CN102978251A - 一种l-叔亮氨酸的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物制药和生物化工领域，具体涉及一种L-叔亮氨酸的生产方法，所述方法由L-亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶酶法合成L-叔亮氨酸。酶催化步骤中酶投料量为底物的4%(w/w)，辅酶投料量为底物的0.2%(w/w)，时空产率为100g/d/L，产品纯度>98%，光学纯度>99%。本发明与传统的制备工艺相比，有效减少了催化剂酶的用量，产品纯度高、产率高，工艺流程简单，对设备无特殊要求，适用于工业化生产，产品可广泛应用于化工中间体和医药中间体。

Description

一种L-叔亮氨酸的生产方法

技术领域

本发明适用于生物制药和生物化工技术领域，尤其涉及一种L-叔亮氨酸的生产方法。

背景技术

非天然氨基酸及其衍生物是重要的化工中间体。其中，L-叔亮氨酸是一种重要的非天然氨基酸。它可以用于合成医药中间体，及作为不对称合成的手性诱导剂和不对称拆分的拆分试剂，是合成多种抗艾滋病药物和肝炎病毒抑制剂等药物的手性前体。随着我国社会经济的发展和环境保护意识的增强，医药化工行业不但需要提高L-叔亮氨酸的生产能力，而且需要创造绿色无污染的生产工艺。因此，利用酶法进行生物转化生产L-叔亮氨酸正越来越受到相关机构的重视。

从生产路线上划分，生产L-叔亮氨酸的方法主要有化学试剂拆分法，手性源合成法，化学合成法和生物转化法。其中拆分法受到得率限制，手性源法受到天然产物产能的限制，化学合成法成本较高，因此其它合成方法并无成功大规模应用的实例，生物转化法目前已经成为生产L-叔亮氨酸的主要方法。

生物转化法中，利用脂肪酶拆分消旋体DL-叔亮氨酸的相关工艺研究较多，如中国专利CN201010210770.0等，但是该路线存在着与化学拆分法同样的缺陷，即收率难以超过50%。因此，目前生物法的主要研究方向均集中于利用L-亮氨酸脱氢酶从三甲基丙酮酸还原为L-叔亮氨酸的路线，并利用甲酸脱氢酶原位再生辅酶NADH，利用甲酸铵提供氨分子和氢原子。早在上世纪九十年代德国的Degussa公司就利用该路线与超滤膜反应器结合，生产L-叔亮氨酸。该路线已经有数个专利申请公开，如中国专利CN201110116253.1，CN201110277030.3等，其存在的主要问题如下：1. 目前公开的专利中，反应起始底物浓度为10-15%。事实上，学术界公认的L-叔亮氨酸脱氢酶在底物浓度过高时会受到显著的底物抑制，反应速率急剧下降(Enzyme Catalysis in Organic Synthesis Edition I, Wiley, 1186)，在高氨浓度的条件下，过量的底物和生成的产物累积都会形成副产物(Biocatalysis 1994, 10: 37-47; J. Mol. Catal: B 1998, 5: 1-11)。可见，以上专利的方法是低效率的，或是难以重复的；2. 酶投料量过多。显而易见的，这是问题1的必然结果。例如专利CN201110116253.1中，昂贵的辅酶NAD投料量达到底物的1%(w/w)，经济性差，专利CN201110277030.3中整细胞催化剂占反应体系的浓度为80%(4g/5 mL)；3. 无明确的后提取工艺。同样由于问题1的存在，其得率和收率均不能满足工业化生产的需要。基于以上三点，目前尚未见利用该方法规模化生产L-叔亮氨酸的报道。

发明内容

为解决以上问题，本发明的目的在于提供一种酶法合成L-叔亮氨酸的方法。该方法制备条件温和，环境友好，收率高，成本低，适用于工业化生产。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：

一种L-叔亮氨酸的生产方法，所述方法利用L-亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶生产L-叔亮氨酸，其制备反应方程式为：

。

其中，LeuDH为亮氨酸脱氢酶；NADH为还原态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，具体为还原酶辅酶；NAD为氧化态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，具体为脱氢酶辅酶；FDH为甲酸脱氢酶。

所述酶法生产L-叔亮氨酸的方法，包括如下步骤：

(1) 称量一定量L-亮氨酸脱氢酶，甲酸脱氢酶 ，NAD于2000 mL三口瓶中，加入200 mL 5.0 mol/L甲酸铵水溶液，430 mL去离子水，150 mL 2.0 mol/L三甲基丙酮酸溶液（含底物40 g），装置搭建完成，温度达到预定值后，启动机械搅拌，开始反应计时，维持反应体系在一定温度；

