CN107858384B

CN107858384B - 一种利用活性包涵体制备光学纯l-叔亮氨酸的方法

Info

Publication number: CN107858384B
Application number: CN201711094066.1A
Authority: CN
Inventors: 方柏山; 张永辉
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2017-11-08
Filing date: 2017-11-08
Publication date: 2020-10-09
Anticipated expiration: 2037-11-08
Also published as: CN107858384A; WO2019091366A1

Abstract

本发明公开了一种利用活性包涵体制备光学纯L‑叔亮氨酸的方法，包括如下步骤：(1)制备双功能酶活性包涵体，该双功能酶活性包涵体的活性成分为一融合双功能酶，该融合双功能酶包括通过连接肽相连的一亮氨酸脱氢酶(leucine dehydrogenase，LeuDH)部和一用于辅酶NAD⁺再生的多聚酶部；(2)将上述双功能酶活性包涵体加入pH 6.0～10.0的反应混合液重悬，然后于20～40℃反应，反应期间控制pH为6.0～10.0；所述反应混合液包含50～1000mM三甲基丙酮酸、50‑1000mM甲酸铵和0.05～5mM的辅酶NAD⁺。

Description

一种利用活性包涵体制备光学纯L-叔亮氨酸的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种利用活性包涵体制备光学纯L-叔亮氨酸的方法。

背景技术

L-叔亮氨基酸(L-Tle)的结构中的叔丁基由于空间位阻大，有利于反应从背面进行，因此L-Tle及其衍生物常被用作诱导不对称反应的催化剂，所生成产物均具有高选择性的特点，常用做诱导不对称合成反应的模板，广泛的应用在不对称合成中。另外，L-Tle的叔丁基结构疏水性强，能够有效地控制分子构型；在多肽成分中，L-Tle正逐步代替其中的Val、Leu及Ile，因为其可增强多肽的疏水性和稳定性，防止被酶降解。

L-Tle在饲料添加剂以及营养强化剂等方面具有广泛的应用。另外，L-Tle及其衍生物也常作为金属手性配体，或化学酶催化剂的配体，为不对称氨化还原反应提供更为高效的催化方式。L-Tle的另一重要用途是作为医药中间体，广泛应用于抗艾滋病药物以及生物抑制剂等的合成。

已有报道的生产L-叔亮氨酸的方法主要有化学试剂拆分法，手性源合成法，化学合成法和生物酶法。其中拆分法受到得率限制，手性源法受到天然产物产能的限制，化学合成法成本较高，因此这些合成方法并无成功工业化的实例，生物酶法是目前实现L-叔亮氨酸工业化生产的主要方法。

已报道的叔亮氨酸的生物酶法合成主要分为两类，利用游离酶和全细胞作为催化剂。德国Degussa公司采用游离的亮氨酸脱氢酶与甲酸脱氢酶在吨级的酶生物膜反应器中进行反复批次反应，酶可以通过超滤回收；美国Codexis公司采用游离的亮氨酸脱氢酶与酮基还原酶进行L-Tle的批次反应，酮基还原酶用于还原NAD⁺为NADH；美国Great Lakes FineChemicals公司利用产转氨酶微生物全细胞催化叔丁基酮酸和氨基工体化合物转氨反应合成叔亮氨酸。包涵体常形成于原核表达体系的异源蛋白表达过程中，通常被视为不利的副产物，严重降低可溶重组蛋白的表达量。然而，在近些年关于包涵体的研究表明其主要是由目的重组蛋白组成，并且重组蛋白聚集形成包涵体不意味着生物活性的丧失，根据文献报道可以证实在包涵体仍具有相当于可溶重组蛋白的生物活性。

目标酶可以通过融合上适当的标签实现自固定化，形成稳定的、可重复利用的生物催化剂。Nahálka等人将麦芽糊精磷酸化酶与Clostridium cellulovorans的纤维素结合位点融合构建了活性包涵体，83％的麦芽糊精磷酸化酶酶活存在于包涵体中，可用于D-葡萄糖-1-磷酸的重复批次催化；Diener等人利用来自Staphylothermus marinus的细胞表面蛋白Tetrabrachion的卷曲螺旋区域(53个氨基酸)作为融合标签，分别与脂肪酶、羟基腈裂解酶和2-琥珀酰-5-烯醇式丙酮酸-6-羟基-3-环己烯-1-羧酸合成酶进行融合，均能得到对应的活性包涵体，并且提高了酶的稳定性与重复利用性；Li和Zhang等人将弹性蛋白多肽与木聚糖酶进行融合，诱导表达得到活性包涵体，其比活为木聚糖酶的92％，且pH稳定性、热稳定性和储存稳定性均得到大幅的提升。

