CN109943541A - 一种自组装固定化甲酸脱氢酶-亮氨酸脱氢酶融合酶的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种自组装固定化甲酸脱氢酶‑亮氨酸脱氢酶融合酶的制备方法，本发明选用刚性多肽作为连接肽融合双酶，利用亚基间形成四级结构的多聚作用作为驱动力，采用浓缩的方法促进多聚相互作用实现融合酶的自组装固定化。本发明所获得的甲酸脱氢酶‑亮氨酸脱氢酶融合酶的自组装固定化方法简单、自组装程度高，具有较好的温度稳定性、重复使用稳定性及催化效率。制备条件温和，制备工艺简单易行，所得自组装融合酶呈片层结构，具有自身固定化、组装程度高、重复利用率高等优点。

Description

一种自组装固定化甲酸脱氢酶-亮氨酸脱氢酶融合酶的制备 方法

技术领域

本发明属于固定化酶制备技术领域，具体涉及一种自组装固定化甲酸脱氢酶-亮氨酸脱氢酶融合酶的制备方法。

背景技术

手性氨基酸(天然L-氨基酸和非天然D-氨基酸)是合成手性药物、手性农药和手性食品添加剂等精细化工品的关键中间体，许多新药(如蛋白酶抑制剂类、抗艾滋病药等)使用人工合成的非天然手性氨基酸。其中，L-叔亮氨酸(L-Tle)在饲料添加剂以及营养强化剂等方面具有广泛的应用；L-Tle及其衍生物也常作为金属手性配体，或化学酶催化剂的配体，为不对称氨化还原反应提供更为高效的催化方式；L-Tle的另一重要用途是作为医药中间体，广泛应用于抗艾滋病药物以及生物抑制剂等的合成。

目前在工业应用中物理和化学手性拆分仍占主导地位，但手性化学品的生产还远远不能满足消费需求。生物法制备手性药物，利用酶对手性化合物高度专一的识别催化功能，在温和的反应条件下实现化合物的高选择性转化，尤其适用于高光学纯度手性药物的制备。该法不需制备前体衍生物，可将前体100％地转化为手性目标产物，因此具有更大的工业价值。生物法制备因极高的选择性为手性药物制备提供了特殊的技术选择和解决方案。另外，相对于化学法的多步反应，多个酶催化的生物转化反应被认定是今后化学品绿色制造发展的大趋势。

融合酶相比游离的酶在催化级联反应时具有明显的优势，能快速地运输反应中间产物到达下一个酶的反应位点进行催化，有利于辅酶的再生以及消除产物抑制，融合酶的高效性取决于其复合体的高级结构，其拉近了酶与酶的活性位点并形成底物通道，使得中间产物的传递从自由扩散变为直接传递，提高整体催化效率，并有利于避免副反应。

20世纪60年代催生了固定化酶技术，该技术是利用物理或化学方法将酶分子固定或束缚在一定区域内，能够重复及长时间发挥催化作用，并可回收的一种生物工程技术。在工业生产中，主要从固定化载体和固定化方法2个方面改进固定化酶，从而得到催化效率高、稳定性好、方便回收、成本低廉的固定化酶，固定化酶技术是制备酶制剂的重要技术之一。

发明内容

本发明的目的在于提供一种自组装固定化甲酸脱氢酶-亮氨酸脱氢酶融合酶的制备方法。

本发明的技术方案如下：

一种自组装固定化甲酸脱氢酶-亮氨酸脱氢酶融合酶的制备方法，包括如下步骤：

(1)将甲酸脱氢酶片段的基因序列与亮氨酸脱氢酶片段的基因序列，通过OE-PCR用刚性连接肽的基因序列连接起来，再与质粒载体相连，然后转化入大肠杆菌，获得工程菌；上述甲酸脱氢酶片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：01所示，上述亮氨酸脱氢酶片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：02所示，上述刚性连接肽由一至三如SEQ ID NO：09的氨基酸序列构成；

