CN102978251A - 一种l-叔亮氨酸的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物制药和生物化工领域,具体涉及一种L-叔亮氨酸的生产方法,所述方法由L-亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶酶法合成L-叔亮氨酸。酶催化步骤中酶投料量为底物的4%(w/w),辅酶投料量为底物的0.2%(w/w),时空产率为100g/d/L,产品纯度>98%,光学纯度>99%。本发明与传统的制备工艺相比,有效减少了催化剂酶的用量,产品纯度高、产率高,工艺流程简单,对设备无特殊要求,适用于工业化生产,产品可广泛应用于化工中间体和医药中间体。
Description
技术领域
本发明适用于生物制药和生物化工技术领域,尤其涉及一种L-叔亮氨酸的生产方法。
背景技术
非天然氨基酸及其衍生物是重要的化工中间体。其中,L-叔亮氨酸是一种重要的非天然氨基酸。它可以用于合成医药中间体,及作为不对称合成的手性诱导剂和不对称拆分的拆分试剂,是合成多种抗艾滋病药物和肝炎病毒抑制剂等药物的手性前体。随着我国社会经济的发展和环境保护意识的增强,医药化工行业不但需要提高L-叔亮氨酸的生产能力,而且需要创造绿色无污染的生产工艺。因此,利用酶法进行生物转化生产L-叔亮氨酸正越来越受到相关机构的重视。
从生产路线上划分,生产L-叔亮氨酸的方法主要有化学试剂拆分法,手性源合成法,化学合成法和生物转化法。其中拆分法受到得率限制,手性源法受到天然产物产能的限制,化学合成法成本较高,因此其它合成方法并无成功大规模应用的实例,生物转化法目前已经成为生产L-叔亮氨酸的主要方法。
生物转化法中,利用脂肪酶拆分消旋体DL-叔亮氨酸的相关工艺研究较多,如中国专利CN201010210770.0等,但是该路线存在着与化学拆分法同样的缺陷,即收率难以超过50%。因此,目前生物法的主要研究方向均集中于利用L-亮氨酸脱氢酶从三甲基丙酮酸还原为L-叔亮氨酸的路线,并利用甲酸脱氢酶原位再生辅酶NADH,利用甲酸铵提供氨分子和氢原子。早在上世纪九十年代德国的Degussa公司就利用该路线与超滤膜反应器结合,生产L-叔亮氨酸。该路线已经有数个专利申请公开,如中国专利CN201110116253.1,CN201110277030.3等,其存在的主要问题如下:1. 目前公开的专利中,反应起始底物浓度为10-15%。事实上,学术界公认的L-叔亮氨酸脱氢酶在底物浓度过高时会受到显著的底物抑制,反应速率急剧下降(Enzyme Catalysis in Organic Synthesis Edition I, Wiley, 1186),在高氨浓度的条件下,过量的底物和生成的产物累积都会形成副产物(Biocatalysis 1994, 10: 37-47; J. Mol. Catal: B 1998, 5: 1-11)。可见,以上专利的方法是低效率的,或是难以重复的;2. 酶投料量过多。显而易见的,这是问题1的必然结果。例如专利CN201110116253.1中,昂贵的辅酶NAD投料量达到底物的1%(w/w),经济性差,专利CN201110277030.3中整细胞催化剂占反应体系的浓度为80%(4g/5 mL);3. 无明确的后提取工艺。同样由于问题1的存在,其得率和收率均不能满足工业化生产的需要。基于以上三点,目前尚未见利用该方法规模化生产L-叔亮氨酸的报道。
发明内容
为解决以上问题,本发明的目的在于提供一种酶法合成L-叔亮氨酸的方法。该方法制备条件温和,环境友好,收率高,成本低,适用于工业化生产。
为实现上述目的,本发明提供的技术方案是:
一种L-叔亮氨酸的生产方法,所述方法利用L-亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶生产L-叔亮氨酸,其制备反应方程式为:
其中,LeuDH为亮氨酸脱氢酶;NADH为还原态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸,具体为还原酶辅酶;NAD为氧化态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸,具体为脱氢酶辅酶;FDH为甲酸脱氢酶。
所述酶法生产L-叔亮氨酸的方法,包括如下步骤:
(1) 称量一定量L-亮氨酸脱氢酶,甲酸脱氢酶 ,NAD于2000 mL三口瓶中,加入200 mL 5.0 mol/L甲酸铵水溶液,430 mL去离子水,150 mL 2.0 mol/L三甲基丙酮酸溶液(含底物40 g),装置搭建完成,温度达到预定值后,启动机械搅拌,开始反应计时,维持反应体系在一定温度;
(2) 补料流程: 反应开始后,2 h补加150 mL 2.0 mol/L三甲基丙酮酸溶液(含底物40 g),4小时补加70 mL(含底物20 g);
