PT1361279E - Processo para o fabrico enzimático de beta-aminoácidos enriquecidos com enantiómeros - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "PROCESSO PARA O FABRICO ENZIMÁTICO DE BETA-AMINOÁCIDOS ENRIQUECIDOS COM ENANTIÓMEROS" A presente invenção é relativa a um processo para o fabrico de beta-aminoácidos enriquecidos com enantiómeros.

Os ácidos beta-aminocarboxilicos opticamente activos surgem em substâncias naturais como os alcaloides e antibióticos, e o isolamento dos mesmos tem vindo a ganhar cada vez mais interesse, para o que conta também o significado cada vez maior que têm como produtos intermediários essenciais ao fabrico de medicamentos (ver, entre outros, E. Juaristi, H. Lopez-Ruiz, Curr. Med. Chem. 1999, 6, 983 - 1004). Tanto a forma livre de ácidos beta-aminocarboxilicos opticamente activos como também os respectivos derivados mostram efeitos farmacológicos interessantes, e também podem ser empregues na síntese de péptidos modificados.

Como métodos de fabrico dos ácidos beta-aminocarboxilicos, têm estado estabelecidas até à data a separação clássica de racematos através de sais diastereoméricos (via proposta in: H. Boesch et al., "Org. Proc. Res. Developm." 2001, 5, 23 - 27) e, em particular, a adição diastereo-selectiva de litio-feniletilamida (A. F. Abdel-Magid, J. H. Cohen, C. A. Maryanoff, Curr. Med. Chem. 1999, 6, 955 - 970). O último método é considerado estudado de forma intensiva e é aplicado apesar das inúmeras desvantagens que acarreta. Por um lado, são necessárias quantidades estoquiométricas de um reagente quiral, o que representa uma grande desvantagem em comparação com os métodos assimétricos catalíticos. Além disso, são necessárias substâncias auxiliares caras e ainda 2 perigosas, como, por exemplo, n-butil-lítio, para a activação do reagente estoquiométrico através de desprotonização. Para uma estereo-selectividade suficiente é ainda importante a realização da reacção a temperaturas baixas de cerca de -70°C, o que exige muito do material do reactor, custos adicionais e um grande consumo energético. O fabrico de ácidos beta-aminocarboxilicos opticamente activos por vias biocataliticas desempenha nos dias de hoje um papel secundário, sendo no entanto algo desejado devido em particular às vantagens económicas e ecológicas das reacções biocataliticas. Não existe o emprego de quantidades estoquiométricas de um reagente quiral e, em vez, emprega-se quantidades catalíticas reduzidas de enzimas, que representam catalisadores naturais e ecológicos. Estes biocatalisadores empregues de forma eficiente em meio aquoso apresentam ainda - além das respectivas propriedades catalíticas e da respectiva grande eficácia; e ao contrário de uma série de catalisadores sintéticos contendo metais - a vantagem de poder renunciar-se à utilização de componentes contendo metais, em particular metais pesados, e com isso tóxicos.

No estado da técnica já se relatou várias vezes, por exemplo, a N-acilação enantio-selectiva de ácidos beta-aminocarboxilicos .

Assim, é feita a descrição por L. T. Kanerva et al. in Tetrahedron:

Asymmetry, vol. 7, n.° 6, pág. 1707 - 1716, 1996, a N-acilação enantio-selectiva de ésteres de etilo de diversos ácidos beta-aminocarboxilicos alicíclicos, com ésteres de 3 2,2,2-trifluoroetilo em solventes orgânicos, e Lipase SP 526 de Candida antarctica ou Lipase PS de Pseudomonas cepacia como biocatalisador. V. M. Sanchez et al. estudaram a separação biocatalitica de racematos de (±)-etil-3-aminobutirato {Tetrahedron: Asymmetry, vol. 8, N.° 1, pág. 37 - 40, 1997) com a lipase de Candida antarctica, através do fabrico do éster do ácido beta-aminocarboxilico N-acetilado.

