KR101172905B1 - 한쪽의 에난티오머가 풍부화된 β-아미노산의 효소적 제조방법 - Google Patents

한쪽의 에난티오머가 풍부화된 β-아미노산의 효소적 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 한쪽의 에난티오머가 풍부화된 β-아미노산의 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 화학식 1의 β-아미노산의 유리한 에스테르 및 한쪽의 에난티오머가 풍부화된 β-아미노산의 효소적 제조 방법에 있어서의 이의 용도에 관한 것이다.
Figure 112003016308252-pat00001
한쪽의 에난티오머가 풍부화된 β-아미노산, N-비보호된 β-아미노산의 에스테르, 가수분해 효소, 에난티오머 혼합물, 효소적 가수분해

Description

한쪽의 에난티오머가 풍부화된 β-아미노산의 효소적 제조 방법{Process for the Enzymatic Preparation of Enantiomerically Enriched β-Amino Acids}
본 발명은 한쪽의 에난티오머가 풍부화된 β-아미노산의 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 β-아미노산의 유리한 에스테르 및 한쪽의 에난티오머가 풍부화된 β-아미노산의 효소적 제조 방법에 있어서의 이의 용도에 관한 것이다.
광학 활성인 β-아미노카르복실산은 알칼로이드 및 항생물질과 같은 천연 물질에 존재하며, 특히 약제 제조에 필수적인 중간체로서 그 중요성이 증가하고 있기 때문에 이의 분리는 점점 더 중요해지고 있다[참조: 특히, E. Juaristi, H. Lopez-Ruiz, Curr. Med. Chem. 1999, 6, 983-1004]. 유리 형태의 광학 활성 β-아미노카르복실산 및 이의 유도체 둘 다는 흥미로운 약리학적 효과를 나타내며, 또한 개질 펩티드의 합성에 사용할 수 있다.
β-아미노카르복실산에 대한 제조 방법으로는, 지금까지는 문헌[참조: H. Boesch et al., Org. Proc. Res. Developm. 2001, 5, 23-27]에 제안되어 있는 경로인 부분입체 이성질체 염을 경유하는 통상적인 라세미체 분할법, 및 특히 리튬 페닐에틸아미드의 부분입체선택적 첨가법[문헌 참조: A. F. Abdel-Magid, J. H. Cohen, C. A. Maryanoff, Curr. Med. Chem. 1999, 6, 955-970]이 확립되어 있다. 후자의 방법은, 당해 방법을 사용할 경우에 발생하는 다수의 결점에도 불구하고, 집중적으로 연구되었으며, 선호하여 이용되고 있다. 한편, 촉매에 의한 비대칭 방법에 비해 큰 단점을 보이는 화학량론적 양의 키랄 시약이 필요하다. 또한, 예를 들어, n-부틸리튬과 같은, 고가이면서도, 또한 위험한 보조 물질이 탈양성자화에 의해 화학량론적 시약을 활성화시키는 데 필요하다. 또한, 만족스러운 입체선택률을 위해서는, 약 -70℃의 저온에서 반응을 수행하는 것이 중요하며, 이는 반응기 재료에 대한 고도의 요건, 부가 비용 및 높은 에너지 소비를 의미하는 것이다.
생물 촉매 방법에 의한 광학 활성 β-아미노카르복실산의 제조법이 현재는 단지 부차적인 역할을 하고 있지만, 이 방법은 특히 생물 촉매 반응의 경제적 및 생태학적 이점으로 인해 바람직하다. 화학량론적 양의 키랄 시약을 사용할 필요가 없으며, 대신에 천연의 환경 친화적 촉매인 효소를 소량의 촉매량으로 사용한다. 이들의 촉매 특성과 높은 활성 이외에도, 수성 매질 중에서 효율적으로 사용되는 상기한 생물 촉매는, 금속, 특히 중금속을 함유하므로 독성인 물질의 사용을 피할 수 있어, 많은 합성 금속-함유 촉매에 비해 유리하다.
선행 기술에 있어서, 예를 들어 β-아미노카르복실산의 에난티오머선택적 N-아실화는 이미 수차례 보고된 바 있다.
예를 들어, 문헌[참조: Tetrahedron: Asymmetry, Vol. 7, No. 6, p. 1707-1716, 1996, L.T. Kanerva et al.]에는 유기 용매 및 생물 촉매로서의 칸디다 안타르크티카(Candida antarctica) 유래의 리파제(Lipase) SP 526 또는 슈도모나스 세 파시아(Pseudomonas cepacia) 유래의 리파제 PS 중에서 2,2,2-트리플루오로에틸 에스테르를 이용한 각종 지환족 β-아미노카르복실산의 에틸 에스테르의 에난티오머선택적 N-아실화가 기술되어 있다.
