CN111763700B

CN111763700B - 一种达泊西汀中间体的生物合成方法

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Publication number: CN111763700B
Application number: CN202010581167.7A
Authority: CN
Inventors: 陈本顺; 江涛; 何伟; 刘轩豪; 朱萍
Original assignee: Nanjing Ocean Pharmaceutical Technology Co ltd
Current assignee: Nanjing Ocean Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date: 2020-06-23
Filing date: 2020-06-23
Publication date: 2023-07-04
Anticipated expiration: 2040-06-23
Also published as: CN111763700A

Abstract

本发明提供一种达泊西汀中间体的生物合成方法，由化合物(2)作为起始原料，经生物酶催化转化为化合物(3)，在催化剂四丁基溴化铵和苄基三乙基氯化铵存在的条件下，化合物(3)与化合物(4)进行化学反应制备达泊西汀中间体化合物(5)，所述生物酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其反应如下所示。本发明的合成方法解决了现有技术中达泊西汀中间体合成步骤多，合成工艺复杂等问题，提供了一种合成路线新颖，简单易行，具有降低生产成本、减少污染、产品收率高、产品纯度高，原料价廉易得以及适合于工业化生产等优点。

Description

一种达泊西汀中间体的生物合成方法

技术领域

本发明属于药物合成技术领域，具体涉及一种达泊西汀中间体及其生物合成方法。

背景技术

达泊西汀(Dapoxetine)，化学名为:S-(+)-N,N-二甲基-a-[2-(萘氧基)乙基]苯甲胺，成品通常为其盐酸盐。达泊西汀的分子量：305.413；CAS登记号：119356-77-3(盐酸盐为：129938-20-1)；其结构式如下所示：

盐酸达泊西汀是一种强效的选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRIs)，是目前唯一被批准用于治疗早泄的药物。盐酸达泊西汀作为一种按需服用药物，具有吸收迅速、起效快、半衰期短、体内清除速率快等特点。基于涉及全世界范围内16000名以上男性的临床试验，证明达泊西汀能够显著改善早泄(PE)的所有指标，包括增强射精控制能力、提高性生活满意度以及延长阴道内射精潜伏时间(IELT)，并且具有良好的耐受性。首次服用该药物，即可起效，在性生活开始前1-3小时服用即可，能够在体内迅速消除且副反应发生率低的特性使得达泊西汀是用于治疗早泄(PE)的理想药物。

达泊西汀的广阔市场前景吸引了国内外众多的科研工作者的兴趣，其合成方法自然也是科研工作者研究的重点。例如，专利号为CN 110078632A的发明专利提供了一种达泊西汀的合成路线，该路线如下：

由化合物(2)和化合物(3)作为起始原料，经相转移催化取代反应制得化合物(4)，化合物(4)经生物酶转化反应，制得达泊西汀中间体化合物(1)。但由于在第一步相转移催化取代反应时，残留的有机溶剂或者中间产物会对第二步酶催化反应时添加的生物酶有毒害作用，会降低酶活，影响催化效率，故在第二步反应前，需要完全去除第一步所添加的有机溶剂以及中间产物；另外，在酶催化反应时，反应时间达到十几小时，反应时间长；因此，对于该专利的生产方法成本高，不利于工业化生产。

因此需，要找到一种简单易行，能够缩短反应步骤，降低生产成本，适合工业化生产的合成路线。

发明内容

本发明的目的是提供一种达泊西汀中间体的生物合成方法，该合成方法简单易行，酶催化反应时间短，具有降低生产成本、减少污染、产品收率高、产品纯度高，原料价廉易得以及适合于工业化生产等优点。

本发明的技术方案如下：

一种达泊西汀中间体的生物合成方法，由化合物(2)作为起始原料，经生物酶催化转化为化合物(3)，在催化剂四丁基溴化铵和苄基三乙基氯化铵存在的条件下，化合物(3)与化合物(4)进行化学反应制备达泊西汀中间体化合物(5)，所述生物酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其反应如下所示：