(2)培养上述工程菌进行融合酶的表达，再纯化获得融合酶纯酶；

(3)将上述融合酶纯酶采用截留分子量小于20000Da的超滤杯、超滤管、超滤包或透析袋进行浓缩，再用Tris-盐酸缓冲液重悬，即得所述自组装固定化甲酸脱氢酶-亮氨酸脱氢酶融合酶。

在本发明的一个优选实施方案中，所述超滤杯的截留分子量为5000Da。

在本发明的一个优选实施方案中，所述超滤管的截留分子量为3000Da。

在本发明的一个优选实施方案中，所述超滤包的截留分子量为5000Da。

在本发明的一个优选实施方案中，所述透析袋的截留分子量为3500Da。

在本发明的一个优选实施方案中，用于所述透析袋浓缩除水的高分子聚合物为PEG20000。

进一步优选的，所述质粒载体为pET-28a。

进一步优选的，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明的有益效果是：本发明选用刚性多肽作为连接肽融合双酶，利用亚基间形成四级结构的多聚作用作为驱动力，采用浓缩的方法促进多聚相互作用实现融合酶的自组装固定化。本发明所获得的甲酸脱氢酶-亮氨酸脱氢酶融合酶的自组装固定化方法简单、自组装程度高，具有较好的温度稳定性、重复使用稳定性及催化效率。制备条件温和，制备工艺简单易行，所得自组装融合酶呈片层结构，具有自身固定化、组装程度高、重复利用率高等优点。

附图说明

图1为本发明实施例3所制备的自组装固定化融合酶的自组装片层结构表面扫描电镜(SEM)图。

图2为本发明实施例8中制备的自组装固定化融合酶的催化性能图。

图3为本发明实施例8中的L-叔亮氨酸和D-叔亮氨酸的高效液相色谱图。

图4为本发明实施例8中的L-叔亮氨酸标准曲线图。

图5为本发明实施例9所制备的自组装固定化融合酶的重复利用率变化图。

图6为本发明实施例10所制备的自组装固定化融合酶的LDH部分的温度稳定性实验变化图。

图7为本发明实施例10所制备的自组装固定化融合酶的FDH部分的温度稳定性实验变化图。

具体实施方式

以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

实施例1

甲酸脱氢酶-亮氨酸脱氢酶融合酶工程菌构建：

(1)由商业化公司(上海生物工程有限公司)合成甲酸脱氢酶和亮氨酸脱氢酶的基因序列，利用刚性连接肽融合两个酶，构建融合酶基因序列。

甲酸脱氢酶(FDH)基因序列为：

亮氨酸脱氢酶(LeuDH)基因序列为：

设计引物序列如下：

引物1：5’GGAATTCCATATGAAAATTGTCCTGGTCCTGT-3’(SEQ ID NO：03)；下划线为NdeI酶切位点序列；

引物2：5’GCCTATGGCAAACACGATAAAAAGXXXATGACATTGGAAATCTTCGA-3’(SEQ ID NO：04至SEQ ID NO：06)；粗体部分的序列为插入的刚性连接肽序列，其中，SEQ ID NO：04至SEQID NO：06分别依次对应表1中的R1至R3的刚性连接肽的基因序列，此引物将为融合酶插入连接肽；

引物3：5’ATGACATTGGAAATCTTCGAATAT-3’(SEQ ID NO：07)；

引物4：5’CCGCTCGAGTTACCGGCGACTAATGATGT-3’(SEQ ID NO：08)；下划线为XhoI酶切位点序列；

利用引物1和引物2，PCR扩增得到FDH片段；

FDH片段PCR扩增条件如下：采用Taq酶

利用引物3和引物4，PCR扩增得到LeuDH片段；

LeuDH片段PCR扩增条件如下：采用Taq酶

以等摩尔的扩增得到的上述FDH片段和LeuDH片段为模板，用引物1和引物4进行PCR扩增，最终得到插入刚性连接肽的融合酶的基因。

融合酶基因PCR扩增条件如下：采用Taq酶

表1

(2)将上述融合酶基因序列与载体pET28a连接，构建质粒，导入至大肠杆菌E.coliBL21(DE3)，筛选转化成功的工程菌。

(3)融合酶基因及pET-28a质粒进行NdeI/XhoI双酶切，37℃酶切过夜，接着经纯化后在T4DNA ligase作用下4℃过夜反应连接，获得连接好的质粒。