目前报道的诱导包涵体形成的标签包括纤维素结合位点、细胞表面蛋白Tetrabrachion的四聚化位点、口蹄疫病毒VP1衣壳蛋白、绿色荧光蛋白、弹性蛋白多肽等。但是尚无通过构建双功能酶制备活性包涵体制备L-Tle或是其他产品的先例，因此利用基因工程手段构建双功能酶活性包涵体，并利用其作为高效经济的生物催化剂制备光学纯L-Tle具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种利用活性包涵体制备光学纯L-叔亮氨酸的方法。

本发明的技术方案如下：

一种利用活性包涵体制备光学纯L-叔亮氨酸的方法，包括如下步骤：

(1)制备双功能酶活性包涵体，该双功能酶活性包涵体的活性成分为一融合双功能酶，该融合双功能酶包括通过连接肽相连的一LeuDH(亮氨酸脱氢酶leucinedehydrogenase)部和一用于辅酶NAD⁺再生的多聚酶部，上述LeuDH部包括如SEQ ID NO 01所示的序列，上述连接肽为一刚性连接肽或一柔性连接肽，上述刚性连接肽能够形成α螺旋以将上述LeuDH部和多聚酶部有效隔离，上述柔性连接肽没有形成特定二级结构的能力，一般以无规卷曲的形式存在以提供催化过程中蛋白所需的柔性；

(2)将上述双功能酶活性包涵体加入pH 6.0～10.0的反应混合液重悬，然后于20-40℃反应，反应期间控制pH为6.0～10.0；所述反应混合液包含50-1000mM三甲基丙酮酸、50-1000mM甲酸铵和0.05～5mM的辅酶NAD⁺。

在本发明的一个优选实施方案中，所述刚性连接肽包括若干依次相连的如SEQ IDNO 02所示的氨基酸序列。

在本发明的一个优选实施方案中，所述柔性连接肽包括若干依次相连的如SEQ IDNO 03所示的氨基酸序列。

在本发明的一个优选实施方案中，所述多聚酶部为FDH部(甲酸脱氢酶formatedehydrogenase)、葡萄糖脱氢酶部、甘油脱氢酶部、醇脱氢酶部、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶部、乳酸脱氢酶部或氢化酶部。

进一步优选的，所述多聚酶部为FDH部，该FDH部包括如SEQ ID NO 04所示的氨基酸序列。

在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(2)中的反应混合液的pH为8.5～9，温度为30℃，反应期间控制pH为8.5～9。

在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(2)中的反应混合液包含50～710mM的三甲基丙酮酸、50～780mM的甲酸铵和0.04-0.5mM的辅酶NAD⁺。

本发明的有益效果是：

1.本发明通过构建融合酶可以大大降低双酶体系中催化剂制备成本。

2.本发明的双功能酶活性包涵体的构建方法成本低，易于工业应用。

3.本发明中的双功能酶活性包涵体属于无载体的自组装固定化，免去酶固定化的成本，且便于下游产物的分离纯化。所述双功能酶活性包涵体，典型地，FDH-LeuDH双功能酶活性包涵体，光学选择性高，热稳定性较可溶双功能酶得到了提高，且可作为固定化酶重复使用，在经济高效制备光学纯叔亮氨酸领域具有较好的工业应用前景。

4.本发明通过含有双功能酶表达载体的基因工程菌制备双功能酶活性包涵体，可以通过调整连接肽配置优化双功能酶活性包涵体的整体结构，提高双酶的耦联效率。

5.本发明工艺流程简单，对设备无特殊要求，适用于工业化生产。

附图说明

图1为本发明实施例1中的FDH-LeuDH双功能酶基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。

图2为本发明实施例2中不同连接肽介导的FDH-LeuDH双功能酶基因工程菌的全细胞SDS-PAGE图。

图3为本发明实施例3中双功能酶活性包涵体的SEM图，其中A为FDH-R1-LeuDH，B为FDH-R2-LeuDH，C为FDH-S1-LeuDH，D为FDH-S2-LeuDH。

图4为本发明实施例3中双功能酶活性包涵体的重组蛋白分布(A)、FDH酶活分布(B)和LeuDH酶活分布(C)。

图5为本发明实施例3中双功能酶活性包涵体和游离酶的酶活对比，其中A为LeuDH部分，B为FDH部分，以游离单酶的酶活为100％计算相对酶活。

图6为本发明实施例4中FDH-R3-LeuDH可溶部分和活性包涵体部分催化能力对比。

图7为本发明实施例4中的液相色谱结果图，其中，A是标准L-Tle和标准D-Tle的液相色谱图，B是FDH-R3-LeuDH活性包涵体催化产物的液相色谱图，星号标示D-Tle出峰时间。