No EP A 8 890 649 é revelado um processo para o fabrico de ésteres de aminoácidos opticamente activos de ésteres de aminoácidos racémicos, através da acilação enantio-selectiva com um éster de ácido carboxilico, na presença de uma hidrolase seleccionada do grupo amidase, protease, esterase e lipase, e posterior isolamento do enantiómero não transformado do éster de aminoácido. O WO A 98/50575 é relativo a um processo para a obtenção de um ácido beta-aminocarboxilico quiral ou dos respectivos ésteres, ao fazer contactar um ácido beta-aminocarboxilico racémico, de um dador de acilo e penicilina G acilase, sob as condições para acilar um enantiómero do ácido beta-aminocarboxilico racémico de forma estereo-selectiva, não sendo o outro enantiómero substancialmente transformado, pelo que se obtém um ácido beta-aminocarboxilico quiral. Também a sequência de reacção inversa foi estudada (V. A. Soloshonok, V. K. Svedas, V. P. Kukhar, A. G. Kirilenko, A. V. Rybakova, V. A. Solodenko, N. A. Fokina, Ο. V. Kogut, I. Y. Galaev, E. V. Kozlova, I. P. Shishkina, S. V. Galushko, Synlett 1993, 339 - 341; V. Soloshonok, A. G. Kirilenko, N. A. Fokina, I. P. Shishkina, S. V. Galushko, V. P. Kukhar, V. K. Svedas, E. V. Kozlova, Tetrahedron: Asymmetry 1994, 4 5, 1119 - 1126; V. Soloshonok, N. A. Fokina, A. V. Rybakova, I. P. Shishkina, S. V. Galushko, A. E. Sochorinsky, V. P. Kukhar, Μ. V. Savchenko, V. K. Svedas, Tetrahedron: Asymmetry 1995, 6, 1601 - 1610; G. Cardillo, A. Tolomelli, C. Tomasini, Eur. J. Org. Chem. 1999, 155 -161). A desvantagem deste processo é o difícil processamento final da mistura de produto depois da hidrólise enantio-selectiva. Depois da separação do ácido beta-aminocarboxílico livre, obtém-se uma mistura de ácido fenilacético e de ácido N-fenilacetil-beta-aminocarboxílico, cuja separação é difícil.

Para obter ácidos carboxílicos enriquecidos com enantiómeros, conhece-se desde há muito tempo a transformação dos mesmos com lipases. No US 5518903, este princípio foi transferido para os ésteres de beta-aminoácidos N-protegidos com um êxito contudo alternante. Enquanto unicamente o éster de benzilo correspondente do ácido N-butoxicarbonil-beta-aminobutírico racémico pôde ser separado de forma altamente enantio-selectiva com uma lipase, os restantes ésteres de metilo ou ésteres de n-butilo empregues deram apenas origem a valores ee de 70%. Neste caso, comprova-se que notoriamente há uma transição de um éster de metilo correspondente para um éster de n-butilo com uma degradação do valor ee do ácido produzido. Assim, a hidrólise de ésteres dá origem, a partir do éster de n-butilo do ácido N-Boc-beta-aminobutírico com a enzima lipase da empresa Asahi, a um valor de ee do respectivo ácido de 45% ee, passados 8 dias com um rendimento de 37%. Com a Lipase PS da Amano, obtém-se na mesma reacção, sempre em 7 dias com um rendimento de 41%, um composto enriquecido até 61% ee. Comparativamente a isto, o éster de metilo correspondente fornece 70% ee. 5 A partir dos resultados brevemente publicados por Faulconbridge et al., pode ver-se que a hidrólise de ésteres aromáticos de etilo de beta-aminoácidos ocorre com um pH de 8 com a Lipase PS da Amano, com rendimentos aceitáveis e excessos enantioméricos muito bons (Tetrahedron Letters 2000, 41, 2679-81). Obtém-se o produto com uma unidade enantiomérica de até 99%, mas em todo o caso a síntese, que foi exclusivamente realizada em suspensão, encontra-se ligada a algumas desvantagens. Por uma lado, verificou-se que a cristalização é selectiva sob estas condições, mas que a reacção em si leva a baixos valores ee de 85,1% ee, como documentado no exemplo comparativo 1. No global, isto significa, por um lado, uma perda de rendimento devido à formação do enantiómero indesejado, por outro lado, isto leva a que o valor ee também possa facilmente cair abaixo dos 99% ee ou até mesmo abaixo dos 98% ee, em função de ligeiras oscilações processuais à escala técnica, devido a condições modificadas de cristalização. No entanto, é um requisito prévio para as aplicações farmacêuticas um valor ee o mais alto possível > 98% ee, em particular > 99% ee. Além disso, também seria desejável a realização em meio homogéneo (nenhuma suspensão!), de modo a ser possível garantir uma boa separação enzimática por ultrafiltração. De forma óptima, também deveria haver nesta etapa um valor ee superior, o que não pode ser conseguido com o processo da literatura até à data. O objectivo da presente invenção foi, por conseguinte, o de indicar outro processo para o fabrico enzimático de beta-aminoácidos. Este processo deveria em particular poder ser empregue de forma vantajosa em termos económicos e ecológicos a uma escala técnica, ou seja, salientar-se sobretudo em relação à compatibilidade ambiental, à protecção no trabalho e à robustez do 6 processo, assim como ao rendimento espaço/tempo e à selectividade.