(3) 反应过程用HPLC-MS和HPLC监测反应,至24小时底物完全转化为产物。加热反应液至60℃,1-2 h后加入硅藻土过滤,得到产物溶液,旋转蒸发去除水得到固体粗产品;
(4) 加入200 mL甲醇洗涤两次,取甲醇洗涤液蒸干,得到精制产品。
所述酶法生产L-叔亮氨酸的方法,步骤(1)中,L-亮氨酸脱氢酶,甲酸脱氢酶的总投料量不超过底物质量的4%,辅酶NAD投料量不超过底物质量的0.2%。
所述酶法生产L-叔亮氨酸的方法,步骤(1)中,温度达到预定值具体为36℃,反应过程维持反应体系温度为35℃-37℃。
所述酶法生产L-叔亮氨酸的方法,步骤(1)、(2)中,所述底物分子结构式为:。
本发明具有如下所述的有益效果:
(1) 本发明减少了催化剂用量。L-亮氨酸脱氢酶,甲酸脱氢酶的总投料量不超过底物质量的4%,辅酶NAD投料量不超过底物质量的0.2%。
(2) 本发明提高了反应的时空产率,为100 g/d/L。
(3) 本发明制备的产品收率高、纯度高。收率>90%,产品纯度>98%,光学纯度>99%。
(4) 本发明工艺流程简单,对设备无特殊要求,适用于工业化生产。
具体实施方式
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以作出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述,应当理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明。
实施例一:
(1) 称量2 g L-亮氨酸脱氢酶,2 g甲酸脱氢酶 ,0.2 g NAD于2000 mL三口瓶中,加入200 mL 5.0 mol/L甲酸铵水溶液,430 mL去离子水,150 mL 2.0 mol/L三甲基丙酮酸溶液(含底物约40g),装置搭建完成,温度达到预定值36℃后,启动机械搅拌,开始反应计时,维持反应体系温度为35℃-37℃;
(2) 补料流程: 反应开始后,2小时补加150 mL 2.0 mol/L三甲基丙酮酸溶液(含底物约40 g),4小时补加70 mL(含底物约20 g);
(3) 反应过程利用HPLC-MS和HPLC监测反应,至24小时底物完全转化为产物。加热反应液至60℃,1-2小时后加入硅藻土过滤,得到产物溶液,旋转蒸发去除水得到固体粗产品;
(4) 加入200 mL甲醇洗涤两次,取甲醇洗涤液蒸干,得到精制产品,产物纯度>98%,光学纯度>99%。
本发明实施例有效减少了催化剂酶的用量,产品纯度高、产率高,工艺流程简单,对设备无特殊要求,适用于工业化生产。可广泛应用于化工中间体和医药中间体。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种L-叔亮氨酸的生产方法,其特征在于,所述方法利用L-亮氨酸脱
氢酶和甲酸脱氢酶酶法合成L-叔亮氨酸。
2.根据权利要求1所述酶法生产L-叔亮氨酸的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1) 称量一定量L-亮氨酸脱氢酶,甲酸脱氢酶,NAD于2000 mL三口瓶中,加入200 mL 5.0 mol/L甲酸铵水溶液,430 mL去离子水,150 mL 2.0 mol/L三甲基丙酮酸溶液包含底物40 g,装置搭建完成,温度达到预定值后,启动机械搅拌,开始反应计时,维持反应体系在一定温度;
(2) 补料流程: 反应开始后,2小时补加150 mL 2.0 mol/L三甲基丙酮酸溶液包括底物40g,4小时补加70 mL包括底物20 g;
(3) 反应过程利用HPLC-MS和HPLC监测反应,至24小时底物完全转化为产物,加热反应液至60℃,1-2小时后加入硅藻土过滤,得到产物溶液,旋转蒸发去除水得到固体粗产品;
(4) 加入200 mL甲醇洗涤两次,取甲醇洗涤液蒸干,得到精制产品。
3.根据权利要求2所述酶法生产L-叔亮氨酸的方法,其特征在于,步骤(1)中,L-亮氨酸脱氢酶,甲酸脱氢酶的总投料量不超过底物质量的4%,辅酶NAD投料量不超过底物质量的0.2%。
4.根据权利要求2所述酶法生产L-叔亮氨酸的方法,其特征在于,步骤(1)中,温度达到预定值具体为36℃,反应过程维持反应体系温度为35℃-37℃。
5.根据权利要求2所述酶法生产L-叔亮氨酸的方法,其特征在于,步骤(1)、(2)中,所述底物分子结构式为: 。
6.根据权利要求2所述酶法生产L-叔亮氨酸的方法,其特征在于,步骤(3)中反应过程用HPLC-MS和HPLC监测反应进度,具体通过监测底物的消耗和产物的形成来判断反应终点。
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