图8为本发明实施例5中不同IPTG浓度的FDH-R3-LeuDH活性包涵体的SDS-PAGE图。

图9为本发明实施例5中不同IPTG浓度的FDH-R3-LeuDH活性包涵体的催化能力对比。

图10为本发明实施例6中FDH-R3-LeuDH活性包涵体和可溶部分的热稳定性对比，其中，A是FDH酶活，B是LeuDH酶活。

图11为本发明实施例7中FDH-R3-LeuDH活性包涵体的连续回收催化。以首次催化的产率为100％计算回收催化的相对产率。

具体实施方式

以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

下述实施例中，本发明的双功能酶活性包涵体的活性成分为一融合双功能酶，该融合双功能酶包括通过连接肽相连的一LeuDH部和一用于辅酶NAD⁺再生的多聚酶部，上述连接肽为一刚性连接肽或一柔性连接肽，上述刚性连接肽能够形成α螺旋以将上述LeuDH部和多聚酶部有效隔离，上述柔性连接肽没有形成特定二级结构的能力，一般以无规卷曲的形式存在以提供催化过程中蛋白所需的柔性，多聚酶部为FDH部、葡萄糖脱氢酶部、甘油脱氢酶部、醇脱氢酶部、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶部、乳酸脱氢酶部或氢化酶部，上述多聚酶部的多聚形态以及所参考的PDB结构ID如下表所示。所述能形成多聚体且能用于辅酶再生的酶优选FDH，用于辅酶再生的多聚酶优选FDH的多聚体，此时所述双功能酶活性包涵体优选为FDH-LeuDH双功能酶活性包涵体，即以FDH负责辅酶的再生。

常用于辅酶再生的酶的多聚体形态信息及所参考的PDB ID

下列实施例中若无注明具体操作条件的，通常可按常规的实验条件进行，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》以及汪家政等编写的《蛋白质技术手册》中所述的条件，或是制造厂商所推荐的条件进行。

实施例1

FDH-LeuDH双功能酶重组菌株的构建

采取重叠延伸PCR(Overlap extension polymerase chain reaction，OE-PCR)构建由不同连接肽介导的FDH-LeuDH融合酶，以FDH-R1-LeuDH融合酶基因的构建为例描述构建过程。首先根据LeuDH，FDH、连接肽序列和pET28a质粒上的酶切位点设计一下引物：

P1：5’-GGAATTCCATATGAAAATTGTCCTGGTCCTGT-3’(SEQ ID NO 05)，下划线为NdeI酶切位点序列。

连接肽引物：

5’-GCCTATGGCAAACACGATAAAAAGXXXATGACATTGGAAATCTTCGA-3’，XXX指连接肽序列，详见表1。

P3：5’-ATGACATTGGAAATCTTCGAATAT-3’(SEQ ID NO 06)。

P4：5’-CCGCTCGAGTTACCGGCGACTAATGATGT-3’(SEQ ID NO 07)，下划线为XhoI酶切位点序列。

以FDH和LeuDH基因为模板，分别以P1和连接肽引物扩增FDH基因，以P3和P4扩增LeuDH基因，PCR扩增体系：模板2uL，引物各1.5uL，PCR Mix 25uL，ddH2O 20uL。PCR条件：94℃预变性，5min；94℃变性，1min，56℃退火，1min，72℃延伸，15s，30个循环；72℃延伸，10min。采用凝胶回收试剂盒对FDH和LeuDH基因进行回收，然后以等摩尔的两个酶基因为模板，以引物1和引物4进行PCR扩增，条件同上述，可获得插入连接肽的融合酶基因，如图1所示，其中M表示DNAmarker，条带1-7分别为FDH-DL-LeuDH，FDH-S1-LeuDH，FDH-S2-LeuDH，FDH-S3-LeuDH，FDH-R1-LeuDH，FDH-R2-LeuDH和FDH-R3-LeuDH基因，采用凝胶回收试剂盒对融合酶基因进行回收。将得到的融合酶基因和pET-28a质粒进行NdeI/XhoI双酶切，采用凝胶回收试剂盒对融合酶基因和质粒骨架进行回收后进行连接，连接好的质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)，用卡那霉素抗性平板筛选阳性克隆。得到的阳性克隆于37℃过夜培养后提取质粒，进行双酶切验证正确后，菌种保存于-80℃冰箱。

