CN117821546A - 一种n-乙酰氨基葡萄糖的发酵生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种N‑乙酰氨基葡萄糖的发酵生产方法，其包括在N‑乙酰氨基葡萄糖发酵过程中，向N‑乙酰氨基葡萄糖发酵液中流加复合氮源溶液，其中，所述复合氮源溶液包括玉米浆干粉、酵母粉和硫酸铵。本发明提供的方法通过在N‑乙酰氨基葡萄糖发酵液中流加复合氮源溶液，能够有效提高发酵终点N‑乙酰氨基葡萄糖含量和转化率，降低乙酸等副产物。
Description
技术领域
本发明涉及发酵工程领域，特别涉及一种N-乙酰氨基葡萄糖的发酵生产方法。
背景技术
虽然微生物发酵法生产N-乙酰氨基葡萄糖(在含有N-乙酰氨基葡萄糖的发酵液中，加入0.1mol/L的盐酸，100℃下反应3h，可以把90％以上的N-乙酰氨基葡萄糖转化为氨基葡萄糖)可以克服以上缺点，但微生物发酵生产N-乙酰氨基葡萄糖存在产量低、转化率低和副产物乙酸、谷氨酸含量高的现象，因此，需要开发一种N-乙酰氨基葡萄糖的发酵新工艺，以提高N-乙酰氨基葡萄糖的发酵产量和转化率，同时降低发酵副产物乙酸、谷氨酸的含量。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种N-乙酰氨基葡萄糖的发酵生产方法。本发明提供的方法通过在N-乙酰氨基葡萄糖发酵液中流加复合氮源溶液，能够有效提高发酵终点N-乙酰氨基葡萄糖含量和转化率，降低乙酸等副产物。
本发明提供的N-乙酰氨基葡萄糖的发酵生产方法包括在N-乙酰氨基葡萄糖发酵过程中，向N-乙酰氨基葡萄糖发酵液中流加复合氮源溶液，其中，所述复合氮源溶液包括玉米浆干粉、酵母粉和硫酸铵。
在一些实施方式中，所述复合氮源溶液中，玉米浆干粉的含量为0.1g/L-1.0g/L。在一些实施方式中，玉米浆干粉的含量为0.2g/L、0.25g/L、0.3g/L、0.35g/L、0.4g/L、0.45g/L、0.5g/L、0.55g/L、0.6g/L、0.65g/L、0.7g/L、0.75g/L、0.8g/L、0.9g/L或它们之间的任意值。在一些实施方式中，玉米浆干粉的含量为0.2g/L-0.6g/L。
在一些实施方式中，所述复合氮源溶液中，酵母粉的含量为0.1g/L-1.0g/L。在一些实施方式中，酵母粉的含量为0.2g/L、0.25g/L、0.3g/L、0.35g/L、0.4g/L、0.45g/L、0.5g/L、0.55g/L、0.6g/L、0.65g/L、0.7g/L、0.75g/L、0.8g/L、0.9g/L或它们之间的任意值。
在一些实施方式中，所述复合氮源溶液中，硫酸铵的含量为0.01g/L-0.1g/L。在一些实施方式中，硫酸铵的含量为0.02g/L、0.03g/L、0.04g/L、0.05g/L、0.06g/L、0.07g/L、0.08g/L、0.09g/L或它们之间的任意值。在一些实施方式中，硫酸铵的含量为0.03g/L-0.07g/L。
在一些实施方式中，所述复合氮源溶液包括0.35g/L-0.45g/L例如0.4g/L的玉米浆干粉、0.25g/L-0.35g/L例如0.3g/L的酵母粉、0.04g/L-0.06g/L例如0.05g/L的硫酸铵。
在一些实施方式中，所述复合氮源溶液选自复合氮源水溶液。
在一些实施方式中，所述复合氮源溶液包括0.35g/L-0.45g/L例如0.4g/L的玉米浆干粉、0.25g/L-0.35g/L例如0.3g/L的酵母粉、0.04g/L-0.06g/L例如0.05g/L的硫酸铵以及余量的水。