문헌[참조: V.M. Sanchez et al., Tetrahedron: Asymmetry, Vol. 8, No. 1, p. 37-40, 1997]에는 칸디다 안타르크티카 유래의 리파제를 사용하는, N-아세틸화된 β-아미노카르복실산 에스테르의 제조를 경유한 (±)-에틸-3-아미노부티레이트의 생물 촉매적 라세미체 분할법이 연구되어 있다.
EP-A-8 890 649에는 아미다제, 프로테아제, 에스테라제 및 리파제의 군으로부터 선택된 가수분해 효소의 존재하에 카르복실산 에스테르를 사용한 에난티오머선택적 아실화, 및 아미노산 에스테르 중의 비전환된 에난티오머의 후속적인 분리에 의해 아미노산 에스테르 라세미체로부터 광학 활성인 아미노산 에스테르를 제조하는 방법이 개시되어 있다.
WO-A-98/50575는, 라세미 β-아미노카르복실산, 아실 공여체 및 페니실린 G 아실라제를, 라세미 β-아미노카르복실산 중의 한쪽 에난티오머를 입체선택적으로 아실화시키는 조건하에 접촉시킴으로써, 키랄 β-아미노카르복실산 또는 이의 상응하는 에스테르를 수득하는 방법에 관한 것으로서, 다른 한쪽의 에난티오머는 실질적으로 전환되지 않아, 키랄 β-아미노카르복실산이 수득된다. 역 반응 순서가 또한 문헌[참조: V. A. Soloshonok, V. K. Svedas, V. P. Kukhar, A. G. Kirilenko, A. V. Rybakova, V. A. Solodenko, N. A. Fokina, O. V. Kogut, I. Y. Galaev, E. V. Kozlova, I. P. Shishkina, S. V. Galushko, Synlett 1993, 339-341; V. Soloshonok, A. G. Kirilenko, N. A. Fokina, I. P. Shishkina, S. V. Galushko, V. P. Kukhar, V. K. Svedas, E. V. Kozlova, Tetrahedron: Asymmetry 1994, 5, 1119-1126; V. Soloshonok, N. A. Fokina, A. V. Rybakova, I. P. Shishkina, S. V. Galushko, A. E. Sochorinsky, V. P. Kukhar, M. V. Savchenko, V. K. Svedas, Tetrahedron: Asymmetry 1995, 6, 1601-1610; G. Cardillo, A. Tolomelli, C. Tomasini, Eur. J. Org. Chem. 1999, 155-161]에서 연구되어 있다. 이 방법의 결점은 생성물 혼합물을 에난티오머선택적 가수분해 후에 후처리하는 것이 곤란하다는 점이다. 유리 β-아미노카르복실산의 분리 후에, 분리하기 어려운 페닐아세트산과 N-페닐아세틸-β-아미노카르복실산과의 혼합물이 수득된다.
한쪽의 에난티오머가 풍부화된 카르복실산을 수득하기 위해 이들을 리파제와 반응시키는 것은 오래전부터 알려져 왔다.
미국 특허 제5,518,903호에서는, 이러한 원리를 N-보호된 β-아미노산 에스테르에 적용하였지만, 성공도가 변화하였다. 리파제에 의한 고도로 에난티오머선택적인 방식으로는 라세미 N-부톡시카르보닐-β-아미노부티르산의 상응하는 벤질 에스테르만을 분할할 수 있는 한편, 나머지의 사용된 메틸 에스테르 및 n-부틸 에스테르는 단지 70％ 범위의 ee 값을 나타내었다. 상응하는 메틸 에스테르를 n-부틸 에스테르로 변화시키면 제조된 산의 ee 값이 명백히 저하될 것임을 주지하여야 한다. 예를 들어, 효소 리파제(구입원: Asahi)를 사용한 N-Boc-β-아미노부티르산의 n-부틸 에스테르를 출발물질로 한 에스테르 가수분해는 37％ 수율로 8일 후에 45％ ee의 상응하는 산의 ee 값을 제공한다. 리파제 PS(구입원: Amano)를 사용하 여서는, 61％ ee로 풍부화된 화합물이 41％의 수율로 7일의 기간내에 동일한 반응에서 수득된다. 비교컨대, 상응하는 메틸 에스테르는 70％ ee를 나타낸다.