上述FDH的氨基酸序列如SEQ ID NO 04所示，核苷酸序列如SEQ ID NO 08所示，桑树LeuDH的氨基酸序列如SEQ ID NO 01所示，核苷酸序列如SEQ ID NO 09所示。

表1种不同融合酶连接肽氨基酸序列以及插入连接肽使用的引物序列。

^aDL表示直接连接；R1-R3表示1至3个重复单元的EAAAK连接肽；S1-S3表示1至3个重复单元的GGGGS连接肽。

^b下划线部分为用于对应融合酶构建的引物。

实施例2

双功能酶活性包涵体的制备

将双功能酶重组菌株接种于LB培养基中，37℃，200rpm过夜活化后，转接于Lb培养基中，接种量为1％，37℃，200rpm培养至OD600约为0.5，加入终浓度0.2mM的IPTG，16℃，200rpm诱导表达24h。培养完成后收集菌体，以PBS缓冲液(pH＝7.2)洗涤菌体2次后保存于-80℃待用。以全细胞SDS-PAGE验证重组双功能酶是否成功表达，结果如图2所示，其中M表示蛋白marker，带1-9分别为FDH单酶、LeuDH单酶、FDH-DL-LeuDH，FDH-S1-LeuDH，FDH-S2-LeuDH，FDH-S3-LeuDH，FDH-R1-LeuDH，FDH-R2-LeuDH和FDH-R3-LeuDH，可以看出7种连接肽介导的双功能酶均得到成功表达。

以5mL ddH₂O悬浮100mg菌体，利用超声波细胞破碎仪对细菌细胞进行破碎，12000×g离心20min，上清置于4℃暂时保存。离心得到的沉淀首先溶解于添加1％体积比的乙基苯基聚乙二醇(NP-40)的PBS缓冲液中，4℃放置45min，随后加入25μL DNAse和MgSO₄(终浓度10mM)，37℃，100rpm震荡45min后，4℃下12000×g离心20min，沉淀用PBS缓冲液(含1％Trition X-100)洗涤一次，用PBS缓冲液液洗涤两次后即为纯化后的包涵体。

实施例3

双功能酶活性包涵体的表征

通过扫描电子显微镜直接观察包涵体的形貌特征。样品制备方法如下：将5μL的包涵体样品滴加在单晶硅片上，过夜风干，随后在JFC-1600(JEOL，Tokyo，Japan)溅射仪中镀上约2nm厚的铂(溅射条件：10mA，30s)，然后将镀膜的样品放入场发射Sigma型扫描电镜(Carl-Zeiss AG，Germany)进行观察。图3为部分包涵体的SEM结构图，其中A为FDH-R1-LeuDH，B为FDH-R2-LeuDH，C为FDH-S1-LeuDH，D为FDH-S2-LeuDH，可以看出刚性连接肽介导的双功能酶活性包涵体呈现片层结构，而柔性连接肽介导的双功能酶活性包涵体呈现不规则的球棒状聚集结构。

对双功能酶活性包涵体分布与酶活分布进行了研究，图4A为重组蛋白的分布情况图，可以看出超过80％的重组蛋白存在于活性包涵体中，上清中的重组蛋白分布较少，图4B和图4C为酶活的分布情况，可以看出超过90％的FDH酶活和LeuDH酶活均分布在包涵体部分，部分双功能酶包涵体中FDH和LeuDH酶活分布超过95％，实验结果说明FDH-LeuDH双功能酶大部分表达为活性的包涵体。

对双功能酶活性包涵体的酶活进行了研究，图5A为双功能酶活性包涵体和游离酶的LeuDH酶活对比，图5B为双功能酶活性包涵体和游离酶的FDH酶活对比，以LeuDH和FDH单酶的酶活为100％计算其相对酶活，可以看出活性包涵体部分FDH的酶活相比单酶有较大的提高(24.7％-146.6％)，而游离酶部分FDH的酶活则出现了明显的下降。LeuDH的酶活较游离酶有一定程度的下降，但是由于在L-Tle双酶催化体系中，FDH为限速酶，LeuDH的酶活远高于FDH，因此LeuDH酶活的下降并不会降低整体的催化效率。

实施例4

双功能酶活性包涵体制备L-Tle

上述实施例2的基础上，沉淀在纯化处理后加入10mL的反应混合液悬浮开始反应，上清加入5mL的2×反应混合液以保持两组实验的浓度相等，两组置于30℃，200rpm反应48h。反应混合液含50mM三甲基丙酮酸、50mM甲酸铵、0.04mM NAD⁺，以氨水调节pH为8.5，溶剂为H₂O。