在一些实施方式中，所述复合氮源溶液的流加速率为0.1g/L·h-0.7g/L·h，例如为0.15g/L·h、0.2g/L·h、0.25g/L·h、0.3g/L·h、0.35g/L·h、0.4g/L·h、0.45g/L·h、0.5g/L·h、0.55g/L·h、0.6g/L·h、0.65g/L·h或它们之间的任意值。在一些实施方式中，所述复合氮源溶液的流加速率为0.2g/L·h-0.5g/L·h。在一些实施方式中，所述复合氮源溶液的流加速率为0.3g/L·h-0.4g/L·h。
本发明中，复合氮源溶液的流加速率的含义是每1L N-乙酰氨基葡萄糖发酵液每1h流加的复合氮源溶液的质量。
在一些实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖的发酵生产方法包括以下步骤：
S1：将N-乙酰氨基葡萄糖种子液接种于发酵培养基中进行第一发酵，得到N-乙酰氨基葡萄糖发酵液；
S2：当N-乙酰氨基葡萄糖发酵液的溶氧回升时，在N-乙酰氨基葡萄糖发酵液中流加葡萄糖溶液进行第二发酵；
S3：当N-乙酰氨基葡萄糖发酵液中OD660nm为25-28时，向N-乙酰氨基葡萄糖发酵液中流加所述复合氮源溶液进行第三发酵。
本发明根据发酵后期不产N-乙酰氨基葡萄糖或者产N-乙酰氨基葡萄糖较慢来判断发酵终点，培养55-60小时可以达到发酵终点。
在一些实施方式中，当N-乙酰氨基葡萄糖发酵液中OD660nm为25-28时，在所述N-乙酰氨基葡萄糖发酵液中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)后再流加所述复合氮源溶液。
本发明所述OD660nm是指在波长660nm可见光下测定的发酵液的吸光值。
在一些实施方式中，基于所述N-乙酰氨基葡萄糖发酵液，所述IPTG的加入量为0.04mM-0.08mM，例如0.05mM、0.06mM或0.07mM。
在一些实施方式中，所述葡萄糖溶液的流加速率为5g/L·h-8g/L·h，例如为6g/L·h或7g/L·h。
在一些实施方式中，所述葡萄糖溶液的质量浓度为50％-60％，例如为53％、55％或57％。
在一些实施方式中，所述第一发酵的温度为35℃-37℃。
在一些实施方式中，所述第三发酵的温度为32℃-34℃。
在一些实施方式中，所述发酵的时间为55h-60h，例如为56h、57h、58h或59h。在一些实施方式中，所述发酵的时间为为57h-59h。
在一些实施方式中，所述发酵培养基包括葡萄糖5g/L(单消)、磷酸氢二钾16g/L、磷酸二氢钾10g/L、酵母浸粉0.3g/L、酵母膏0.1g/L、苏氨酸0.1g/L、蛋氨酸0.15g/L、硫酸镁0.25g/L、硫酸铵3g/L、氯化钾0.1g/L、硫酸锰0.015mg/L、硫酸铁0.35mg/L、硫酸锌0.41mg/L和氯化钴0.02mg/L。
在一些实施方式中，所培养所述N-乙酰氨基葡萄糖种子液的种子培养基包括葡萄糖15g/L、磷酸氢二钾11g/L、磷酸二氢钾16g/L、酵母浸粉1g/L、苏氨酸0.2g/L、蛋氨酸0.15g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸铵5g/L、硫酸锰0.013mg/L、硫酸铁0.024mg/L、硫酸锌0.047mg/L和氯化钴0.01mg。
在一些实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖的发酵生产方法包括以下具体步骤：
(1)种子培养
配制种子培养基，用浓度为25％(m/m)的氨水调种子培养基pH值至7.0-7.2，向种子培养基中通饱和蒸汽至121℃，保温30min；设定种子培养条件：温度37℃，罐压0.05mPa，通风比1:0.5，转速300rpm，pH值6.9-7.0；接入产N-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌进行培养，当种子培养基中OD660nm＝4-6范围区间时，作为种子成熟标准；
