CN116240189A - 一种转氨酶突变体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种转氨酶突变体SEQ ID NO:3，在该转氨酶突变体催化(2Z)‑4‑氧代‑4‑[3‑(三氟甲基)‑5,6‑二氢‑[1,2,4]三唑并[4,3‑a]吡嗪‑7‑(8H)‑基]‑1‑(2,4,5‑三氟苯基)丁‑2‑酮转化为西格列汀的反应体系中可以使用DMSO、甲醇、乙醇、丙醇或者异丙醇作为助溶剂。

Description

一种转氨酶突变体及其应用
技术领域
本发明属于酶催化技术领域，具体地说，涉及一种转氨酶突变体及其用于生产西格列汀的用途。
背景技术
西格列汀化学名称为7-[(3R)-3-氨基-1-氧代-4-(2,4,5-三氟苯基)丁基]-5,6,7,8-四氢-3-三氟甲基-1,2,4-三唑并[4,3-a]吡嗪，其磷酸盐一水合物是首次用于2型糖尿病治疗的二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制剂药物，可通过增加活性肠促胰岛激素的水平而改善血糖控制，具有不良反应发生率低、安全性好等优势。
西格列汀合成的关键步骤是手性氨基的合成，目前有两种方法可进行工业化生产。专利WO2004085378A1采用手性铑催化剂对烯胺的不对称氢化来构建手性中心，具有合成步骤短、路线简洁、底物转化率和产物光学纯度高等优点。专利CN102405281A是以Arthrobacter sp.(R)-ω-转氨酶为研究对象，通过联用定点饱和突变、全基因随机突变以及蛋白质结构计算机辅助设计等策略，最终获得了能在50％水-50％DMSO混合液相中高效催化(2Z)-4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮合成西格列汀的新型转氨酶。相比于化学合成法，利用酶法转化策略可使产物得率提高10～13％，生产效率提高53％，总废弃物排放减少19％，并且反应过程无需添加重金属。目前生物酶法成为合成手性医药化学品或化学中间体的优选方案。
Figure BDA0003397065020000011
Figure BDA0003397065020000021
申请人在专利文献202111141071X中报道了一种转氨酶突变体ATA55，其氨基酸序列是本申请中的SEQ ID NO.1，其具有很高的酶活力，可以高效地催化底物(2Z)-4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮(化合物I)反应生成目标产物西格列汀(化合物II)。在进一步商业化应用的生产工艺优化过程中，发现其对于反应体系中作为助溶剂的有机溶剂具有选择性/偏好性，似乎只适用于水-DMSO混合溶液反应体系，考虑到DMSO价格昂贵，后处理复杂，为了降低生产成本、尤其是原料成本，我们尝试使用廉价的大宗有机溶剂品种醇类溶剂比如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇等代替DMSO。然而，实验发现这些醇类溶剂对转氨酶ATA55有抑制作用，酶催化反应速度大幅度下降，构成了一种工艺优化的技术障碍。
发明内容
为了突破有机溶剂种类限制转氨酶ATA55用于催化制备西格列汀的工艺优化的瓶颈，降低西格列汀的生产成本，考虑到转氨酶是具有一定介电性质的蛋白质，不同有机溶剂对于同一种蛋白质的构象及构象稳定性的影响也不相同，我们将工作重点集中在转氨酶ATA55自身的改造上，包括酶固定化、酶的化学修饰、氨基酸突变，其中在氨基酸突变中取得了突破，获得了一种对有机助溶剂具有普适性即低选择性、且酶活力比转氨酶ATA55更高的突变酶。因此，本发明的技术方案如下所述：
一种转氨酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3：
MAKSADTPSNMYTHDTGLDYIKFSEYEGSADNNLNGGAAWIEGAFVPPSEARISVFDQGFYTSDATYTTFSVWHGNAFRLDDHIERLYSNAESMRLIPPLTQDEVKEIALELVAKTELRDAMVTVTFTRGLSSTPFERDITNHRPQVYMTAIPYVSIVPFDRIRNGVHAMVAQSVRRTPRSSIDPQVKNFQWGDLIRAIQETNDRGFELPVLLDCDGLLAEGPGFNVVVIKDGVVRSPGRAALPGITRKTVLEIAESLGHEAILADISLADLYDADEVLGCSTGGGVWPFVSVDGNPISDGVPGPVTQSIIRRYWELNVEPSQLLTPVQY(SEQ ID NO:3)。
本发明还提供了编码上述转氨酶突变体的基因。
在一种优选的实施方式中，上述基因的核苷酸序列可以为SEQ ID NO:4。
本发明的另一方面提供了一种包含上述基因的质粒。该质粒包含用于表达上述基因例如SEQ ID NO:4的载体，优选载体是PET系列，比如载体是pET22b、pET24a、pET28a等，但并不受限于此。
本发明的另一方面提供了一种用于表达上述转氨酶突变体SEQ ID NO:3的微生物，例如是转化了上述质粒的微生物。