FDH-R3-LeuDH可溶部分和活性包涵体部分催化TMA生成L-Tle的催化能力，结果如图6所示，可以看出在相同条件下可溶部分的转化率仅为14.6％，活性包涵体部分的转化率为93.5％，约为可溶部分的6.4倍，活性包涵体催化获得的L-Tle ee值大于99％，结果如图4所示，其中图7A为标准L-Tle和D-Tle的HPLC谱图，图7B为FDH-R3-LeuDH活性包涵体催化产物的谱图，流速因柱压提高降低为0.8mL/min，星号标示理论D-Tle出峰时间。上述结果表明绝大部分的融合酶表达为活性包涵体的形式，并且在L-Tle的生物催化转化方面具有更高的利用潜力。

实施例5

诱导剂浓度对双功能酶活性包涵体催化能力的影响

使用不同的IPTG浓度对FDH-R3-LeuDH进行诱导培养，然后对重组蛋白的分布进行SDS-PAGE分析，如图8所示，其中M表示蛋白标准，1为上清(0mM)；2为包涵体(0mM)；3为上清(0.01mM)；4为包涵体(0.01mM)；5为上清(0.2mM)；6为包涵体(0.2mM)；7为上清(1mM)；8为包涵体(1mM)。可以看出包涵体中重组蛋白的含量随着IPTG浓度的增加而增加，而可溶部分的重组蛋白则呈现相反的趋势。将50mg的不同IPTG浓度诱导得到的FDH-R3-LeuDH活性包涵体重悬于10mL反应混合液，置于30℃，200rpm反应16h。反应混合液含50mM三甲基丙酮酸、50mM甲酸铵、0.01mM NAD⁺，以氨水调节pH为8.5，溶剂为H₂O。对活性包涵体的催化如图9所示，可以看出包涵体的活性在一开始随着IPTG浓度的增加而增加，但是当IPTG浓度增加到1mM时，催化效率出现了下降，在0.2mM的IPTG浓度，此时重组蛋白在包涵体中的表达量较高，并且能保持较好的活性构象。

实施例6

双功能酶活性包涵体的热稳定性

将FDH-R3-LeuDH可溶部分和活性包涵体分别置于20-50℃水浴1h，测定其残余酶活，结果如图10所示，在水浴后FDH部分酶活保持70-112％，LeuDH部分酶活保持87-108％，而可溶部分的FDH酶活保持47-94％，LeuDH酶活保持74-94％，可以看出活性包涵体FDH和LeuDH部分的热稳定性均优于可溶融合酶，热稳定性的提高可能是由于融合酶在胞内的聚集形成聚集体能防止酶的亚基在高温下解离。活性融合酶包涵体在低温条件下孵育1h后酶活性有小幅度的提高，造成这一现象的原因可能是包涵体中错误折叠的重组蛋白在热激下重折叠形成活性的构象。

实施例7

双功能酶活性包涵体的重复催化

100mg(湿重)的活性包涵体中加入10mL反应混合液(包含50mM三甲基丙酮酸、50mM甲酸铵、0.04mM NAD⁺，pH＝8.5)，悬浮，于30℃，200rpm反应24h，反应结束后取200μL样品保存于-80℃待测。活性包涵体在4℃下，5000×g离心10min，沉淀用ddH₂O洗涤两次去除反应残余物质，接着加入10mL反应混合液，悬浮，开始下一轮反应，重复批次催化共进行六轮。首批催化得到的产率记为100％，计算后面批次的相对产率，结果如图11所示，可以看出L-Tle的产量随着回收次数的增加而降低，在没有外加固定化介质与其他修饰的情况下，在2、4、6次连续回收催化后，产量分别保持首次催化产量的86.0％、72.0％和54.3％。实验结果表明FDH-R3-LeuDH活性包涵体具有良好的重复利用性，多酶活性包涵体可以同时实现多酶催化系统的构建的和酶的固定化。

实施例8

双功能酶活性包涵体的批次催化

10g(湿重)的活性包涵体中加入200mL反应混合液(包含710mM三甲基丙酮酸、780mM甲酸铵、0.5mM NAD⁺，pH＝9)，悬浮，于30℃，200rpm反应16h，每隔一段时间取样保存于-20℃分析，反应2h后转化率为31.8％，反应4h后转化率为48.7％，在16h时达到最大转化率87.4％，实验结果表明FDH-R3-LDH活性包涵体能较好地进行催化，具有较好的应用潜力。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

序列表

<110> 厦门大学

<120> 一种利用活性包涵体制备光学纯L-叔亮氨酸的方法

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 366

<212> PRT

<213> 蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)

