CN107739742A

CN107739742A - 一种全细胞催化生产l‑赤藓酮糖的方法

Info

Publication number: CN107739742A
Application number: CN201710973667.3A
Authority: CN
Inventors: 杨建刚; 孙媛霞; 朱玥明; 戴隆海; 张颖
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2017-10-18
Filing date: 2017-10-18
Publication date: 2018-02-27

Abstract

本发明公开了一种全细胞催化生产L‑赤藓酮糖的方法，其特征为通过构建含有甲醛连接酶和D‑果糖‑6磷酸醛缩酶的大肠埃希氏菌重组菌株，并制备全细胞催化剂，以单一甲醛或者组合甲醛和二羟丙酮合成L‑赤藓酮糖，该方法可以耐受底物浓度为1.5mol/L，合成153g/L L‑赤藓酮糖，采用该全细胞催化剂循环反应10次，仍可以保持73％转化率；采用固定化细胞策略可以提高底物耐受浓度至2mol/L，循环转化10次，仍可以保持53％转化率。相比目前报道的发酵法生产，具有底物耐受浓度高、产物合成效率高、产物单一便于分离的优势，具有工业化应用潜力，该方法具有底物廉价、转化率高的优点，为一碳化合物的高附加值利用提供基础。

Description

一种全细胞催化生产L-赤藓酮糖的方法

技术领域

本发明属于生物制造领域，具体涉及一种全细胞催化合成L-赤藓酮糖的方法。

背景技术

L-赤藓酮糖是一种稀有糖，其主要用途是作为人工美黑剂，应用于化妆品行业，该化合物与皮肤外部或者老死表层中的角蛋白氨基酸发生反应，使皮肤变成棕色，进而起到美黑效果，该美黑效果不存在引起皮肤癌变的风险，同时还可有效阻止皮肤水分的过度蒸发，起到保湿、防晒的作用；该化合物和目前常用的美黑剂化合物二羟丙酮相比，具有使皮肤缓慢变黑、可产生自然、同质和持久的棕褐色、无特殊气味、皮肤安全、可为肌肤补水等优点。此外L-赤藓酮糖还是多种抗感染药物的前体，作为鞣剂的主要成分应用于医药、工业等领域，具有很高的应用价值。

L-赤藓酮糖主要通过微生物以赤藓糖醇为底物发酵生产，这些工业菌株大都含有赤藓糖醇脱氢酶。目前报道较多的L-赤藓酮糖生产菌株为葡萄糖酸杆菌属(Gluconobacter)和醋杆菌属(Acetobacter)，如Gluconobacter oxydans ATCC621、Gluconobacter oxydans DSM7145、Acetobacter suboxydans、Acetobacter xylinum等。中国专利文献CN103952334A(申请号201410112899.6)公开了一种微生物发酵生产L-赤藓酮糖的菌株HD385和方法，该菌株发酵赤藓糖醇生产L-赤藓酮糖的方法，其在好氧条件下能显著地积累L-赤藓酮糖，然而该方法存在底物耐受性差、产率低、分离提取成本高等问题，所以有必要开发一种底物耐受浓度高、生产速率高、分离纯化成本低、环境友好等L-赤藓酮糖合成方法。

发明目的

本发明目的之一是提供一种生产L-赤藓酮糖的方法，其特征在于：甲醛连接酶和D-果糖-6-磷酸醛缩酶催化甲醛生成L-赤藓酮糖。

在优选的实施方式中，所述的方法，其特征在于，所述的甲醛连接酶来源于荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，所述的D-果糖-6-磷酸醛缩酶来源于大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。

在优选的实施方式中，所述的方法，其特征在于，所述的甲醛连接酶的氨基酸序列为(a)或(b)：(a)SEQ ID NO：1，(b)与SEQ ID NO：1具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列；所述的D-果糖-6-磷酸醛缩酶的氨基酸序列为(c)或(d)：(c)SEQID NO：2，(d)与SEQ ID NO：2具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列。

在更优选的实施方式中，本发明目的上述的任一方法，其特征在于，催化反应体系中甲醛含量10-100mM，优选的甲醛含量50mM，缓冲液pH为6-8，优选pH为7.5，催化反应条件为20℃-37℃，优选的温度30℃，反应时间2-24小时，优选反应时间24小时。