(4)质粒的转化：向100uL感受态细胞(上海生物工程有限公司)中加入10ng的上述连接好的质粒，轻轻混匀后冰上放置30分钟，42℃水浴放置45秒，立即于冰上放置2分钟。加入37℃预温的LB培养基，37℃震荡培养1小时，取适量菌液涂带有卡那霉素抗性的LB固体平板，37℃过夜培养后挑取单菌落，即为工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a。

实施例2

甲酸脱氢酶-亮氨酸脱氢酶融合酶表达纯化

(1)粗酶液制备：以1％的接种量，将实施例1制备的工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a接种到200mL LB培养基中。该LB培养基的组成为：胰蛋白胨15.0g/L，酵母浸膏10.0g/L，NaCl 10.0g/L，调节pH7.5，接种前添加卡那霉素使其终浓度为40ug/mL；所述培养条件为37℃，200rpm培养2h后，OD600达到0.6，继续在20℃，200rpm下培养24h。

(2)培养结束获得的发酵液在冷冻离心机中离心，获得细胞，弃上清液，沉淀用pH7.4的Tris-盐酸缓冲液重悬，充分洗涤后离心，重复操作3次，获得细胞悬液，该细胞悬液的浓度为50g/L。

(3)将制备的细胞悬液置于冰浴中，细胞破碎仪探头置于液面下1.5cm，功率200W，超声3sec，间隔6sec，超声90次；然后4℃、10,000rpm离心30min，沉淀为包涵体及不溶性细胞碎片，上清即为融合酶粗酶液。

(4)融合酶纯酶的制备：采用GE公司的His Trap镍柱对上述融合酶粗酶液进行分离纯化，并用索莱宝公司的截留分子量为3500Da的透析袋进行透析除盐。所述的纯化过程采用的纯化柱为能够特异性纯化带有His-tagged标签的蛋白质的HisTrap HP柱，其步骤包括平衡、上样、平衡、洗脱、柱子再生；收集洗脱的部分并利用透析袋进行除盐；除盐后获得的液体即为融合酶纯酶。

实施例3

利用超滤杯浓缩制备自组装固定化融合酶：

上述实施例2的基础上，采用结构稳定性最佳的R3连接肽连接的融合酶纯酶，在超滤杯中加入10mL的纯酶液(以0.45μm滤膜过滤)，优选截留分子量5000Da的超滤膜，磁力搅拌器开至500rpm搅拌，同时通入氮气；浓缩至原浓度的10倍时，取1mL浓缩融合酶，4℃、10,000rpm离心10min，分离上清沉淀，沉淀用Tris-盐酸缓冲液重悬至原体积，形成自组装固定化融合酶悬液，上清为游离融合酶。

测定自组装固定化融合酶悬液的酶活回收率，以未浓缩前的纯酶液的酶活为100％，自组装固定化融合酶悬液的酶活为46.5％。通过扫描电镜观察自组装固定化融合酶悬液的形貌特征(图1)。

实施例4

利用超滤管浓缩制备自组装固定化融合酶：

上述实施例2的基础上，采用结构稳定性最佳的R3连接肽连接的融合酶纯酶，在AmiconUltra超滤管中加入10mL的纯酶样品(预先用0.45μm滤膜过滤)，优选超滤型号为截留分子量3000Da的超滤管；4℃，5000g离心2h，浓缩至内管样品体积为1mL，即浓缩到原浓度的10倍；内管混匀或吹打后，取1mL浓缩融合酶纯酶，4℃、10,000rpm离心10min，分离上清沉淀，沉淀用Tris-盐酸缓冲液重悬至原体积，形成自组装固定化融合酶悬液，上清为游离融合酶。

