CN114181978A - 一种提高赤藓糖醇转化率的发酵培养方法 - Google Patents

一种提高赤藓糖醇转化率的发酵培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高赤藓糖醇转化率的发酵培养方法，属于微生物发酵生产技术领域。本发明公开的一种提高赤藓糖醇转化率的发酵培养方法，先进行解脂假丝酵母菌种子液的培养，再对解脂假丝酵母菌种子液通过两阶段调控进行发酵培养，在发酵初期葡萄糖的浓度为150～200g/L，发酵22～28h通过补料使葡萄糖终浓度达到320～350g/L，补料葡萄糖后根据产醇情况流加金属离子，制得赤藓糖醇。本发明方法采用两阶段发酵工艺调控，发酵前期使用低浓度葡萄糖培养基利于菌体生长，产赤藓糖醇期使用高浓度葡萄糖利于菌体产醇，流加金属离子提高赤藓糖还原酶活性，节省发酵原料成本的同时提高赤藓糖醇的转化率。

Description

一种提高赤藓糖醇转化率的发酵培养方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵生产技术领域，更具体的说是涉及一种提高赤藓糖醇转化率的发酵培养方法。
背景技术
赤藓糖醇是一种天然甜味剂和食品添加剂，被广泛应用于食品、制药和化工等行业。因为赤藓糖醇所具有的独特性质，比如安全性高，食用安全，热值低，不被人体代谢吸收等优良特性使得赤藓糖醇成为糖替代品研究中的一个重要组成部分。
目前，在工业化生产中，赤藓糖醇主要是微生物发酵法获得，采用耐高渗酵母菌或细菌进行微生物发酵，将葡萄糖转化成赤藓糖醇。但是目前微生物发酵法存在着一些问题，比如发酵底物价格高、生产成本高、副产物多、生长周期长等。基于此，对发酵培养基成分、发酵条件及发酵工艺进行研究调整是目前微生物发酵产赤藓糖醇的研究热点，以期能够使产能和转化率最大化，实现高效、低成本的赤藓糖醇生产工艺。
因此，提供一种提高赤藓糖醇转化率的发酵培养方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种提高赤藓糖醇转化率的发酵培养方法，发酵成本低、发酵周期短、赤藓糖醇转化率高。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种提高赤藓糖醇转化率的发酵培养方法，具体步骤如下：
(1)解脂假丝酵母菌种子液的制备；
(2)将步骤(1)制备得到的解脂假丝酵母菌种子液接种到装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，发酵罐初始搅拌转速为150～200r/min，压力为0.02～0.03MPa，通入压缩空气量为0.5～0.8立方米空气/立方米发酵液/分钟，温度为30℃，并进行两阶段发酵调控：发酵初期葡萄糖的浓度为150～200g/L，待菌体生长至发酵罐中溶氧为10～15％后，通过调控转速、压力和空气量将溶氧维持在10～15％；22～28h时通过补加葡萄糖使葡萄糖终浓度为320～350g/L，同时调控转速、压力和空气量将溶氧控制在18％～28％；补料后每隔12h测定产赤藓糖醇速率，当产赤藓糖醇速率低于2.5g/L/h时以0.01L/h的速率流加金属离子溶液进行补料；当发酵液中葡萄糖含量≤0.2g/100mL时发酵结束，制备得到赤藓糖醇；
所述发酵培养基的组成如下：葡萄糖150～200g/L、尿素1～2g/L、硫酸镁0.2～0.5g/L、磷酸二氢钾0.2～0.5g/L、柠檬酸铵5～8g/L、硫酸铵1～2g/L，余量为水；
所述金属离子溶液的组成如下：0.08～0.1g/L钼酸钠、0.05～0.08g/L六水合氯化镍、0.06～0.08g/L亚硒酸钠，余量为水。
进一步，步骤(1)所述解脂假丝酵母菌种子液的制备方法如下：
①将解脂假丝酵母菌液以1～2％的接种量接种至一级种子培养基中，在30℃、180～200r/min条件下培养20～24h，获得一级种子液；
②将步骤①获得的一级种子液以9～10％的接种量接种至二级种子培养基中，在30℃、180～200r/min条件下培养20～24h，得到解脂假丝酵母菌种子液；
所述一级种子培养基和二级种子培养基的组成如下：150～200g/L葡萄糖、15～20g/L酵母粉，余量为水。
进一步，步骤(2)所述解脂假丝酵母菌种子液以5～10％的接种量接种到装有发酵培养基的发酵罐中。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种提高赤藓糖醇转化率的发酵培养方法，具有如下有益效果：