Este objectivo e outros não mencionados em detalhe, mas que resultam do estado da técnica de forma evidente, são atingidos por um processo com as caracteristicas da reivindicação 1 concreta. As reivindicações subordinadas 2 a 8 são relativas às formas de execução preferidas da presente invenção.

Ao realizar-se um processo para o fabrico de beta-aminoácidos N-desprotegidos enriquecidos com enantiómeros -através da hidrólise enzimática de uma mistura enantiomérica de ésteres de alquilo de beta-aminoácidos ou de ésteres de arilo de beta-aminoácidos N-desprotegidos, com uma lipase, sob a condição de não se empregar ésteres de metilo ou de etilo correspondentes - consegue-se, em contrapartida mas não de modo inferior, atingir de forma muito surpreendente o objectivo delineado. Até à data, empregou-se para a reacção em causa apenas os ésteres de metilo e de etilo dos beta-aminoácidos N-desprotegidos, que acarretam contudo as desvantagens já acima mencionadas. Evidentemente, tem-se um resultado melhor tanto do ponto de vista do rendimento espaço-tempo como da selectividade, se os grupos éster que preenchem mais espaço com, por exemplo, radicais alquilo C3-C8, forem utilizados na hidrólise enzimática. Isto deve, por um lado, ser considerado surpreendente em relação ao US 5518903 acima referido, e, por outro lado, esta tendência é inesperada, visto que no caso de uma reacção mais rápida geralmente decresce a probabilidade de uma diferenciação enantiomérica. Esta relação lógica é por exemplo evidenciada ao ter-se em consideração as enantio-selectividades em geral mais baixas 7 no caso de temperaturas de reacçao mais altas, às quais, em contrapartida, a reacção decorre de forma mais rápida.

Em principio, o especialista tem liberdade na escolha do respectivo grupo éster. A sua escolha terá a ver com pontos de vista económicos e de técnica de reacção. Os álcoois favoráveis à formação do éster são sobretudo aqueles que podem ser facilmente removidos da mistura de reacção. Tratam-se de álcoois como os álcoois alquílicos ou os álcoois arílicos, eventualmente fenol de baixo ponto de ebulição ou álcool benzilico. Os ésteres de alquilo de beta-aminoácidos ou os ésteres de arilo de beta-aminoácidos, que podem ser obtidos com estes álcoois, são por conseguinte preferencialmente empregues na hidrólise. Totalmente preferida é a utilização dos respectivos ésteres de n-propilo, de i-propilo, de n-butilo, de sec.-butilo, de i-butilo ou de terc.-butilo dos beta-aminoácidos. A escolha dos parâmetros de reacção também é colocada à disposição do especialista. 0 especialista fará essa escolha de forma cuidada com base em experiências de rotina para os diferentes casos. Em todo o caso, adequa-se ao processo enzimático concreto uma gama de valores de pH entre 4 e 10, de preferência entre 6 e 9 e, com maior preferência, entre 7 e 8,5. Para um pH de 8 deu provas de ser especialmente apropriada a Lipase PS da empresa Amano.