문헌[참조: Faulconbridge et al., Tetrahedron Letters 2000, 41, 2679-81]에 의해 최근에 공개된 결과는 리파제 PS(구입원: Amano)를 사용한 pH 8에서의 방향족 β-아미노산 에틸 에스테르의 에스테르 가수분해가 허용가능한 수율 및 매우 우수한 에난티오머 과잉률로 일어남을 보여주고 있다. 99％에 이르는 에난티오머 순도를 갖는 생성물이 수득되지만, 현탁액 중에서 단독으로 수행되는 합성은 몇가지 결점을 수반한다. 한편으로는, 결정화가 상기 조건하에 선택성이 있더라도, 비교예 1에서 입증된 바와 같이 반응 자체는 85.1％ ee의 낮은 ee 값을 제공하는 것으로 밝혀졌다. 전반적으로, 이는 한편으로는 목적하지 않은 에난티오머의 형성으로 인한 수율의 손실을 의미하고, 다른 한편으로는 ee 값이 경미한 공정 변형에 좌우되어 변화된 결정화 조건으로 인해 99％ ee 아래로 또는 심지어 상업적 규모에서는 98％ ee 아래로 쉽게 떨어질 수 있음을 의미한다. 그러나, 98％ ee를 초과하는, 특히 99％ ee를 초과하는 가능한 높은 ee 값은 약제학적 적용을 위한 필수 조건이다. 게다가, 한외 여과에 의한 우수한 효소 분리를 확실하게 가능하도록 하기 위해서는, 균질 매질(현탁액 아님!) 중에서 반응을 수행하는 것이 또한 바람직할 것이다. 최적으로는, 지금까지 공지된 문헌의 방법을 이용하여 달성할 수 없는 높은 ee 값이 또한 그 공정으로 달성되어야 하는 것이다.
따라서, 본 발명의 목적은 β-아미노산의 효소적 제조를 위한 새로운 방법을 제공하는 것이다. 특히, 이 방법은 경제적 및 생태학적 관점으로부터 상업적 규모로 유리하게 이용가능하여야 하며, 즉 상기 방법은 특히 환경 적합성, 작업장에서의 안전성 및 공정의 강건성, 및 공간/시간 수율 및 선택률이 탁월하여야 한다.
보다 더 상세하게 언급되지는 않았지만 선행 기술로부터 명백한 방식으로 자명한 상기 및 기타 목적은 본 발명의 주제에 의거한 특허청구범위 제1항의 특징을 갖는 방법에 의해 달성된다. 종속항 제2항 내지 제8항은 본 발명의 바람직한 실시양태에 관한 것이다. 특허청구범위 제9항은 β-아미노산의 신규한 에스테르에 관한 것이고, 당해 방법에서의 이의 유리한 용도는 특허청구범위 제10항에서 보호된다.
N-비보호된 β-아미노산 에스테르와 가수분해 효소와의 에난티오머 혼합물의 효소적 가수분해에 의한 한쪽의 에난티오머가 풍부화된 N-비보호된 β-아미노산의 제조 방법은 상응하는 메틸 또는 에틸 에스테르를 사용하지 않음을 전제로 하여 수행되기 때문에, 상술한 목적은 매우 놀랍지만 유리한 방식으로 달성된다. 지금까지는, 단지 N-비보호된 β-아미노산의 메틸 또는 에틸 에스테르만이 당해 반응에 사용되어 왔지만, 이러한 에스테르는 위에서 미리 언급한 결점을 수반한다. 보다 큰, 예를 들어 (C3-C8)-알킬 라디칼을 갖는 에스테르기를 효소적 가수분해의 목적으로 사용할 경우, 공간/시간 수율 및 선택률의 양쪽 관점에서 보다 우수한 결과가 명백하게 얻어진다. 이러한 사실은 위에서 논의된 미국 특허 제5,518,903호에 비 추어 놀라운 것이며, 다른 한편으로는, 보다 신속한 반응일수록 에난티오머 구별의 가능성이 일반적으로는 감소하기 때문에 이러한 경향은 예측할 수 없었던 것이다. 이러한 논리적인 관계는, 예를 들어, 일반적으로 보다 높은 반응 온도 - 당해 온도에서는 반응이 따라서 보다 신속하게 진행한다 - 에서의 보다 낮은 에난티오머선택률을 고려해보면 설명이 된다.