优选地，所述微生物选自枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、大肠杆菌，更优选所述微生物是大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明的再一方面提供了上述转氨酶突变体SEQ ID NO:3或者其表达微生物在生产西格列汀中的用途。
具体而言，在生产西格列汀中，以西格列汀前体酮((2Z)-4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮)为底物原料，用上述转氨酶突变体SEQ ID NO:3或者其表达微生物作为催化剂来催化2-位氨基化反应，得到目标产物西格列汀。
优选地，上述反应体系中反应体系中包含磷酸吡哆醛作为辅酶。
上述反应体系中还可以包含邻苯二甲胺二盐酸、或者异丙胺和/或三乙醇胺作为氨基供体。
由于上述转氨酶突变体的热稳定性高，催化生产西格列汀时的酶反应温度可以为40-50℃，优选45℃左右。
反应体系pH值为8.0-9.0，优选8.5。
为了加快反应速度，可以在反应体系中加入有机溶剂作为底物的助溶剂，所述有机溶剂包括但不限于DMSO、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、或者它们两种以上的混合物。
当助溶剂是甲醇时，反应体系中甲醇浓度为10％-60％，优选50％。
进一步地，底物浓度可以为2-100g/L，优选100g/L。
本发明采用溶剂甲醇作为环境筛选压力，结合基因工程突变技术，对专利文献202111141071X中报道的转氨酶突变体ATA55(氨基酸序列为SEQ ID NO:1，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2)进行多轮突变后，筛选得到一种有机溶剂抑制性低、且酶活力更高的突变体SEQ ID NO:3，为西格列汀生产工艺的反应体系优化奠定了基础，提高了酶法合成西格列汀工艺路线的经济性。
具体实施方式
本发明是在专利文献202111141071X基础上完成的，故将该专利文献中的部分内容包括检测方法、菌株培养和发酵条件等引入本文作为参考。
为了筛选对有机溶剂具有低选择性即溶剂抑制性低、酶活力至少不低于转氨酶ATA55(氨基酸序列为SEQ ID NO:1)的突变体，本发明以转氨酶ATA55为初始酶继续进行突变，并通过施加环境压力方式来进行。初始酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1：
MAKSADTPSNMYTHDTGLDYIKFSEYEGSADNNLAGGAAWIEGAFVPPSEARISVFDQGFYTSDATYTTFSVWHGNAFRLDDHIERLYSNAESMRLIPPLTQDEVKEIALELVAKTELREAMVTVTFTRGLSSTPFERDITNHRPQVYMTAVPYQTIVPFDRIRNGVHAMVAQSVRRTPRSSIDPQVKNFQWGDLIRAIQETNDRGFELPVLLDCDGLLAEGPGFNVVVIKDGVVRSPGRAALPGITRKTVLEIAESLGHEAILADISLADLYDADEVLGCSTGGGVWPFVSVDGNPISDGVPGPVTQSIIRRYWELNVEPSQLLTPVQY(SEQ ID NO:1)。
在本文中，术语“起始(型)酶”、“初始(型)酶”、“出发酶”表示相同的意义，都是指氨基酸序列为SEQ ID NO:1的转氨酶。
经过环境加压结合基因工程突变，最终筛选出一种较为理想的突变体SEQ ID NO:3，其为起始酶第35位点的丙氨酸突变为天冬酰胺(A35N)、第120位的谷氨酸突变为天冬氨酸(E120D)、第152位点的缬氨酸突变为异亮氨酸(V152I)、第155位点的谷氨酰胺突变为缬氨酸(Q155V)、第156位点的苏氨酸突变为丝氨酸(T156S)的突变体。
有时为了表述方便起见，在本文中可以将起始酶与其突变体比如SEQ ID NO:3等统称为“转氨酶”。
本发明的转氨酶突变体SEQ ID NO:3的氨基酸数量有330个，且结构明确，因此本领域技术人员很容易获得其编码基因、包含这些基因的表达盒和质粒、以及包含该质粒的转化体。这些基因、表达盒、质粒、转化体可以通过本领域技术人员所熟知的基因工程构建方式获得。
为了在基因工程中最常用的大肠杆菌中最佳地表达转氨酶，可以对这些酶的表达基因进行了密码子优化。密码子优化是可用于通过增加感兴趣基因的翻译效率使生物体中蛋白质表达最大化的一种技术。不同的生物体由于突变倾向和天然选择而通常示出对于编码相同氨基酸的一些密码子之一的特殊偏好性。例如，在生长快速的微生物如大肠杆菌中，优化密码子反映出其各自的基因组tRNA库的组成。因此，在生长快速的微生物中，氨基酸的低频率密码子可以用用于相同氨基酸的但高频率的密码子置换。因此，优化的DNA序列的表达在快速生长的微生物中得以改良。
例如，为了在大肠杆菌中表达转氨酶，经密码子优化的起始转氨酶SEQ ID NO:1的编码基因可以是SEQ ID NO:2；转氨酶突变体SEQ ID NO:3的编码基因可以是SEQ ID NO:4。