Em relação à temperatura, existem em principio as mesmas condições prévias que para o valor de pH. Também neste caso é possível determinar uma temperatura o mais óptima possível para o caso individual, consoante qual a enzima que trabalha melhor a que temperatura. Para as enzimas de organismos termófilos, são possíveis temperaturas elevadas até aos 100°C. Outras, por sua vez, apenas trabalham de forma óptima de < 0°C a -15°C, eventualmente numa matriz de gelo. Em termos preferenciais, a temperatura ajustada deverá durante a reacção encontrar-se compreendida entre 15 e 40°C e, com maior preferência, entre 20 e 30°C. A escolha das lipases a serem empregues cabe ao especialista. É possível seleccionar muitas enzimas apropriadas a partir de Enzyme Catalysis in Organic Synthesis, Ed.: K. Drauz, H. Waldmann, VCH, 1995, pág. 165 e na literatura aí citada. Em termos preferenciais, recorre-se na hidrólise de ésteres à Lipase PS da Amano da Pseudomonas cepacia. Na aplicação, o polipéptido considerado pode ser utilizado na forma livre como composto de purificação homogénea, ou como enzima de produção recombinante. Além disso, o polipéptido também pode ser utilizado como componente de um organismo hospedeiro intacto, ou em ligação com a massa celular decomposta e opcionalmente muito purificada do organismo hospedeiro. Também é possível a utilização das enzimas na forma imobilizada (Sharma B. P.; Bailey L. F. e Messing R. A. (1982), "Immobilisierte Biomaterialien-Techniken und Anwendungen, Angew. Chem." 94, 836 - 852). Como vantagem, a imobilização ocorre por liofilização (Paradkar, V. M.; Dordick, J. S. (1994), "Aqueous-Like Activity of a-Chymotrypsin Dissolved in Nearly Anhydrous Organic Solvents", J. Am. Chem. Soc. 116, 5009 - 5010; Mori, T.; Okahata, Y. (1997), "A variety of lipicoated glycoside hydrolases as effective glycosyl transfer catalysts in homogeneous organic solvents", Tetrahedron Lett. 38, 1971 -1974; Otamiri, M.; Adlercreutz, P.; Matthiasson, B. (1992), "Complex formation between chymotrypsin and ethyl cellulose as a means to solubilize the enzyme in active form in 9 toluene", Biocatalysis 6, 291 - 305). Totalmente preferida é a liofilização na presença de substâncias de actividade superficial, como Aerosol OT, ou polivinilpirrolidona ou polietilenoglicol (PEG) ou Brij 52 (dietilenoglicol-monocetiléter) (Kamiya, N.; Okazaki, S.-Y.; Goto, M. (1997), "Surfactant-horseradish peroxidase complex catalytically active in anhydrous benzene", Biotechnol. Tech. 11, 375 - 378). Extremamente preferida é a imobilização em Eupergit®, em particular Eupergit C® e Eupergit 250L® (Rohm) (como resumo ver: E. Katchalski-Katzir, D. M. Kraemer, “J. Mol. Catai. B: Enzym." 2000, 10, 157). Igualmente preferida é a imobilização em Ni-NTA, em combinação com o polipéptido modificado através de anexação de uma His-tag (hexa-histidina) (Petty, K. J. (1996), Metal-chelate affinity chromatography in: Ausubel, F. M. et al. eds. Current Protocols in Molecular Biology, vol. 2, Nova Iorque: John Wiley and Sons) . Também é concebível a utilização como CLECs (St. Clair, N. : Wang, Y.-F.; Margolin, A. L. (2000), Cofactorbound cross-linked enzyme crystals (CLEC) of alcohol dehydrogenase, Angew. Chem. Int. Ed. 39, 380 - 383). Por meio destas medidas, é possível conseguir a partir de polipéptidos, que ficam instáveis através de solventes orgânicos, gerar aqueles que podem trabalhar em misturas de solventes aquosos e orgânicos ou totalmente em meio orgânico. A reacção concreta pode ser realizada em qualquer recipiente de reacção previsto para esse fim. Trata-se em pormenor de reactores de mistura normais, de fermentadores ou de um reactor de enzima-membrana (Bommarius, A. S.; Drauz, K.; Groeger, U.; Wandrey, C.; Membrane Bioreactors for the Production of Enantiomerically Pure α-Amino Acids, 10 in: "Chirality in Industry" (edição: Collins, A. N.; Sheldrake, G. N.; Crosby, J.) 1992, John Wiley & Sons, pág. 371 - 397).

Os ésteres a serem empregues na reacção de acordo com a invenção, mostram por vezes uma má solubilidade no meio de reacção aquoso. Nestes casos, poderá constituir uma vantagem, em função da tolerância aos solventes das enzimas empregues, adicionar solventes orgânicos hidrossolúveis à mistura de reacção, para conseguir uma fase de reacção homogénea. Os solventes orgânicos hidrossolúveis deste género tratam-se, entre outros, em particular dos seguintes: acetona, DMF, etanol e metanol. No entanto, a reacção também tem lugar com maiores concentrações de substrato, mediante a formação de uma suspensão.