测定自组装固定化融合酶悬液的酶活回收率，以未浓缩前的纯酶液的酶活为100％，自组装固定化融合酶悬液的酶活为43.0％。

实施例5

利用超滤包浓缩制备自组装固定化融合酶：

上述实施例2的基础上，采用结构稳定性最佳的R3连接肽连接的融合酶纯酶，将蠕动泵、乳胶管与超滤包连接组装，优选型号为截留分子量5000Da的超滤包，首先以去离子水预处理超滤包，流速约300mL/min，处理时间为2min；加入200mL纯酶液进行浓缩，流速400mL/min，浓缩至100倍时，取1mL浓缩融合酶纯酶，4℃、10,000rpm离心10min，分离上清沉淀，沉淀用Tris-盐酸缓冲液重悬至原体积，形成自组装固定化融合酶悬液，上清为游离融合酶。

测定自组装固定化融合酶悬液的酶活回收率，以未浓缩前的纯酶液的酶活为100％，自组装固定化融合酶悬液的酶活为89.3％。

实施例6

利用透析袋(PEG20000溶液)浓缩制备自组装固定化融合酶：

上述实施例2的基础上，采用结构稳定性最佳的R3连接肽连接的融合酶纯酶，配制质量分数为50％PEG溶液30mL，将10mL的纯酶液加入透析袋中，优选型号为截留分子量3500Da的透析袋，放置于PEG溶液内，浓缩至1mL，即浓缩到原浓度的10倍，取1mL浓缩融合酶纯酶，4℃、10,000rpm离心10min，分离上清沉淀，沉淀用Tris-盐酸缓冲液重悬至原体积，形成自组装固定化融合酶悬液，上清为游离融合酶。

测定自组装固定化融合酶悬液的酶活回收率，以未浓缩前的纯酶液的酶活为100％，自组装固定化融合酶悬液的酶活为49.3％。

实施例7

利用透析袋(固体PEG20000)浓缩制备自组装固定化融合酶：

上述实施例2的基础上，采用结构稳定性最佳的R3连接肽连接的融合酶纯酶，将10mL的纯酶液加入透析袋中，优选型号为截留分子量3500Da的透析袋，放置于适量固体PEG20000中，浓缩至1mL，即浓缩到原浓度的10倍，取1mL浓缩融合酶纯酶，4℃、10,000rpm离心10min，分离上清沉淀，沉淀用Tris-盐酸缓冲液重悬至原体积，形成自组装固定化融合酶悬液，上清为游离融合酶。

测定自组装固定化融合酶悬液的酶活回收率，以未浓缩前的纯酶液的酶活为100％，自组装固定化融合酶悬液的酶活为67.5％。

实施例8

测定自组装固定化融合酶的催化性能：

上述实施例3的基础上，对游离融合酶和制备的自组装固定化融合酶悬液进行催化性能测定：自组装固定化融合酶催化L-Tle的反应体系包括：100mM三甲基丙酮酸、100mM甲酸铵、0.04mM NAD⁺将上述溶液置于冰上，以氨水调节体系pH为8.5，加入适量的自组装固定化融合酶悬液，于30℃、200rpm条件下反应，反应168h，每隔一段时间取样保存于-80℃待分析，催化结果如图2所示，每毫克的游离融合酶和自组装固定化融合酶催化生成产物的效率分别为0.43mg/mL/h、1.5mg/mL/h，其e.e.值均大于99％，图3为L-叔亮氨酸和D-叔亮氨酸的高效液相色谱图，图4为L-叔亮氨酸标准曲线图。

实施例9

测定自组装固定化融合酶的重复利用率：

上述实施例3的基础上，对制备的自组装固定化融合酶悬液进行重复利用率测定：反应体系同上，反应2小时，取200μL反应液保存于-80℃，分析得到的催化产物生成效率，定义为100％，结果如图5所示。离心得到自组装固定化融合酶后，重复上述反应过程，得到第二次重复使用的自组装固定化融合酶催化效率，与初始效率相比较，此时相对活力为93.5％。重复分离和反应过程，得到第三次重复使用的固定化胺脱氢酶相对活力为75.3％，第四次重复使用相对活力为64.8％，第五次重复使用相对活力为59.6％。