本发明目的之二是提供一种在存在全细胞催化剂的条件下循环催化合成L-赤藓酮糖的方法，其特征在于：底物为甲醛和二羟丙酮，所述全细胞催化剂包含D-果糖-6-磷酸醛缩酶。

在优选的实施方式中，所述的方法，其特征在于，所述的D-果糖-6-磷酸醛缩酶的氨基酸序列为(a)或(b)：(a)SEQ ID NO：2，(b)与SEQ ID NO：2具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列。

在更优选的实施方式中，本发明目之二的上述的方法，催化的反应体系中添加全细胞催化剂，直至菌体初始密度OD₆₀₀为40-120，优选的菌体初始密度为80，甲醛1-2mol/L，优选甲醛1.5mol/L，二羟丙酮1-2mol/L，优选二羟丙酮1.5mol/L；催化反应条件为，温度为25-30℃，pH为6-8，反应时间为2-4h；反应结束后，离心分别收集上清和沉淀，沉淀作为全细胞催化剂再次催化合成L-赤藓酮糖。

在最优选的实施方式中，本发明目之二的上述的任一方法，其特征在于，循环次数2-10次，优选的10次。

本发明目的之三是提供一种应用固定化全细胞珠循环催化合成L-赤藓酮糖的方法，其特征在于，以海藻酸钠为固定化材料，包埋含有D-果糖-6-磷酸醛缩酶的大肠杆菌重组菌株，制备成固定化全细胞珠，催化甲醛和二羟丙酮合成L-赤藓酮糖。

在更优选的实施方式中，本发明目的上述的固定化细胞循环催化合成L-赤藓酮糖的方法，其特征在于，催化的反应体系中固定化细胞材料含量为5-15g/L，优选的固定化细胞材料含量为10g/L，甲醛1-2mol/L，优选的甲醛2mol/L，二羟丙酮1-2mol/L，优选的二羟丙酮2mol/L；催化反应条件为，温度为25-30℃，pH为6-8，反应时间为2-4h；反应结束后，离心分别收集上清和沉淀，沉淀作为固定化全细胞珠再次催化合成L-赤藓酮糖。

在最优选的实施方式中，本发明目之三的上述任一的方法，其特征在于，循环次数为2-10次，优选的10次。

本发明目的四：提供一种以甲醛为单一底物全细胞催化合成L-赤藓酮糖的方法，其特征为构建含有来源于荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的甲醛连接酶(formolase)(序列表SEQ ID NO：1)和来源于大肠埃希氏菌(Escherichia coli)果糖-6-磷酸醛缩酶(D-fructose-6-phosphate aldolase，FSA)的突变体(序列表SEQ ID NO：2)的重组大肠杆菌1，并用重组菌株1制备全细胞催化剂，以甲醛为唯一底物合成L-赤藓酮糖。

所述甲醛连接酶FLS催化甲醛转化为二羟丙酮，所述果糖-6-磷酸醛缩酶FSA催化甲醛和二羟丙酮合成L-赤藓酮糖。

所述全细胞催化体系包括底物甲醛10-100mM，全细胞催化剂(10-20g CDWL^-1)，三乙醇胺缓冲液(50mM，pH 7.5)，反应条件为：温度30℃，转速120rpm，反应12h。

所述全细胞催化剂的制备方法包括以下步骤：挑取含有果糖-6-磷酸醛缩酶突变体基因的大肠埃希氏菌重组菌株单菌落，接种至4mL LB培养基中，在37℃、200rmp条件下，培养过夜。按照1％的接种量，将种子液接种于100mL培养基中，在37℃、200rmp条件下，培养2-3h；当菌体浓度OD₆₀₀达到0.6-0.8时，添加终浓度为1mmol的IPTG，同时降低培养温度至20℃，摇床转速降低至120rmp，诱导时间为20h；将诱导得到的大肠埃希氏菌重组菌株菌液，4℃、6000rmp离心10min收集菌体，并用三乙醇胺缓冲液(50mmol pH 7.0)洗涤菌液三次，最终用三乙醇胺缓冲液浓缩，制成全细胞催化剂。

本发明目的五：提供一种全细胞循环催化合成L-赤藓酮糖的方法，其特征为，构建含有果糖-6-磷酸醛缩酶突变体基因的大肠杆菌重组菌株2，并用重组菌株2制备全细胞催化剂，以甲醛和二羟丙酮为底物合成L-赤藓酮糖，全细胞催化剂可以循环使用多次，并保持较高的转化率。