<400> 1

Met Thr Leu Glu Ile Phe Glu Tyr Leu Glu Lys Tyr Asp Tyr Glu Gln

1 5 10 15

Val Val Phe Cys Gln Asp Lys Glu Ser Gly Leu Lys Ala Ile Ile Ala

20 25 30

Ile His Asp Thr Thr Leu Gly Pro Ala Leu Gly Gly Thr Arg Met Trp

35 40 45

Thr Tyr Asp Ser Glu Glu Ala Ala Ile Glu Asp Ala Leu Arg Leu Ala

50 55 60

Lys Gly Met Thr Tyr Lys Asn Ala Ala Ala Gly Leu Asn Leu Gly Gly

65 70 75 80

Ala Lys Thr Val Ile Ile Gly Asp Pro Arg Lys Asp Lys Ser Glu Ala

85 90 95

Met Phe Arg Ala Leu Gly Arg Tyr Ile Gln Gly Leu Asn Gly Arg Tyr

100 105 110

Ile Thr Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Val Asp Asp Met Asp Ile Ile

115 120 125

His Glu Glu Thr Asp Phe Val Thr Gly Ile Ser Pro Ser Phe Gly Ser

130 135 140

Ser Gly Asn Pro Ser Pro Val Thr Ala Tyr Gly Val Tyr Arg Gly Met

145 150 155 160

Lys Ala Ala Ala Lys Glu Ala Phe Gly Thr Asp Asn Leu Glu Gly Lys

165 170 175

Val Ile Ala Val Gln Gly Val Gly Asn Val Ala Tyr His Leu Cys Lys

180 185 190

His Leu His Ala Glu Gly Ala Lys Leu Ile Val Thr Asp Ile Asn Lys

195 200 205

Glu Ala Val Gln Arg Ala Val Glu Glu Phe Gly Ala Thr Ala Val Glu

210 215 220

Pro Asn Glu Ile Tyr Gly Val Glu Cys Asp Ile Tyr Ala Pro Cys Ala

225 230 235 240

Leu Gly Ala Thr Val Asn Asp Glu Thr Ile Pro Gln Leu Lys Ala Lys

245 250 255

Val Ile Ala Gly Ser Ala Asn Asn Gln Leu Lys Glu Asp Arg His Gly

260 265 270

Asp Ile Ile His Glu Met Gly Ile Val Tyr Ala Pro Asp Tyr Val Ile

275 280 285

Asn Ala Gly Gly Val Ile Asn Val Ala Asp Glu Leu Tyr Gly Tyr Asn

290 295 300

Arg Glu Arg Ala Leu Lys Arg Val Glu Ser Ile Tyr Asp Thr Ile Ala

305 310 315 320

Lys Val Ile Glu Ile Ser Lys Arg Asp Gly Ile Ala Thr Tyr Val Ala

325 330 335

Ala Asp Arg Leu Ala Glu Glu Arg Ile Ala Ser Leu Lys Asn Ser Arg

340 345 350

Ser Thr Tyr Leu Arg Asn Gly His Asp Ile Ile Ser Arg Arg

355 360 365

<210> 2

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Glu Ala Ala Ala Lys

1 5

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 4

<211> 364

<212> PRT

<213> 博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)