上述转化体宿主可以使任何适合表达转氨酶的微生物，包括细菌和真菌。优选微生物是枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、或者大肠杆菌，优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌BL21(DE3)。
当作为生物催化剂用于生产西格列汀时，本发明的转氨酶可以呈现酶的形式或者菌体的形式。所述酶的形式包括游离酶、固定化酶，包括纯化酶、粗酶、发酵液、载体固定的酶等；所述菌体的形式包括存活菌体、死亡菌体、固定化菌体等。
当微生物比如枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母或者大肠杆菌不再进行发酵增殖、而是用于酶催化反应时，本身就是一种天然的固定化酶，而且不需要进行破碎处理、甚至提取纯化处理，就可以作为一种酶制剂用于催化反应。由于反应底物和反应产物都是小分子化合物，可以很方便地穿过菌体的生物屏障--细胞膜，因此不需要对菌体进行破碎处理，这在经济方面是有利的。
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例
本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。
材料和方法
实施例中的全基因合成、引物合成及测序皆由苏州金唯智生物科技有限公司完成。
实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、连接、感受态细胞制备、转化、培养基配制等等，主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。
PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。
LB培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，pH7.2。(LB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)
TB培养基：24g/L酵母提取物、12g/L胰蛋白胨、16.43g/L K2HPO4.3H2O、2.31g/LKH2PO4、5g/L甘油，pH7.0-7.5。(TB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)
HPLC检测底物和产物色谱条件：色谱柱C18(4.6×250mm，5μm)；流动相A为50mM磷酸二氢钾溶液(pH3.00)，流动相B为乙腈，流动相A：流动相B＝1：1；流速1.0mL/min；检测波长为254nm。
HPLC手性检测色谱条件：色谱柱CHIRALPAK AD-H(4.6×250mm，5μm)；流动相为正己烷：乙醇：三乙胺(40：60：0.1)；流速为0.7mL/min，检测波长为268nm。
需说明的是，为描述方便起见，在实施例中，可将菌株编号、质粒编号、酶编号、酶编码基因编号共用一个编号，这是本领域技术人员容易理解的，即同一个编号在不同环境中可以指代不同的生物形式。
实施例1：初始型转氨酶基因重组大肠杆菌的构建
参照专利文献202111141071X中实施例1的方法，以初始酶ATA55的氨基酸序列SEQID NO:1为基础，根据大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化，委托苏州金唯智生物科技有限公司合成其编码基因SEQ ID NO:2，并克隆到质粒pET28a的NcoI、BamHI位点，获得质粒pET-AT55。
通过电转化将重组质粒pET-AT55转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)，得到表达初始转氨酶的重组大肠杆菌EcAT55。
可选地，也可以直接使用专利文献202111141071X实施例9中的菌株EcATA55进行实验。
实施例2：第1轮和第2轮随机突变点文库建立及甲醇环境下高通量筛选
1、易错PCR法构建随机突变点库
以质粒pET-AT55为模板，利用易错PCR技术构建随机突变体文库。
设计如下引物对AT-5/AT-3：
正向引物AT-5：5’-CTTTAAGAAGGAGATATACCATG-3’，
反向引物AT-3：5’-GAGCTCGAATTCGGATCCTTA-3’。
以质粒pET-AT55为模板，进行PCR扩增，获得约1.0kb的转氨酶突变体DNA序列。
50μL易错PCR反应体系包括：10ng质粒(pET-AT55)模板，50pmol一对引物AT-5和AT-3，1×Taq buffer，0.2mM dGTP，0.2mM dATP，1mM dCTP，1mM dTTP，7mM MgCl2，(0mM、0.05mM、0.1mM、0.15mM、0.2mM)MnCl2，2.5个单位的Taq酶(Takara)。
PCR反应条件为：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃2min/kbp，30个循环；72℃10min。