所述全细胞催化反应体系包括全细胞催化剂(10-30g CDWL^-1)，二羟丙酮1-2mol/L，甲醛1-2mol/L，三乙醇胺(100mM，pH 7.5)，反应条件为：温度30℃，转速120rpm，反应2h。

本发明目的六：提供一种固定化细胞循环催化合成L-赤藓酮糖的方法，其特征为，采用海藻酸钠作为固定化材料，包埋静息细胞制备成固定化细胞，并用固定化细胞催化甲醛和二羟丙酮合成L-赤藓酮糖，固定化细胞可以循环使用多次，并保持较高的转化效率。

所述静息细胞为重组菌株经诱导和处理后的一种细胞状态，其制备包括以下步骤，挑取含有果糖-6-磷酸醛缩酶突变体基因的大肠杆菌重组菌株2，接种至4mL LB培养基中，在37℃、200rmp条件下，培养过夜。按照1％的接种量，将种子液接种于100mL培养基中，在37℃、200rmp条件下，培养2-3h；当菌体浓度OD₆₀₀达到0.6-0.8时，添加终浓度为1mmol的IPTG，同时降低培养温度至20℃，摇床转速降低至120rmp，诱导时间为20h；将诱导得到的大肠埃希氏菌重组菌株菌液，4℃、6000rmp离心10min收集菌体，并用三乙醇胺缓冲液(50mmolpH 7.0)洗涤菌液三次，最终用水缓冲液浓缩，制成静息细胞。

所述固定化细胞的制备方法包括以下步骤，将3％的海藻酸钠与静息细胞按照1∶2的体积比混合，并将混合液加入预冷的浓度为0.4％的CaCl₂溶液中，4℃放置3h制备成固定化细胞珠，用于催化反应。

本发明与现有L-赤藓酮糖生产方法相比，具有以下优点：

(1)成本低廉，以市场中廉价的甲醛为原料；

(2)果糖-6-磷酸醛缩酶催化的缩醛反应构型专一，没有副产物产生，全细胞催化剂可以重复利用，后期分离工艺简单；

(3)该全细胞催化生产工艺可以耐受较高的底物浓度；

(4)该全细胞催化生产工艺具有生产效率高的优势。

附图说明

图1全细胞催化甲醛合成L-赤藓酮糖反应技术路线。

图2全细胞催化甲醛合成L-赤藓酮糖高效液相色谱分析结果。

图3全细胞催化二羟丙酮和甲醛合成L-赤藓酮糖高效液相色谱分析结果。

图4全细胞循环催化二羟丙酮和甲醛合成L-赤藓酮糖反应结果。

具体实施方式

以下结合实施例进一步详述本发明。

本发明及实施例中提到的百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。

各实施例中所用相同名称的材料或试剂如无特别说明即为相同的。实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为实施本发明时对生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

本发明中所用引物由江苏金唯智生物技术有限公司合成。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1、全细胞催化甲醛合成L-赤藓酮糖

1、含有甲醛连接酶和果糖-6-磷酸醛缩酶突变体重组菌株的构建

首先，委托江苏金唯智生物技术有限公司全基因合成了甲醛连接酶基因序列(序列表SEQ ID NO：3)和果糖-6-磷酸醛缩酶突变体基因序列(序列表SEQ ID NO：4)。

其次，设计引物1、引物2、引物3和引物4，引物1和引物3中含有NdeI酶切位点，引物2和引物4中有HindIII酶切位点。

引物序列如下：

引物1：5’-GGGTTTCATATGCATCATCACCATCACCATACTGATTTATCTGCAAGCAGCCTG-3’

引物2：5’-AAAACCGTGGGCATCAAACCGGCGGGCGGCGTGCGTACTG-3’

引物3：5’-AACCGTGGGCATCAAACCGGCGGGCGGCGTG-3’

引物4：5’-ACTCAAGCTTTTAGCTGCTGGCGCTCTTACCGTC-3’

以含有甲醛连接酶基因的质粒pUC57-FLS(由江苏金唯智生物技术有限公司完成)为模板，用引物1和引物2扩增甲醛连接酶基因fls片段，用限制性内切酶NdeI和HindIII同时对甲醛连接酶基因FLS和pET21a酶切，然后用T4DNA连接酶进行连接得到含有甲醛连接酶基因FLS的载体质粒，命名为pET21-FLS。