<400> 4

Met Lys Ile Val Leu Val Leu Tyr Asp Ala Gly Lys His Ala Ala Asp

1 5 10 15

Glu Glu Lys Leu Tyr Gly Ser Thr Glu Asn Lys Leu Gly Ile Ala Asn

20 25 30

Trp Leu Lys Asp Gln Gly His Glu Leu Ile Thr Thr Ser Asp Lys Glu

35 40 45

Gly Glu Thr Ser Glu Leu Asp Lys His Ile Pro Asp Ala Asp Ile Ile

50 55 60

Ile Thr Thr Pro Phe His Pro Ala Tyr Ile Thr Lys Glu Arg Leu Asp

65 70 75 80

Lys Ala Lys Asn Leu Lys Leu Val Val Val Ala Gly Val Gly Ser Asp

85 90 95

His Ile Asp Leu Asp Tyr Ile Asn Gln Thr Gly Lys Lys Ile Ser Val

100 105 110

Leu Glu Val Thr Gly Ser Asn Val Val Ser Val Ala Glu His Val Val

115 120 125

Met Thr Met Leu Val Leu Val Arg Asn Phe Val Pro Ala His Glu Gln

130 135 140

Ile Ile Asn His Asp Trp Glu Val Ala Ala Ile Ala Lys Asp Ala Tyr

145 150 155 160

Asp Ile Glu Gly Lys Thr Ile Ala Thr Ile Gly Ala Gly Arg Ile Gly

165 170 175

Tyr Arg Val Leu Glu Arg Leu Leu Pro Phe Asn Pro Lys Glu Leu Leu

180 185 190

Tyr Tyr Asp Tyr Gln Ala Leu Pro Lys Glu Ala Glu Glu Lys Val Gly

195 200 205

Ala Arg Arg Val Glu Asn Ile Glu Glu Leu Val Ala Gln Ala Asp Ile

210 215 220

Val Thr Val Asn Ala Pro Leu His Ala Gly Thr Lys Gly Leu Ile Asn

225 230 235 240

Lys Glu Leu Leu Ser Lys Phe Lys Lys Gly Ala Trp Leu Val Asn Thr

245 250 255

Ala Arg Gly Ala Ile Cys Val Ala Glu Asp Val Ala Ala Ala Leu Glu

260 265 270

Ser Gly Gln Leu Arg Gly Tyr Gly Gly Asp Val Trp Phe Pro Gln Pro

275 280 285

Ala Pro Lys Asp His Pro Trp Arg Asp Met Arg Asn Lys Tyr Gly Ala

290 295 300

Gly Asn Ala Met Thr Pro His Tyr Ser Gly Thr Thr Leu Asp Ala Gln

305 310 315 320

Thr Arg Tyr Ala Glu Gly Thr Lys Asn Ile Leu Glu Ser Phe Phe Thr

325 330 335

Gly Lys Phe Asp Tyr Arg Pro Gln Asp Ile Ile Leu Leu Asn Gly Glu

340 345 350

Tyr Val Thr Lys Ala Tyr Gly Lys His Asp Lys Lys

355 360

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 5

ggaattccat atgaaaattg tcctggtcct gt 32

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 6

atgacattgg aaatcttcga atat 24

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 7

ccgctcgagt taccggcgac taatgatgt 29

<210> 8

<211> 1092

<212> DNA

<213> 博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)

<400> 8

atgaaaattg tcctggtcct gtatgacgcg ggcaaacatg cggccgatga ggagaaactt 60

tacggatcta cggaaaataa actggggatc gccaattggc tgaaagatca gggccacgaa 120

ctgatcacca caagtgataa agaaggggaa acaagcgaat tggataagca tattccggat 180

gcagatatca ttattactac gccgtttcat ccagcatata tcaccaaaga acgcctcgat 240

aaagctaaga acctgaagtt ggtggtagtc gcaggggtgg ggtcggatca tattgacctg 300

gattacatta atcagaccgg gaaaaaaatt tctgtgttag aagttaccgg cagtaatgtc 360

gtttctgtgg ccgaacacgt ggttatgacc atgttggttc tggtgcgcaa ctttgtgcca 420

gcacatgaac agattatcaa tcacgactgg gaggttgccg cgatcgcaaa agacgcctac 480

gatatcgaag gaaaaactat cgctactatc ggtgcgggcc gcatcggtta tcgtgttttg 540

gagcgtcttc tgccttttaa cccgaaagag ctcttatatt acgattatca ggccttaccg 600

aaagaagcgg aagagaaagt aggtgcgcgt cgtgtggaaa atatcgaaga attagtagcg 660

caagcagata tcgtgacggt gaacgcgcct ctccatgccg gtacgaaagg cctgattaat 720

aaggaactcc tgtccaaatt caaaaaaggt gcgtggcttg tgaataccgc tcgcggtgcg 780

atttgcgtcg ctgaagacgt ggcggcagcg ctggagagcg gccaacttcg cggttatggc 840

ggtgacgtat ggtttccgca gccggctccg aaagaccacc catggcgcga catgcgtaac 900

aaatatggcg cgggcaacgc catgaccccg cattattcgg gtaccaccct ggatgcccaa 960

acccggtacg cagagggcac caagaatatt ctggagtcat ttttcacggg caaattcgat 1020

tatcggccgc aggatattat tctgttgaac ggagagtatg ttacgaaggc ctatggcaaa 1080

cacgataaaa ag 1092

<210> 9

<211> 1101

<212> DNA

<213> 蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)