对PCR产物电泳、胶回收(Axygen DNA凝胶回收试剂盒AP-GX-50)。以质粒pET-AT55为模板，以约1.0kb的回收产物(随机突变片段)作为大引物，用KOD-plus DNA聚合酶做MegaPrimer PCR：94℃5min，；98℃10s，60℃30s，68℃2min/kb，25个循环；68℃10min。DpnI限制性内切酶(Thermo公司)消化质粒模板，电转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，得到超过104个克隆的随机突变库。
2、突变体库的甲醇环境下高通量筛选
挑取单菌落至96孔板(每孔含有110μL的液体LB-Kan培养基)，在37℃、400rpm条件下孵育5h后，从每孔中取出60μL的菌液到96孔深孔板(每孔含有240μL的液体TB-Kan-0.2mMIPTG)，在25℃、400rpm条件下孵育12～16h。在4℃、4000rpm条件下离心10min收集菌体，去除上清培养液。随后，用预冷的生理盐水洗涤菌体，在4℃、4000rpm条件下离心10min收集菌体，去除上清液。每孔加200μL酶反应液(70mM三乙醇胺、70mM邻苯二甲胺二盐酸、0.5g/L磷酸吡哆醛、5g/L化合物I(西格列汀前体酮)、30％甲醇，调pH值为8.5进行反应。重悬菌体，在45℃、250rpm条件下孵育1～5h，检测475nm波长数值。
选择活力明显提升的菌株进行核酸测序，确定氨基酸突变位点，同时HPLC检测这些菌种反应产物的ee值，选择产物ee值大于99.95％，且酶活力改善最高的菌株作为下一轮随机突变体库建库的出发菌株。委托苏州金唯智生物科技有限公司对酶活力最高的菌株进行基因组测序比对，确定其氨基酸序列改变情况。重复随机突变库建立和以化合物I为底物、甲醇助溶反应体系的高通量筛选。筛选结果参见表1。
表1、第1轮到第2轮随机突变库高通量筛选结果
Figure BDA0003397065020000071
Figure BDA0003397065020000081
备注：“+”代表与吸光值差值相对出发菌株反应数值在大于0小于0.05；“++”代表与吸光值差值相对出发菌株反应数值在大于0.05小于0.1；“+++”代表与吸光值差值相对出发菌株反应数值在大于0.1小于0.2。
从突变库中筛选出酶活力最高的ATA59表达菌株EcAT59用于下一步实验。
实施例3：第3轮到第4轮随机突变点文库建立及更高甲醇浓度环境下高通量筛选
1、易错PCR法构建随机突变点库
以转氨酶突变体ATA59的氨基酸序列为基础，参照实施例1的方法构建质粒pET-AT59和表达突变体ATA59的重组大肠杆菌EcAT59；参照实施例2步骤1的方法构建转氨酶ATA59的随机突变点文库。
2、突变体库的高通量筛选
挑取单菌落至96孔板(每孔含有110μL的液体LB-Kan培养基)，在37℃、400rpm条件下孵育5h后，从每孔中取出60μL的菌液到96孔深孔板(每孔含有240μL的液体TB-Kan-0.2mMIPTG)，在25℃、400rpm条件下孵育12～16h。在4℃、4000rpm条件下离心10min收集菌体，去除上清培养液。随后，用预冷的生理盐水洗涤菌体，在4℃、4000rpm条件下离心10min收集菌体，去除上清液。每孔加200μL酶反应液(70mM三乙醇胺、70mM邻苯二甲胺二盐酸、0.5g/L磷酸吡哆醛、20g/L化合物I、50％甲醇，调pH值为8.5进行反应。重悬菌体，在45℃、250rpm条件下孵育5小时，检测475nm波长数值。
3、选择活力明显提升的菌株进行核酸测序，确定氨基酸突变位点，同时HPLC检测这些菌种反应产物的ee值，选择产物ee值大于99.95％，且酶活力最高的菌株作为下一轮随机突变体库建库的出发菌株，重复随机突变库建立及以化合物I为底物、甲醇助溶反应体系的高通量筛选。筛选结果参见表2。
表2、第3轮到第4轮随机突变库高通量筛选结果
Figure BDA0003397065020000082
Figure BDA0003397065020000091
备注：“+”代表活力百分比相对各自出发菌株大于0％小于等于50％；“++”代表活力百分比相对各自出发菌株大于50％小于等于100％；“+++”代表活力百分比相对各自出发菌株大于100％小于等于200％；“++++”代表活力百分比相对各自出发菌株大于200％。
从表2中可以看出，菌株EcAT64的酶活相对最高，其表达的转氨酶突变体ATA64的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，对应的编码基因的核酸序列为SEQ ID NO:4。
实施例4：转氨酶突变体ATA64用于西格列汀的合成
在1L反应体系中，利用EcAT64全细胞催化西格列汀前体酮(化合物I)不对称合成西格列汀(化合物II)。总反应体系包括：100mM三乙醇胺、1M异丙胺、0.5g/L磷酸吡哆醛、100g/L化合物Ⅰ、25g细胞(湿重)，50％甲醇。100g化合物I溶于甲醇中，以1mL/min的流速流加到反应体系中。利用盐酸或异丙胺控制反应体系的pH值在8.5左右。反应8-12h结束。
HPLC检测结果显示，反应12h后，产物摩尔生成率超过97％，产物e.e.值大于99.95％。而在相同条件下利用初始酶ATA55表达菌株EcAT55全细胞催化西格列汀前体酮不对称合成西格列汀，产物摩尔生成率只有大约20％。该实验证明转氨酶突变体ATA64不被甲醇抑制，并在一定程度上证明转氨酶突变体ATA64的酶活力高于初始酶ATA55。