(1)本发明使用较为廉价的尿素和硫酸铵作为氮源代替酵母粉，降低了原料成本；同时调节无机盐的配比，对培养基进行优化，使解脂假丝酵母处于最利于产赤藓糖醇的条件，提高赤藓糖醇的转化率，转化率达到68.33～69.07％，具有良好的经济效益。
(2)本发明提供的赤藓糖醇发酵方法通过两阶段进行发酵调控，在发酵初期，使用低浓度葡萄糖发酵培养基，有利于菌体的生长；在产赤藓糖醇阶段进行补料葡萄糖，使菌体处于利于产赤藓糖醇的高渗透压环境，同时流加金属离子，提高赤藓糖还原酶活性，提高赤藓糖醇转化率。
(3)本发明发酵原料成本低、发酵工序简单、操作便捷，同时能最大化解脂假丝酵母菌的赤藓糖醇产率，将发酵周期缩短至86～96h，降低生产成本，使产品有更高的竞争力。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
解脂假丝酵母为市售购买获得。
实施例1
一种提高赤藓糖醇转化率的发酵培养方法，具体步骤如下：
(1)解脂假丝酵母菌种子液的制备方法如下：
①将保存的解脂假丝酵母菌液以1％的接种量接种至一级种子培养基中，在30℃、180r/min条件下培养24h，获得一级种子液；
②将步骤①获得的一级种子液以10％的接种量接种至二级种子培养基中，在30℃、180r/min条件下培养24h，得到解脂假丝酵母菌种子液；
一级种子培养基和二级种子培养基的组成如下：150g/L葡萄糖、15g/L酵母粉，余量为水。
(2)将步骤(1)制备得到的解脂假丝酵母菌种子液以10％的接种量接种到装有葡萄糖浓度为150g/L发酵培养基的发酵罐(初始溶氧为30-50％)中进行发酵培养，发酵罐初始搅拌转速为150r/min，压力为0.025MPa，通入压缩空气量为0.5立方米空气/立方米发酵液/分钟，温度为30℃；待菌体生长至发酵罐中溶氧为10～14％后，通过调控转速、压力和空气量将溶氧维持在10～14％(维持至发酵24h)；24h时通过补加葡萄糖使葡萄糖终浓度为320g/L，同时调控转速、压力和空气量将溶氧控制在18％～22％(24h至发酵结束维持该溶氧条件)；补料后每隔12h测定产赤藓糖醇速率，当产赤藓糖醇速率低于2.5g/L/h时以0.01L/h的速率流加金属离子溶液进行补料，流加12h至下一次测定产赤藓糖醇速率，如果低于2.5g/L/h时继续流加，高于2.5g/L/h时无需流加，直至发酵结束。当发酵液中葡萄糖含量≤0.2g/100mL时发酵结束，制备得到赤藓糖醇。
发酵培养基的组成如下：葡萄糖150g/L、尿素1g/L、硫酸镁0.25g/L、磷酸二氢钾0.25g/L、柠檬酸铵5g/L、硫酸铵1.5g/L，余量为水；
金属离子溶液的组成如下：0.08g/L钼酸钠、0.05g/L六水合氯化镍、0.06g/L亚硒酸钠，余量为水。
本实施例发酵周期为86h，制备的发酵液中赤藓糖醇含量为21.88％，赤藓糖醇的转化率为68.54％。
实施例2
一种提高赤藓糖醇转化率的发酵培养方法，具体步骤如下：
(1)解脂假丝酵母菌种子液的制备方法如下：
①将保存的解脂假丝酵母菌液以1％的接种量接种至一级种子培养基中，在30℃、180r/min条件下培养22h，获得一级种子液；
②将步骤①获得的一级种子液以10％的接种量接种至二级种子培养基中，在30℃、180r/min条件下培养22h，得到解脂假丝酵母菌种子液；
一级种子培养基和二级种子培养基的组成如下：180g/L葡萄糖、18g/L酵母粉，余量为水。
(2)将步骤(1)制备得到的解脂假丝酵母菌种子液以8％的接种量接种到装有葡萄糖浓度为180g/L发酵培养基的发酵罐(初始溶氧为30-50％)中进行发酵培养，发酵罐初始搅拌转速为180r/min，压力为0.025MPa，通入压缩空气量为0.6立方米空气/立方米发酵液/分钟，温度为30℃；待菌体生长至发酵罐中溶氧为12～15％后，通过调控转速、压力和空气量将溶氧维持在12～15％(维持至发酵26h)；26h时通过补加葡萄糖使葡萄糖终浓度为320g/L，同时调控转速、压力和空气量将溶氧控制在20％～25％(26h至发酵结束维持该溶氧条件)；补料后每隔12h测定产赤藓糖醇速率，当产赤藓糖醇速率低于2.5g/L/h时以0.01L/h的速率流加金属离子溶液进行补料，流加12h至下一次测定产赤藓糖醇速率，如果低于2.5g/L/h时继续流加，高于2.5g/L/h时无需流加，直至发酵结束。当发酵液中葡萄糖含量≤0.2g/100mL时发酵结束，制备得到赤藓糖醇。
发酵培养基的组成如下：葡萄糖180g/L、尿素1.5g/L、硫酸镁0.35g/L、磷酸二氢钾0.35g/L、柠檬酸铵6g/L、硫酸铵2g/L，余量为水；
金属离子溶液的组成如下：0.08g/L钼酸钠、0.06g/L六水合氯化镍、0.06g/L亚硒酸钠，余量为水。