本发明化合物(2)经生物酶催化转化为化合物(3)的生物酶的氨基酸序列为SEQID NO.1，具体如下所示：

本发明提及的生物酶制备方法如下：在无菌环境下，接种大肠杆菌E.coli于LB液体培养基(包括以下成分：胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，酵母浸粉5g/L)中，接种量为培养基体积的0.1～1％，向培养基中添加卡那霉素，该培养基中含卡那霉素浓度为50～100μg/mL，在28～37℃的条件下，于150～220rpm摇床中培养12～24h后，作为种子液。将新鲜的种子液接入胰酪大豆胨液体培养基(生产厂家：青岛高科技工业园海博生物技术有限公司)，接种量为胰酪大豆胨液体培养基体积的1～5％，无菌过滤添加卡那霉素于胰酪大豆胨液体培养基中，卡那霉素在胰酪大豆胨液体培养基中浓度为50～100μg/mL，再在28～37℃的条件下，于150～220rpm摇床中培养2～3h，当OD₆₀₀在0.6～0.8时向培养基中加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)，IPTG的浓度为0.1～0.5mM，再于18～25℃诱导24h。发酵液诱导结束后，于4℃，5000～12000rpm离心1～5min，收集菌体。用pH＝7.0，0.1～0.2M的PB缓冲液重旋，PB缓冲液的体积为发酵液体积的1/10，再超声破碎，超声破碎功率为260W，冰浴下超声破碎3～6min，即可制备本发明提及的生物酶粗酶液。每1L的发酵液可制备100mL生物酶粗酶液，经纯化处理后，可制备生物酶干粉约5～6g。

在本发明的合成方法中，由化合物(2)作为起始原料，经生物酶催化转化为化合物(3)时，生物酶和化合物(2)的质量比为1:1～20；优选为1:8～15，更优选为1:10。

在本发明的合成方法中，由化合物(2)作为起始原料，经生物酶催化转化为化合物(3)时，化合物(2)经生物酶催化转化为化合物(3)还包括氨基供体，其中，氨基供体可以但不局限于选自三乙醇胺、异丙胺、丙胺、乙胺、丁胺或α-氨基戊二酸中的一种或几种。在不影响本发明效果的情况下，可以优选为异丙胺。

在一种优选方案中，化合物(2)与氨基供体(例如，异丙胺)的摩尔比为1:1～4；优选为1:1～2。

在本发明的合成方法中，化合物(2)经生物酶催化转化为化合物(3)时还包括水相缓冲液，用于调节反应体系中的pH值，其中，水相缓冲液为磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液，优选地，水相缓冲液为磷酸盐缓冲液。

在一种优选的方案中，水相缓冲液为0.1～0.2mol/L磷酸盐缓冲液。

进一步地，水相缓冲液的pH值为6.0～9.0，水相缓冲液的pH值为7.0～8.0。

例如，水相缓冲液为0.1～0.2mol/L的磷酸缓冲液，pH值为7.0～8.0。

在本发明的合成方法中，化合物(2)经生物酶催化转化为化合物(3)时还包括助溶剂，其中，助溶剂选自甲醇、乙醚、甲苯、四氢呋喃、二甲亚砜或N,N-二甲基甲酰胺中的一种或几种。例如，二甲亚砜或N,N-二甲基甲酰胺。

在一种优选方案中，化合物(2)与助溶剂(例如，二甲亚砜或N,N-二甲基甲酰胺)的质量体积比为0.1～0.2:1g/ml，进一步优选为0.1685:1g/ml。

在一种优选方案中，助溶剂(例如，二甲亚砜或N,N-二甲基甲酰胺)与水相缓冲液(0.1～0.2mol/L的磷酸缓冲液，pH值为7.0～8.0)的体积比为1:5～15；优选为1:9。

在一种优选方案中，在本发明的合成方法中，化合物(2)经生物酶催化转化为化合物(3)时还包括辅酶PLP；其中生物酶与辅酶PLP的质量比5～30:1；优选为10～20:1；更优选为16.8:1。例如，5:1、10:1、15:1、16:1、16.5:1、16.7:1、16.8:1、16.9:1或30:1。

在本发明的合成方法中，化合物(2)经生物酶催化反应时，反应温度为0～60℃；优选为0～40℃；更优选为40℃。

在本发明的合成方法中，化合物(2)经生物酶催化反应时，反应时间为20～120min；优选为20～60min；更优选为30min。

在本发明的合成方法中，先加入水相缓冲液(0.1～0.2mol/L的磷酸缓冲液，pH值为7.0～8.0)、化合物(2)、氨基供体(例如，异丙胺)和助溶剂(例如，二甲亚砜或N,N-二甲基甲酰胺)，搅拌均匀后，采用盐酸和/或氢氧化钠调节反应体系pH稳定在8.0，再加入生物酶和辅酶PLP，在0～60℃(例如，40℃)，反应20～120min(例如，30min)，生物酶催化转化为化合物(3)。