实施例5：转氨酶突变体ATA64的有机溶剂适应性
按照实施例4的方法考察EcAT64全细胞催化西格列汀前体酮反应合成西格列汀的反应体系，与实施例4不同的是，反应体系中采用除甲醇以外的其他可以与水形成混合溶液体系的有机溶剂，包括DMSO和其他廉价的醇类等。实验发现，EcAT64全细胞在使用DMSO、乙醇、丙醇、异丙醇的反应体系中的反应速度基本相同，相差不大，表明DMSO、甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇对转氨酶突变体ATA64没有抑制性或者抑制性较低，提示转氨酶突变体ATA64适用于包含这些有机溶剂作为助溶剂的反应体系。另外，对比实验还发现，醇类比如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇等对初始酶ATA55有相当大的抑制性。
综上所述，本发明在甲醇为有机助溶剂的环境压力下，经过多轮突变后，筛选得到一种有机溶剂种类适应性更广、且酶活力更高的突变体SEQ ID NO:3，为实现酶催化法生产西格列汀的工业化奠定了基础。
序列表
<110> 上海邦林生物科技有限公司
<120> 一种转氨酶突变体及其应用
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<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 1
Met Ala Lys Ser Ala Asp Thr Pro Ser Asn Met Tyr Thr His Asp Thr
1 5 10 15
Gly Leu Asp Tyr Ile Lys Phe Ser Glu Tyr Glu Gly Ser Ala Asp Asn
20 25 30
Asn Leu Ala Gly Gly Ala Ala Trp Ile Glu Gly Ala Phe Val Pro Pro
35 40 45
Ser Glu Ala Arg Ile Ser Val Phe Asp Gln Gly Phe Tyr Thr Ser Asp
50 55 60
Ala Thr Tyr Thr Thr Phe Ser Val Trp His Gly Asn Ala Phe Arg Leu
65 70 75 80
Asp Asp His Ile Glu Arg Leu Tyr Ser Asn Ala Glu Ser Met Arg Leu
85 90 95
Ile Pro Pro Leu Thr Gln Asp Glu Val Lys Glu Ile Ala Leu Glu Leu
100 105 110
Val Ala Lys Thr Glu Leu Arg Glu Ala Met Val Thr Val Thr Phe Thr
115 120 125
Arg Gly Leu Ser Ser Thr Pro Phe Glu Arg Asp Ile Thr Asn His Arg
130 135 140
Pro Gln Val Tyr Met Thr Ala Val Pro Tyr Gln Thr Ile Val Pro Phe
145 150 155 160
Asp Arg Ile Arg Asn Gly Val His Ala Met Val Ala Gln Ser Val Arg
165 170 175
Arg Thr Pro Arg Ser Ser Ile Asp Pro Gln Val Lys Asn Phe Gln Trp
180 185 190
Gly Asp Leu Ile Arg Ala Ile Gln Glu Thr Asn Asp Arg Gly Phe Glu
195 200 205
Leu Pro Val Leu Leu Asp Cys Asp Gly Leu Leu Ala Glu Gly Pro Gly
210 215 220
Phe Asn Val Val Val Ile Lys Asp Gly Val Val Arg Ser Pro Gly Arg
225 230 235 240
Ala Ala Leu Pro Gly Ile Thr Arg Lys Thr Val Leu Glu Ile Ala Glu
245 250 255
Ser Leu Gly His Glu Ala Ile Leu Ala Asp Ile Ser Leu Ala Asp Leu
260 265 270
Tyr Asp Ala Asp Glu Val Leu Gly Cys Ser Thr Gly Gly Gly Val Trp
275 280 285
Pro Phe Val Ser Val Asp Gly Asn Pro Ile Ser Asp Gly Val Pro Gly
290 295 300
Pro Val Thr Gln Ser Ile Ile Arg Arg Tyr Trp Glu Leu Asn Val Glu
305 310 315 320
Pro Ser Gln Leu Leu Thr Pro Val Gln Tyr
325 330
<210> 2
<211> 990
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