No caso da utilização de enzimas, que se encontram eventualmente adsorvidas em materiais de suporte, ou veículos ou estabilizadores insolúveis na água, deu mostras de constituir uma vantagem separar o suporte, ou o veículo ou o estabilizador insolúvel antes da utilização da enzima na reacção, de modo a que não ocorra uma contaminação do produto a ser precipitado com o material de suporte insolúvel da enzima empregue, desde que seja possível de forma simples a separação da enzima e do suporte. Como exemplo, encontra-se adsorvida a Lipase PS da empresa Amano a ser aplicada como vantagem em suportes de silicato. Por conseguinte, deverá ocorrer aqui uma filtração da solução enzimática aquosa antes da adição dos reagentes ao meio de reacção, por forma a remover os ácidos silícicos do sistema de reacção. A actividade ou a estabilidade processual da enzima não influencia negativamente este procedimento. 11

No âmbito da invenção, "N-desprotegido" trata-se do facto de o átomo de beta-nitrogénio do ácido não estar bloqueado por um grupo de protecção N estável, sob as condições de reacção. Tais são sobretudo os grupos de protecção correntes, como Z, Boc, Fmoc, Eoc, Moc, acetilo, etc..

Como alquilo C3-C8 tem-se em consideração n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec.-butilo, terc.-butilo, pentilo, hexilo, heptilo ou octilo, mais todos os isómeros de ligação. Estes podem estar monossubstituidos ou polissubstituidos por alcoxi Ci-Cs, haloalquilo Ci-Cs, OH, halogéneo, NH2, N02, SH, S-(Ci-Cs) -alquilo. 0 conceito "enriquecido com enantiómeros" trata-se, no âmbito da invenção, do teor de um enantiómero na mistura com o seu antípoda óptico, numa gama > 50% e < 100%.

As estruturas representadas são relativas a todos os diastereómeros e enantiómeros, e respectivas misturas, que são possíveis.

Exemplos experimentais:

Exemplo 1 (= exemplo comparativo):

Deita-se 9,2 mmoles do composto racémico éster de etilo do ácido rac-3-amino-3-f enilpropiónico (1,79 g) em 50 ml de água, e ajusta-se a solução para um valor de pH de 8,2, por meio de estatização automática do pH, através da adição de

1 M de lixívia de soda cáustica (referência da Merck). Para incorporar inteiramente o éster na solução, junta-se ainda 3 ml de acetona para dissolução. Ao atingir uma temperatura de reacção de 20°C, adiciona-se 200 mg da Amano Lipase PS 12 (Pseudomonas cepacia; referência da Amano Enzymes, Inc.), de modo a iniciar a reacção. Depois de um tempo de reacção de 3 e 6 horas, determina-se a taxa de transformação e, passadas 6 horas, a enantio-selectividade do ácido (S)-3-amino-3-fenilpropiónico formado. Neste caso, determina-se uma transformação de 18,5% passadas 3 horas ou de 37,8% passadas 6 horas; e uma enantio-selectividade de 85,1% ee (passadas 6 horas). A determinação da transformação e da enantio-selectividade ocorreu por meio de HPLC.

Exemplo 2:

Deita-se 9,2 mmoles do composto racémico éster de n-propilo do ácido rac-3-amino-3-fenilpropiónico (1,91 g) em 50 ml de água, e ajusta-se a solução para um valor de pH de 8,2 por meio de estatização automática do pH, através da adição de 1 M de lixívia de soda cáustica (referência da Merck). Para incorporar inteiramente o éster na solução, junta-se ainda 3 ml de acetona à dissolução. Ao atingir uma temperatura de reacção de 20°C, adiciona-se 200 mg da Amano Lipase PS (Pseudomonas cepacia; referência da Amano Enzymes, Inc.), de modo a iniciar a reacção. Depois de um tempo de reacção de 1 hora, determina-se a taxa de transformação e, passadas 3 horas, a enantio-selectividade do ácido (S)-3-amino-3-fenilpropiónico formado. Neste caso, determina-se uma transformação de 48,7% passada 1 hora; e uma enantio-selectividade de 96,4% ee (passadas 3 horas). A determinação da transformação e da enantio-selectividade ocorreu por meio de HPLC.