在制备达泊西汀中间体化合物(5)时，化合物(3)与化合物(4)的摩尔比为1:1.1～1.6；优选为1:1.4～1.5。

在制备达泊西汀中间体化合物(5)时，苄基三乙基氯化铵的质量为化合物(3)质量的0.5-2％；优选为0.5-1％。

在制备达泊西汀中间体化合物(5)时，反应温度为50～100℃；优选为70～80℃。

在制备达泊西汀中间体化合物(5)时，反应溶剂选自二甲亚砜，甲苯，四氢呋喃，乙醚，二氯甲烷，N,N-二甲基甲酰胺中的一种或几种；优选为甲苯。

本发明提供的中间体化合物(3)和化合物(5)可以用于制备达泊西汀，其制备方法如下：由化合物(2)作为起始原料，经生物酶催化转化为化合物(3)，在催化剂四丁基溴化铵和苄基三乙基氯化铵存在的条件下，化合物(3)与化合物(4)进行化学反应制备达泊西汀中间体化合物(5)，所述生物酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其反应如下所示：

采用本发明的技术方案，优势如下:

本发明提供了达泊西汀中间体的生物合成方法，该方法解决了现有技术中达泊西汀中间体合成步骤多，反应时间长，合成工艺复杂等问题，提供了一种合成路线新颖，简单易行，具有降低生产成本、减少污染、产品收率高、产品纯度高，原料价廉易得以及适合于工业化生产等优点。同时，本发明所合成的中间体为达泊西汀的制备提供了新的中间体原料。

具体实施方式

以下以具体的实施例来说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围并不限于此：

实施例1

生物酶制备方法：在无菌环境下操作，取100μL大肠杆菌E.coli接入100mL已灭菌的LB液体培养基(包括以下成分：胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，酵母浸粉5g/L)中，接种量为培养基体积的0.1％，向培养基中添加卡那霉素5mg，在37℃，220rpm的条件下，于摇床中培养过夜，作为种子液。取10mL新鲜的种子液接入200mL的胰酪大豆胨液体培养基(生产厂家：青岛高科技工业园海博生物技术有限公司)，接种量为胰酪大豆胨液体培养基体积的5％，向培养基中加入卡那霉素10mg，在37℃的条件下，于220rpm摇床中培养2～3h，当OD₆₀₀在0.8左右时加入23.83mg的IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)，IPTG的浓度为0.5mM，再于18℃诱导24h。发酵液诱导结束后，于4℃，5000rpm离心5min，收集菌体。用20mL的pH＝7.0，0.1M的PB缓冲液重旋，超声破碎，设置超声破碎功率为260W，冰浴下超声破碎3min，即可本发明提及的生物酶粗酶液。每20mL的生物酶粗酶液经纯化后，可制备生物酶干粉约1g。

实施例2

化合物(3)的制备：

在反应瓶中加入90mL pH＝8.0，0.1mol/L的磷酸盐缓冲液，依次投入化合物(2)(1.685g，10mmol)，二甲亚砜10mL，异丙胺(1.2g，20mmol)，搅拌均匀后，用0.1M的盐酸和氢氧化钠溶液调节反应体系pH稳定在8.0时，再加入实施例1制备的生物酶0.168g，辅酶PLP10mg，在温度40℃，150rpm振荡，反应30min后取样，HPLC检测纯度为97.3％，ee值99.2％。后处理：乙酸乙酯萃取反应体系后旋蒸干燥称重，质量收率为95.2％。

实施例3

化合物(3)的制备：

在反应瓶中加入90mL pH＝8.0，0.1mol/L的磷酸盐缓冲液，依次投入化合物(2)(3.37g，20mmol)，二甲亚砜10mL，异丙胺(2.4g，40mmol)，搅拌均匀后，用0.1M的盐酸和氢氧化钠溶液调节反应体系pH稳定在8.0时，再加入实施例1制备的生物酶0.337g，辅酶PLP20mg，在温度40℃，150rpm振荡，反应30min后取样，HPLC检测纯度为97.7％，ee值99.5％。后处理：乙酸乙酯萃取反应体系后旋蒸干燥称重，质量收率为96.3％。

实施例4

化合物(3)的制备：

在反应瓶中加入90mL pH＝8.0，0.2mol/L的磷酸盐缓冲液，依次投入化合物(2)(3.37g，20mmol)，二甲亚砜10mL，异丙胺(2.4g，40mmol)，搅拌均匀后，用0.1M的盐酸和氢氧化钠溶液调节反应体系pH稳定在8.0时，再加入实施例1制备的生物酶0.337g，辅酶PLP20mg，在温度40℃，150rpm振荡，反应30min后取样，HPLC检测纯度为96.3％，ee值98.9％。后处理：乙酸乙酯萃取反应体系后旋蒸干燥称重，质量收率为94.8％。

