CN103981229A - 一种双酶合成l-叔亮氨酸的方法 - Google Patents

一种双酶合成l-叔亮氨酸的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103981229A
CN103981229A CN201410212568.XA CN201410212568A CN103981229A CN 103981229 A CN103981229 A CN 103981229A CN 201410212568 A CN201410212568 A CN 201410212568A CN 103981229 A CN103981229 A CN 103981229A
Authority
CN
China
Prior art keywords
reaction solution
reaction
leucine
solution
joined
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201410212568.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN103981229B (zh
Inventor
黄勇开
托马斯-道斯曼
纪摇摇
徐青
张城孝
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ningbo Mei Sai Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Ningbo Mei Sai Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ningbo Mei Sai Biotechnology Co Ltd filed Critical Ningbo Mei Sai Biotechnology Co Ltd
Priority to CN201410212568.XA priority Critical patent/CN103981229B/zh
Publication of CN103981229A publication Critical patent/CN103981229A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103981229B publication Critical patent/CN103981229B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Landscapes

  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种双酶合成L-叔亮氨酸的方法，利用亮氨酸脱氢酶与异丙醇脱氢酶偶联介导辅酶NADH，且在反应液中有终浓度10%左右的异丙醇作用下，异丙醇脱氢酶能迅速将NAD+还原为NADH，使反应速度加快，反应时间缩短，提高反应效率，增加了时空产率，同时双酶的用量也较低，不超过底物质量的3%，反应成本下降，反应产物纯度达到99%ee以上，不需在再重结晶拆分。

Description

一种双酶合成L-叔亮氨酸的方法
技术领域
 本发明涉及L-叔亮氨酸的合成方法，具体涉及一种双酶合成L-叔亮氨酸的方法。
背景技术
L-叔亮氨酸是个重要的药物的中间体，是抗艾滋病药物阿扎那韦、抗丙肝药物特拉泼维和博赛泼维的主要手性化合物。目前国内外利用酶生物催化生产L-叔亮氨酸的方法有：如公开号为CN101845476，名称为双酶体系制备L-叔亮氨酸类化合物的方法发明专利申请，公开了使用酰化氨基酸消旋酶和水解酶拆分的方法，制备L-叔亮氨酸类化合物，虽然方法简单，但转化率低于50%。公开号为CN102888431，名称为一种制备L-叔亮氨酸的方法发明专利申请，公开了利用亮氨酸脱氢酶为生物催化剂，与甲酸脱氢酶偶联介导辅酶NADH，合成L-叔亮氨酸，虽然辅酶可以循环再生，降低用量，但还原辅酶还原速率较慢，反应时间较长24小时以上。公开号WO2011100265 A2的发明，则公开了用亮氨酸脱氢酶与酮还原酶酶偶联生产L-叔亮氨酸，该发明反应时间长达24小时，生产成本高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种辅酶还原速率较快，反应时间较短的双酶合成L-叔亮氨酸的方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种双酶合成L-叔亮氨酸的方法，步骤如下：
a、配置反应液A：将0.25～1.0g三甲基丙酮酸、质量百分浓度为30%体积为0.47mL的氨水、0.5mL异丙醇加入至摩尔浓度为0.63M体积为2mL的甲酸铵溶液中，搅拌均匀，调节pH值为8.0～9.5；
b、配置反应液B：将7.5mg亮氨酸脱氢酶、7.5mg异丙醇脱氢酶和2.5mg辅酶NADH溶于水中，搅拌均匀，配成2.03mL酶溶液；
c、将反应液A一次或二次加入到反应液B中，在反应温度25～40℃，搅拌速率每分钟400转下反应4～12小时，反应完毕，过滤，得到L-叔亮氨酸固体。反应液A加入方式可以为：一次性倒入到反应液B中或二次性倒入到反应液B中或持续性加入到反应液B中。
反应液A二次性倒入到反应液B中的方法为，先将反应液A1.5mL加入到反应液B中，反应3小时后再将余量反应液A加入到反应液B中。
与现有技术相比，本发明的优点在于一种双酶合成L-叔亮氨酸的方法，利用亮氨酸脱氢酶与异丙醇脱氢酶偶联介导辅酶NADH，且在反应液中有终浓度10%左右的异丙醇作用下，异丙醇脱氢酶能迅速将NAD+还原为NADH，使反应速度加快，反应时间缩短，提高反应效率，增加了时空产率，同时双酶的用量也较低，不超过底物质量的3%，反应成本下降，反应产物纯度达到99%ee以上，不需在再重结晶拆分。
附图说明
图1为本发明的反应式示意图。
具体实施方式
以下结合附图、实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1
一种双酶合成L-叔亮氨酸的方法，配置反应液A：将0.5g三甲基丙酮酸、浓度为30%体积为0.47mL的氨水、0.5mL异丙醇加入至浓度为0.63M体积为2mL的甲酸铵溶液中，搅拌均匀，调节pH值为9.0；配置反应液B：将7.5mg亮氨酸脱氢酶（市售）、7.5mg异丙醇脱氢酶（购于宁波市麦迪逊医药科技有限公司，商品名为111EM006）和2.5mg辅酶NADH（市售）溶于水中，搅拌均匀，配成2.03mL酶溶液；将反应液A一次性全部倒入到反应液B中，在反应温度40℃，搅拌速率每分钟400转下反应4小时，反应完毕，过滤，得到L-叔亮氨酸固体，上述反应过的反应式如图1所示。
实施例2
与实施例1基本相同，所不同的只是三甲基丙酮酸质量为0.25g，pH值为9.5，反应温度为25℃，反应时间为8小时。
实施例3
与实施例1基本相同，所不同的只是三甲基丙酮酸质量为1.0g，pH值为8.0，反应温度为30℃，反应液A分二次倒入到反应液B中：即先将反应液A1.5mL加入到反应液B中，反应3小时后再将余量反应液A加入到反应液B中反应9小时。
实施例4
与实施例1基本相同，所不同的只是三甲基丙酮酸质量为0.75g，反应温度为35℃，反应液A持续性加入到反应液B中反应6小时：即将反应液A1.5mL缓慢逐渐加入到反应液B中，边加入加搅拌反应。
上述异丙醇也可以用相似的仲醇替代，甲酸铵溶液也可以用乙酸铵溶液替代。