<400> 9

atgacattgg aaatcttcga atatctggaa aagtatgatt atgaacaggt tgtgttttgt 60

caggacaaag agagcggact gaaagcaatt atcgccattc atgacactac cctgggaccg 120

gctctcggcg gtacccgcat gtggacctat gattcagagg aagcggcaat cgaagatgca 180

ctccgtctgg caaaaggcat gacatataaa aacgcagctg ctggtttaaa tctgggtggc 240

gcgaaaaccg tcattattgg cgatccgcgt aaagataaat cagaagcgat gtttcgtgcc 300

ctgggtcgct acatccaagg gctgaacggg cgttatatta ccgcggaaga tgtaggcact 360

acggttgacg atatggatat cattcacgag gagactgatt ttgtcacggg catctctccg 420

tccttcggga gctccggaaa tccgtctccg gttaccgctt atggggttta ccgcgggatg 480

aaagcggcgg cgaaagaggc gtttggtacc gacaatttag agggcaaagt gattgcggtg 540

caaggtgtgg gcaatgtggc ctatcacctt tgcaagcacc tgcacgccga gggtgcaaag 600

ttaattgtca ccgacatcaa taaggaggcc gtccagcgtg ccgtagagga gttcggtgct 660

acggcggtgg agcctaacga aatttatggg gtggaatgcg acatttatgc gccatgtgca 720

ctcggcgcaa cggtaaatga tgaaaccatc ccacagctta aagcgaaagt gattgccggc 780

agcgctaata atcagcttaa agaagatcgg catggcgata tcattcatga aatgggcatc 840

gtctacgccc cggattatgt tattaatgcg ggtggtgtta ttaacgtggc ggatgaactg 900

tacggctata accgcgaacg tgcactgaaa cgtgtggaaa gcatttacga caccattgcc 960

aaggtgatcg aaatctcgaa acgggatggc atcgccacgt acgtagccgc ggatcggttg 1020

gcggaagaac gcatcgcctc gttgaaaaac agtcgctcga cgtatctgcg caacggccat 1080

gacatcatta gtcgccggta a 1101

<210> 10

<211> 50

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 10

aggcctatgg caaacacgat aaaaagatga cattggaaat cttcgaatat 50

<210> 11

<211> 59

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 11

gcctatggca aacacgataa aaaggaagct gctgctaaaa tgacattgga aatcttcga 59

<210> 12

<211> 80

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 12

aggcctatgg caaacacgat aaaaaggaag ctgctgctaa agaagctgct gctaaaatga 60

cattggaaat cttcgaatat 80

<210> 13

<211> 89

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 13

ggcctatggc aaacacgata aaaaggaagc tgctgctaaa gaagctgctg ctaaagaagc 60

tgctgctaaa atgacattgg aaatcttcg 89

<210> 14

<211> 65

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 14

aggcctatgg caaacacgat aaaaagggtg gtggtggttc tatgacattg gaaatcttcg 60

aatat 65

<210> 15

<211> 80

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 15

aggcctatgg caaacacgat aaaaagggtg gtggtggttc tggtggtggt ggttctatga 60

cattggaaat cttcgaatat 80

<210> 16

<211> 88

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 16

tatggcaaac acgataaaaa gggtggtggt ggttctggtg gtggtggttc tggtggtggt 60

ggttctatga cattggaaat cttcgaat 88

Claims

1.一种利用活性包涵体制备光学纯L-叔亮氨酸的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)通过含有双功能酶表达载体的基因工程菌诱导制备双功能酶活性包涵体，该双功能酶活性包涵体的活性成分为一融合双功能酶，该融合双功能酶包括通过连接肽相连的一LeuDH部和一用于辅酶NAD⁺再生的多聚酶部，上述LeuDH部包括如SEQ ID NO 01所示的氨基酸序列，上述连接肽为一刚性连接肽或一柔性连接肽，上述刚性连接肽能够形成α螺旋以将上述LeuDH部和多聚酶部有效隔离，上述柔性连接肽没有形成特定二级结构的能力，一般以无规卷曲的形式存在以提供催化过程中蛋白所需的柔性；上述刚性连接肽包括若干依次相连的如SEQ ID NO 02所示的氨基酸序列；上述柔性连接肽包括若干依次相连的如SEQ IDNO 03所示的氨基酸序列；上述多聚酶部为FDH部，该FDH部包括如SEQ ID NO 04所示的氨基酸序列；

(2)将上述双功能酶活性包涵体加入pH 6.0～10.0的反应混合液重悬，然后于20～40℃反应，反应期间控制pH为6.0～10.0；所述反应混合液包含50～1000mM三甲基丙酮酸、50-1000mM甲酸铵和0.05～5mM的辅酶NAD⁺。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的反应混合液的pH为8.5～9，温度为30℃，反应期间控制pH为8.5～9。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的反应混合液包含50～710mM的三甲基丙酮酸、50～780mM的甲酸铵和0.04～0.5mM的辅酶NAD⁺。