优选地，所述种子培养基为：葡萄糖15g/L(单消)，磷酸氢二钾11g/L，磷酸二氢钾16g/L，酵母浸粉1g/L，苏氨酸0.2g/L，蛋氨酸0.15g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸铵5g/L，硫酸锰0.013mg/L，硫酸铁0.024mg/L，硫酸锌0.047mg/L，氯化钴0.01mg/L。
(2)发酵培养
配制发酵培养基，121℃灭菌30min；降温后设定发酵培养条件：温度37℃，罐压0.03-0.05mPa，通风比1:0.5-1:1，转速300-500rpm，pH值6.9-7.0(可在发酵全程用25％(m/m)氨水调控)；将成熟的N-乙酰氨基葡萄糖种子液按照10％(V/V)接种量接种到发酵罐进行培养，发酵过程中通过调节转速、风量、罐压的顺序控制溶氧25-40％；
当N-乙酰氨基葡萄糖发酵培养过程中发酵液溶氧回升时，按照5-8g/L·h的流加速率向N-乙酰氨基葡萄糖发酵液中流加55％(m/m)葡萄糖溶液；
当N-乙酰氨基葡萄糖发酵液OD660nm＝25-28区间时，降温至33℃，同时一次性加入0.04mM-0.08mM IPTG进行诱导，再按照0.2-0.5g/L·h的流加速度向N-乙酰氨基葡萄糖发酵液流加复合氮源溶液。
本发明所述种子培养基、发酵培养基的溶剂均为水。
本发明的有益效果是：本发明提供的提高N-乙酰氨基葡萄糖产量的发酵方法能够提高菌种的氧消耗速率，提高发酵终点N-乙酰氨基葡萄糖含量和转化率，降低乙酸等副产物。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于构成对本发明的任何限制。
在下述实施例和对比例中：
OD值测定：采用7230G可见分光光度计，在波长660nm可见光下测定吸光值。
按照GB/T5009.7-2008的方法测定还原糖的浓度。
N-乙酰氨基葡萄糖含量测定：高效液相色谱法。
乙酸含量测定：高效液相色谱法。
谷氨酸含量测定：取发酵液离心后的上清液，稀释到残谷氨酸浓度在1g/L以内，用生物传感分析仪测定。
转化率(％)＝N-乙酰氨基葡萄糖量/总耗糖量×100％。
实施例1
提高N-乙酰氨基葡萄糖产量的发酵方法，其包括以下步骤：
(1)种子培养
配制种子培养基：葡萄糖15g/L，磷酸氢二钾11g/L，磷酸二氢钾16g/L，酵母浸粉1g/L，苏氨酸0.2g/L，蛋氨酸0.15g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸铵5g/L，硫酸锰0.013mg/L，硫酸铁0.024mg/L，硫酸锌0.047mg/L，氯化钴0.01mg/L。投入到50L发酵罐中，用浓度为25％(m/m)的氨水调种子培养基pH值至7.0-7.2，向种子培养基中通饱和蒸汽至121℃，保温30min。设定种子培养条件：温度37℃，罐压0.05Mpa，通风比1:0.5，转速300rpm，pH值6.9-7.0。接入产N-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌进行培养，当种子OD660nm＝4-6范围区间时，作为种子成熟标准。
(2)发酵培养
配制发酵培养基：葡萄糖5g/L(单消)，磷酸氢二钾16g/L，磷酸二氢钾10g/L，酵母浸粉0.3g/L，酵母膏0.1g/L，苏氨酸0.1g/L，蛋氨酸0.15g/L，硫酸镁0.25g/L，硫酸铵3g/L，氯化钾0.1g/L，硫酸锰0.015mg/L，硫酸铁0.35mg/L，硫酸锌0.41mg/L，氯化钴0.02mg/L。