以含有果糖-6-磷酸醛缩酶突变体基因的质粒pUC57-FSA(由江苏金唯智生物技术有限公司完成)为模板，用引物3和引物4扩增果糖-6-磷酸醛缩酶突变体基因fsa片段，用限制性内切酶NdeI和HindIII同时对果糖-6-磷酸醛缩酶突变体基因fsa和pACYCDuet酶切，然后用T4DNA连接酶进行连接得到含有果糖-6-磷酸醛缩酶突变体基因fsa的载体质粒，命名为pACYC-FSA。

再次，将上述重组质粒pET21-FLS和pACYC-FSA采用化学转化进入大肠埃希氏菌BL21(DE3)中，得到两种大肠埃希氏菌重组菌株1。

2、全细胞催化剂的制备

首先，培养及诱导分别含有甲醛连接酶和果糖-6-磷酸醛缩酶突变体基因的大肠埃希氏菌重组菌株1，选用LB培养基(蛋白胨(10g/L)，酵母抽提物(5g/L)，氯化钠(10g/L)，培养基中添加氨苄抗生物(100mg/L)，在37℃、200rmp条件下对大肠埃希氏菌重组菌株进行培养，当OD₆₀₀达到0.6-0.8时，添加IPTG，终浓度为1mmol，降低摇床转速为120rmp，诱导约20h。

其次，收集和浓缩大肠埃希氏菌重组菌株，将诱导得到的重组菌株菌液(100mL)，4℃、8000rmp离心15min收集菌体，用三乙醇胺缓冲液(50mmol，pH 7.0)洗涤菌液两次，最终用三乙醇胺缓冲液(50mmol，pH 7.0)浓缩菌液至2mL。

3、全细胞催化甲醛合成L-赤藓酮糖

采用如上所述制备的全细胞催化剂合成L-赤藓酮糖，反应体系(2mL)中含有甲醛(50mM)，全细胞催化剂10g CDW L^-1，三乙醇胺缓冲液(50mM，pH 7.5)，反应条件为：温度30℃，pH 7.5，转速120rpm，反应24h。样品14000rmp条件下离心20min，并用0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液做高效液相分析。高效液相色谱分析按如下条件进行：仪器为安捷伦高效液相色谱仪1200，分析柱：Sugar-Pak，流动相：超纯水，流速：0.4mL/min，柱温：80℃，检测器：示差折光检测器，上样量为10μl。

高效液相色谱结果如图2所示，图(a)为L-赤藓酮糖标品，图(b)为反应液，全细胞催化甲醛合成2.3g/L L-赤藓酮糖。

本发明提供了以甲醛为单一底物全细胞催化合成L-赤藓酮糖的方法，该方法目前受限于甲醛连接酶低酶活性，任何通过酶分子改造提高甲醛连接酶活性的方法，都将提高L-赤藓酮糖的合成效率。

实施例2、利用全细胞循环催化甲醛和二羟丙酮合成L-赤藓酮糖

1、构建含有果糖-6-磷酸醛缩酶突变体基因的大肠杆菌重组菌株2

以含有果糖-6-磷酸醛缩酶突变体基因的质粒pUC57-FSA(由江苏金唯智生物技术有限公司完成)为模板，用引物3和引物4扩增果糖-6-磷酸醛缩酶突变体基因fsa片段，用限制性内切酶NdeI和HindIII同时对果糖-6-磷酸醛缩酶突变体基因fsa和pET21酶切，然后用T4DNA连接酶进行连接得到含有果糖-6-磷酸醛缩酶突变体基因fsa的载体质粒，命名为pET21-FSA。

2、制备含果糖-6-磷酸醛缩酶突变体的全细胞催化剂

携带有果糖-6-磷酸醛缩酶突变体基因的大肠埃希氏菌重组菌株2的培养、诱导、收集和浓缩步骤与实施案例1中步骤二相同。

3、L-赤藓酮糖的循环转化生产

取10mL表达有果糖-6-磷酸醛缩酶突变体的大肠埃希氏菌重组菌株浓缩菌液，放置于50mL的锥形瓶中，控制反应体系的初始菌体浓度OD₆₀₀为80(20g CDWL^-1)，加入终浓度为1.5mol/L的二羟丙酮和甲醛，采用三乙醇胺缓冲液100mM，控制反应pH为7.5，进行全细胞催化反应，反应条件为：温度30℃，pH 7.0，120rmp，反应2小时，反应结束后，14000rmp离心20min，离心收集菌体，并重新加入终浓度为1.5mol/L的二羟丙酮和甲醛，循环10次，每次反应结束均收集上清，上清样品经0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液做高效液相分析。