원칙적으로, 당업자는 에스테르기를 자유롭게 선택할 수 있다. 당업자는 경제적 고려사항 및 반응-관련된 고려사항에 따라 에스테르기를 선택할 것이다. 에스테르를 형성시키는데 유리한 알콜은 특히 반응 혼합물로부터 용이하게 제거할 수 있는 것들이다. 그 예로는 알킬 알콜 또는 아릴 알콜, 임의로는 저비점 페놀 또는 벤질 알콜과 같은 알콜이 있다. 따라서, 상기 알콜을 사용하여 수득가능한 β-아미노산 알킬 에스테르 또는 β-아미노산 아릴 에스테르가 가수분해에 바람직하게 사용된다. β-아미노산의 상응하는 n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 2급-부틸, 이소부틸 또는 3급-부틸 에스테르가 매우 특히 바람직하다.
당업자는 또한 반응 파라미터를 자유롭게 선택할 수 있다. 당업자는 통상의 실험에 의해 각각의 경우에 대해 파라미터를 개별적으로 결정할 것이다. 임의의 경우에, 본 발명의 주제에 따르는 효소적 방법에서 적합한 pH 범위는 4 내지 10, 바람직하게는 6 내지 9 및 보다 바람직하게는 7 내지 8.5이다. 리파제 PS(구입원: Amano)는 약 pH 8에서 특히 적합한 것으로 입증되어 있다.
온도와 관련하여, 필요 조건은 원칙적으로 pH 값의 경우와 동일하다. 이 경우에도 또한, 최적 온도는 어떤 효소가 어떤 온도에서 최적으로 작용하는지에 의거 해 각각의 경우에 대해 결정할 수 있다. 호열성 유기체 유래의 효소인 경우에, 100℃까지의 고온이 가능하다. 또 다른 효소는 최적으로는 0℃ 미만 내지 -15℃에서만, 임의로는 아이스 매트릭스 중에서 작용한다. 반응 동안 설정되어 있는 온도는 바람직하게는 15 내지 40℃, 보다 바람직하게는 20 내지 30℃의 범위이어야 한다.
당업자가 사용할 효소의 선택을 담당한다. 다수의 적합한 효소를 문헌[참조: Enzyme Catalysis in Organic Synthesis, Ed.: K. Drauz, H. Waldmann, VCH, 1995, p. 165], 및 상기 문헌에 인용된 문헌으로부터 선택할 수 있다. 리파제가 에스테르 가수분해에 바람직하게 사용되고, 보다 바람직하게는 슈도모나스 세파시아 유래의 리파제 PS(구입원: Amano)가 사용된다. 상기 폴리펩티드는 균질하게 정제된 화합물로서 유리 형태로, 또는 재조합 방법에 의해 제조된 효소 형태로 사용할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 또한 무손상 숙주 유기체의 일부로서, 또는 파쇄되고, 필요에 따라 고도로 정제된 숙주 유기체의 세포 덩어리와 함께 사용할 수 있다. 또한, 효소를 고정화 형태로 사용하는 것도 가능하다[문헌 참조: Sharma B. P.; Bailey L. F. and Messing R. A. (1982), Immobilisierte Biomaterialien - Techniken und Anwendungen, Angew. Chem. 94, 836-852]. 고정화는 바람직하게는 동결건조에 의해 수행한다[문헌 참조: Paradkar, V. M.; Dordick, J. S. (1994), Aqueous-Like Activity of α-Chymotrypsin Dissolved in Nearly Anhydrous Organic Solvents, J. Am. Chem. Soc. 116, 5009-5010; Mori, T.; Okahata, Y. (1997), A variety of lipi-coated glycoside hydrolases as effective glycosyl transfer catalysts in homogeneous organic solvents, Tetrahedron Lett. 38, 1971-1974; Otamiri, M.; Adlercreutz, P.; Matthiasson, B. (1992), Complex formation between chymotrypsin and ethyl cellulose as a means to solubilize the enzyme in active form in toluene, Biocatalysis 6, 291-305]. 계면활성 물질, 예를 들어, 에어로졸(Aerosol) OT 또는 폴리비닐피롤리돈 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 Brij 52(디에틸렌 글리콜 모노-세틸 에테르)의 존재하에서의 동결건조가 매우 특히 바람직하다[문헌 참조: Kamiya. N.; Okazaki, S.