投入到50L发酵罐中，121℃，灭菌30min。降温后设定发酵培养条件：温度37℃，罐压0.03-0.05Mpa，通风比1:0.5-1:1，转速300-500rpm，发酵全程用25％(m/m)氨水自控pH值为6.9-7.0。将成熟的N-乙酰氨基葡萄糖种子液按照10％(V/V)接种量接种到发酵罐进行培养。
发酵过程中通过调节转速、风量、罐压的顺序控制溶氧25％-40％。
当N-乙酰氨基葡萄糖发酵培养过程中溶氧回升时，按照6g/L·h的流加速率向N-乙酰氨基葡萄糖发酵液中流加55％(m/m)葡萄糖溶液；
当N-乙酰氨基葡萄糖发酵液OD660nm＝25-28区间时，降温至33℃，同时一次性加入0.05mM IPTG进行诱导，此时按照0.2g/L·h的流加速度向N-乙酰氨基葡萄糖发酵液流加复合氮源溶液(复合氮源溶液组成：玉米浆干粉0.4g/L，酵母粉0.3g/L，硫酸铵0.05g/L以及余量的水)。
根据发酵后期不产N-乙酰氨基葡萄糖或者产N-乙酰氨基葡萄糖较慢来判断发酵终点。
发酵培养周期56小时，N-乙酰氨基葡萄糖含量为106.5g/L，转化率为38.9％，乙酸含量为3.2g/L，谷氨酸含量为3.5g/L。
实施例2
与实施例1的区别仅在于：当N-乙酰氨基葡萄糖发酵液OD660nm＝25-28区间时，降温至33℃，同时一次性加入0.05mM IPTG进行诱导，此时按照0.3g/L·h的流加速度向N-乙酰氨基葡萄糖发酵液流加复合氮源溶液。
发酵培养56h时，N-乙酰氨基葡萄糖含量为112.1g/L，转化率为39.9％，乙酸含量为2.1g/L，谷氨酸含量为2.0g/L。
实施例3
与实施例1的区别仅在于：当N-乙酰氨基葡萄糖发酵液OD660nm＝25-28区间时，降温至33℃，同时一次性加入0.05mM IPTG进行诱导，此时按照0.4g/L·h的流加速度向N-乙酰氨基葡萄糖发酵液流加复合氮源溶液。
发酵培养58h时，N-乙酰氨基葡萄糖含量为115.1g/L，转化率为40.8％，乙酸含量为1.8g/L，谷氨酸含量为1.9g/L。
实施例4
与实施例1的区别仅在于：当N-乙酰氨基葡萄糖发酵液OD660nm＝25-28区间时，降温至33℃，同时一次性加入0.05mM IPTG进行诱导，此时按照0.5g/L·h的流加速度向N-乙酰氨基葡萄糖发酵液流加复合氮源溶液。
发酵培养58h时，N-乙酰氨基葡萄糖含量为108.9g/L，转化率为39.2％，乙酸含量为2.5g/L，谷氨酸含量为2.3g/L。
实施例5
与实施例1的区别仅在于：当N-乙酰氨基葡萄糖发酵液OD660nm＝25-28区间时，降温至33℃，同时一次性加入0.05mM IPTG进行诱导，此时按照0.1g/L·h的流加速度向N-乙酰氨基葡萄糖发酵液流加复合氮源溶液。
发酵培养60h时，N-乙酰氨基葡萄糖含量为101g/L，转化率为36.9％，乙酸含量为3.9g/L，谷氨酸含量为3.9g/L。
实施例6
与实施例1的区别仅在于：当N-乙酰氨基葡萄糖发酵液OD660nm＝25-28区间时，降温至33℃，同时一次性加入0.05mM IPTG进行诱导，此时按照0.6g/L·h的流加速度向N-乙酰氨基葡萄糖发酵液流加复合氮源溶液。
发酵培养60h时，N-乙酰氨基葡萄糖含量为99.8g/L，转化率为37.2％，乙酸含量为3.7g/L，谷氨酸含量为4.0g/L。
实施例7
与实施例1的区别仅在于：当N-乙酰氨基葡萄糖发酵液OD660nm＝25-28区间时，降温至33℃，同时一次性加入0.05mM IPTG进行诱导，此时按照0.7g/L·h的流加速度向N-乙酰氨基葡萄糖发酵液流加复合氮源溶液。
发酵培养60h时，N-乙酰氨基葡萄糖含量为89.3g/L，转化率为33.2％，乙酸含量为4.2g/L，谷氨酸含量为4.4g/L。