Claims (3)

1.一种双酶合成L-叔亮氨酸的方法，其特征在于步骤如下：
a、配置反应液A：将0.25～1.0g三甲基丙酮酸、质量百分浓度为30%体积为0.47mL的氨水、0.5mL异丙醇加入至摩尔浓度为0.63M体积为2mL的甲酸铵溶液中，搅拌均匀，调节pH值为8.0～9.5；
b、配置反应液B：将7.5mg亮氨酸脱氢酶、7.5mg异丙醇脱氢酶和2.5mg辅酶NADH溶于水中，搅拌均匀，配成2.03mL酶溶液；
c、将反应液A加入到反应液B中，在反应温度25～40℃，搅拌速率每分钟400转下反应4～12小时，反应完毕，过滤，得到L-叔亮氨酸固体。
2.如权利要求1所述的一种双酶合成L-叔亮氨酸的方法，其特征在于反应液A加入方式为：一次性倒入到反应液B中或二次性倒入到反应液B中或持续性加入到反应液B中。
3.如权利要求2所述的一种双酶合成L-叔亮氨酸的方法，其特征在于上述反应液A二次性加入到反应液B中的方法为：先将反应液A1.5mL加入到反应液B中，反应3小时后再将余量反应液A加入到反应液B中。
CN201410212568.XA 2014-05-19 2014-05-19 一种双酶合成l-叔亮氨酸的方法 Active CN103981229B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410212568.XA CN103981229B (zh) 2014-05-19 2014-05-19 一种双酶合成l-叔亮氨酸的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410212568.XA CN103981229B (zh) 2014-05-19 2014-05-19 一种双酶合成l-叔亮氨酸的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103981229A true CN103981229A (zh) 2014-08-13
CN103981229B CN103981229B (zh) 2016-07-06

Family

ID=51273401

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410212568.XA Active CN103981229B (zh) 2014-05-19 2014-05-19 一种双酶合成l-叔亮氨酸的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103981229B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108359626A (zh) * 2018-01-05 2018-08-03 复旦大学 一种工程菌及其在制备（r）-3-羟基-5-己烯酸酯中的应用
CN111676256A (zh) * 2020-06-30 2020-09-18 南通大学 一种l-叔亮氨酸的生物制备方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101845476A (zh) * 2010-04-02 2010-09-29 浙江大学 双酶体系制备l-叔亮氨酸类化合物的方法
WO2011100265A2 (en) * 2010-02-10 2011-08-18 Codexis, Inc. Processes using amino acid dehydrogenases and ketoreductase-based cofactor regenerating system
CN102888431A (zh) * 2011-07-19 2013-01-23 陈依军 一种制备l-叔亮氨酸的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011100265A2 (en) * 2010-02-10 2011-08-18 Codexis, Inc. Processes using amino acid dehydrogenases and ketoreductase-based cofactor regenerating system
CN101845476A (zh) * 2010-04-02 2010-09-29 浙江大学 双酶体系制备l-叔亮氨酸类化合物的方法
CN102888431A (zh) * 2011-07-19 2013-01-23 陈依军 一种制备l-叔亮氨酸的方法