(2) 补料流程: 反应开始后，2 h补加150 mL 2.0 mol/L三甲基丙酮酸溶液（含底物40 g），4小时补加70 mL（含底物20 g）；

(3) 反应过程用HPLC-MS和HPLC监测反应，至24小时底物完全转化为产物。加热反应液至60℃，1-2 h后加入硅藻土过滤，得到产物溶液，旋转蒸发去除水得到固体粗产品；

(4) 加入200 mL甲醇洗涤两次，取甲醇洗涤液蒸干，得到精制产品。

所述酶法生产L-叔亮氨酸的方法，步骤(1)中，L-亮氨酸脱氢酶，甲酸脱氢酶的总投料量不超过底物质量的4%，辅酶NAD投料量不超过底物质量的0.2%。

所述酶法生产L-叔亮氨酸的方法，步骤(1)中，温度达到预定值具体为36℃，反应过程维持反应体系温度为35℃-37℃。

所述酶法生产L-叔亮氨酸的方法，步骤(1)、(2)中，所述底物分子结构式为：。

所述酶法生产L-叔亮氨酸的方法，步骤(3)中反应过程用HPLC-MS和HPLC监测反应进度，具体通过监测底物的消耗和产物

的形成来判断反应终点。

本发明具有如下所述的有益效果：

(1) 本发明减少了催化剂用量。L-亮氨酸脱氢酶，甲酸脱氢酶的总投料量不超过底物质量的4%，辅酶NAD投料量不超过底物质量的0.2%。

(2) 本发明提高了反应的时空产率，为100 g/d/L。

(3) 本发明制备的产品收率高、纯度高。收率>90%，产品纯度>98%，光学纯度>99%。

 (4) 本发明工艺流程简单，对设备无特殊要求，适用于工业化生产。

具体实施方式

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明。

实施例一：

(1) 称量2 g L-亮氨酸脱氢酶，2 g甲酸脱氢酶 ，0.2 g NAD于2000 mL三口瓶中，加入200 mL 5.0 mol/L甲酸铵水溶液，430 mL去离子水，150 mL 2.0 mol/L三甲基丙酮酸溶液（含底物约40g），装置搭建完成，温度达到预定值36℃后，启动机械搅拌，开始反应计时,维持反应体系温度为35℃-37℃；

(2) 补料流程: 反应开始后，2小时补加150 mL 2.0 mol/L三甲基丙酮酸溶液（含底物约40 g），4小时补加70 mL（含底物约20 g）；

(3) 反应过程利用HPLC-MS和HPLC监测反应，至24小时底物完全转化为产物。加热反应液至60℃，1-2小时后加入硅藻土过滤，得到产物溶液，旋转蒸发去除水得到固体粗产品；

(4) 加入200 mL甲醇洗涤两次，取甲醇洗涤液蒸干，得到精制产品，产物纯度>98%，光学纯度>99%。

本发明实施例有效减少了催化剂酶的用量，产品纯度高、产率高，工艺流程简单，对设备无特殊要求，适用于工业化生产。可广泛应用于化工中间体和医药中间体。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种L-叔亮氨酸的生产方法，其特征在于，所述方法利用L-亮氨酸脱

氢酶和甲酸脱氢酶酶法合成L-叔亮氨酸。

2.根据权利要求1所述酶法生产L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1) 称量一定量L-亮氨酸脱氢酶，甲酸脱氢酶，NAD于2000 mL三口瓶中，加入200 mL 5.0 mol/L甲酸铵水溶液，430 mL去离子水，150 mL 2.0 mol/L三甲基丙酮酸溶液包含底物40 g，装置搭建完成，温度达到预定值后，启动机械搅拌，开始反应计时，维持反应体系在一定温度；

(2) 补料流程: 反应开始后，2小时补加150 mL 2.0 mol/L三甲基丙酮酸溶液包括底物40g，4小时补加70 mL包括底物20 g；

(3) 反应过程利用HPLC-MS和HPLC监测反应，至24小时底物完全转化为产物，加热反应液至60℃，1-2小时后加入硅藻土过滤，得到产物溶液，旋转蒸发去除水得到固体粗产品；

(4) 加入200 mL甲醇洗涤两次，取甲醇洗涤液蒸干，得到精制产品。

3.根据权利要求2所述酶法生产L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，步骤(1)中，L-亮氨酸脱氢酶，甲酸脱氢酶的总投料量不超过底物质量的4%，辅酶NAD投料量不超过底物质量的0.2%。

4.根据权利要求2所述酶法生产L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，步骤(1)中，温度达到预定值具体为36℃，反应过程维持反应体系温度为35℃-37℃。

5.根据权利要求2所述酶法生产L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，步骤(1)、(2)中，所述底物分子结构式为：                                                。

6.根据权利要求2所述酶法生产L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，步骤(3)中反应过程用HPLC-MS和HPLC监测反应进度，具体通过监测底物的消耗和产物的形成来判断反应终点。