实施例8
与实施例3的区别仅在于：复合氮源溶液中的玉米浆干粉含量不同。玉米浆干粉0.05g/L，酵母粉0.3g/L，硫酸铵0.05g/L及余量的水。
发酵培养60h时，N-乙酰氨基葡萄糖含量为100g/L，转化率为33.9％，乙酸含量为2.8g/L，谷氨酸含量为3.3g/L。
实施例9
与实施例3的区别仅在于：复合氮源溶液中的玉米浆干粉含量不同。玉米浆干粉0.2g/L，酵母粉0.3g/L，硫酸铵0.05g/L及余量的水。
发酵培养60h时，N-乙酰氨基葡萄糖含量为106g/L，转化率为38.1％，乙酸含量为3.0g/L，谷氨酸含量为2.9g/L。
实施例10
与实施例3的区别仅在于：复合氮源溶液中的玉米浆干粉含量不同。玉米浆干粉0.6g/L，酵母粉0.3g/L，硫酸铵0.05g/L及余量的水。
发酵培养60h时，N-乙酰氨基葡萄糖含量为106.3g/L，转化率为38.2％，乙酸含量为2.8g/L，谷氨酸含量为3.2g/L。
实施例11
与实施例3的区别仅在于：复合氮源溶液中的玉米浆干粉含量不同。玉米浆干粉0.8g/L，酵母粉0.3g/L，硫酸铵0.05g/L及余量的水。
发酵培养60h时，N-乙酰氨基葡萄糖含量为103.3g/L，转化率为35.9％，乙酸含量为3.5g/L，谷氨酸含量为3.8g/L。
实施例12
与实施例3的区别仅在于：复合氮源溶液中的酵母粉含量不同。玉米浆干粉0.4g/L，酵母粉0.1g/L，硫酸铵0.05g/L及余量的水。
发酵培养60h时，N-乙酰氨基葡萄糖含量为101.1g/L，转化率为35.2％，乙酸含量为3.0g/L，谷氨酸含量为3.8g/L。
实施例13
与实施例3的区别仅在于：复合氮源溶液中的酵母粉含量不同。玉米浆干粉0.4g/L，酵母粉0.5g/L，硫酸铵0.05g/L及余量的水。
发酵培养60h时，N-乙酰氨基葡萄糖含量为108g/L，转化率为38.8％，乙酸含量为3.2g/L，谷氨酸含量为2.9g/L。
实施例14
与实施例3的区别仅在于：复合氮源溶液中的酵母粉含量不同。玉米浆干粉0.4g/L，酵母粉0.8g/L，硫酸铵0.05g/L及余量的水。
发酵培养60h时，N-乙酰氨基葡萄糖含量为105.9g/L，转化率为33.9％，乙酸含量为4.0g/L，谷氨酸含量为3.8g/L。
对比例1
N-乙酰氨基葡萄糖的发酵方法，与实施例3的区别仅在于：IPTG诱导时，不流加复合氮源溶液。
发酵培养58h时，N-乙酰氨基葡萄糖含量为86.8g/L，转化率为37.2％，乙酸含量为2.5g/L，谷氨酸含量为3.1g/L。
对比例2
与实施例3的区别仅在于：当复合氮源溶液中酵母粉和玉米浆干粉总含量相同时，复合氮源溶液中的玉米浆干粉0g/L，酵母粉0.7g/L，硫酸铵0.05g/L及余量的水。
发酵培养60h时，N-乙酰氨基葡萄糖含量为103.8g/L，转化率为35.1％，乙酸含量为3.2g/L，谷氨酸含量为3.1g/L。
对比例3
与实施例3的区别仅在于：当复合氮源溶液中酵母粉和玉米浆干粉总含量相同时，复合氮源溶液中的玉米浆干粉0.7g/L，酵母粉0g/L，硫酸铵0.05g/L及余量的水。
发酵培养60h时，N-乙酰氨基葡萄糖含量为104.6g/L，转化率为34.5％，乙酸含量为3.0g/L，谷氨酸含量为3.3g/L。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种N-乙酰氨基葡萄糖的发酵生产方法，其包括在N-乙酰氨基葡萄糖发酵过程中，向N-乙酰氨基葡萄糖发酵液中流加复合氮源溶液，其中，所述复合氮源溶液包括玉米浆干粉、酵母粉和硫酸铵。