高效液相色谱分析按如下条件进行与实施案例一中一致，高效液相色谱结果如图3表示(图(a)为L-赤藓酮糖标品，图(b)为反应液)，第一次反应转化率为85％，L-赤藓酮糖浓度为153g/L；循环10次，转化率仍保持70％，为初始转化率的83％。

实施例3、利用固定化细胞循环催化甲醛和二羟丙酮合成L-赤藓酮糖

1、制备表达有果糖-6-磷酸醛缩酶突变体基因的静息细胞

携带有果糖-6-磷酸醛缩酶突变体基因的大肠埃希氏菌重组菌株2的培养、诱导、收集步骤与实施案例1中步骤二相同，菌体浓缩时，采用水溶液进行浓缩，并且浓缩，使得初始菌体浓度OD₆₀₀为400。

2、固定化细胞珠的制备

将3％的海藻酸钠与静息细胞按照1∶2的体积比混合，并将混合液加入预冷的浓度为0.4％的CaCl₂溶液中，4℃放置3h制备成含有不同细胞载量的固定化细胞珠。

3、固定化细胞循环催化合成L-赤藓酮糖

反应体系中含有固定化细胞珠10g/L，甲醛和二羟丙酮底物浓度为2mol/L，三乙醇胺缓冲液100Mm，pH 7.5；反应条件：温度30℃，pH 7.0，120rmp，反应2小时，反应结束后，14000rmp离心20min，离心收集菌体，并重新加入终浓度为2mol/L的二羟丙酮和甲醛，循环10次，每次反应结束均收集上清，上清样品经0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液做高效液相分析。

结果显示，采用固定化细胞珠催化甲醛和二羟丙酮合成L-赤藓酮糖，首次反应终止时转化率达到74％，L-赤藓酮糖浓度为177.6g/L；循环10次，仍可以保持73％的转化率。

使用本发明的全细胞催化合成L-赤藓酮糖，具有底物耐受性高、产物合成效率高、便于分离纯化的优点，为L-赤藓酮糖工业化生产提供了可能。本发明采用的底物之一为二羟丙酮，二羟丙酮本身可用于人工美黑剂，所以通过全细胞催化获得的L-赤藓酮糖，可以直接配合二羟丙酮使用；本发明采用的底物二羟丙酮可以通过甘油脱氢合成，甲醛可以通过甲醇脱氢合成，为进一步降低生产成本提供基础；本发明所合成的L-赤藓酮糖还可以经过异构酶催化合成昂贵的L-赤藓糖，为高效制备L-赤藓糖提供基础，因此，本发明所提出的全细胞催化合成L-赤藓酮糖的方法，可应用于多种衍生物的合成领域，具有广阔的应用前景和竞争力。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一种全细胞催化生产L-赤藓酮糖的方法

<130> 2017

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 577

<212> PRT

<213> 荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)