实施例10

测定自组装固定化融合酶的温度稳定性：

上述实施例3的基础上，对游离融合酶和制备的自组装固定化融合酶悬液进行温度稳定性测定：LDH温度稳定性测定：将游离融合酶和自组装固定化融合酶分别置于60℃水浴锅中，每隔1小时取样，加入底物、缓冲液、辅酶体系，使用酶标仪测定温浴不同时间的样品酶活，结果如图6所示，5小时后游离融合酶酶活几乎丧失，而自组装固定化融合酶酶活保持超过30％。FDH温度稳定性测定：将游离融合酶和自组装固定化融合酶分别置于50℃水浴锅中，每隔20分钟取样，加入底物、缓冲液、辅酶体系，使用酶标仪测定温浴不同时间的样品酶活，结果如图7所示，3小时后游离融合酶酶活几乎丧失，而自组装固定化融合酶酶活保持30％左右。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

序列表

<110> 厦门大学

<120> 一种自组装固定化甲酸脱氢酶-亮氨酸脱氢酶融合酶的制备方法

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1095

<212> DNA

<213> Artifical Sequence

<400> 1

atgaaaattg tcctggtcct gtatgacgcg ggcaaacatg cggccgatga ggagaaactt 60

tacggatcta cggaaaataa actggggatc gccaattggc tgaaagatca gggccacgaa 120

ctgatcacca caagtgataa agaaggggaa acaagcgaat tggataagca tattccggat 180

gcagatatca ttattactac gccgtttcat ccagcatata tcaccaaaga acgcctcgat 240

aaagctaaga acctgaagtt ggtggtagtc gcaggggtgg ggtcggatca tattgacctg 300

gattacatta atcagaccgg gaaaaaaatt tctgtgttag aagttaccgg cagtaatgtc 360

gtttctgtgg ccgaacacgt ggttatgacc atgttggttc tggtgcgcaa ctttgtgcca 420

gcacatgaac agattatcaa tcacgactgg gaggttgccg cgatcgcaaa agacgcctac 480

gatatcgaag gaaaaactat cgctactatc ggtgcgggcc gcatcggtta tcgtgttttg 540

gagcgtcttc tgccttttaa cccgaaagag ctcttatatt acgattatca ggccttaccg 600

aaagaagcgg aagagaaagt aggtgcgcgt cgtgtggaaa atatcgaaga attagtagcg 660

caagcagata tcgtgacggt gaacgcgcct ctccatgccg gtacgaaagg cctgattaat 720

aaggaactcc tgtccaaatt caaaaaaggt gcgtggcttg tgaataccgc tcgcggtgcg 780

atttgcgtcg ctgaagacgt ggcggcagcg ctggagagcg gccaacttcg cggttatggc 840

ggtgacgtat ggtttccgca gccggctccg aaagaccacc catggcgcga catgcgtaac 900

aaatatggcg cgggcaacgc catgaccccg cattattcgg gtaccaccct ggatgcccaa 960

acccggtacg cagagggcac caagaatatt ctggagtcat ttttcacggg caaattcgat 1020

tatcggccgc aggatattat tctgttgaac ggagagtatg ttacgaaggc ctatggcaaa 1080

cacgataaaa agtaa 1095

<210> 2

<211> 1101

<212> DNA

<213> Artifical Sequence

<400> 2

atgacattgg aaatcttcga atatctggaa aagtatgatt atgaacaggt tgtgttttgt 60

caggacaaag agagcggact gaaagcaatt atcgccattc atgacactac cctgggaccg 120

gctctcggcg gtacccgcat gtggacctat gattcagagg aagcggcaat cgaagatgca 180

ctccgtctgg caaaaggcat gacatataaa aacgcagctg ctggtttaaa tctgggtggc 240

gcgaaaaccg tcattattgg cgatccgcgt aaagataaat cagaagcgat gtttcgtgcc 300

ctgggtcgct acatccaagg gctgaacggg cgttatatta ccgcggaaga tgtaggcact 360

acggttgacg atatggatat cattcacgag gagactgatt ttgtcacggg catctctccg 420

tccttcggga gctccggaaa tccgtctccg gttaccgctt atggggttta ccgcgggatg 480

aaagcggcgg cgaaagaggc gtttggtacc gacaatttag agggcaaagt gattgcggtg 540

