de que o microrganismo hospedeiro é selecionado a partir do grupo que consiste em Escherichia coli, Corynebacterium e levedura.

12. Microrganismo recombinante, de acordo com a reivindi- cação 10, caracterizado pelo fato de que tem atividade de aldeído descarbonilase para sintetizar um hidrocarboneto com uso de um alde- ído como um substrato.

13. Microrganismo recombinante, de acordo com a reivindi- cação 10, caracterizado pelo fato de que o microrganismo hospedeiro compreende um ácido nucléico que codifica um aideído descarbonila- se que sintetiza um hidrocarboneto com uso de um aideído como um substrato.

14. Microrganismo recombinante, de acordo com a reivindi- cação 10, caracterizado pelo fato de que produz um hidrocarboneto que compreende uma cadeia carbônica de 13 a 15 átomos de carbo- no.

15. Método para produzir uma substância caracterizado pe- lo fato de que compreende uma etapa de cultivar o microrganismo re- combinante, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, em um meio que contém uma fonte de carbono e uma etapa de recuperar uma substância alvo a partir do microrganismo recombinante cultivado.

16. Método para produzir a substância, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a substância alvo é pelo menos um membro selecionado a partir do grupo que consiste em um aideído alifático, um álcool alifático e um hidrocarboneto.