-Y.; Goto, M. (1997), Surfactant-horseradish peroxidase complex catalytically active in anhydrous benzene, Biotechnol. Tech. 11, 375-378]. 유퍼지트(등록상표, Eupergit), 특히 유퍼지트 C(등록상표) 및 유퍼지트 250L(등록상표)(Rohm) 상에서의 고정화가 가장 바람직하다[개관으로서 문헌 참조: E. Katchalski-Katzir, D. M. Kraemer, J. Mol. Catal. B: Enzym. 2000, 10, 157]. 또한, His 태그(헥사-히스티딘)의 부착에 의해 개질된 폴리펩티드와 함께 Ni-NTA 상에서의 고정화가 바람직하다[문헌 참조: Petty, K.J. (1996), Metal-chelate affinity chromatography in: Ausubel, F.M. et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, New York: John Wiley and Sons]. CLEC 형태로의 사용이 또한 가능하다[문헌 참조: St. Clair, N.; Wang, Y.-F.; Margolin, A. L. (2000), Cofactor-bound cross-linked enzyme crystals (CLEC) of alcohol dehydrogenase, Angew. Chem. Int. Ed. 39, 380-383]. 이들 기준에 의해, 유기 용매로 인해 불안정화되는 폴리펩티드로부터 수성 용매와 유기 용매와의 혼합물 중에서 또는 완전한 유기 매질 중에서 작용 할 수 있는 폴리펩티드를 생성시키는 것이 가능할 수 있다.
본 발명의 주제에 따르는 반응은 이를 위해 제공되는 임의의 반응 용기내에서 수행할 수 있다. 이러한 반응 용기는 상세하게는 통상의 회분식 반응기, 루프 반응기 또는 효소-막 반응기이다[문헌 참조: Bommarius, A. S.; Drauz, K.; Groeger, U.; Wandrey, C.; Membrane Bioreactors for the Production of Enantiomerically Pure α-Amino Acids, in: Chirality in Industry (eds: Collins, A. N.; Sheldrake, G. N.; Crosby, J.) 1992, John Wiley ＆ Sons, p. 371-397].
본 발명에 따르는 반응에서 사용되는 에스테르는 때때로 수성 반응 매질 중에서 불량한 용해도를 나타낸다. 이러한 경우에, 균질한 반응 상을 수득하기 위해서는, 사용되는 효소의 용매 허용도에 따라, 수용성 유기 용매를 반응 혼합물에 첨가하는 것이 유리할 수 있다. 이러한 수용성 유기 용매로서는 특히 아세톤, DMF, 에탄올 및 메탄올이 적합하다. 그러나, 보다 높은 물질 농도에서는 현탁액의 형성을 이용한 반응도 또한 가능하다.
수용성 담체 재료, 또는 동반된 물질 또는 안정화제 상에 임의로 흡착된 효소를 사용하는 경우에, 효소 및 담체의 분리가 간단한 방식으로 가능하다면, 효소를 반응에서 사용하기 전에 불용성 담체, 또는 동반된 물질 또는 안정화제를 분리 제거하여, 사용된 효소의 불용성 담체 재료에 의해 침전되는 생성물이 오염되지 않도록 하는 것이 유리한 것으로 입증되어 있다. 예를 들어, 유리하게 사용되는 리파제 PS(구입원: Amano)를 실리카 담체 상에 흡착시킨다. 반응물을 반응 매질에 첨가하기 전에, 실리카를 반응 시스템으로부터 제거하기 위해서는, 효소 수용액의 여과를 수행하여야 한다. 이러한 과정은 효소의 활성 또는 공정 안정성에 부작용을 미치지 않는다.
또한, 본 발명은 화학식 1의 구조를 갖는 β-아미노산 n-프로필 에스테르를 제공한다.
<화학식 1>
Figure 112003016308252-pat00002
상기 식에서,
R은 (C1-C8)-알킬, (C2-C8)-알케닐, (C2-C8 )-알키닐, (C3-C8)-시클로알킬, (C6-C18)-아릴, (C7-C19)-아르알킬, (C3-C18)-헤테로아릴, (C4-C19)-헤테로아르알킬, ((C1-C8)-알킬)1-3-(C3-C8)-시클로알킬, ((C1-C8 )-알킬)1-3-(C6-C18)-아릴, ((C1-C8)-알킬) 1-3-(C3-C18)-헤테로아릴이고,
R'는 H, (C1-C8)-알킬, (C2-C8)-알케닐, (C2-C8 )-알키닐, (C3-C8)-시클로알킬, (C6-C18)-아릴, (C7-C19)-아르알킬, (C3-C18 )-헤테로아릴, (C4-C19)-헤테로아르알킬, ((C1-C8)-알킬)1-3-(C3-C8)-시클로알킬, ((C1 -C8)-알킬)1-3-(C6-C18)-아릴, ((C1-C8 )-알 킬)1-3-(C3-C18)-헤테로아릴이다.