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述复合氮源溶液中，玉米浆干粉的含量为0.1g/L-1.0g/L，优选为0.2g/L-0.6g/L，更优选为0.4g/L。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述复合氮源溶液中，酵母粉的含量为0.1g/L-1.0g/L，优选为0.2g/L-0.6g/L，更优选为0.3g/L。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述复合氮源溶液中，硫酸铵的含量为0.01g/L-0.1g/L，优选为0.03g/L-0.07g/L，更优选为0.05g/L。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述复合氮源溶液选自复合氮源的水溶液；和/或
所述复合氮源溶液的流加速率为0.1g/L·h-0.7g/L·h，优选为0.2g/L·h-0.5g/L·h，更优选为0.3g/L·h-0.4g/L·h。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将N-乙酰氨基葡萄糖种子液接种于发酵培养基中进行第一发酵，得到N-乙酰氨基葡萄糖发酵液；
S2：当N-乙酰氨基葡萄糖发酵液的溶氧回升时，在N-乙酰氨基葡萄糖发酵液中流加葡萄糖溶液进行第二发酵；
S3：当N-乙酰氨基葡萄糖发酵液中OD660nm为25-28时，向N-乙酰氨基葡萄糖发酵液中流加所述复合氮源溶液进行第三发酵。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，当N-乙酰氨基葡萄糖发酵液中OD660nm为25-28时，在所述N-乙酰氨基葡萄糖发酵液中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷后再流加所述复合氮源溶液，优选地，基于所述N-乙酰氨基葡萄糖发酵液，所述异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的加入量为0.04mM-0.08mM。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述葡萄糖溶液的流加速率为5g/L·h-8g/L·h；和/或
所述葡萄糖溶液的质量浓度为50％-60％。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一发酵的温度为35℃-37℃；和/或
所述第三发酵的温度为32℃-34℃；和/或
所述发酵的时间为55h-60h，优选为57h-59h。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基包括葡萄糖5g/L、磷酸氢二钾16g/L、磷酸二氢钾10g/L、酵母浸粉0.3g/L、酵母膏0.1g/L、苏氨酸0.1g/L、蛋氨酸0.15g/L、硫酸镁0.25g/L、硫酸铵3g/L、氯化钾0.1g/L、硫酸锰0.015mg/L、硫酸铁0.35mg/L、硫酸锌0.41mg/L和氯化钴0.02mg/L；和/或
培养所述N-乙酰氨基葡萄糖种子液的种子培养基包括葡萄糖15g/L、磷酸氢二钾11g/L、磷酸二氢钾16g/L、酵母浸粉1g/L、苏氨酸0.2g/L、蛋氨酸0.15g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸铵5g/L、硫酸锰0.013mg/L、硫酸铁0.024mg/L、硫酸锌0.047mg/L和氯化钴0.01mg/L。
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