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108359626A (zh) * 2018-01-05 2018-08-03 复旦大学 一种工程菌及其在制备（r）-3-羟基-5-己烯酸酯中的应用
CN108359626B (zh) * 2018-01-05 2021-10-26 复旦大学 一种工程菌及其在制备(r)-3-羟基-5-己烯酸酯中的应用
CN111676256A (zh) * 2020-06-30 2020-09-18 南通大学 一种l-叔亮氨酸的生物制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN103981229B (zh) 2016-07-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106520849B (zh) 一种制备手性2-氯-3,4-二氟苯乙醇的方法
CN104561217B (zh) 6a‑甲基泼尼松龙的合成方法
CN103981229B (zh) 一种双酶合成l-叔亮氨酸的方法
CN103012432A (zh) 高纯度头孢替安中间体盐酸盐的制备方法
CN104561160A (zh) 生物法制备茶氨酸的方法
CN101104862B (zh) 非均相酶催化水解5-芳基海因合成d-芳基甘氨酸的方法
CN111635917A (zh) 一种β-烟酰胺核糖二核苷酸的制备方法
CN102978251A (zh) 一种l-叔亮氨酸的生产方法
CN104293851A (zh) 一种链格孢菌生产羟乙基吡啶的方法
WO2016140233A1 (ja) キラル－１，１－ジフルオロ－２－プロパノールの工業的な製造方法
CN106636227B (zh) 一种酶法转化l-丙氨酸制备丙酮酸的方法
CN104342464A (zh) 一种黄蓝状菌催化生产手性苯基甲醇方法
CN104313074A (zh) 一种青霉催化生产吡啶基乙醇方法
CN104263776A (zh) 一种生物催化生产手性吡啶乙醇的方法
CN104212843A (zh) 一种酿酒酵母还原生产溴苯基丙酸甲酯的方法
CN104313065A (zh) 一种生产手性苯基丙酸甲酯的方法
CN104263769A (zh) 一种生物法生产氯苯基丙酸甲酯的方法
CN105087668A (zh) 一种青霉菌生产(s)-氟苯乙醇的方法
CN102452949A (zh) 一种生产d-对羟基苯甘氨酸的方法
CN105039435A (zh) 一种酵母生产(s)-溴苯羟丙酸甲酯的方法
CN105039449A (zh) 一种青霉菌生产(s)-呋喃乙醇的方法
CN109020795A (zh) 4-甲氧基肉桂醛的制备方法
CN105177069A (zh) 一种细胞生产(s)-羟乙苯丙酸甲酯的方法
CN104313075A (zh) 一种光活性溴吡啶乙醇的细胞生产方法
CN104263774A (zh) 一种酿酒酵母催化生产手性亚环己基烯醇的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
PE01 Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right
PE01 Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right

Denomination of invention: Synthesis of L-Tert-Leucine by two enzymes

Effective date of registration: 20200916

Granted publication date: 20160706

Pledgee: Ningbo Tianjin Enterprise Service Co.,Ltd.

Pledgor: ENZYMASTER (NINGBO) BIO-ENGINEERING Co.,Ltd.

Registration number: Y2020330000717

PC01 Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right
PC01 Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right

Date of cancellation: 20210415

Granted publication date: 20160706

Pledgee: Ningbo Tianjin Enterprise Service Co.,Ltd.

Pledgor: ENZYMASTER (NINGBO) BIO-ENGINEERING Co.,Ltd.

Registration number: Y2020330000717

PE01 Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right
PE01 Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right

Denomination of invention: A method for synthesis of L-Tert-Leucine by two enzymes

Effective date of registration: 20210416

Granted publication date: 20160706

Pledgee: Ningbo Tianjin Enterprise Service Co.,Ltd.

Pledgor: ENZYMASTER (NINGBO) BIO-ENGINEERING Co.,Ltd.

Registration number: Y2021330000308