매우 특히 유리한 화합물은 R이 방향족 라디칼, 특히 페닐, 티에닐, 푸릴, 피리딜, 및 방향족 환 상에서 특히 치환체로서의 (C1-C8)-알킬 또는 (C1-C 8)-알콕시로 일치환되거나 다치환된 이의 유도체이고, R'가 H인 화합물이다. 3-아미노-3-페닐프로피온산 n-프로필 에스테르를 특히 중요한 상기 화합물 유형의 대표적인 예로서 언급할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따르는 방법에서의 상기한 화합물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 범위내에 있어서, "N-비보호된"은 산의 β-질소 원자가 반응 조건하에 안정한 N-보호기에 의해 차단되지 않음을 의미하는 것으로 해석된다. 이러한 보호기는 특히 통상의 보호기, 예를 들어, Z, Boc, Fmoc, Eoc, Moc, 아세틸 등인 것으로 고려된다.
(C1-C8)-알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, 2급-부틸, 3급-부틸, 펜틸, 헥실, 펩틸 또는 옥틸(이중 결합의 상이한 위치로 인한 모든 이성질체 포함)인 것으로 고려된다. 이들은 (C1-C8)-알콕시, (C1-C 8)-할로알킬, OH, 할로겐, NH2, NO2, SH 또는 S-(C1-C8)-알킬에 의해 일치환되거나 다치환될 수 있다. (C3-C8)-알킬은 이와 마찬가지로 고려된다.
(C2-C8)-알케닐은, 하나 이상의 이중 결합을 함유하는, 메틸을 제외한 상기한 바와 같은 (C1-C8)-알킬 라디칼인 것으로 해석된다.
(C2-C8)-알키닐은, 하나 이상의 삼중 결합을 함유하는, 메틸을 제외한 상기한 바와 같은 (C1-C8)-알킬 라디칼인 것으로 해석된다.
(C1-C8)-아실은 -C=O- 관능기를 통해 분자에 결합되어 있는 (C1-C8 )-알킬 라디칼인 것으로 해석된다.
(C3-C8)-시클로알킬은 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실 또는 시클로헵틸 라디칼 등인 것으로 해석된다. 이들은 하나 이상의 할로겐 및(또는) N, O, P 또는 S 원자를 함유하는 라디칼에 의해 치환될 수 있고(있거나), 예를 들어, 1-, 2-, 3-, 4-피페리딜, 1-, 2-, 3-피롤리디닐, 2-, 3-테트라히드로푸릴 또는 2-, 3-, 4-모르폴리닐과 같이, N, O, P 또는 S 원자를 함유하는 라디칼을 환 중에 가질 수 있다. 이러한 라디칼은 (C1-C8)-알콕시, (C1-C8)-할로알킬, OH, 할로겐, NH2, NO2, SH, S-(C1-C8)-알킬, (C1-C8)-아실 또는 (C1-C8)-알킬에 의해 일치환되거나 다치환될 수 있다.
(C6-C18)-아릴 라디칼은 6 내지 18개의 탄소 원자를 갖는 방향족 라디칼인 것으로 해석된다. 이러한 라디칼은 특히 페닐, 나프틸, 안트릴, 페난트릴 또는 비페닐 라디칼과 같은 화합물을 포함한다. 이러한 라디칼은 (C1-C8)-알콕시, (C1 -C8)-할로알킬, OH, 할로겐, NH2, NO2, SH, S-(C1-C8)-알킬, (C1 -C8)-아실 또는 (C1-C8)-알킬 에 의해 일치환되거나 다치환될 수 있다.
(C7-C19)-아르알킬 라디칼은 (C1-C8)-알킬 라디칼을 통해 분자에 결합되어 있는 (C6-C18)-아릴 라디칼이다.
(C1-C8)-알콕시는 산소 원자를 통해 당해 분자에 결합되어 있는 (C1-C8 )-알킬 라디칼이다.
(C1-C8)-알콕시카르보닐은 -OC(O)- 관능기를 통해 당해 분자에 결합되어 있는 (C1-C8)-알킬 라디칼이다. 동일한 사항이 또 다른 옥시카르보닐 라디칼에 유사하게 적용된다.