实施例5

化合物(3)的制备：

在反应瓶中加入90mL pH＝7.0，0.2mol/L的磷酸盐缓冲液，依次投入化合物(2)(3.37g，20mmol)，二甲亚砜10mL，异丙胺(2.4g，40mmol)，搅拌均匀后，用0.1M的盐酸和氢氧化钠溶液调节反应体系pH稳定在8.0时，再加入实施例1制备的生物酶0.337g，辅酶PLP20mg，在温度40℃，150rpm振荡，反应30min后取样，HPLC检测纯度为95.8％，ee值99.1％。后处理：乙酸乙酯萃取反应体系后旋蒸干燥称重，质量收率为94.9％。

实施例6

化合物(3)的制备：

在反应瓶中加入90mL pH＝7.0，0.2mol/L的磷酸盐缓冲液，依次投入化合物(2)(3.37g，20mmol),N,N-二甲基甲酰胺10mL，异丙胺(2.4g，40mmol)，搅拌均匀后，用0.1M的盐酸和氢氧化钠溶液调节反应体系pH稳定在8.0时，再加入实施例1制备的生物酶0.337g，辅酶PLP 20mg，在温度40℃，150rpm振荡，反应30min后取样，HPLC检测纯度为96.7％，ee值99.5％。后处理：乙酸乙酯萃取反应体系后旋蒸干燥称重，质量收率为95.7％。

实施例7

化合物(5)的制备：

在20-30℃条件下，向反应瓶中依次加入(16.9g，0.1mol)化合物(3)和100ml甲苯，搅拌溶清，再依次加入(21.7g，0.15mol)化合物(4)和50ml水，搅拌均匀后，依次加入催化剂四丁基氯化铵(0.17g，0.6mmol)和苄基三乙基氯化铵(0.12g，0.5mmol)，升温至70-80℃，搅拌反应4-5h。

监控反应完毕后，静置分液，有机相用饱和碳酸氢钠水溶液50ml洗涤，将有机相减压脱溶剂得27.5g化合物(5)，摩尔收率为94.3％，HPLC检测纯度：98.6％。

实施例8

化合物(1)的制备

在反应瓶中加入90％甲酸水溶液(22.5g)，再于冰浴下的条件下，加入(25g，0.09mol)化合物(5)，搅拌溶解后加质量浓度为36％甲醛水溶液30g(含甲醛0.36mol)，升温至100℃反应6-8h。

反应完全后，温度降至室温，加适量水，乙酸乙酯萃取，水层用氢氧化钠溶液调pH至12-13，二氯甲烷萃取3-4次，合并二氯甲烷层，加无水硫酸钠干燥，过滤，滤液加压脱溶剂得化合物(1)粗品(25.7g)，收率93％。

上述化合物(1)粗品加入反应瓶中，加正己烷，升温至回流，搅拌溶清，缓慢降温至0-5℃，再保温1-2h，抽滤，收集滤饼，得23.2g化合物(1)精品，摩尔收率为84.6％，HPLC检测纯度：99.2％。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可能对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