caaggtgtgg gcaatgtggc ctatcacctt tgcaagcacc tgcacgccga gggtgcaaag 600

ttaattgtca ccgacatcaa taaggaggcc gtccagcgtg ccgtagagga gttcggtgct 660

acggcggtgg agcctaacga aatttatggg gtggaatgcg acatttatgc gccatgtgca 720

ctcggcgcaa cggtaaatga tgaaaccatc ccacagctta aagcgaaagt gattgccggc 780

agcgctaata atcagcttaa agaagatcgg catggcgata tcattcatga aatgggcatc 840

gtctacgccc cggattatgt tattaatgcg ggtggtgtta ttaacgtggc ggatgaactg 900

tacggctata accgcgaacg tgcactgaaa cgtgtggaaa gcatttacga caccattgcc 960

aaggtgatcg aaatctcgaa acgggatggc atcgccacgt acgtagccgc ggatcggttg 1020

gcggaagaac gcatcgcctc gttgaaaaac agtcgctcga cgtatctgcg caacggccat 1080

gacatcatta gtcgccggta a 1101

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> Artifical Sequence

<400> 3

ggaattccat atgaaaattg tcctggtcct gt 32

<210> 4

<211> 59

<212> DNA

<213> Artifical Sequence

<400> 4

gcctatggca aacacgataa aaaggaagct gctgctaaaa tgacattgga aatcttcga 59

<210> 5

<211> 74

<212> DNA

<213> Artifical Sequence

<400> 5

gcctatggca aacacgataa aaaggaagct gctgctaaag aagctgctgc taaaatgaca 60

ttggaaatct tcga 74

<210> 6

<211> 89

<212> DNA

<213> Artifical Sequence

<400> 6

gcctatggca aacacgataa aaaggaagct gctgctaaag aagctgctgc taaagaagct 60

gctgctaaaa tgacattgga aatcttcga 89

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> Artifical Sequence

<400> 7

atgacattgg aaatcttcga atat 24

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> Artifical Sequence

<400> 8

ccgctcgagt taccggcgac taatgatgt 29

<210> 9

<211> 5

<212> PRT

<213> Artifical Sequence

<400> 9

Glu Ala Ala Ala Lys

1 5

Claims (8)

1.一种自组装固定化甲酸脱氢酶-亮氨酸脱氢酶融合酶的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)将甲酸脱氢酶片段的基因序列与亮氨酸脱氢酶片段的基因序列，通过OE-PCR用刚性连接肽的基因序列连接起来，再与质粒载体相连，然后转化入大肠杆菌，获得工程菌；上述甲酸脱氢酶片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：01所示，上述亮氨酸脱氢酶片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：02所示，上述刚性连接肽由一至三如SEQ ID NO：09的氨基酸序列构成；

(2)培养上述工程菌进行融合酶的表达，再纯化获得融合酶纯酶；

(3)将上述融合酶纯酶采用截留分子量小于20000Da的超滤杯、超滤管、超滤包或透析袋进行浓缩，再用Tris-盐酸缓冲液重悬，即得所述自组装固定化甲酸脱氢酶-亮氨酸脱氢酶融合酶。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述超滤杯的截留分子量为5000Da。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述超滤管的截留分子量为3000Da。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述超滤包的截留分子量为5000Da。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述透析袋的截留分子量为3500Da。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：用于所述透析袋浓缩除水的高分子聚合物为PEG20000。

7.如权利要求1至6中任一权利要求所述的制备方法，其特征在于：所述质粒载体为pET-28a。

8.如权利要求1至6中任一权利要求所述的制备方法，其特征在于：所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。