(C1-C8)-할로알킬은 하나 이상의 할로겐 원자에 의해 치환된 (C1-C8 )-알킬 라디칼이다.
본 발명의 범위내에 있어서, (C3-C18)-헤테로아릴 라디칼은 환 중에 3 내지 18개의 탄소 원자를 가지고, 예를 들어, 질소, 산소 또는 황과 같은 헤테로 원자를 함유하는 5원, 6원 또는 7원 방향족 환계를 의미한다. 이러한 헤테로방향족 화합물은 특히 1-, 2-, 3-푸릴, 1-, 2-, 3-피롤릴, 1-, 2-, 3-티에닐, 2-, 3-, 4-피리딜, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-인돌릴, 3-, 4-, 5-피라졸릴, 2-, 4-, 5-이미다졸릴, 아크리디닐, 퀴놀리닐, 페난트리디닐 또는 2-, 4-, 5-, 6-피리미디닐과 같은 라디칼인 것으로 고려된다. 이러한 라디칼은 (C1-C8)-알콕시, (C1-C8 )-할로알킬, OH, 할 로겐, NH2, NO2, SH, S-(C1-C8)-알킬, (C1-C8 )-아실 또는 (C1-C8)-알킬에 의해 일치환되거나 다치환될 수 있다.
(C4-C19)-헤테로아르알킬은 (C7-C19)-아르알킬 라디칼에 상응하는 헤테로방향족계인 것으로 해석된다.
적합한 할로겐은 불소, 염소, 브롬 및 요오드이다.
본 발명의 범위내에 있어서, 표현 '한쪽의 에난티오머가 풍부화된'은 광학 대장체를 갖는 혼합물 중에서의 한쪽 에난티오머 비율이 50％ 내지 100％ 범위인 것을 의미하는 것으로 해석된다.
제시된 화학식 1의 구조는 모든 가능한 부분입체 이성질체 및 에난티오머 및 가능한 이들의 혼합물을 나타낸다.
인용된 참조 문헌은 본 발명의 명세서에 포함되는 것으로 간주된다.
실험예:
실시예 1(= 비교예):
9.2mmol의 라세미 화합물 rac-3-아미노-3-페닐프로피온산 에틸 에스테르(1.79g)를 물 50ml에 용해시킨 다음, 당해 용액의 pH를 1M 수산화나트륨 용액(구입원: Merck)의 첨가에 의해 자동 pH 측정으로 pH 8.2의 값으로 조정하였다. 에스테르를 잔사없이 용해시키기 위해, 아세톤 3ml를 용해용으로 추가로 첨가하였다. 20℃의 반응 온도에 도달했을 때, 반응을 개시하기 위해 아미노 리파제(Amano Lipase) PS(슈도모나스 세파시아; 구입원: Amano Enzymes, Inc.) 200mg을 첨가하였다. 3시간 및 6시간의 반응 시간 후에, 생성된 (S)-3-아미노-페닐프로피온산의 전환율을 측정하였고, 6시간 후에, 이의 에난티오머선택률을 측정하였다. 3시간 후에 18.5％ 및 6시간 후에 37.8％의 전환율, 및 85.1％ ee의 에난티오머선택률(6시간 후)이 측정되었다. 전환율 및 에난티오머선택률은 HPLC에 의해 측정하였다.
실시예 2:
9.2mmol의 라세미 화합물 rac-3-아미노-3-페닐프로피온산 n-프로필 에스테르(1.91g)를 물 50ml에 용해시킨 다음, 당해 용액의 pH를 1M 수산화나트륨 용액(구입원: Merck)의 첨가에 의해 자동 pH 측정으로 pH 8.2의 값으로 조정하였다. 에스테르를 잔사없이 용해시키기 위해, 아세톤 3ml를 용해용으로 추가로 첨가하였다. 20℃의 반응 온도에 도달했을 때, 반응을 개시하기 위해 아미노 리파제 PS(슈도모나스 세파시아; 구입원: Amano Enzymes, Inc.) 200mg을 첨가하였다. 1시간의 반응 시간 후에, 생성된 (S)-3-아미노-페닐프로피온산의 전환율을 측정하였고, 3시간 후에, 이의 에난티오머선택률을 측정하였다. 1시간 후에 48.7％의 전환율 및 96.4％ ee의 에난티오머선택률(3시간 후)이 측정되었다. 전환율 및 에난티오머선택률은 HPLC에 의해 측정하였다.