序列表

<110> 南京欧信医药技术有限公司

<120> 一种达泊西汀中间体的生物合成方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 403

<212> PRT

<213> Pseudomonas fluorescens

<400> 1

Met Ala Asp Gln Gly Ser Pro Arg Arg Phe Ala Arg Ile Asp Arg

1 5 10 15

Leu Pro Pro Tyr Val Phe Asn Ile Thr Ala Glu Leu Lys Met Ala Gly

20 25 30

Arg Arg Gly Glu Asp Ile Ile Asp Leu Ser Met Gly Asn Pro Asp

35 40 45

Gly Ala Thr Pro Pro His Ile Val Glu Lys Met Val Thr Val Ala Gln

50 55 60

Arg Glu Asp Thr Thr Ser Lys Gly Ile Pro Pro Arg Leu Arg Arg Ala

65 70 75

Ile Ser Arg Trp Tyr Lys Asp Arg Tyr Glu Val Asp Ser Leu Glu Asn

80 85 90

Glu Ser Glu Ala Ile Val Thr Ile Gly Ser Lys Glu Gly Leu Ala His

95 100 105 110

Leu Met Leu Ala Thr Leu Asp Gln Gly Asp Thr Val Leu Val Pro

115 120 125

Asn Pro Ser Tyr Pro Ile His Ile Cys Gly Ala Val Tyr Ile Ala Gly

130 135 140

Ala Gln Val Arg Ser Val Pro Leu Ile Pro Gly Val Asp Phe Phe Ala

145 150 155

Glu Leu Glu Arg Ala Ile Arg Gly Ser Ile Pro Lys Pro Lys Met Met

160 165 170

Ile Leu Gly Phe Pro Ala Ser Asn Pro Thr Ala Gln Cys Val Glu Leu

175 180 185

Asp Phe Phe Glu Arg Pro Val Met Ser Ala Leu Ser Ser Gln Ala

190 195 200

Asp Val Leu Val Val His Asp Leu Ala Tyr Ala Asp Ile Val Tyr Asp

205 210 215 220

Gly Tyr Gly Tyr Trp Lys Ala Pro Ser Met Gln Val Pro Gly Ala Lys

225 230 235

Asp Ile Ala Val Glu Phe Asp Thr Leu Ser Lys Ser Tyr Asn Met Ala

240 245 250

Gly Trp Arg Ile Gly Phe Met Val Gly Pro Glu Leu Val Asn Ala Leu

255 260 265

Ala Arg Ile Ile Lys Ser Tyr His Asp Tyr Gly Thr Phe Arg Glu Pro

270 275 280

Leu Val Ala Ala Ile Ala Ala Leu Glu Gly Asp Gln Gln Cys Val Lys

285 290 295 300

Asp Ile Ala Glu Gln Tyr Arg Gln Arg Arg Asn Val Leu Val Lys Gly

305 310 315

Leu His Glu Leu Gly Trp Met Glu Asn Pro Lys Ala Ser Met Tyr

320 325 330

Val Trp Ala Lys Ile Pro Glu Gln Tyr Ala Ala Met Gly Ser Leu Glu

335 340 345

Phe Ala Lys Lys Leu Leu Leu Glu Ala Lys Val Cys Val Ser Pro Gly

350 355 360

Ile Gly Phe Gly Glu Tyr Gly Asp Asp His Val Arg Phe Ala Leu Ile

365 370 375

Glu Asn Gln Asp Arg Ile Arg Gln Gly Gly Ile Arg Gly Met Phe

380 385 390

Arg Ala Asp Gly Leu Val Thr Lys Ala

395 400

Claims

1.一种达泊西汀中间体的生物合成方法，其特征在于，由化合物(2)作为起始原料，经生物酶催化转化为化合物(3)，在催化剂四丁基溴化铵和苄基三乙基氯化铵存在的条件下，化合物(3)与化合物(4)进行化学反应制备达泊西汀中间体化合物(5)，所述生物酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其反应如下所示：

其中，所述生物酶和化合物(2)的质量比为1:10；所述化合物(2)经生物酶催化转化为化合物(3)时还包括氨基供体异丙胺，所述化合物(2)与所述氨基供体的摩尔比为1:1～2；所述化合物(2)经生物酶催化转化为化合物(3)时还包括水相缓冲液，所述水相缓冲液为0.1～0.2mol/L磷酸盐缓冲液，pH值为7.0～8.0；所述化合物(2)经生物酶催化转化为化合物(3)时还包括助溶剂，所述助溶剂为二甲亚砜或N,N-二甲基甲酰胺，所述化合物(2)的添加量为每毫升助溶剂添加0.1685g或0.337g；所述助溶剂与水相缓冲液的体积比为1:9；所述化合物(2)经生物酶催化转化为化合物(3)时还包括辅酶PLP，所述生物酶与辅酶PLP的质量比16.8:1；所述化合物(2)经生物酶催化反应时，反应温度为40℃，反应时间为20～60min；

在制备达泊西汀中间体化合物(5)时，化合物(3)与化合物(4)的摩尔比为1:1.4～1.5；四丁基氯化铵的质量为化合物(3)质量的1-1.5％；苄基三乙基氯化铵的质量为化合物(3)质量的0.5-1％；反应温度为70～80℃；反应溶剂选自二甲亚砜、甲苯、四氢呋喃、乙醚、二氯甲烷或N,N-二甲基甲酰胺中的一种或几种。

2.根据权利要求1所述的达泊西汀中间体的生物合成方法，其特征在于，所述化合物(2)经生物酶催化反应时，反应时间为30min。

3.根据权利要求1所述的达泊西汀中间体的生物合成方法，其特征在于，在制备达泊西汀中间体化合物(5)时，反应溶剂选自甲苯。