<400> 1

Met Ala Met Ile Thr Gly Gly Glu Leu Val Val Arg Thr Leu Ile Lys

1 5 10 15

Ala Gly Val Glu His Leu Phe Gly Leu His Gly Ile His Ile Asp Thr

20 25 30

Ile Phe Gln Ala Cys Leu Asp His Asp Val Pro Ile Ile Asp Thr Arg

35 40 45

His Glu Ala Ala Ala Gly His Ala Ala Glu Gly Tyr Ala Arg Ala Gly

50 55 60

Ala Lys Leu Gly Val Ala Leu Val Thr Ala Gly Gly Gly Phe Thr Asn

65 70 75 80

Ala Val Thr Pro Ile Ala Asn Ala Trp Leu Asp Arg Thr Pro Val Leu

85 90 95

Phe Leu Thr Gly Ser Gly Ala Leu Arg Asp Asp Glu Thr Asn Thr Leu

100 105 110

Gln Ala Gly Ile Asp Gln Val Ala Met Ala Ala Pro Ile Thr Lys Trp

115 120 125

Ala His Arg Val Met Ala Thr Glu His Ile Pro Arg Leu Val Met Gln

130 135 140

Ala Ile Arg Ala Ala Leu Ser Ala Pro Arg Gly Pro Val Leu Leu Asp

145 150 155 160

Leu Pro Trp Asp Ile Leu Met Asn Gln Ile Asp Glu Asp Ser Val Ile

165 170 175

Ile Pro Asp Leu Val Leu Ser Ala His Gly Ala Arg Pro Asp Pro Ala

180 185 190

Asp Leu Asp Gln Ala Leu Ala Leu Leu Arg Lys Ala Glu Arg Pro Val

195 200 205

Ile Val Leu Gly Ser Glu Ala Ser Arg Thr Ala Arg Lys Thr Ala Leu

210 215 220

Ser Ala Phe Val Ala Ala Thr Gly Val Pro Val Phe Ala Asp Tyr Glu

225 230 235 240

Gly Leu Ser Met Leu Ser Gly Leu Pro Asp Ala Met Arg Gly Gly Leu

245 250 255

Val Gln Asn Leu Tyr Ser Phe Ala Lys Ala Asp Ala Ala Pro Asp Leu

260 265 270

Val Leu Met Leu Gly Ala Arg Phe Gly Leu Asn Thr Gly His Gly Ser

275 280 285

Gly Gln Leu Ile Pro His Ser Ala Gln Val Ile Gln Val Asp Pro Asp

290 295 300

Ala Cys Glu Leu Gly Arg Leu Gln Gly Ile Ala Leu Gly Ile Val Ala

305 310 315 320

Asp Val Gly Gly Thr Ile Glu Ala Leu Ala Gln Ala Thr Ala Gln Asp

325 330 335

Ala Ala Trp Pro Asp Arg Gly Asp Trp Cys Ala Lys Val Thr Asp Leu

340 345 350

Ala Gln Glu Arg Tyr Ala Ser Ile Ala Ala Lys Ser Ser Ser Glu His

355 360 365

Ala Leu His Pro Phe His Ala Ser Gln Val Ile Ala Lys His Val Asp

370 375 380

Ala Gly Val Thr Val Val Ala Asp Gly Gly Leu Thr Tyr Leu Trp Leu

385 390 395 400

Ser Glu Val Met Ser Arg Val Lys Pro Gly Gly Phe Leu Cys His Gly

405 410 415

Tyr Leu Asn Ser Met Gly Val Gly Phe Gly Thr Ala Leu Gly Ala Gln

420 425 430

Val Ala Asp Leu Glu Ala Gly Arg Arg Thr Ile Leu Val Thr Gly Asp

435 440 445

Gly Ser Val Gly Tyr Ser Ile Gly Glu Phe Asp Thr Leu Val Arg Lys

450 455 460

Gln Leu Pro Leu Ile Val Ile Ile Met Asn Asn Gln Ser Trp Gly Trp

465 470 475 480

Thr Leu His Phe Gln Gln Leu Ala Val Gly Pro Asn Arg Val Thr Gly

485 490 495

Thr Arg Leu Glu Asn Gly Ser Tyr His Gly Val Ala Ala Ala Phe Gly

500 505 510

Ala Asp Gly Tyr His Val Asp Ser Val Glu Ser Phe Ser Ala Ala Leu

515 520 525

Ala Gln Ala Leu Ala His Asn Arg Pro Ala Cys Ile Asn Val Ala Val

530 535 540

Ala Leu Asp Pro Ile Pro Pro Glu Glu Leu Ile Leu Ile Gly Met Asp

545 550 555 560

Pro Phe Ala Gly Ser Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Gly Ala Leu

565 570 575

Glu

<210> 2

<211> 220

<212> PRT

<213> 大肠埃希氏菌(Escherichia coli)