atggcaaaaa gtgctgatac accctcaaat atgtatacgc atgataccgg tcttgactac 60
atcaagttca gcgagtacga aggtagcgca gacaacaacc tggctggtgg cgcggcatgg 120
attgaaggcg cgttcgtgcc accgtccgag gcgcgtatct ccgtctttga ccagggtttt 180
tacaccagcg acgcgaccta tactacgttt agtgtgtggc acggcaacgc gttccgcttg 240
gacgaccaca tcgagcgttt gtacagcaat gcggagagca tgcgtctgat tccgccgctg 300
acccaagatg aggtgaaaga aatcgctctg gaattggttg cgaaaacgga actgcgtgaa 360
gctatggtta cggtgacctt tacccgtgga ttaagctcga ccccgttcga gcgcgatatc 420
acgaaccatc gaccgcaagt ttatatgacc gcagttccgt atcagaccat tgtcccattc 480
gatcgcatcc gcaatggtgt gcacgcgatg gtggcacagt ctgtgcgtcg taccccgcgt 540
agcagcattg atccgcaagt gaagaacttt cagtggggtg atctgattag agccatccaa 600
gagaccaacg atcgtggttt cgaacttccg gttctgctgg actgtgatgg tttactggct 660
gagggccctg gcttcaacgt tgtggttatt aaggacggcg tcgtacgctc tccgggccgt 720
gcggcactgc cgggtattac ccgtaaaacc gttctggaga tcgcggagtc gctgggtcat 780
gaagccatcc tggcggacat ttctttggct gacctctacg atgcggacga ggttctgggc 840
tgcagcactg gtggcggtgt ttggccattt gttagcgtcg atggtaatcc gatttccgac 900
ggcgtcccgg gtccggtaac acaaagcatc atccgccgtt actgggaatt gaatgtggaa 960
ccgtcccagc tgttgacccc ggtgcagtat 990
<210> 3
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 3
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1 5 10 15
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115 120 125
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130 135 140
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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Claims (10)

1.一种转氨酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3。
2.编码如权利要求1所述转氨酶突变体的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:4。
4.包含如权利要求3所述基因的质粒。
5.一种用于表达如权利要求1所述转氨酶突变体的微生物，其特征在于，转化了如权利要求4所述质粒的微生物。
6.如权利要求5所述的微生物，其特征在于，是所述微生物选自枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、大肠杆菌。优选所述微生物是大肠杆菌BL21(DE3)。
7.如权利要求1所述转氨酶突变体或者如权利要求5所述微生物在生产西格列汀中的用途。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，以(2Z)-4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮为反应底物，采用如权利要求1所述转氨酶突变体或者如权利要求5所述微生物催化氨基转移反应，得到西格列汀。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，反应体系中包含磷酸吡哆醛作为辅酶。
10.如权利要求8所述的用途，其特征在于，反应体系中还包含邻苯二甲胺二盐酸、或者异丙胺和/或三乙醇胺作为氨基供体。
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