本实施例发酵周期为88h，制备的发酵液中赤藓糖醇含量为21.59％，赤藓糖醇的转化率为68.33％。
实施例3
一种提高赤藓糖醇转化率的发酵培养方法，具体步骤如下：
(1)解脂假丝酵母菌种子液的制备方法如下：
①将保存的解脂假丝酵母菌液以2％的接种量接种至一级种子培养基中，在30℃、200r/min条件下培养20h，获得一级种子液；
②将步骤①获得的一级种子液以9％的接种量接种至二级种子培养基中，在30℃、200r/min条件下培养20h，得到解脂假丝酵母菌种子液；
一级种子培养基和二级种子培养基的组成如下：200g/L葡萄糖、20g/L酵母粉，余量为水。
(2)将步骤(1)制备得到的解脂假丝酵母菌种子液以5％的接种量接种到装有葡萄糖浓度为200g/L发酵培养基的发酵罐(初始溶氧为30-50％)中进行发酵培养，发酵罐初始搅拌转速为200r/min，压力为0.03MPa，通入压缩空气量为0.7立方米空气/立方米发酵液/分钟，温度为30℃；待菌体生长至发酵罐中溶氧为12～15％后，通过调控转速、压力和空气量将溶氧维持在12～15％(维持至发酵28h)；28h时通过补加葡萄糖使葡萄糖终浓度为330g/L，同时调控转速、压力和空气量将溶氧控制在24％～28％(28h至发酵结束维持该溶氧条件)；补料后每隔12h测定产赤藓糖醇速率，当产赤藓糖醇速率低于2.5g/L/h时以0.01L/h的速率流加金属离子溶液进行补料，流加12h至下一次测定产赤藓糖醇速率，如果低于2.5g/L/h时继续流加，高于2.5g/L/h时无需流加，直至发酵结束。当发酵液中葡萄糖含量≤0.2g/100mL时发酵结束，制备得到赤藓糖醇。
发酵培养基的组成如下：葡萄糖200g/L、尿素2g/L、硫酸镁0.45g/L、磷酸二氢钾0.45g/L、柠檬酸铵8g/L、硫酸铵2g/L，余量为水；
金属离子溶液的组成如下：0.1g/L钼酸钠、0.06g/L六水合氯化镍、0.08g/L亚硒酸钠，余量为水。
本实施例发酵周期为96h，发酵液中赤藓糖醇含量为22.58％，赤藓糖醇的转化率为69.07％。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (3)

1.一种提高赤藓糖醇转化率的发酵培养方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)解脂假丝酵母菌种子液的制备；
(2)将步骤(1)制备得到的解脂假丝酵母菌种子液接种到装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，发酵罐初始搅拌转速为150～200r/min，压力为0.02～0.03MPa，通入压缩空气量为0.5～0.8立方米空气/立方米发酵液/分钟，温度为30℃，并进行两阶段发酵调控：发酵初期葡萄糖的浓度为150～200g/L，待菌体生长至发酵罐中溶氧为10～15％后，通过调控转速、压力和空气量将溶氧维持在10～15％；22～28h时通过补加葡萄糖使葡萄糖终浓度为320～350g/L，同时调控转速、压力和空气量将溶氧控制在18％～28％；补料后每隔12h测定产赤藓糖醇速率，当产赤藓糖醇速率低于2.5g/L/h时以0.01L/h的速率流加金属离子溶液进行补料；当发酵液中葡萄糖含量≤0.2g/100mL时发酵结束，制备得到赤藓糖醇；
所述发酵培养基的组成如下：葡萄糖150～200g/L、尿素1～2g/L、硫酸镁0.2～0.5g/L、磷酸二氢钾0.2～0.5g/L、柠檬酸铵5～8g/L、硫酸铵1～2g/L，余量为水；
所述金属离子溶液的组成如下：0.08～0.1g/L钼酸钠、0.05～0.08g/L六水合氯化镍、0.06～0.08g/L亚硒酸钠，余量为水。
2.根据权利要求1所述的一种提高赤藓糖醇转化率的发酵培养方法，其特征在于，步骤(1)所述解脂假丝酵母菌种子液的制备方法如下：
①将解脂假丝酵母菌液以1～2％的接种量接种至一级种子培养基中，在30℃、180～200r/min条件下培养20～24h，获得一级种子液；
②将步骤①获得的一级种子液以9～10％的接种量接种至二级种子培养基中，在30℃、180～200r/min条件下培养20～24h，得到解脂假丝酵母菌种子液；
所述一级种子培养基和二级种子培养基的组成如下：150～200g/L葡萄糖、15～20g/L酵母粉，余量为水。
3.根据权利要求2所述的一种提高赤藓糖醇转化率的发酵培养方法，其特征在于，步骤(2)所述解脂假丝酵母菌种子液以5～10％的接种量接种到装有发酵培养基的发酵罐中。
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