<400> 2

Met Glu Leu Tyr Leu Asp Thr Ser Asp Val Val Ala Val Lys Ala Leu

1 5 10 15

Ser Arg Ile Phe Pro Leu Ala Gly Val Thr Thr Asn Pro Ser Ile Ile

20 25 30

Ala Ala Gly Lys Lys Pro Leu Asp Val Val Leu Pro Gln Leu His Glu

35 40 45

Ala Met Gly Gly Gln Gly Arg Leu Phe Ala Gln Val Met Ala Thr Thr

50 55 60

Ala Glu Gly Met Val Asn Asp Ala Leu Lys Leu Arg Ser Ile Ile Ala

65 70 75 80

Asp Ile Val Val Lys Val Pro Val Thr Ala Glu Gly Leu Ala Ala Ile

85 90 95

Lys Met Leu Lys Ala Glu Gly Ile Pro Thr Leu Gly Thr Ala Val Tyr

100 105 110

Gly Ala Ala Gln Gly Leu Leu Ser Ala Leu Ala Gly Ala Glu Tyr Val

115 120 125

Ser Pro Tyr Val Asn Arg Ile Asp Ala Gln Gly Gly Ser Gly Ile Gln

130 135 140

Thr Val Thr Asp Leu His Gln Leu Leu Lys Met His Ala Pro Gln Ala

145 150 155 160

Lys Val Leu Ala Ala Ser Phe Lys Thr Pro Arg Gln Ala Leu Asp Cys

165 170 175

Leu Leu Ala Gly Cys Glu Ser Ile Thr Leu Pro Leu Asp Val Ala Gln

180 185 190

Gln Met Ile Ser Tyr Pro Ala Val Asp Ala Ala Val Ala Lys Phe Glu

195 200 205

Gln Asp Trp Gln Gly Ala Phe Gly Arg Thr Ser Ile

210 215 220

<210> 3

<211> 1728

<212> DNA

<213> 荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)

<400> 3

atggctatga ttactggtgg tgaactggtt gttcgtaccc tgattaaagc tggcgtagaa 60

catctgtttg gcctgcatgg cattcatatt gacaccattt ttcaggcttg cctggaccac 120

gacgtcccaa tcattgatac tcgccacgaa gcggcggcag gccacgctgc ggaaggttat 180

gcccgcgcgg gcgctaaact gggtgttgcc ctggtgaccg ctggcggtgg ctttaccaat 240

gccgttacgc cgatcgcgaa cgctcggacc gatcgcactc cggttctgtt cctgaccggt 300

tctggtgctc ttcgtgatga cgaaaccaac accctgcagg ccggtattga tcaggtggcc 360

atggcggccc cgatcacgaa atgggctcat cgtgttatgg caactgaaca catcccgcgt 420

ctggttatgc aggccattcg tgccgctctg agcgccccac gtggcccggt gctgctggat 480

ctgccatggg acatcctgat gaaccaaatc gatgaagatt ccgttatcat cccagacctg 540

gtgctgtctg ctcacggtgc ccatccagac ccggctgacc tggaccaggc tctggcactg 600

ctgcgtaaag ccgaacgccc agttatcgta ctgggctccg aggcgtcccg caccgcacgc 660

aagaccgcac tgagcgcatt cgtagcggcg accggtgtac cggttttcgc tgactatgaa 720

ggcctgtcca tgctgagcgg cctgccggac gctatgcgtg gcggcctggt gcagaacctg 780

tactcctttg caaaagctga tgcagctccg gacctggtac tgatgctggg tgctcgtttc 840

ggtctgaaca ccggtcatgg ttccggtcaa ctgatcccgc attctgctca ggtgatccag 900

gtggatccag acgcgtgtga actgggtcgc ctgcaaggca tcgcgctggg tatcgtggct 960

gatgtaggtg gcaccattga agcgctggct caggcgaccg cacaggacgc cgcgtggccg 1020

gaccgcggcg actggtgcgc caaggtaact gacctggccc aggagcgtta cgcttccatc 1080

gcggctaaat ccagctctga acatgcgctg cacccgttcc acgcttctca ggttatcgcg 1140

aaacacgtgg acgcaggcgt gaccgtcgtt gcggatggtg gcctgactta tctgtggctg 1200

tccgaagtta tgtctcgtgt caaaccaggc ggcttcctgt gccacggcta tctgaacagc 1260

atgggtgtag gcttcggtac tgccctgggt gcgcaggttg cggatctgga ggcaggtcgt 1320

cgtaccatcc tggtgaccgg cgacggctct gttggttatt ccattggcga attcgacacc 1380

ctggtacgca aacagctgcc gctgattgta attatcatga acaaccagtc ttggggctgg 1440

accctgcact ttcagcagct ggccgttggt cctaaccgtg tcaccggcac ccgcctggaa 1500

aatggttcct atcacggcgt tgctgcggca ttcggtgctg atggttacca cgtcgactct 1560

gtcgagagct tcagcgccgc tctggctcag gcactggcac acaaccgccc ggcatgcatc 1620

aacgttgctg tggccctgga cccgatcccg ccggaggaac tgatcctgat tggcatggac 1680

ccgtttgcgg gctccacgga gaatctgtat ttccaatccg gcgcgtaa 1728

<210> 4

<211> 663

<212> DNA

<213> 大肠埃希氏菌(Escherichia coli)