Exemplo 3:

Deita-se 8,63 mmoles do composto racémico éster de n-butilo 13 do ácido rac-3-amino-3-fenilpropiónico (1,91 g) em 50 ml de água, e ajusta-se a solução para um valor de pH de 8,2 por meio de estatização automática do pH, através da adição de 1 M de lixívia de soda cáustica (referência da Merck). Para incorporar inteiramente o éster na solução, junta-se ainda 3 ml de acetona à dissolução. Ao atingir uma temperatura de reacção de 20°C, adiciona-se 200 mg da Amano Lipase PS (Pseudomonas cepacia; referência da Amano Enzymes, Inc.), de modo a iniciar a reacção. Depois de um tempo de reacção de 3 horas, determina-se a taxa de transformação e a enantio-selectividade do ácido (S)-3-amino-3-fenilpropiónico formado. Neste caso, determina-se uma transformação de 45,2% e uma enantio-selectividade de 96,8% ee. A determinação da transformação e da enantio-selectividade ocorreu por meio de HPLC.

Exemplo 4:

Deita-se 81 ml de água e adiciona-se 1,45 g da Amano Lipase PS (Pseudomonas cepacia; referência da Amano Enzymes, Inc.). Em seguida, separa-se por filtração o sólido não dissolvido. A solução aquosa enzimática resultante como filtrado é misturada com 81 ml de metil-terc.-butiléter (MTBE) como componente solvente orgânico. O sistema de duas fases originado é ajustado por meio de estatização automática do pH, através da adição de 1 M de lixívia de soda cáustica (referência da Merck) para um pH de 8,2. Ao atingir uma temperatura de 20°C, junta-se depois 188,2 mmoles do composto racémico éster de n-propilo do ácido rac-3-amino-3-fenilpropiónico (39,0 g), e a reacção é iniciada. O tempo de reacção é de 15 horas, precipitando-se um precipitado branco, composto pelo produto pretendido ácido (S)-3-amino-3-fenilpropiónico. Depois de um tempo de 14 reacção de 15 horas, junta-se 160 ml de acetona para completar a precipitação; procede-se a pós-agitação durante cerca de 45 minutos e separa-se o sólido por filtração. O sólido é lavado várias vezes com um pouco de acetona e é em seguida seco no vácuo. Obtém-se 12,91 g do ácido (5)-3-amino-3-fenilpropiónico pretendido, o que corresponde a um rendimento de 41,6%. A enantio-selectividade para o produto é de 99,6% ee. A determinação da enantio-selectividade ocorreu por meio de HPLC. Apurou-se 98,8% de pureza química (determinada por titulação). A estrutura do produto foi adicionalmente confirmada por espectroscopia NMR.

Lisboa, 28 de Setembro de 2006

Claims (8)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Processo para o fabrico de beta-aminoácidos N-desprotegidos enriquecidos com enantiómeros, através da hidrólise enzimática de uma mistura enantiomérica de ésteres de arilo de beta-aminoácidos ou de ésteres de alquilo de beta-aminoácidos N-desprotegidos com uma lipase, sob a condição de não se empregar nenhum éster de metilo ou de etilo correspondente.

2. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de empregar-se um éster de n-propilo, de i-propilo, de n-butilo, de sec.-butilo, de i-butilo ou de terc.-butilo correspondente.

3. Processo de acordo com uma ou mais das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de o valor de pH da reacção se encontrar entre 4 e 10.

4. Processo de acordo com uma ou mais das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de a temperatura na reacção se encontrar entre -15 e +100°C.

5. Processo de acordo com uma ou mais das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de empregar-se a lipase PS de Pseudomonas cepacia.

6. Processo de acordo com uma ou mais das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de a reacção ser levada a cabo num reactor de enzima-membrana.

7. Processo de acordo com uma ou mais das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de a hidrólise ser 2 levada a cabo em meio aquoso, ao qual se pode adi por mistura solventes orgânicos hidrossolúveis.

8. Processo de acordo com uma ou mais das reivindi anteriores, caracterizado pelo facto de a hidróli levada a cabo em meio aquoso, ao qual se pode adi por mistura solventes orgânicos hidrossolúveis. Lisboa, 28 de Setembro de 2006 cionar cações se ser cionar