실시예 3:
8.63mmol의 라세미 화합물 rac-3-아미노-3-페닐프로피온산 n-부틸 에스테르(1.91g)를 물 50ml에 용해시킨 다음, 당해 용액의 pH를 1M 수산화나트륨 용액(구입원: Merck)의 첨가에 의해 자동 pH 측정으로 pH 8.2의 값으로 조정하였다. 에스테르를 잔사없이 용해시키기 위해, 아세톤 3ml를 용해용으로 추가로 첨가하였다. 20℃의 반응 온도에 도달했을 때, 반응을 개시하기 위해 아미노 리파제 PS(슈도모나스 세파시아; 구입원: Amano Enzymes, Inc.) 200mg을 첨가하였다. 3시간의 반응 시간 후에, 생성된 (S)-3-아미노-페닐프로피온산의 전환율 및 에난티오머선택률을 측정하였다. 45.2％의 전환율 및 96.8％ ee의 에난티오머선택률이 측정되었다. 전환율 및 에난티오머선택률은 HPLC에 의해 측정하였다.
실시예 4:
물 81ml를 용기에 유입하고, 아미노 리파제 PS(슈도모나스 세파시아; 구입원: Amano Enzymes, Inc.) 1.45g을 이에 첨가하였다. 다음, 미용해된 고체를 여과 제거하였다. 유기 용매 성분으로서의 메틸 3급-부틸 에테르(MTBE) 81ml를 여액으로서 수득된 효소 수용액에 첨가하였다. 생성된 2상 시스템을 1M 수산화나트륨 용액(구입원: Merck)의 첨가에 의해 자동 pH 측정으로 pH 8.2로 조정하였다. 20℃의 반응 온도에 도달했을 때, 188.2mmol의 라세미 화합물 rac-3-아미노-3-페닐프로피온산 n-프로필 에스테르(39.0g)를 첨가하여, 반응을 개시하였다. 반응 시간은 15시간이었으며, 이 동안 목적하는 생성물인 (S)-3-아미노-3-페닐프로피온산으로 구성된 백색 침전물이 형성되었다. 15시간의 반응 시간 후에, 아세톤 160ml를 첨가 하여, 침전을 종료시킨 다음, 교반을 약 45분 동안 수행하고, 고체를 여과하였다. 고체를 소량의 아세톤으로 수회 세척한 다음, 진공하에 건조시켰다. 41.6％의 수율에 상당하는 목적하는 (S)-3-아미노-3-페닐프로피온산 12.91g을 수득하였다. 생성물에 대한 에난티오머선택률은 99.6％ ee이었다. 에난티오머선택률은 HPLC에 의해 측정하였다. 화합물의 순도는 98.8％(적정법에 의해 측정)로 측정되었다. 생성물의 구조는 NMR 분광계에 의해 추가로 확인하였다.
본 발명에 따르면, 경제적 및 생태학적 관점으로부터 상업적 규모로 유리하게 이용가능하며, 즉 특히 환경 적합성, 작업장에서의 안전성 및 공정의 강건성, 및 공간/시간 수율 및 선택률이 탁월한, 한쪽의 에난티오머가 풍부화된 β-아미노산의 효소적 제조 방법을 제공한다.

Claims (16)

  1. N-비보호된 β-아미노산 n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 2급-부틸, 이소부틸 또는 3급-부틸 에스테르의 에난티오머 혼합물을 가수분해 효소에 의해 효소적 가수분해하여 한쪽의 에난티오머가 풍부화된 N-비보호된 β-아미노산을 제조하는 방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 반응의 pH 값이 4 내지 10임을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 반응 중의 온도가 -15 내지 +100℃임을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 리파제를 사용함을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 반응을 효소-막 반응기내에서 수행함을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 가수분해를, 수용성 유기 용매가 첨가되거나 첨가되지 않은 수성 매질 중에서 수행함을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 반응의 pH 값이 4 내지 10이고, 반응 중의 온도가 -15 내지 +100℃임을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 반응 중의 온도가 +15 내지 +40℃임을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 반응의 pH 값이 6 내지 9임을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 리파제를 사용하고, 반응의 pH 값이 4 내지 10이고, 반응 중의 온도가 -15 내지 +100℃임을 특징으로 하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 슈도모나스 세파시아 유래의 리파제 PS를 사용함을 특징으로 하는 방법.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
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