<400> 4

atggaactgt atctggatac ttcagacgtt gttgcggtga aggcgctgtc acgtattttt 60

ccgctggcgg gtgtgaccac taacccaagc attatcgccg cgggtaaaaa accgctggat 120

gttgtgcttc cgcaacttca tgaagcgatg ggcggtcagg ggcgtctgtt tgcccaggta 180

atggctacca ctgccgaagg gatggttaat gacgcgctta agctgcgttc tattattgcg 240

gatatcgtgg tgaaagttcc ggtgaccgcc gaggggctgg cagctattaa gatgttaaaa 300

gcggaaggga ttccgacgct gggaaccgcg gtatatggcg cagcacaagg gctgctgtcg 360

gcgctggcag gtgcggaata tgtttcgcct tacgttaatc gtattgatgc tcagggcggt 420

agcggcattc agactgtgac cgacttacac cagttattga aaatgcatgc gccgcaggcg 480

aaagtgctgg cagcgagttt caaaaccccg cgtcaggcgc tggactgctt actggcagga 540

tgtgaatcaa ttactctgcc actggatgtg gcacaacaga tgattagcta tccggcggtt 600

gatgccgctg tggcgaagtt tgagcaggac tggcagggag cgtttggcag aacgtcgatt 660

taa 663

Claims

1.一种生产L-赤藓酮糖的方法，其特征在于：甲醛连接酶和D-果糖-6-磷酸醛缩酶催化甲醛生成L-赤藓酮糖。

2.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的甲醛连接酶来源于荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，所述的D-果糖-6-磷酸醛缩酶来源于大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。

3.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的甲醛连接酶的氨基酸序列为(a)或(b)：(a)SEQ ID NO：1，(b)与SEQ ID NO：1具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列；所述的D-果糖-6-磷酸醛缩酶的氨基酸序列为(c)或(d)：(c)SEQ ID NO：2，(d)与SEQ ID NO：2具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列。

4.权利要求1-3的任一方法，其特征在于，催化反应体系中甲醛含量10-100mM，优选的甲醛含量50mM，缓冲液pH为6-8，优选pH为7.5，催化反应条件为20℃-37℃，优选的温度30℃，反应时间2-24小时，优选反应时间24小时。

5.一种在存在全细胞催化剂的条件下循环催化合成L-赤藓酮糖的方法，其特征在于：底物为甲醛和二羟丙酮，所述全细胞催化剂包含D-果糖-6-磷酸醛缩酶。

6.权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的D-果糖-6-磷酸醛缩酶的氨基酸序列为(a)或(b)：(a)SEQ ID NO：2，(b)与SEQ ID NO：2具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列。

7.权利要求5或权利要求6所述的方法，催化的反应体系中添加全细胞催化剂，直至菌体初始密度OD₆₀₀为40-120，优选的菌体初始密度为80，甲醛1-2mol/L，优选甲醛1.5mol/L，二羟丙酮1-2mol/L，优选二羟丙酮1.5mol/L；催化反应条件为，温度为25-30℃，pH为6-8，反应时间为2-4h；反应结束后，离心分别收集上清和沉淀，沉淀作为全细胞催化剂再次催化合成L-赤藓酮糖。

8.一种应用固定化全细胞珠循环催化合成L-赤藓酮糖的方法，其特征在于，以海藻酸钠为固定化材料，包埋含有D-果糖-6-磷酸醛缩酶的大肠杆菌重组菌株，制备成固定化全细胞珠，催化甲醛和二羟丙酮合成L-赤藓酮糖。

9.权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的D-果糖-6-磷酸醛缩酶的氨基酸序列为(a)或(b)：(a)SEQ ID NO：2，(b)与SEQ ID NO：2具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列。

10.权利要求8或权利要求9所述的固定化细胞循环催化合成L-赤藓酮糖的方法，其特征在于，催化的反应体系中固定化细胞材料含量为5-15g/L，优选的固定化细胞材料含量为10g/L，甲醛1-2mol/L，优选的甲醛2mol/L，二羟丙酮1-2mol/L，优选的二羟丙酮2mol/L；催化反应条件为，温度为25-30℃，pH为6-8，反应时间为2-4h；反应结束后，离心分别收集上清和沉淀，沉淀作为固定化全细胞珠再次催化合成L-赤藓酮糖。